Obtención de suspensiones celulares y embriones somáticos de
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1. 1 15 22 Gatita A M Arrieta G Espinoza A M 2007 Comparison of three in vitro protocols for direct somatic embryogenesis of and plant regeneration of Coffea arabica L CVS Caturra and Catuai Agronomia Costarricense 31 1 85 94 Gonz lez M E Hern ndez M M Hern ndez A 2007 Compor tamiento de diferentes genotipos de cafeto frente al empleo de un biopreparado bacteriano en la callog nesis Cultivos Tropi cales 28 3 39 45 Inca Start 1998 Sistema autom tico para an lisis estad stico Ver si n 4 10 1998 Jim nez V M 2005 Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis Plant Growth Regulators 47 91 110 Kalyaeva M A 2001 Methylotrophic bacteria promote in vitro growth and morphogenesis Russian Journal of Plant Physiology 48 4 514 517 Mauri P V Manzanera J A 2003 Induction maturation and ger mination of holm oak Quercus ilex L somatic embryos Plant Cell Tissue and Organ Culture 10 1 7 Montes S Mart nez M Rojas R Santana N Cuba M 1995 Obtenci n de embriones som ticos a partir de suspensiones celulares de Coffea canephora var Robusta Cultivos Tropicales 16 3 77 81 Murashige T Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassoys whith tobbaco tissue cultures Physiol Plants 15 473 497 Ozawa K Komamine A 1999 Stablisment of a system of High Frecuency Embryogenesis fro2. DI y la limitaci n del cultivo fueron se alados en otras plantas de cafeto por Montes et al 1995 al estudiar el proceso de forma ci n de embriones som ticos en medio l quido Se ha informado que la inducci n a la embriog nesis en el cafeto pudiera estar regulada por la presencia en el medio de cultivo de mol culas inductoras como las glicoprote nas similar a lo se alado para el cultivo de la zanahoria por De Vries 1988 dependiendo la res puesta adem s de las caracter sticas de cada material lo que coincide con resultados obtenidos en estudios precedentes en cafeto Santana et al 2004 Gatica et al 2007 El color de la suspensi n fue otro indicador que va ri seg n el genotipo y la DI exceptuando a K 234 donde se mantuvo el color cremoso con las diferen tes DI estudiadas tabla 3 Los resultados mostraron que la coloraci n blanco crema fue buen indicador al utilizar Dl igual a 1 gMF L en el trabajo con las sus pensiones dada la correspondencia entre esta variable y el comportamiento logrado en los dem s indicado res evaluados En este caso la respuesta diferenciada de los genotipos pudiera atribuirse a la existencia de una gran variabilidad de compuestos fen licos en C canephora var Robusta caracter stica que influye ne gativamente en el establecimiento de los cultivos debi do a los da os celulares que ocasiona Al respecto se se ala que los compuestos fen licos se enlazan a las prote nas
3. analizado y los genotipos Al respecto es de destacar que un comportamien to similar fue obtenido por Dublin 1980 al estudiar el proceso de inducci n de embriones en el h brido Arabusta y evaluar el efecto de las auxinas ANA AIA cido indolac tico AIB cido indolbutirico 2 4 D cido 2 4 diclorofenociac tico sobre el mismo obte niendo que el mayor porcentaje de formaci n de em briones som ticos 33 se logr con el AIA mientras que en los restantes tratamientos los valores obtenidos no rebasaron el 14 2 resultados que contribuyen a explicar el efecto favorable observado con el extracto aux nico en este estudio el cual contiene al AIA como fuente de auxina mayoritaria habiendo sido enuncia dos los efectos positivos de este regulador sobre los genotipos estudiados Este mismo autor al realizar un estudio de dosificaci n del AIA con el empleo de con centraciones entre 0 5 y 2 0 mg L en la formaci n de embriones som ticos de Arabusta obtuvo el mayor valor 37 7 con 1 0 mg L resultados que difirieron de lo alcanzado en el presente estudio donde se obtu vo la mejor respuesta con concentraciones inferiores a la anteriormente referida En la tabla 6 se presentan los resultados de la forma ci n de embriones som ticos por fase de desarrollo obtenidos a partir de las suspensiones celulares culti vadas en medio MIE 2 Tabla 6 Embriones som ticos de C canephora var Robusta en las diferentes fases
4. el cultivo del cafeto Referencias bibliogr ficas Barrueto L P Cruz A R Castro L H 2004 Somatic embryogen esis from the coffee cultivars Rubi Catuai Vermelho 81 and IAPAR 59 HortScience 39 130 131 Barry D Bertrand B Schlonvoigt A Etienne H 2002 The mor phological variability within a population of coffee somatic em bryos produced in a bioreactor affects the regeneration and the development of plants in the nursery Plant Cell Tissue and Organ Culture 68 153 162 Cerda F Aquea F Gebauer M Medina C Arce P 2002 Stable transformation of Pinus radiata embryogenis tissue by Agrobac terium tumefaciens Plant Cell Tissue and Organ Culture 70 251 257 Cevallos M 2000 Establecimiento de una metodolog a eficiente en el proceso de embriog nesis som tica del cafeto Tesis pre sentada en opci n al grado de Doctor en Ciencias INCA La Habana De Vries S 1988 Carrot somatic embryogenesis suspends on the phytohormone controlled presence of correctly glycosilated extracellular proteins Genes and Development 2 462 476 Dibut B Mart nez R R os Y Ortega M Planas L Rodr guez J Canizares K 2010 Contribuci n de rizobacterias fijadoras de dinitr geno a la nutrici n de cultivos econ micos En Caracte rizaci n y manejo de microorganismos rizosf ricos Congreso Cient fico del INCA 17 2010 nov 23 26 La Habana Memo rias CD ROM Instituto Nacional de Cienc
