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1. AESKULISA AMA M2 G REF 3705 Manual de Instrucciones Contenido Utilizaci n Aplicaciones cl nicas y principio del ensayo Contenido del equipo Almacenamiento y caducidad Precauciones Toma de muestra manipulaci n y almacenamiento Procedimiento del ensayo Interpretaci n Cuantitativa y Cualitativa Datos t cnicos Datos de funcionamiento Bibliograf a Esquema de dispensaci n Procedimiento del test 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 1 Utilizaci n AESKULISA AMA M2 G es un enzimoinmunoensayo en fase s lida que emplea ant geno mitocondrial M2 nativo para la detecci n cuantitativa y cualitativa de anticuerpos contra M2 en suero humano El ensayo es una herramienta para el diagn stico de la cirrosis biliar primaria CBP 2 Aplicaci n cl nica y principio del ensayo La cirrosis biliar primaria CBP es una dolencia inflamatoria cr nica de los peque os y medianos conductos biliares y caracterizada serol gicamente por la presencia de autoanticuerpos M2 circulantes Los autoanticuerpos anti M2 pertenecen al grupo de los anticuerpos anti mitocondriales AMA La reacci n heterog neamente espec fica de los AMA del subtipo M2 est dirigida contra tres prote nas relacionadas del complejo a ceto cido deshidrogenasa que est localizado en la membrana mitocondrial interna El epitopo principal reconocido est localizado en la subunidad E2 y la prote na X del complejo piruvato deshidrogenasa2. Cut off Calibrator 4 Calibrador de cut off Opiak c op c AvridpacT pio Baduov punongc Positive Control Control Positivo OETIK G Op c EAEYXOU Negative Control Control Negativo ApvnTik g op g EAEYXOU 4 Calibrator 4 Calibrador Avtidpaotnpio Badnov unong Recovery 4 Recuperado Avaktnon 4 Conjugate Conjugado 9 2 Ceuya 4 Coated microtiter plate Microplaca sensibilizada ETTIKOAUJHJEVIN JIKPOTT KA 4 Coated pinplate 4 Pinplate sensibilizada 9 Ermikalupp vn Tr KA Pin Wash buffer Soluci n de lavado PuOLIOTIKO DIG M A TA ONS Substrate buffer Tampon sustrato PuBuIOTIK DIGAULA UTTOOTPWHATOG 4 Stop solution 4 Soluci n de parada Avtidpaotnpio dIAKoTING avTi paong 4 Sample buffer Tampon Muestras PuBpOTIK DIG ALLA dEIYN ATWV
3. REF7705 La correlacion La equivalencia de estos datos se evaluo tanto en AESKULISA 7705 como en AESKULISA 3705 con 49 sueros El an lisis de regresi n lineal de los dos productos mostr que ambos son equivalentes En estos sueros est incluidos los sueros 18 cerca del l mite AMA M2 G comparison 30 30 30 vs 30 15 15 300 l 250 200 w b 150 2 E a 100 50 0 0 50 100 150 200 250 300 30 30 30 U ml Pagina 6 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 10 3 Linealidad Se han analizado con este equipo sueros seleccionados y se encontr que deb an diluirse linealmente No obstante debido a la naturaleza heterog nea de los autoanticuerpos humanos pueden haber mue stras que no sigan esta regla concentraci n concentraci n Factor de medida esperada Recuperaci n diluci n U ml U ml 10 4 Precision Para determinar la precision del ensayo se valoro la variabilidad intra e inter ensayo a traves del analisis de su reproducibilidad en tres muestras de suero Estas muestras fueron seleccionadas para representar un rango por encima de la curva standard Intra Ensayo Inter Ensayo Media CV U ml 10 5 Calibraci n Debido a la no existencia de una calibraci n de referencia internacional este ensayo est calibrado en unidades arbitrarias U ml 11 Bibliograf a 1 Berg PA Klein R 1989 Heterogeneity of antimitochondrial antibodies Seminars in liver disease 9
