Efecto de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt y
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1. Meloidogyne hapla Chitwood in green pepper Journal of Plant Protection Research 2011 51 4 371 376 20 P rez M Manual T cnico Programa de Manejo Agroecol gico de nematodos en el cultivo del tabaco Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales ECOVIDA Pinar del R o Cuba 2010 10pp 21 Winham MT Elod Y Baker R A mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 1986 76 518 521 147 22 Jayant Bhatt Sengupta SK Chaurasia RK Management of Meloidogyne incognita by Trichoderma viride in betelvine Indian Phytopathology 2002 55 1 97 98 23 Nagesh M Hussaini SS Ramanujam B Chidanandaswamy BS Management of Meloidogyne incognita and Fusarium oxysporum f sp lycopersici wilt complex using antagonistic fungi in tomato Nematol Medit 2006 34 63 68 Recibido 18 10 2014 Aceptado 6 3 2015 Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 1472. 22 um Los filtrados se colectaron en erlenmeyers est riles y se conservaron en frascos est riles a 4 C hasta su utilizaci n Las ootecas de M incognita se extrajeron de ra ces de tomate cv Campbell 28 y se colocaron a eclosionar en siracusas con agua destilada est ril a 28 C en una incubadora Friocell utilizando la meto dolog a de Baermann modificada 7 Los juveniles de segundo estadio J se colectaron a las 72 horas Se tomaron 10 J y se depositaron en placas de 48 pocillos a los que se les a adi 1 ml de las diluciones 1 10 1 25 1 50 y filtrado puro de cada una de las ce pas de 7 asperellum por separado Como controles se utilizaron agua destilada est ril y el medio de culti vo Richard est ril sin inocular Transcurridas 24 horas se extrajeron los juveniles de cada tratamiento y se colocaron en siracusas con agua destilada est ril durante otras 24 horas al cabo de las cuales se contabilizaron los J vivos y muertos Posteriormente se colocaron en portaobjetos escavados est riles con 50ul de agua destilada se observaron al microscopio ptico Zess con 600 au mentos Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 Los datos relacionados con el n mero de juveniles muertos expresados en porcentaje de mortalidad se transformaron mediante la expresi n arc y se so metieron a an lisis de varianza simple y la diferencia entre las medias se estableci a trav s del test de T
3. agallamiento en relaci n al con trol en tomate 23 Se pudo constatar que el hongo creci en todos los segmentos de ra ces que se colocaron en medio de cultivo evidenciando la presencia de Ta 90 en la su perficie de las ra ces De igual modo se produjo el 100 de parasitismo en ootecas y huevos de M incognita Los resultados obtenidos concuerdan con lo plan teado por Sharon et al 16 acerca de que Trichoderma posee la habilidad de parasitar diferen tes estadios del ciclo de vida de Meloidogyne lo que demostraron con T asperellum cepa 203 que interactu con J2 hembras y huevos e interfiri en el proceso de reproducci n Este aspecto debe continuar en estudio debido a su importancia pr ctica para lograr disminuciones de las poblaciones en el tiempo sobre todo en especies vegetales de ciclo corto donde los productores usan las reas para sembrar varios cultivos en el a o algu nos de los cuales pueden ser susceptibles a nematodos de agallas Los resultados sugieren que la cepa Ta 90 de 7 asperellum posee potencialidades para ser utilizada en el manejo de M incognita en tomate pues aun cuan do no se produjo una reducci n significativa del ndice de agallamiento y del n mero de agallas se observ disminuci n en el n mero de huevos por hembra y un mejor comportamiento de las plantas independiente mente de que estuvieran parasitadas por nematodos No obstante resulta necesario continuar los estudios y