5. tenidos con el medio MDE 1 aunque difirieron de los anteriormente descritos son similares a los obtenidos por Cevallos 2000 en esta misma especie al emplear un medio de cultivo alternativo con el oligogalactur nido Pectimorf porcentajes que resultaron superados por los alcanzados en el presente estudio con el me dio MDE 2 evidenci ndose mejoras en la eficiencia de este indicador para el cafeto aspecto de significaci n ya que contribuye a la disminuci n de los niveles de p rdida por no conversi n del material regenerado Conclusiones Los genotipos M 229 y K 234 mostraron mayor reacti vidad durante las fases de cultivo in vitro tanto en los medios de cultivo suplementados con reguladores de crecimiento convencionales como en los alternativos demostr ndose el efecto ben fico del extracto auxf nico Se evidenci una fuerte relaci n entre la viabilidad ce lular y el n mero de c lulas ante las diferentes con diciones de cultivo y seg n la densidad de in culo utilizada aspecto de importancia por su posible apli caci n pr ctica Se observaron diversas formas en las poblaciones de embriones som ticos debido a la asincron a dentro ellas la fase globular acorazonado y torpedo resul tando desventajoso por la no uniformidad inicial de la fase de desarrollo de los embriones Los altos porcentajes de conversi n de ES con el em pleo del medio MDE 2 evidencian mejoras en la efi ciencia de este indicador para
6. ART CULO DE INVESTIGACI N Obtenci n de suspensiones celulares y embriones som ticos de cafeto Coffea canephora P con el empleo de metabolitos bacterianos Obtaining of cell suspensions and somatic embryos of coffee Coffea canephora P using of bacterial metabolites Mar a Esther Gonz lez Vega Yanelis Castilla Vald s Annia Hern ndez Rodr guez Resumen La embriog nesis som tica es importante como sistema modelo para estudiar el desarrollo de eventos fisiol gicos citol gicos y moleculares que sustentan la embriog nesis en plantas por ser un sistema adecuado para la propaga ci n masiva de especies vegetales y servir de herramienta para el mejoramiento gen tico la conservaci n de germo plasma y la validaci n de nuevos productos biol gicos y facilitar la producci n a gran escala a trav s del cultivo en medio l quido y su aplicaci n en biorreactores proporcionando alta frecuencia de multiplicaci n r pido crecimiento del embri n facilidad de absorci n de nutrientes y reducci n de la labor de subcultivo En este trabajo se emple la embriog nesis som tica como v a de multiplicaci n para evaluar el efecto de metabolitos bacterianos en la inducci n de suspensiones celulares y embriones som ticos en tres genotipos de cafeto pertenecientes a Coffea canephora P variedad Robusta Para ello se estudiaron densidades de in culo entre 0 2 0 5 1 0 y 3 0 gMF L y se evalu el efecto de diferentes medios de c
7. MDE 2 contentivo del extracto aux nico de los metabolitos bacterianos en sustituci n del ANA con tribuy al mejor comportamiento de este genotipo que mostr acci n tard a ante las etapas precedentes del proceso de embriog nesis som tica Al parecer para esta fase de cultivo los requerimientos hormo nales de M 28 resultaron favorecidos con el empleo del extracto aux nico obteni ndose un mayor n mero de embriones som ticos germinados niveles que es tuvieron en correspondencia con los alcanzados para M 229 y K 234 en ambos medios de cultivo Al respecto en la literatura se se ala la importancia de emplear diferentes concentraciones de AIA en el de sarrollo de embriones som ticos de diferentes cultivos obtenidos a partir de materiales de baja reactividad lo que pudiera contribuir a explicar el efecto observado en el genotipo de menor respuesta M 28 con la va riante de medio de cultivo descrita Los resultados ob tenidos fueron similares a los se alados por V zquez et al 1998 que lograron diferentes ndices de rege neraci n en la micropropagaci n de h bridos de C ara bica valores que estuvieron en correspondencia con el genotipo evaluado La conversi n de los embriones som ticos difiere entre los genotipos las especies y los sistemas de cultivo Freire 2003 A su vez es v lido destacar que los porcentajes de germinaci n alcanzados en el presente estudio difirie ron de los informados por Garc a y