4. PDC Adicionalmente los autoanticuerpos AMA M2 G reconocen las Ela y E1B subunidades del mismo complejo y la subunidad E2 de otros diversos complejos multienzim ticos como el complejo 2 oxo glutarato deshidrogenasa OGDC y la cadena bifurcada del complejo 2 oxo cido deshidrogenasa BCOADC La determinaci n de los AMA M2 G es una potente herramienta para el diagn stico de la CBP Principio del test Las muestras de suero diluidas 1 101 se incuban en la microplaca reve stida con el ant geno espec fico Los anticuerpos de los pacientes si est n presentes en la muestra se unen al ant geno La fracci n no unida es eli minada por el lavado en el paso siguiente Despu s las inmunoglobulinas anti humanas conjudagas con peroxidasa conjugado se incuban y reac cionan con el complejo ant geno anticuerpo de las muestras dentro de la microplaca El conjugado no unido es retirado a trav s del lavado en el paso siguiente La adici n del substrato TMB genera una reacci n colorim trica azul enzim tica que se detiene a trav s de cido diluido el color cambia a amarillo La tasa de formaci n de color por parte del crom geno va en funci n de la cantidad de conjugado unido al complejo antigeno anticuerpo y esto es proporcional a la concentraci n inicial de los respectivos anti cuerpos en la muestra del paciente P gina 1 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 3 Contenido del equipo Para ser reconstituido Tamp n
5. las mues tras de suero deben ser utilizadas inmediatamente Pueden guardarse bien cerradas a 2 8 C 35 46 F hasta tres d as o congelarse a 20 C 4 F para per odos m s largos P gina 3 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 7 Procedimiento del ensayo 7 1 Preparativos antes de dispensar Diluya los reactivos concentrados Diluya el tamp n de muestra concentrado a 1 5 con agua destilada p e 20 ml en 80 ml Diluya el tamp n de lavado concentrado a 1 50 con agua destilada p e 20 ml en 980 ml Muestras Diluya las muestras de suero a 1 101 con tamp n de muestra 1x p e 1000 ul tamp n de muestra 1x 10 ul suero Mezcle bien la diluci n Lavado Prepare 20 ml de tamp n de lavado diluido 1x para 8 pocillos o 200 ml para 96 pocillos p e 4 ml de concentrado en 196 ml de agua destilada Lavado autom tico Tenga en cuenta los vol menes de exceso requeridos para purgar el instrumento y el volumen muerto en el dispensador del aparato Lavado manual Descarte el l quido de los pocillos invertiendo la placa Golpee vigorosamente el marco con los micropocillos sobre papel absorbente limpio manteniendo la placa invertida Dispense 300 ul de tamp n de lavado diluido dentro de cada pocillo y espere 20 segundos Repita el procedimiento entero dos veces m s Microplacas Calcule el n mero de pocillos necesarios para el ensayo Saque los pocillos no utlizados del marco p ngalos de nuevo en la bolsa de pl stico suminist
6. m xima seguridad Recomendaciones y precauciones Este equipo contiene componentes potencialmente peligrosos Aunque los reactivos del equipo no est n clasificados como irritantes de los ojos y la piel recomendamos evitar el contacto de los mismos con los ojos y con la piel y utilizar guantes desechables AVISO Los calibradores controles y agentes contienen zida de sodio NaN como conservante El NaN puede ser t xico si se ingiere o se absorbe por medio de la piel o de los ojos El NaN puede reaccionar con la fontaner a de plomo y de cobre y formar zida met lica muy explosiva Al tirar tirarla deje correr una gran cantidad de agua para evitar que la zida tome consistencia Por favor consulte los procesos de