4. agua destila da est ril tres veces se sembraron tres por cada pla ca y se incubaron durante cuatro d as a 28 2 C Se cuantific el n mero de ootecas parasitadas y se ex pres en porcentaje Parasitismo de huevos se extrajeron 20 ootecas por cada tratamiento se enjuagaron tres veces con agua destilada est ril y se suspendieron en 1ml de agua est ril en siracusas est riles Posteriormente de cada siracusa y con el auxilio de un estereoscopio ZEISS se extrajeron huevos y se colocaron con un asa de siembra en tres puntos en una placa que con ten a medio agar agua m s el antibi tico Las placas se incubaron durante cuatro d as a 28 2 C Las obser vaciones se realizaron en el microscopio ptico Wild TM con 400 y 1000 aumentos y se cuantific el n mero de huevos parasitados y se expres en porcentaje RESULTADOS Y DISCUSI N Selecci n de cepas de T asperellum como potenciales agentes de control biol gico de M incognita raza 2 Efecto toxig nico de filtrados de T asperellum sobre M incognita Se produjeron diferencias significativas entre los valores de mortalidad provocados por las cepas de T asperellum sobre los juveniles de M incognita Solo la diluci n de 1 50 de tres cepas ocasion porcentajes de mortalidad en los juveniles de M incognita por en cima de 70 distingui ndose la cepa Ta 90 con 90 de mortalidad a las 24 horas Fig 1 Por su parte las cepas Ta 13 y Ta 25 provocaron menor afectac
5. different environmental conditions and substrates For the in vitro trial 1 10 1 25 1 50 dilutions and the pure filtrate of each strain were tested including a control treatment with sterile water For the study under semi controlled conditions tomato Solanum lycopersicum L plants were inoculated with 2 5 second instar juveniles J per gram of soil and after 72 hours 10 CFU of the strain Ta 90 were added per pot The treatments were healthy plants absolute control plants 7a 90 plants 7a 90 nematodes plants nematodes and nematodes Ta 90 without plants The parameters evaluated after 35 days were galling index IA number of eggs per root system plant height stem diameter root length number of leaves and weight of fresh root High mortality Los resultados son parte de la Tesis de Maestro en Ciencias en Sanidad Vegetal presentada por el primer autor y fueron desarrollados en el marco del Proyecto Diagn stico y manejo de plagas en granos con nfasis en el desarrollo y uso de productos bioactivos Programa Nacional de Salud Animal y Vegetal Cuba 2013 2016 140 levels were shown by all the T asperellum strain filtrates the strain 7a 90 stood out with 90 mortality at 24 hours In the pot trial this latter strain significantly reduced the number of eggs per female compared with the unapplied control and attenuated the effect of the nematode on parameters such as plant height stem diameter number of leaves and
6. las plantas solo la masa y el volumen de las ra ces se incrementan en las plantas con nematodos debido a la presencia de las agallas Sin embargo la aplicaci n de T asperellum cepa Ta 90 atenu el efecto del nematodo en par metros como altura di metro del tallo n mero de hojas y masa fresca a rea se mostraron plantas con buen vigor Desde el punto de vista pr ctico ser a conveniente su uso en la producci n protegida de hortalizas donde los nematodos est n siempre presentes en los suelos y adem s porque pueden disminuir el ataque de Fusarium spp y con ello los da os que ocasiona el complejo Fusarium nematodo en el cultivo del tomate Este tipo de comportamiento se observa en plan tas de tomate parasitadas por Meloidogyne spp y tratadas con Trichoderma se obtiene un follaje m s exuberante en estas plantas que en el testigo con nematodos 18 Asimismo se encontr que la apli caci n de Trifender producto cuyo ingrediente activo es una cepa de 7 asperellum no tuvo efecto sobre el n mero de hembras de Meloidogyne pero la altura de las plantas de pimiento aument entre 12 15 y el rendimiento entre el 25 35 durante el primer a o del experimento mientras que al siguiente el n mero de hembras disminuy en el 33 y la altura de las plantas se increment en 11 18 19 Otros autores observaron incremento en altura di metro de tallos masa fresca y rendimiento de tomate cultivar M2 tra tado con Trichoder