8. Men ndez 1987 al emplear el ANA en la germinaci n de embriones som ticos del h brido de cafeto Catimor con valores que no superaron 27 En la emisi n de las hojas verdaderas a los 60 d as de cultivo no hubo diferencias estad sticas entre los tratamientos oscilando los valores entre 50 y 56 Sin embargo al analizar la emisi n de ra ces secundarias se presentaron diferencias significativas correspon diendo los valores m s altos al medio MDE 2 con 71 y 73 para los genotipos M 229 y K 234 respectiva mente seguidos por el genotipo M 28 que logr supe rar el porcentaje alcanzado en el medio MDE 1 51 De forma general se observ un efecto favorable con Tabla 7 Germinaci n y conversi n de ES en genotipos de C canephora var Robusta ET Germinaci n IS S a verdaderas Genotipo 20 d as 60 d as MDE 1 MDE 2 MDE 1 MDE 2 M 229 K 234 M 28 ES X 153 0 82 ns Conversi n en vitroplantas Emisi n ra ces secundarias 60 d as 65 d as MDE 1 MDE 2 MDE 1 MDE 2 6la 60 a 49c 1 07 116 Medias con letras comunes no difieren estad sticamente seg n Prueba de Rangos M ltiples de Duncan para lt 0 05 significativo para p lt 0 01 Obtenci n de suspensiones celulares y embriones som ticos de cafeto Coffea canephora P 129 el medio MDE 2 lo que pudiera estar relacionado con las propiedades del extracto aux nico utilizado como sustituto del ANA
9. ant Growth Subs tance produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet Pennistem americanun L Applied Enviroment Microbiology 37 219 226 van Boxtel J Berthouly M 1996 High frequency somatic embryo genesis from Coffee leaves factors influencing embryogenesis and subsequent proliferation and regeneration in liquid me dium Plant Cell Tissue Organ Culture 44 7 17 Vaugh K C 1984 Funtion of polyphenol oxidate in higher plants Physiol Plant 60 106 112 V zquez N Salazar K Solano W Peseira A Bertand B Etienne H 1998 Embriog nesis de alta frecuencia en h bridos F1 selec cionados de Coffea arabica a partir de explantes de hoja reacti vidad y eventos histol gicos En III Encuentro Latinoamericano de Biotecnolog a Vegetal REDBIO 98 La Habana 1 5 junio von Aderkas P Rohr R Sundberg B Gutmann M Dumont N Lelu M A 2002 Abscisic acid and its influence on deveplo ment of the embryonal root cap storage product and secon dary metabolite accumulation in hybrid larch somatic embryos Plant Cell Tissue and Organ Culture 69 111 120 von Aderkas P Lelub M A Label P 2001 Plant growth regulators levels during maturation of larch somatic embryos Plant Physio logy Biochemistry 39 495 502 von Arnold S Sabala I Bozhkov P Dyachok J Filonova L 2002 Developmental pathways of somatic embryogenesis Plant Cell Tissue and Organ Cul
10. ar para este ltimo indicador se utiliz el m todo del colorante Azul de Evans P rez 1998 cre ndose una escala cualitativa de 3 gra dos seg n la coloraci n de la suspensi n Escala 1 viabilidad celular 1 Sin color viabilidad celular alta 2 Azul claro viabilidad celular moderada 3 Azul intenso viabilidad celular baja Obtenci n de embriones som ticos Se emplearon suspensiones celulares embriog nicas de 2 meses de establecidas en el medio de cultivo MMC 2 y con una DI de 1 gMF L procedentes de los 3 genotipos eva luados Se caracterizaron por una coloraci n blanco cremosa y apariencia granulosa Para evaluar el efecto de dos medios de cultivo en la formaci n de embriones som ticos se utilizaron 70 mL de los medios de inducci n de embriones MIE 1 con trol y MIE 2 donde la auxina cido naftalenac tico ANA fue sustituida por el extracto aux nico bacteria no tabla 1 Se procedi a la inoculaci n de 5 erlen meyers por tratamiento medio de cultivo x genotipo con 1 gMF L de las suspensiones celulares estableci das en el medio MMC 2 A las 14 semanas de cultivo se procedi a la inocula ci n de 10 mL del cultivo en placas de Petri 5 placas por tratamiento contentivas del medio para desarrollo de embriones MDE 1 tabla 1 El medio se utiliz en estado semis lido empleando 1 g L de agente geli ficante gelrite para facilitar el conteo de los embrio nes A los 30 d as y con ayuda de u
11. de desarrollo Embriones por fase de desarrollo Genotipo Globular Acorazonado Torpedo M 229 22d 24 cd 54a K 234 38 b 28 cd 34 bc M 28 51a 27 cd 22d ES x 2 75 Medias con letras comunes no difieren estad sticamente seg n Prue ba de Rangos M ltiples de Duncan para lt 0 05 significativo para p lt 0 01 Se observ una mejor respuesta del genotipo M 229 y la fase torpedo 54 este valor no difiri del resul tado alcanzado por el genotipo M 28 para la fase glo bular 51 demostr ndose el comportamiento precoz de M 229 y la respuesta tard a del genotipo M 28 don de solo se obtuvo un 22 para la fase torpedo en igual periodo de cultivo conoci ndose de la importancia de lograr estadios de desarrollo avanzados Este comporta miento pudiera deberse a la alta respuesta del genotipo M 229 dada por sus caracter sticas gen ticas aspecto que se ha corroborado al evaluar otros indicadores du rante el proceso de multiplicaci n v a embriog nesis som tica y por el contrario a la menor respuesta de M 28 que ha mostrado un comportamiento diferencial para la mayor a de las variables estudiadas demostr n dose su bajo potencial embriog nico Por su parte el genotipo K 234 present un comportamiento m s ba 128 Rev Colomb Biotecnol Vol XIII No 1 Julio 2011 123 131 lanceado obteni ndose un 34 de embriones som ticos en fase torpedo comportamiento que corr
