Modo de empleo – ChromoQuant QF-PCR kit
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1. ETA 1 1 normal no informativo 1E IF 901 210 311 Q07 122 ES05 3 4 El ndice pico normal dentro de una STR es 0 8 1 4 El ndice pico de trisom a es lt 0 65 y gt 1 8 rea o altura del alelo corto dividida por rea o altura del alelo largo Los ndices de alelo comprendidos entre los l mites normales y anormales se clasifican como no concluyentes y deben analizarse de nuevo Si en un solo cromosoma se obtienen patrones de alelos tanto anormales como normales no es aceptable interpretar los resultados finales como normales o anormales Deben llevarse a cabo estudios de seguimiento Para obtener informaci n detallada sobre la interpretaci n de los resultados consulte el manual del usuario de ChromoQuant El manual del usuario se puede descargar del sitio web de ChromoQuant o solicitarlo directamente a CyberGene AB N de producto 901 115 00 Soluci n 1 Marcador_ Ubicaci n STeMESSna EA AMEL Xp22 31 Xp22 1 e AMEL x 103 108 Verde Yp11 2 y 109 114 D185391 18p11 31 135 185 D18S976 18p11 31 171 201 6 FAM XHPRT___ Xg26 1 260 304 6 FAM Soluci n 2 DXS6854 _ Xq26 1 X Tetra 93 119 Azul 6 FAM EX Yp11 31 E 202 207 ET EI CyberGene AB Box 30057 104 25 Estocholmo Suecia 901 210 311 Q07 122 ESO5 4 42. Haga el paso 1 de acuerdo con la Taq polimerasa elegida Paso N de ciclos Temp Tiempo 1 GoTaq l 94 C 3 Min 1 HotStarTaq 1 95 C 15 Min 2 Repetici n 26 94 C 30 S 3 i E 1 Min 4 E 1E 2 Min 5 1 71 C 5 Min 6 1 60 C 1H 7 Aguantar 4 C 00 Electroforesis en gel de fragmentos de ADN amplificados Desale cada muestra de PCR de forma individual antes de la inyecci n electrocin tica en los capilares Realice la electroforesis en gel de acuerdo con el manual del instrumento o la buena pr ctica en el laboratorio para obtener la mejor resoluci n de fragmentos entre 93 500 nucle tidos Limitaciones del m todo y caracter sticas de rendimiento La informaci n del marcador de cada cromosoma es cuatro seis veces redundante cromosoma 13 18 y 21 Un resultado anal tico en el que dos de los marcadores de un cromosoma particular sean informativos debe considerarse un xito y se puede utilizar como indicaci n diagn stica Este kit no est pensado para evaluar o determinar si se ha producido alguna translocaci n que afecte a los cromosomas 13 18 21 X o Y No obstante se puede evaluar un estado tris mico a nivel cromos mico Este kit no debe utilizarse para evaluar aberraciones gen ticas mosaico por ejemplo la lionizaci n ChromoQuant s lo da indicios en cuanto al s ndrome de Turner X0 As pues para diagnosticar este s ndrome se recomiendan otros m todos d Heterocigoto Homocigoto Trisom a Trisom a 2 1
3. Modo de empleo ChromoQuant QF PCR kit P N 311 002 1 48 ChromoQuant Kit QF PCR de diagn stico in vitro ChromoQuant para el an lisis de alteraciones cromos micas comunes en los cromosomas 13 18 21 y X Y 311 002 1 48u z Ver caja n Ver caja Sir 18 C gt gt 7 a JN CE sl 25 C Precauciones Para utilizarse con secuenciadores fluorescentes compatibles con el grupo de filtros D en los analizadores gen ticos ABI Prism 3100 310 y 31xx de Applied Biosystems y el grupo de filtros 2 en MegaBACE 500 1000 de Amersham Biosciences Aseg rese de que su secuenciador sea compatible con los fluorocromos 6 FAM HEX y NED Se recomienda utilizar este kit con ADN purificado procedente de l quido amni tico algodones bucales saliva o sangre La funci n del kit no se puede garantizar si no se utiliza la Taq polimerasa recomendada La Taq polimerasa NO se incluye en el kit Para obtener resultados de calidad utilice gt 15 ng lt 150 ng de ADN por muestra de PCR InstaGene Matrix Para lograr resultados de PCR ptimos siga las instrucciones proporcionadas para el instrumento PCR disponible Los tapones de PCR rotos deben sustituirse antes de llevarse a amplificaci n por PCR Las muestras de los pacientes que est n manchadas de sangre no deben analizarse con este kit por ejemplo cuando se utiliza ADN procedente del l quido amni tico Para evitar la contaminaci n cruzada durante la configuraci n de PCR aseg rese de