7. root fresh weight Key words biological control of nematodes tomato root knot nematode Trichoderma INTRODUCCI N El tomate Solanum lycopersicum L es uno de los vegetales m s apetecidos a nivel mundial Su popula ridad se debe a que sus frutos son consumidos fres cos en m ltiples formas procesadas conservas de tomate tomate deshidratado y en alimentos basados en tomate 1 Los nematodos representan una de las principales plagas del cultivo donde el g nero Meloidogyne es el m s distribuido y da ino pues provoca p rdidas del 20 33 en los rendimientos a escala mundial 2 En Cuba la especie que m s afecta al tomate y la m s distribuida en plantaciones tradicionales y en producciones protegidas es Meloidogyne incognita Kofoid y White Chitwood 3 Diversos insumos biol gicos se desarrollaron en el pa s para el manejo de nematodos agalleros 4 sin embargo no se cubren a n las demandas de es tos productos Al respecto se conoce que las cepas de Trichoderma se utilizaron con xito en el manejo de plagas de suelo en Cuba 5 y a nivel internacio nal lo que sugiere que este g nero resulta efectivo como agente de control biol gico de nematodos pa r sitos de plantas 6 Diversas cepas de Trichoderma asperellum Samuels se seleccionaron en Cuba por su acci n sobre Fusarium spp 5 y resulta de inter s determinar su efecto so bre M incognita y establecer sus potencialidades para ser empleadas
8. EE 18 4 CV 0 34 Effect of the strain T asperellum Ta 90 on the number of eggs per female of M incognita race 2 SE 18 4 CV 0 34 Este resultado tiene significaci n pr ctica pues representa una disminuci n de m s 50 de los hue vos que dar an origen a nuevos juveniles y re infesta r an el cultivo teniendo en cuenta que el ciclo del to mate es de m s de 100 d as La disminuci n en el n mero de huevos es una con secuencia del parasitismo detectado en ootecas y en huevos lo que ratifica el efecto observado bajo condi ciones in vitro Esto es una evidencia del potente sis tema enzim tico que posee la cepa Ta 90 capaz de ejercer su efecto bajo diversos ambientes aspecto que fue detectado con anterioridad en diferentes sustratos 145 donde mostr elevada actividad quitinasa y glucanasa entre los cinco y siete d as de incubaci n datos no publicados Este tiempo de incubaci n est en co rrespondencia con el de incorporaci n del producto al suelo antes del trasplante Se inform la reducci n del n mero de huevos por ootecas cuando se aplicaron diferentes especies ce pas de Trichoderma en especial cuando se aplic T viride 22 Sharon et al 6 notificaron que en los trata mientos que recibieron Trichoderma se produjo una reducci n en la producci n de huevos de Meloidogyne mientras que la cepa PDBC TH23 de T harzianum disminuy significativamente la multiplicaci n del nematodo e ndice de
9. Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 ISSN 2224 4697 ART CULO ORIGINAL Efecto de cepas de Trichoderma asperellum Samuels Lieckfeldt y Nirenberg sobre el desarrollo del tomate y Meloidogyne incognita Kofoid Y White Chitwood Daine Hern ndez Ochand a Mayra G Rodr guez Belkis Peteira Ileana Miranda Yail n Arias Benedicto Mart nez Direcci n de Sanidad Vegetal Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria CENSA Apartado 10 San Jos de las Lajas CP 32700 Mayabeque Cuba Correo electr nico daineh censa edu cu RESUMEN El objetivo de este trabajo fue determinar el potencial de cepas de Trichoderma asperellum Samuels Lieckfeldt y Nirenberg como agente de control biol gico de Meloidogyne incognita Kofoid y White Chitwood Se utilizaron las cepas Ta 1 Ta 13 Ta 25 Ta 78 Ta 79 y Ta 90 seleccionadas previamente por su alta capacidad antag nica producci n de metabolitos y adaptaci n a diversas condiciones ambientales y sustratos En los ensayos in vitro se evalu el efecto de las cepas sobre juveniles de M incognita y se utilizaron las diluciones de 1 10 1 25 1 50 y filtrado puro de cada una de las cepas y un tratamiento control agua est ril Para el estudio en condiciones semicontroladas las plantas de tomate Solanum lycopersicum L se inocularon con 2 5 juveniles de segundo estadio J por gramo de suelo y a las 72 horas se adicion in culo de la cepa Ta 90 se aplic 107UCF por macet
10. a Los tratamientos fueron plantas sanas control absoluto plantas 7a 90 plantas 7a 90 nematodos plantas nematodo y nematodos 7a 90 sin plantas A los 35 d as se evaluaron los par metros ndice de Agallamiento IA n mero de huevos del nematodo por sistema radical altura de planta di metro del tallo longitud de la ra z n mero de hojas y masa fresca de ra z Los filtrados de las cepas de T asperellum causaron altos niveles de mortalidad y sobresali la cepa Ta 90 con 90 de mortalidad a las 24 horas En macetas dicha cepa provoc una disminuci n en el n mero de huevos por hembras lo que difiere significativamente del testigo sin aplicar y atenu el efecto del nematodo sobre los par metros altura di