12. es seleccionados dado que existe un elevado n mero de microorganismos que poseen la capacidad de producir sustancias promotoras del cre cimiento vegetal dentro de ellas las bacterias Dibut et al 2010 siendo el cido 3 indolac tico AIA una de las principales auxinas producidas por rizobacteias pertenecientes a las especies Pseudomonas fluorescens Aprobado mayo 5 de 2011 y Burkholderia cepacia En este sentido tambi n se ha comprobado que bacterias de la especie Methylovorus mays ejercen efectos ben ficos en la morfog nesis y el crecimiento de vitroplantas de tabaco Nicotiana taba cum papa Solanum tuberosum y flax Linum usitatis simun Kalyaeva 2001 logrando en las vitroplantas colonizadas y cultivadas en un medio de regeneraci n libre de vitaminas incremento significativo del n mero de brotes y r pido desarrollo del sistema radical efec tos que se atribuyen a la producci n de fitohormonas citoquininas y vitaminas En el presente estudio se emple la embriog nesis so m tica como v a de multiplicaci n para evaluar el efec to de metabolitos activos procedentes de una cepa de Burkholderia cepacia caracterizada por estimular el cre cimiento vegetal en la inducci n de suspensiones celu lares y embriones som ticos en tres genotipos de cafeto pertenecientes a Coffea canephora P variedad Robusta caracterizados por su autoincompatibilidad y resistencia o tolerancia a estr s abi tico Materiales y
13. g nesis som tica Efectos similares han sido informados para el cultivo del arroz Oryza sativa L Ozawa y Komamine 1999 Los resultados citados demuestran la influencia de la variable en el proceso estudiado para el cultivo del ca feto lo que pudiera contribuir a explicar el resultado obtenido con la DI de 3 0 gMF L en este estudio y hace inferir que las DI de 0 5 y 1 0 gMF L empleadas favorecieron la multiplicaci n celular de los 3 genoti Tabla 2 Efecto de la DI en el n mero de c lulas por mL x10 en suspensiones de C canephora var Robusta Medias con letras comunes no difieren estad sticamente seg n Prueba de Rangos M ltiples de Duncan para p lt 0 05 significativo para p lt 0 01 Densidad de in culo gMF L Genotipo 3 0 1 0 0 5 0 2 M 229 29 26 f 45 88 a 42 80 bc 11 88 h K 234 29 01 f 41 10c 43 15 b 11 36 h M 28 22 12 g 35 52 d 31 14e 7 61 1 ES x 0 058 126 Rev Colomb Biotecnol Vol XIII No 1 Julio 2011 123 131 pos evaluados corroborado por los niveles de concen traci n celular alcanzados Por otro lado se observ que la DI de 0 2 gMF L condujo a una limitaci n del cultivo para los 3 genoti pos al parecer el crecimiento no se inici hasta una determinada concentraci n considerada como cr tica la limitaci n a su vez pudo ser acentuada por los sub cultivos e influenciada por el genotipo Un comporta miento similar con relaci n a la
14. ias Agr colas 2010 Dublin P 1980 Induction de bourgeons n oformes et embryogen se somatique Deux voies de multiplication v g tative in vitro des caf ier cultiv s Cafe Cacao The 24 2 121 130 Etienne D B Bertrand B N Etienne H 2002 Comparison of so matic embryogenesis derived coffee Coffea arabica L plant lets regenerated in vitro or ex vitro Morphological mineral and water characteristics Annual of Botany 90 77 85 Flota V A Vargas V M 2003 In vitro plant cell culture as the basis for the development of a Research Institute in M xico Centro de Investigaci n Cient fica de Yucat n In vitro Celular Develo pment Biology Plant 39 250 258 130 Rev Colomb Biotecnol Vol XIII No 1 Julio 2011 123 131 Freire M 2003 Aspectos b sicos de la embriog nesis som tica Biotecnolog a Vegetal 3 4 195 209 Furtek D Kasran R Chia T Jonchiul L Mohammed A Hart ney V et al 2001 Biotechnology research by the Malaysian cocoa board In Proceeding of the International Workshop on New Technologies and Cocoa Breeding Maylasia Kota Kinabalu Garc a D Rojas R Mart nez M Cuba M 1996 M todos para la evaluaci n del crecimiento de suspensiones celulares de Co ffea canephora variedad Robusta Cultivos Tropicales 17 1 85 87 Garc a E Men ndez A 1987 Embriog nesis som tica a partir de explantes de cafeto Catimor Caf Cacao The 31