4. cnolog as de preparaci n de ADN comerciales que proporcionen un ADN gen mico puro Independientemente del m todo de preparaci n diluya el ADN para obtener una concentraci n final de 1 5 15 ng hl utilizando agua est ril 901 210 311 Q07 122 ESO5 2 4 Amplificaci n por PCR multiplex de ADN gen mico 1 Descongele el tamp n de QF PCR y el tamp n de diluci n de enzima a temperatura ambiente y col quelos en hielo 2 Determine el n mero total de tubos PCR es decir soluci n 1 2 N 3 M zclelo en un microtubo de polipropileno separado un tubo Eppendorf de 1 5 ml por ejemplo e Tamp n de diluci n de enzima 1 6 ul Taq polimerasa 0 4 ul y tamp n QF PCR 13 pl multiplicados por N Prepare siempre un poco de cantidad extra Los tubos PCR suministrados con el kit est n dispuestos en tiras de ocho Las tiras de cada color analizar n ocho muestras de pacientes cada una Para obtener mejores resultados se recomienda trabajar r pido en hielo 4 A ada 15 ul de la mezcla maestra del paso 3 a cada tubo PCR 5 A ada 10 pul de muestra de ADN 15 150 ng M zclelo mediante bombeo por pipeta cinco veces Volumen final 25 pl 6 Golpee suavemente los tubos de la tira contra la mesa del laboratorio o g relos en una microcentr fuga para asegurarse de que todos los reactivos se acumulen en la parte inferior del tubo PCR Realice la amplificaci n por PCR de inmediato Protocolo de PCR Los pasos 2 4 se repiten 26 ciclos
5. i n 1 Soluci n 2 Instrucciones de almacenamiento y conservaci n despu s de la apertura Inicial e Guarde los tubos PCR de mezcla de cebadores sin usar y el tamp n QF PCR en un lugar oscuro y a lt 18 C El tamp n de diluci n de enzima se puede guardar a una temperatura de 20 a 8 C e Utilice papel de aluminio cuando sea necesario para proteger los tubos de una exposici n innecesaria a la luz por ejemplo al trabajar con el kit en la mesa del laboratorio antes de PCR Es recomendable guardar siempre el material que no se utilice en la bolsa de aluminio precintable original e Periodo de validez Ver fecha de caducidad Reactivos especiales adicionales que debe aportar el usuario e Taq polimerasa HotStar Taq Qiagen n de producto 203203 250U 5 U ur o alternativamente Taq polimerasa GoTaq Promega Inc n de producto M8301 o M3171 5 U u e Electroforesis en gel fluorescente tama o est ndar por ejemplo ABI GeneScan 500 ROX n mero de producto 401734 o ET ROX n mero de producto 5 6550 01 de Amersham Biosciences Esto se a ade a la muestra de ADN despu s de PCR pero antes de la electroforesis en gel e Columnas para desalar el producto de PCR antes de la electroforesis capilar en gel e Otros reactivos para purificar el ADN gen mico Procedimiento Preparaci n y purificaci n del ADN Los reactivos para purificar el ADN procedente de tejido humano NO est n incluidos en el kit Es recomendable utilizar te
6. usar una nueva punta de pipeta para cada pozo que deba llenar con ADN La sal interferir con la separaci n de fragmentos durante la electroforesis en gel Se recomienda desalar despu s de PCR La calidad de la formamida o del agua a adidas a la muestra de ADN antes de la carga o de la inyecci n electrocin tica afectar la sensibilidad Aseg rese que sean siempre de la m xima calidad Los reactivos para purificar el ADN gen mico no se incluyen en el kit El proceso de PCR est cubierto por las patentes de EE UU 4 683 195 y 4 683 202 y equivalentes extranjeros propiedad de Hoffman La Roche AB El usuario debe tener una licencia de Hoffman La Roche para utilizar la tecnolog a PCR 901 210 311 Q07 122 ESO5 1 4 Composici n del kit e Doce 12 tiras de ocho tubos Cada tubo PCR contiene una mezcla de cebadores lista para usar Soluci n de mezcla de cebadores 1 cromosoma 13 18 y X Y Soluci n de mezcla de cebadores 2 cromosoma 21 y X Y As pues basta una tira de ocho tubos ambar para determinar el cromosoma 13 18 de ocho 8 pacientes y una tira de ocho tubos azul para determinar el cromosoma 21 de ocho 8 pacientes e Tapones de tiras de PCR e Un tamp n de diluci n de enzima 300 ul en un tubo con tap n de rosca blanco tamp n Tris EDTA e Un tamp n QF PCR 1 5 ml en un tubo con tap n de rosca amarillo MgCl gt NH14 2504 ANTP f mercaptoetanol alb mina de suero bovino 000000000OOO0O Soluc
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