metro del tallo n mero de hojas y masa fresca a rea Palabras clave control biol gico de nematodos tomate nematodos agalleros Trichoderma Effect of Trichoderma asperellum Samuels Lieckfeldt and Nirenberg strains on the development of tomato and Meloidogyne incognita Kofoid and White Chitwood population ABSTRACT The objective of this study was to determine the potential of strains of Trichoderma asperellum Lieckfeldt amp Nirenberg to control M incognita Kofoid and White Chitwood Under laboratory conditions in vitro six native strains of T asperellum Ta 25 Ta 1 Ta 90 Ta 78 Ta 79 and T 13 were selected for their high antagonistic capability production of various metabolites and adaptation to
11. cognita Se pudo constatar que la cepa Ta 90 de T asperellum tuvo acci n paras tica sobre huevos de M incognita raza 2 Fig 2 no as el resto de las cepas evaluadas Se observ desorganizaci n en el conteni do interno de los huevos con la aparici n de secciones oscurecidas espacios o vacuolas y las hifas del hon go emergiendo de los mismos lo que evidencia que hubo penetraci n del hongo al interior del huevo y muerte de los embriones Al respecto Druzhinina et al 15 en su revisi n sobre el g nero Trichoderma plantearon que los ais lados de diferentes especies de este agente de control biol gico fueron capaces de parasitar huevos y juveni les del segundo estadio de nematodos formadores de agallas Meloidogyne spp La envoltura o cubierta de los huevos de nematodos posee tres capas una externa de vitelina una media de quitina y otra interna de l pidos 12 La infecci n de los huevos por parte de cepas de Trichoderma spp es posible debido al incremento en la actividad de enzimas como quitinasas y proteasas cuando el hon go entra en contacto con los huevos o juveniles 13 Se encontr adem s que la matriz gelatinosa don de se depositan los huevos promueve la atracci n del hongo y mejora las capacidades paras ticas de nume rosos aislados de Trichoderma que utilizan esta ma triz como fuente de nutrientes 16 La funci n de las quitinasas secretadas por este agente de control biol gico en la
12. ellum tuvieron mayor n mero de hojas y masa fresca a rea con diferencias significativas con los otros tratamientos Con relaci n a la masa fresca de ra ces los mayores valores se obtuvieron en los tratamientos con nematodos sin di ferencias significativas entre ellos seguidos por el tra tamiento que solo recibi T asperellum que present diferencias con el testigo absoluto el de menor valor de masa fresca de ra z Tabla 1 Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 144 TABLA 1 Efecto de la interacci n M incognita T asperellum en plantas de tomate cv Campbell 28 Effect of M incognita T asperellum interaction on tomato plants cv Campbell 28 Di metro Masa Masa Long ra z Tratamientos Altura de del tallo N mero fresca fresca principal plantas cm mm hojas a rea g ra ces g cm Plantas inoculadas con 27 14 b 4 86 b 7 86b 16 69 c 7 27 a 22 43 nematodos Plantas inoculadas con 32 14 ab 6 86 b 971 a 46 44 a 5 76 ab 25 5 nematodos y tratadas con T asperellum Plantas tratadas con T 37 57 a 14 71a 9 86 a 55 32 a 4 61b 31 14 asperellum Plantas testigos 34 43 ab 5 711 b 6 86b 31 48 b 2 49 c 25 71 ESx 2 19 4 74 0 73 8 49 1 0 1 81 La presencia de nematodos agalleros en las ra ces de las plantas provoca diversos efectos sobre el crecimiento y el rendimiento debido a su acci n pa ras tica 17 De manera general los nematodos afec taron negativamente el desarrollo de
13. en el manejo del complejo Meloidogyne Fusarium El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de cepas cubanas seleccionadas de T asperellum sobre M incognita y el tomate MATERIALES Y M TODOS Selecci n de cepas de T asperellum como potenciales agentes de control biol gico de Meloidogyne sp Para los ensayos se utilizaron las cepas de T asperellum Ta 1 Ta 13 Ta 25 Ta 78 Ta 79 y Ta 90 provenientes de la colecci n del Laboratorio de Micolog a Vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria CENSA y una poblaci n de M incognita raza 2 proveniente del banco de poblaciones del Labo ratorio de Nematolog a Agr cola del CENSA Selecci n in vitro de cepas de T asperellum Efecto toxig nico de filtrados de T asperellum sobre M incognita Se sembraron los discos de 5 mm de las cepas en el centro de placas de 90 mm de di metro que con ten an medio de cultivo Agar Malta AM Biocen y se incubaron a 30 C y oscuridad por 72 h De la periferia de las colonias de cada cepa de Trichoderma se to maron tres discos M 3 mm y se inocularon en dos frascos de 100 ml de capacidad por cepa contentivos de 30 ml de medio de cultivo l quido Richard pH 5 5 Posteriormente los frascos se agitaron en una zaran da orbital a 250 rpm y temperatura de 24 26 C duran te 48 horas Los cultivos obtenidos se filtraron a trav s de papel de filtro est ril Whatman No 1 y posterior mente por filtros miliporo de 0