15. in three coffee genotypes of Coffea canephora P var Robusta Were studied inoculo densities among 0 2 0 5 1 0 and 3 0 gMF L 1 and the effect of different culture medium in the development of the process The results showed a behavior differed in the genotype M 28 in medium culture with conventional regulators of growth and the alternatives Strong relationship was evidenced between the cellular viability and the number of cells in the different cultivation conditions and according to the inoculo density a wide range of size and forms as observed in the Investigadoras Instituto Nacional de Ciencias Agr colas INCA La Habana Cuba Esther inca edu co Marylago00 yahoo com Investigadora Facultad de Biolog a Universidad de La Habana Cuba Rev Colomb Biotecnol Vol XIII No 1 Julio 2011 123 131 123 populations of somatic embryos The conversion percentages with the medium MDE 2 evidenced improvements of this indicator for the coffee Key words Coffea canephora Robusta density germination conversion Recibido septiembre 26 de 2008 Introducci n Aunque la embriog nesis som tica se inform por vez primera hace aproximadamente 50 a os atr s contin a siendo objeto de numerosos estudios por su importan cia von Arnold et al 2002 Su connotaci n se debe a sus usos como sistema modelo para estudiar el desarro llo de los eventos fisiol gicos citol gicos y moleculares que sustentan la embriog nesis en
16. io nes seg n cada bioensayo Caracter sticas y modo de empleo de los metabolitos bacterianos Los metabolitos activos se obtuvieron a partir de una cepa nativa de la especie Burkholderia cepacia aislada de la rizosfera del cultivo del ma z La efectividad de los mismos se evalu a trav s del em pleo de un extracto aux nico obtenido seg n la meto dolog a descrita por Tien et al 1979 Determinaci n de la densidad ptima de in culo ini cial Para el establecimiento de la suspensi n celular se utilizaron callos con estructuras embriog nicas de 28 y 35 d as de cultivo de los 3 genotipos evaluados caracterizados por una coloraci n blanco cremosa y consistencia friable Los mismos fueron previamente cultivados en el medio de formaci n de callos MFA 3 contentivo de 2 0 mg L de Kinetina y 0 7 mg L del extracto aux nico Gonz lez et al 2007 en condi ciones de oscuridad Las densidades de in culo DI estudiadas fueron 0 2 0 5 1 0 y 3 0 gMF L Se em plearon erlenmeyers de 250 mL de capacidad con teniendo 70 mL de medio de cultivo MMC 2 tabla 1 Recipientes de cultivo con dichas caracter sticas fueron utilizados en la producci n de embriones so m ticos A los 60 d as de cultivo se evaluaron en 10 muestras por tratamiento las variables coloraci n concentra ci n de c lulas n mero de c l mL a trav s del con teo celular en c mara de Fuch Rosentals Garc a et al 1996 y viabilidad celul
17. las inactivan e inhiben el crecimiento de los tejidos del explante Vaugh 1984 Tabla 3 Coloraci n de la suspensi n celular seg n la DI en C canephora var Robusta R Densidad de in culo gMF L Genotipo 3 0 1 0 0 5 0 2 M 229 BC BC BC CC K 234 Cr Cr Cr Cr M 28 Cr Cr Cr CO BC Blanco crema Cr Crema CC Carmelita claro CO Carmelita oscuro Al analizar el comportamiento de la viabilidad celular de las suspensiones se pudo observar que el mejor re sultado se obtuvo con las DI de 0 5 y 1 0 gMF L y el genotipo M 229 comportamiento similar al obtenido con 0 5 gMF L y el genotipo K 234 tabla 4 El resto de las combinaciones present coloraci n azul claro o intenso indicativo de una viabilidad celular media o baja Se demostr que 3 0 gMF L result ser la densi dad de in culo menos favorable ya que la viabilidad de las c lulas en las suspensiones de los 3 genotipos fue baja De forma general la viabilidad celular en las suspensiones del genotipo M 28 fue inferior con rela ci n a M 229 y K 234 y las variantes de densidad de in culo evaluadas corrobor ndose la menor capaci dad de respuesta de este genotipo Tabla 4 Viabilidad celular en las suspensiones de C canephora var Robusta Densidad de in culo gMF L Genotipo 3 0 1 0 0 5 0 2 M 229 3 1 1 2 K 234 2 2 1 2 M 28 3 2 2 2 1 Sin color 2 Azul claro 3 Azul intenso Este re
18. m todos Material vegetal La especie estudiada fue Coffea ca nephora Pierre ex Froehner variedad Robusta Como material de partida se utilizaron callos obtenidos a par tir de explantes foliares de los genotipos promisorios M 229 K 234 y M 28 establecidos en condiciones de campo y procedentes del Banco de Germoplasma de la Estaci n Central de Investigaciones de Caf y Cacao ECICC Condiciones experimentales generales En los bioensa yos se utilizaron como medio basal las sales minerales del medio de cultivo de Murashige y Skoog 1962 suplementado con inositol 100 mg L vitaminas de Morell 4 mg L ciste ma HCl 25 mg L y sacarosa 30 g L Los reguladores del crecimiento convencio nales o sustitutos de estos fueron adicionados seg n se describe en cada bioensayo El pH fue ajustado a 5 7 y la esterilizaci n se realiz en autoclave a 121 C durante 15 min y 1 2 kg cm Los cultivos en medio l quido para los diferentes ensa yos fueron establecidos bajo las siguientes condicio 124 Rev Colomb Biotecnol Vol XIII No 1 Julio 2011 123 131 nes agitaci n en zaranda orbital a 110 rpm 27 1 C y fotoperiodo de 16 h luz 8 oscuridad Los subculti vos se realizaron cada 21 d as tomando como refe rencia los resultados obtenidos al evaluar las curvas de crecimiento celular para cada genotipo Se utiliz un dise o completamente aleatorizado des cribi ndose el n mero de tratamientos y de repetic