14. evaluar en campo la cepa de manera que se pueda establecer las dosis los diferentes momentos de apli caci n y otros efectos adicionales que pudiera mos trar la cepa de Trichoderma probada Esto permitir a incorporar un producto de mayores perspectivas y sostenibilidad al manejo de nematodos y Fusarium Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 146 AGRADECIMIENTOS Los autores desean agradecer a Roberto Enrique Regalado Lidia L pez Noreidys Fern ndez y Regla C rdova por su valioso trabajo t cnico en la realiza ci n de este estudio De igual modo se agradece al Dr Eduardo Sistachs por la revisi n y correcci n del idioma Ingl s REFERENCIAS 1 Costa JM Heuv E Introduction The tomato crop and industry En Tomatoes Crop production science in horticulture series Ep Heuvelink ed CABI publisher 2005 Pp 1 19 2 Sikora RA Fern ndez E Nematode of vegetable In Plant parasite nematodo in subtropical and tropical agriculture Second Edition 2005 pp 319 392 3 G mez L Diagn stico de nematodos agalleros y pr cticas agron micas para el manejo de Meloidogyne incognita en la Producci n Protegida de Hortalizas Tesis en opci n al grado Cient fico de Doctor en Ciencias Agr colas Universidad Agraria de la Habana Cuba 2007 100pp 4 Rodr guez MG Fern ndez E Hidalgo D az L Cuadra R Draguiche JM et al Cuba two decades working on integrated nematode management in a
15. gricultural croping systems Jour Nematology 2014 46 2 227 228 5 Mart nez B Infante D Reyes Y Trichoderma spp y su funci n en el control de plagas en los cultivos Rev Protecci n Veg 2013 28 1 1 9 6 Sharon E Chet I Spiegel Y Trichoderma as biological control Agent En Biological Control of plant parasitic nematodes Building coherence between microbial ecology and molecular mechanisms Progress in Biological Control 11 K Davies and Y Speigel Eds DOI 10 100 7 978 1 4020 9648 8_8 Springer Science Business Media 2011 Pp 183 201 7 Pitcher RS Flegg JJM An improved final separation sieve for the extraction of plant parasitic nematodes from soil debris Nematologica 1968 14 123 127 8 Hussey RS Barker KB A comparison of methods for colleting inocula of Meloidogyne spp including a new technique Plant Disease Report 1973 57 1025 1028 9 Taylor AL Sasser JB Biology Identification and control of root knot nematodes Meloidogyne species 111 Dept Pl Pathol N C State Univ Raleigh 1978 10 Mart nez B Antagonismo de aislamientos de Trichoderma spp sobre algunos pat genos de ca a de az car Fitopatolog a 1998 33 4 207 211 11 Gonz lez I Infante D Mart nez B Arias Y Gonz lez N et al Inducci n de quitinasas y glucanasas en cepas de Trichoderma spp promisorias como agentes para el control biol gico Biotecnolog a Aplicada 2012 29 7 11 12 Bird A The structure of nemat
16. i n sobre los juveniles de M incognita mien tras que los filtrados de la cepa Ta 1 produjeron la menor mortalidad Las larvas muertas por la acci n de los filtrados de T asperellum presentaron deformaciones y rupturas en su cut cula as como vacuolas y desorganizaci n en el contenido interno 100 90 80 g 70 2 60 50 Oo 40 X 30 20 i 10 0 rn T T T T El 1 25 1 90 78 79 13 Cepas FIGURA 1 Mortalidad de juveniles de M incognita provo cada por de cepas cubanas de T asperellum en estudio in vitro Diluci n 1 50 EE 0 Mortality caused by Cuban T asperellum strains on M incognita juveniles in an in vitro assay La acci n de los filtrados provenientes de los culti vos de cepas de 7 asperellum sobre M incognita po dr a estar relacionado con las enzimas producidas por Trichoderma spp que son enzimas l ticas extracelulares fundamentalmente quitinasas glucanasas proteasas entre otras capaces de de gradar la pared celular de pat genos 10 La cepa Ta 90 produce quitinasas y f 1 3 glucanasas enzimas relacionadas con la degradaci n de la pared celular en los pat genos que desempe an una funci n esencial en el parasitismo 11 Debido a que la hipodermis de los nematodos es rica en gluc genos y l pidos 12 es posible que estas enzimas pudieran estar actuando sobre esta y otros tejidos de los juveniles y provocar la muerte de nematodos Este aspec
17. infecci n de huevos de nematodos se comprob por Saheban y Hadavi 13 en el ensayo de T harzianum sobre M javanica Es 143 FIGURA 2 Huevo de M incognita raza 2 parasitado por T asperellum cepa Ta 90 1000 aumentos Egg of M incognita race 2 parasitized by T asperellum Ta 90 strain 1000X tos autores se alaron que es posible que la penetra ci n en los huevos se produzca tambi n por la ac ci n de otras enzimas l ticas A partir de los resultados obtenidos en estos ensa yos in vitro se seleccion la cepa Ta 90 para llevar a cabo el estudio en condiciones semicontroladas pues evidenci la mayor mortalidad en juveniles y el parasi tismo de huevos de M incognita raza 2 Efecto de la cepa seleccionada de T asperellum sobre el desarrollo del tomate y la poblaci n de M incognita raza 2 Excepto en la longitud de ra z principal en el resto de los par metros evaluados se manifestaron diferen cias significativas entre los tratamientos Tabla 1 Las plantas con mayor altura fueron las del testigo absoluto y las que recibieron tratamiento con la cepa Ta 90 con diferencias significativas con las plantas parasitadas por los nematodos El mayor valor del di metro del tallo se produjo en las plantas tratadas con 7 asperellum mientas que el menor se present en las plantas inoculadas con M incognita sin dife rencias significativas con el resto de los tratamientos Las plantas tratadas con 7 asper
18. l semillero se utiliz una bandeja de polietileno con alveolos de dimensiones 100x30 cm Se us como sustrato suelo Ferralsol utrico esterilizado a vapor dos veces en autoclave 121C 1 h El sustrato despu s de la esterilizaci n tuvo un pH de 6 5 En cada alveolo se sembr una semilla de tomate de cv Cambell 28 y las plantas que emergieron permanecieron en la instalaci n a tempe ratura ambiente con riegos en d as alternos hasta su trasplante Se utilizaron macetas de 1kg de capacidad previa mente desinfectadas con NaOCI 2 horas El in culo de juveniles de M ingonita se extrajo de ra ces agalladas utilizando el m todo de Hussey y Barker 8 Se inocularon las macetas con 2 500 juveniles infestivos cada una para un nivel poblacional de 2 5 J 141 por cada gramo de suelo Transcurridas 72 horas de haber inoculado las macetas con los nematodos se aplic una suspensi n de la cepa seleccionada de 7 asperellum a una dosis de 10 UFC por maceta Las plantas de tomate se trasplantaron una por maceta transcurridas 48 horas de la inoculaci n del hongo Se utiliz un dise o completamente aleatorizado con siete r plicas macetas por cada tratamiento Estos fueron 1 testigo absoluto plantas de tomate sanas en macetas sin nematodos y sin aplicaci n de Trichoderma 2 plantas en macetas con nematodos 3 plantas en macetas tratadas con T asperellum 4 plantas en macetas inoculadas con nematodos y tra tadas co
19. los agentes de control biol gico de nematodos act an mejor sobre bajas pobla ciones Como en el ensayo in vitro esta cepa produjo mor talidad de 90 de los juveniles se evalu frente a un nivel poblacional alto de nematodos para determinar el Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 impacto de la misma aplicada luego de que el nematodo ya estuviera en el suelo como ocurre en las aplicaciones curativas En este ensayo con la aplica ci n de Ta 90 tambi n se produjo menor n mero de agallas aunque sin diferencias significativas lo que indica que el hongo parasit un porcentaje de juveni les antes que penetraran en las ra ces y produjeran m s agallas 16 En estudios posteriores con esta cepa se debe tomar en cuenta este aspecto y evaluar diferentes niveles poblacionales iniciales de M incognita as como los momentos de introducir el biorregulador al sistema de manera que se pueda es tablecer la efectividad t cnica del agente para el ma nejo de nematodos en forma ptima La aplicaci n de 7 asperellum cepa Ta 90 provoc una disminuci n en el n mero de huevos por hembras difiriendo significativamente con el testigo sin aplica ci n Fig 3 300 50 x So 00 S 50 gt THE 3 00 50 I o 1 2 3 4 5 Plantas Meloidogyne E Meloidogyne Trichoderma FIGURA 3 Efecto de T asperellum cepa Ta 90 sobre el n mero de huevos por hembra de M incognita raza 2