19. m Long Term Cell Suspensi n Cultures of Rice Orice sativa L Theorical and Applied Gene tics 77 208 216 Palada M 2002 A combined liquid solid medium procedure for enhancing plant regeneration ability for Norway spruce embr yogenic cultures 1 International Symposium on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants Noruega Mayo 2002 P rez P J 1998 Propagaci n y mejora gen tica de plantas por biotecnolog a J N Santa Clara Instituto de Biotecnolog a de las Plantas Santana N Gonz lez M E Valc rcel M Canto Flick A Hern n dez M M Fuentes Cerda C F et al 2004 Somatic Embryoge nesis A valuable alternativa for propagating selected Robusta coffee Coffea canephora clones In vitro Celular Development Biology Plant 40 1 95 101 Shapiro S S Francia R S 1972 An approximate Analysis of Vari ance Test for Normality Journal of the American Statistical As sociation 67 215 216 Statistical Graphics Corp 1999 Stagraphics Plus por Windows 4 1 Steinitz B Kusek M Tabib Y Paran l Zelcer A 2003 Pepper Capsicum annun L regenerants obtained by direct somatic embryogenesis fail to develop a shoot In vitro Celular Develop ment Biology Plant 39 296 303 Tan C L Furtek D B 2003 Develpment of an in vitro regeneration system for Theobroma cacao from matures tissues Plant Scien ces 164 407 412 Tien T M Gaskin M H Hubbell D H 1979 Pl
20. n microscopio estereosc pico marca Leica se evalu el n mero total de embriones som ticos ES y a partir de 100 ES se evalu el n mero de estos por fase de desarrollo para cada genotipo Germinaci n y conversi n de embriones som ticos Se aislaron embriones som ticos en fase cotiledonar de aproximadamente 5 0 5 5 mm pertenecientes a los genotipos M 229 K 234 y M 28 obtenidos en medio l quido MIE 2 y se inocularon en el medio para desa rrollo de embriones MDE 2 tabla 1 con 0 5 mg L del extracto aux nico como sustituto del ANA Como con Tabla 1 Reguladores del crecimiento mg L empleados para la producci n de ES de C canephora var Robusta Composici n U M MMC 2 MIE 1 MIE 2 MDE 1 MDE 2 Kinetina mg L 0 2 0 5 0 5 2 0 2 0 ANA mg L 0 1 0 1 Ext Aux nico mg L 0 7 0 7 0 5 MMC 2 medio de multiplicaci n celular 2 MIE 1 medio de inducci n de embriones 1 MIE 2 medio de inducci n de embriones 2 MDE 1 medio de desarrollo de embriones 1 MDE 2 medio de desarrollo de embriones 2 Obtenci n de suspensiones celulares y embriones som ticos de cafeto Coffea canephora P 125 trol se emple el medio MDE 1 tabla 1 Se utilizaron 30 tubos de ensayo de 15 cm de largo por 2 5 cm de ancho con tapones de goma y contentivos de 15 mL del medio de cultivo con 4 embriones cada uno para los tratamientos evaluados y se sometieron a un foto periodo de 16 h luz 8 h
21. obora lo se alado por Flota y Vargas 2003 y Jim nez 2005 acerca de que existen genotipos que responden a los procesos embriog nicos con mayor facilidad que otros ante determinadas condiciones de cultivo En el presente estudio se observ un alto grado de asincron a que es la causa de que las poblaciones de embriones som ticos muestren t picamente un amplio rango de tama o y de forma en este caso el alto gra do de asincron a presentado durante la formaci n de los embriones som ticos result desventajoso desde el punto de vista pr ctico por dos razones primero la no uniformidad inicial en cuanto a la fase de desarrollo de los embriones que se reflej a lo largo del cultivo in vitro de la poblaci n resultante y segundo por la incertidumbre de determinar en un momento dado si en las c lulas no diferenciadas resultaron fallas o pre sentaron retraso en la embriog nesis Germinaci n y conversi n de los embriones som ti cos En la tabla 7 se observan los valores obtenidos durante las evaluaciones realizadas en la etapa de ger minaci n y conversi n de los embriones som ticos de los 3 genotipos en estudio La interacci n fue significa tiva para los factores analizados existiendo diferencias estad sticas entre los tratamientos Se obtuvieron por centajes de germinaci n elevados que solamente difi rieron para el genotipo M 28 cultivado sobre el medio MDE 1 mostrando el menor valor Se observ que el medio
22. oscuridad y temperatura de 27 1 C Pasados 30 d as los embriones germinados se transfirieron a frascos de cultivo bajo condiciones de iluminaci n A los 20 d as de cultivo se evalu en 50 muestras por tratamiento el porcentaje de germinaci n a los 60 d as el porcentaje de emisi n de hojas verdaderas y de formaci n de ra ces secundarias mientras que la con versi n a pl ntulas fue evaluada a los 65 d as de culti vo Se realizaron 5 repeticiones por cada tratamiento y el experimento fue replicado 3 veces en el tiempo An lisis estad sticos La normalidad de las variables evaluadas se comprob por el m todo de Shapiro y Francia 1972 Los datos originales de las variables ex presadas en porcentaje se transformaron mediante la f rmula arcsen J y los datos de conteos celulares a trav s de la f rmula Log x para su an lisis estad stico A los valores de las diferentes variables se les realiz un an lisis de varianza bifactorial utilizando el proce sador estad stico Start vesi n 4 10 1998 Inca Start 1998 En los casos en que se observaron diferencias significativas se aplic la prueba de Rangos M ltiples de Duncan al 5 para la comparaci n de las medias utilizando el programa Statgraphics 1999 Resultados y discusi n Determinaci n de la densidad ptima del in culo inicial Se detect interacci n entre los factores con diferencias significativas entre los tratamientos los re sultados se mue
23. plantas von Aderkas et al 2001 2002 por ser un sistema adecuado para la propagaci n masiva de algunas especies de plantas Etienne et al 2002 servir de herramienta para asistir el mejoramiento gen tico Cerda et al 2002 y a la con servaci n de germoplasma Barrueto et al 2004 as como a la validaci n de productos biol gicos de nueva formulaci n Cevallos 2000 Wang y Zhong 2002 Adem s facilita la producci n a gran escala a trav s del cultivo en medio l quido van Boxtel y Berthouly 1996 y su aplicaci n en biorreactores Barry et al 2002 resultando muy importantes las condiciones del medio de cultivo que deben ser ensayadas para cada caso en particular y modificadas durante el desarrollo del proceso embriog nico El uso del medio l quido para desarrollar las etapas de proliferaci n del tejido embriog nico y de diferenciaci n de los embriones som ticos es en la actualidad bien conocido Palada 2002 Las ventajas que este tipo de medio proporciona son numerosas cabe destacar la alta frecuencia de multi plicaci n un r pido crecimiento del embri n som ti co facilidad de absorci n de nutrientes reducci n de la labor de subcultivo y facilidad de automatizaci n en biorreactores Mauri y Manzanera 2003 Adem s en la actualidad existen biopreparados bac terianos a base de metabolitos activos con efectos fa vorables en la multiplicaci n por t cnicas de cultivo in vitro de material
24. stran en la tabla 2 El mayor valor de n mero de c lulas se obtuvo para el genotipo M 229 y la densidad de in culo de 1 0 gMF L con 45 88 x 10 c l mL valor que difiri de lo obtenido en el resto de las combinaciones para el genotipo mencionado Sin embargo el genotipo K 234 redujo el n mero de c lu las al variar la DI de 0 5 a 1 0 g MFL mientras que en el genotipo M 28 esta ltima DI permiti alcanzar los mayores valores de c lulas Es de destacar que con la densidad de in culo de 3 gMF L se obtuvieron los m s bajos valores de con centraci n celular para los 3 genotipos evaluados en el presente estudio al compararse los resultados con los obtenidos para las DI de 0 5 y 1 0 gMF L comporta miento que pudiera ser explicado por la presencia de un autoantagonismo ligado a la DI que al ser compa rada con el comportamiento mostrado por los dem s tratamientos result ser elevada efecto que pudiera deberse a la acumulaci n de sustancias inhibidoras ex cretadas por las c lulas de los callos que conducen a la limitaci n del cultivo ya que concentraciones desfa vorables de sustancias inhibidoras pueden alcanzarse de forma r pida con DI consideradas como elevadas Por su parte Van Boxtel y Berthouly 1996 al eva luar el efecto de la DI en genotipos de C canephora var Robusta diferentes a los evaluados en el presente trabajo encontraron que DI superiores a 5 0 gMF L inhibieron el desarrollo de la embrio
25. sultado contribuye a explicar el comportamiento del genotipo M 28 durante las fases de cultivo in vitro precedentes ya que el grado de viabilidad determina el comportamiento ante las diferentes condiciones de cultivo As los resultados obtenidos en el an lisis de la viabilidad de las c lulas se correspondieron con los valores del n mero de c lulas seg n la densidad de in culo utilizada lo que evidenci una fuerte relaci n entre dichas variables aspecto de significativa impor tancia por su posible aplicaci n pr ctica Al discutir los resultados se observ la semejanza del proceso inducido al emplear diferentes DI con el des crito por algunos autores que han destacado la impor tancia de utilizar densidades de inoculaci n que no conduzcan a una limitaci n de la producci n y desa rrollo de las estructuras embriog nicas a fin de lograr mayores ndices de multiplicaci n aspecto que est estrechamente relacionado con el genotipo Zamarri pa et al 1991 van Boxtel y Berthouly 1996 Formaci n de embriones som ticos Los resultados de las evaluaciones realizadas con relaci n a la formaci n de embriones som ticos posterior a las 14 semanas de cultivo se muestran en la tabla 5 Se detect interac Obtenci n de suspensiones celulares y embriones som ticos de cafeto Coffea canephora P 127 ci n significativa para los factores analizados obser v ndose una fuerte influencia del genotipo y el medio de c