20. ma spp aun en presencia de Meloidogyne spp demostraron que al compararlo con el control sin tratar Trichoderma spp incrementa la masa de la ra z y el tallo del tomate y del tabaco hasta el 46 20 Entre los efectos positivos de la inoculaci n con Trichoderma se incluye la de mejorar la respuesta de las plantas ante el ataque de pat genos en la ra z contribuir a la solubilidad de los nutrientes del suelo y al aumento del desarrollo de las ra ces logrando una mayor formaci n de pelos radiculares y por consiguien te un enraizamiento m s profundo 21 No se encontraron diferencias significativas p lt 0 05 con relaci n al n mero de agallas por sistema radical entre los tratamientos 2 planta nematodos y 4 plan ta nematodos biorregulador no obstante se pro dujo una disminuci n en el n mero medio de agallas por ra z En el tratamiento con la aplicaci n de 7 asperellum cepa Ta 90 se disminuy el n mero de agallas por ra z en m s del 10 respecto a las plan tas no tratadas De igual modo no se encontraron di ferencias significativas en el ndice de agallamiento con 3 71 y 3 57 respectivamente Algunos factores pudieron actuar para que no se produjera una disminuci n marcada del ndice de agallamiento y del n mero de agallas con relaci n al testigo entre ellos aparecen que el n mero inicial de nematodos introducido en este estudio fue un nivel de reto y se se al que
21. n 7 asperellum Las plantas se mantuvieron durante 35 d as con riego manual en d as alternos y al final de este periodo se realizaron diferentes an lisis Se evaluaron a las plantas los par metros de desa rrollo altura de las plantas longitud de ra ces principa les di metro del tallo y masa fresca a rea y de ra ces La altura y longitud de ra ces se evaluaron con una cinta m trica Para establecer el di metro de los ta llos a nivel del cuello de la ra z se us un Pie de Rey Por su parte la masa se determin en una balanza t cnica electr nica marca KERNO e 0 01g9 Los valores de los par metros de desarrollo se so metieron a an lisis de varianza simple y las diferen cias entre las medias se establecieron a trav s del test de Tukey p lt 0 05 utilizando el paquete estad sti co SAS 9 0 Los sistemas radicales se analizaron despu s que se evaluaron los par metros de las plantas y para ello se tomaron dos plantas para los an lisis del hon go y cinco para los correspondientes a los nematodos Las ra ces de cada una de las plantas se lavaron cuidadosamente y se observaron en el microscopio estereosc pico STEMI DV4 Las pertenecientes a las plantas con los tratamientos 2 3 y 4 se ti eron con fuschina cida 0 05 al calor durante 30 segundos y se preservaron en placas Petri con lactofenol sin colo rante Se determinaron los par metros N mero de aga llas y se estableci el ndice de agallamient
22. o 9 El n mero de huevos producidos por hembra se determin en los tratamientos 2 y 4 y se tomaron al azar 10 hembras con sus ootecas de cada una de las cinco plantas Las ootecas se colocaron sobre portaobjetos en una gota de agua destilada y se les coloc un cubreobjeto Las l minas se observaron en microscopio ptico Zess con 200 aumentos y se cont el n mero de huevos por cada hembra Los datos se compararon mediante ANOVA simple y la diferencia entre las medias se estableci por la Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 142 Prueba de Tukey p lt 0 05 utilizando el paquete esta d stico SAS 9 0 Por otra parte las ra ces se lavaron con agua co rriente primero y agua destilada despu s para el an li sis micol gico Del tratamiento 4 se tomaron tres frag mentos de ra ces de tres mm de longitud cada uno por planta se sembraron as pticamente en placas de 90 mm de contentivas de medio papa dextrosa agar PDA Biocen y se incubaron a 30 C durante siete d as Se observ si se produjo o no crecimiento del hongo alrededor del fragmento de ra z Colonizaci n de ootecas por T asperellum se homogeneizaron las ra ces de las plantas de tomate de los tratamientos donde estaba presente T asperellum y los nematodos de estos setomaron 20 ootecas Se prepararon dos placas con medio de cul tivo agar agua m s antibi tico cloranfenicol 0 01 Se tomaron las ootecas se lavaron con
23. odes Academic Press New York and London 1971 318pp 13 Saheban N Hadavi N Biological control of the root knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum Soil Biology amp Biochemistry 2008 40 2 2016 2020 14 Infante D Mart nez B Gonz lez N Reyes Y Mecanismos de acci n de Trichoderma frente a hongos fitopat genos Rev Protecci n Veg 2009 24 1 14 21 15 Druzhinina IS Seidl Seiboth V Herrera Estrella A Horwitz BA Kenerley CM Monte E et al Trichoderma the genomics of opportunistic success Nature Reviews Microbiology 2011 9 749 759 16 Sharon E Chet I Viterbo A Parasitism of Trichoderma on Meloidogyne javanica and role of the gelatinous matrix Eur J Plant Pathology 2007 118 247 258 17 Hussey RS Williamson Valerie Physiological and molecular aspects of nematode parasitism Plant and nematode Interactions K Barker G Peterson G Windham Eds Agronomy Monograph No 36 Madison Wisconsin USA 1998 Pp 87 108 18 Ba os Y del Busto A Cruz R Irisley Aguiar Palomino Liudmila Efecto de enmiendas org nicas y Trichoderma spp en el manejo de Meloidogyne spp Rev Brasile a de Agroecolog a 2010 5 2 224 233 Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 19 T mea B r Stingli Ferenc T th The effect of trifender Trichoderma asperellum and the nematode trapping fungus Arthrobotrys oligospora Fresenius on the number of the northern root knot nematode
24. to debe ser objeto de investi gaciones futuras La actividad antag nica de Trichoderma depende m s del aislamiento y del hospedante que de la propia especie del biorregulador lo que se corrobor con los resultados obtenidos en el presente estudio donde hubo diferencias entre las cepas de T asperellum evalua das Esto ratifica la importancia de los estudios de selecci n de cepas que incluyan la evaluaci n de los filtrados de cultivos de cepas de Trichoderma y donde Rev Protecci n Veg Vol 30 No 2 Mayo ago 2015 139 147 se determinen posteriormente las enzimas involucradas en el proceso patog nico Este mecanismo conjuntamente con otros como la competencia por espacio y nutrientes micoparasitismo y desactivaci n de enzimas de los pat genos le permiten a Trichoderma ejercer su ac ci n como antagonista y ser colonizador de las ra ces pudiendo inducir resistencia en plantas 11 Es por ello que la multiplicidad de estos mecanismos en un aislamiento es una caracter stica importante para su selecci n como agente de control biol gico 13 Otro aspecto a tener presente es que las cepas nativas son m s efectivas que las importadas 5 14 En este estudio de la eficacia in vitro todas las cepas evaluadas fueron nativas lo que aporta mayor valor pr c tico al resultado en cuanto a su posibilidad de ser in troducidas en el manejo de M incognita Efecto paras tico de las cepas de T asperellum sobre M in
25. ukey p lt 0 05 del paquete estad stico SAS 9 0 Efecto paras tico de las cepas de T asperellum sobre M incognita Las cepas de 7 asperellum se cultivaron en placas de 70 mm 9 en medio de cultivo AM Biocen y se incubaron a 30 C y oscuridad por 72 h Despu s de este tiempo a las colonias obtenidas de cada cepa por separado se les adicionaron 5 ml de agua destila da est ril y se homogeneizaron con una esp tula de Drigalski Alas suspensiones obtenidas se les ajust la concentraci n de conidios a 10 UFC mlI En sicuracusas independientes que conten an 100ul de la suspensi n de conidios de cada cepa por separado se depositaron cinco ootecas de M incognita Despu s de 24h se colectaron los huevos de manera independiente con una esp tula y se pasa ron a placas de 30 mm de con agua est ril se agita ron suavemente para lavarlos y se colocaron sobre portaobjetos est riles en c maras h medas hasta 48 72h Pasado este tiempo se observaron al microsco pio ZEISS con 200 aumentos y una c mara CANNONO 4 6mpx acoplada al microscopio para determinar el parasitismo de huevos Efecto de una cepa seleccionada de T asperellum sobre el desarrollo del tomate y la poblaci n de M incognita El experimento se realiz en condiciones semicontroladas en aisladores biol gicos del CENSA y se us una cepa de 7 asperellum seleccionada por los resultados en los experimentos anteriores Para el establecimiento de
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