26. ture 69 233 249 Wang W Zhong J 2002 Manipulation of ginsenoside heteroge neity in cell cultures of Panax notoginseng by addition of jas monates Journal Biosciences Bioenginering 93 48 53 Zamarripa C A Ducos J P Tessereau H Bollon H and V Petiard 1991 Production d embryons somatiques de cafeier en mi lieu liquide Effets densite d inoculaci n et renouvellement du milieu Caf Cacao Th 35 4 21 26 Obtenci n de suspensiones celulares y embriones som ticos de cafeto Coffea canephora P 131
27. ultivo en el desarrollo del proceso Los resultados mostraron un comportamiento diferencia do en el genotipo M 28 en medios de cultivo suplementados con reguladores de crecimiento convencionales y en los alternativos Se evidenci una fuerte relaci n entre la viabilidad celular y el n mero de c lulas ante las diferentes condiciones de cultivo y seg n la densidad de in culo se observ un amplio rango de tama o y forma en las pobla ciones de embriones som ticos Los porcentajes de conversi n de ES con el medio MDE 2 evidenciaron mejoras de este indicador para el cultivo del cafeto Palabras clave Coffea canephora Robusta densidad de in culo germinaci n conversi n Abstract The somatic embryogenesis is important as model system to study the development of physiologic and molecular events that sustain the embryogenesis in plants is an appropriate system for the massive propagation of vegetable species and as tool for the genetic improvement the germplasm conservation and the validation of new biological products and to facili tate the multiplication to great scale through the culture in liquid medium as well as application in bioreactores providing high multiplication frequency quick growth of the embryo easiness of absorption of nutritious and reduction of the sub culturing In this paper the somatic embryogenesis was used to evaluate the effect of bacterial compounds in the induction of cellular suspensions and somatic embryos
28. ultivo utilizado El mayor n mero de embriones som ticos 30 9 x 10 ES L se obtuvo en el genotipo M 229 con el medio MIE 2 que conten a 0 5 mg L de kinetina y 0 7 mg L del extracto aux nico Tabla 5 Formaci n de embriones som ticos en genotipos de C canephora var Robusta Embriones totales x 10 ES L Genotipo Medias con letras comunes no difieren estad sticamente seg n Prue ba de Rangos M ltiples de Duncan para p lt 0 05 significativo para p lt 0 01 A este tratamiento le sigui el genotipo K 234 y la mis ma variante de medio de cultivo que aunque difiri de los resultados anteriores logr superar al resto de los tratamientos con 28 1 x 10 ES L Es de destacar que para el genotipo M 28 se observ una disminuci n del n mero de embriones totales al emplear el medio MIE 2 resultando favorecido con MIE 1 lo que pudiera ser explicado por la concentra ci n del extracto aux nico empleada en el cultivo que tal vez no result adecuada para que este material ex presara una mejor respuesta unido al comportamien to diferencial que ha caracterizado a este genotipo durante las etapas precedentes Sin embargo los resul tados obtenidos en los genotipos de mayor respuesta mostraron un incremento significativo del n mero to tal de ES producidos en el medio MIE 2 con relaci n al medio MIE 1 demostr ndose el efecto favorable de esta variante de cultivo sobre el indicador
29. y las caracter sticas de los genotipos en estudio observ ndose en este caso una mayor ac ci n morfog nica En el an lisis de la conversi n a pl ntulas se presen taron diferencias significativas alcanz ndose los ma yores valores en los genotipos M 229 y K 234 y el medio MDE 2 con un 61 y 60 respectivamente Sin embargo sobre este mismo medio de cultivo el ge notipo M 28 solo alcanz el 49 lo que corrobora el marcado efecto genot pico evidenciado en las etapas precedentes Al respecto V zquez et al 1998 se a laron diferencias en los ndices de conversi n de los embriones som ticos 17 79 al trabajar con h bridos de C arabica La obtenci n de plantas a partir de embriones som ticos constituye una etapa cr tica en el proceso de embriog nesis som tica particularmente en plantas le osas y semile osas Tan y Furtek 2003 entre las dificultades que se presentan se puede se alar oscure cimiento del hipocotilo fallo de los embriones som ti cos en la emisi n de brotes y hojas debido al peque o tama o de los cotiledones lo que provoca la muer te de los mismos Furtek et al 2001 fallo en la for maci n del meristemo caulinar Steinitz et al 2003 Actualmente en varios cultivos se desarrollan impor tantes protocolos en aras de superar las dificultades que en dicho sentido pudieran limitar el uso eficiente de m todos biotecnol gicos Es v lido destacar que los valores de conversi n ob
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