descontaminaci n del CDC u otras directrices locales o nacionales No fume coma o beba mientras manipule el equipo No pipetee con la boca Todo el material de fuente humana utilizado en algunos reactivos de este equipo por ejemplo con troles standards ha sido analizado a trav s de m todos aprobados y ha resultado ser negativo para HbsAg Hepatitis C y HIV 1 No obstante ning n test puede completamente garantizar la ausencia de agentes virales en ese tipo de material Por lo tanto manipule los controles standards y muestras de los pacientes como si se trataran de aut nticos transmisores de enfermedades infecciosas y seg n los requerimientos de manipulaci n de su pais 5 2 Instrucciones generales para la utilizac
7. 103 116 2 Berg P A Klein R Lindenborn Fotinos J Kl ppel G 1982 ATPase associated antigen M2 marker antigen for serological diagnosis of primary biliary cirrhosis Lancet 2 1423 1426 3 Manns M Meyer zum Buschenfelde K H 1989 Prim re bili re Zirrhose In Hepatologie und Praxis Meyer zum B schenfelde K H Arnold W H ttenrothTH eds Georg Thieme Verlag stuttgart New York 350 358 4 Coppel RL Gershwin ME 1995 Primary biliary cirrhosis The molecule and the mimic Immunological Reviews 44 17 49 P gina 7 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G ANEXO A Esquema de dispensaci n Se sugiere dispensar los calibradores controles y muestras como sigue Para una interpretaci n cuantitativa utilice calibradores para establecer una curva standard Para una interpretaci n cualitativa utilice el calibradore cut off for quantitative interpretation use cali for qualitative interpretation use cut brators to establish a standard curve off calibrator MN fa hB ja s je 7 ja jo jo 1 f12 A caa cae Pt Inc fp B caa cae P1 el cap car P2 cc ps tst E caciPo ps pc se 1 lt E E ssi s H CalD NC CalA calibrator A CalB calibrator B CalC calibrator C CalD calibrator D CalE calibrator E CalF calibrator F PC positive control NC negative control CC Cut off calibrator P1 patient 1 P2 patient 2 P3 patient
8. 3 Pagina 8 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G Anexo B Procedimiento del test Samples 1 101 Controls 1 0 100 ul 3x 300ul P gina 9 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G LTLT96 YEL9 6Y XP A OLT96 VEL9 6Y 9U0Yg Aueunsn Z SUNA UMIOJODHA urt us puoAA FETSS HAWD SOLLSONOVIG AMSAV H D H H 9 y Cl Il Ol 6 8 L 9 r E I uu SOUR N JJ1199S19 U 9 MIBUSIS uum Z Do do Imyeladulo amjelodua WML 218 urtu I QNxU uoneqnou S9 BSSY e e Ole lt CIS FHF 010 CIS GIS lt 010 010 lt 010 O FIO SF 010 CIS GIS CIS 010 4 4 Diagnosi in vitro Pour diagnostic in vitro In Vitro Diagnostikum Para uso Diagn stico in vitro Numero d ordine R f rence Catalogue Bestellnummer N mero de cat logo Descrizione lotto Lot Chargen Bezeichnung Lote Conformit europea D claration CE de Conformit Europ ische Konformit t D clarac o CE de Conformidade 96 determinazioni 96 tests 96 Bestimmungen 96 Testes Rispettare le istruzioni per luso Voir les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten Ver as instruc es de uso Da utilizzarsi entro Utilise avant le Verwendbar bis Utilizar antes de Conservare a 2 8 C Conserver a 2 8 C Lagerung bei 2 8 C Conservar entre 2 8 C Prodotto da Fabriqu par Hergestellt von Fabricado por Cali
9. bratore cut off Etalon Seuil Grenzwert Kalibrator Calibrador de cut off Controllo positivo Contr le Positif Positiv Kontrolle Controlo positivo Controllo negativo Contr le N gatif Negativ Kontrolle Controlo negativo Calibratore Etalon Kalibrator Calibrador Recupero Corr lation Wiederfindung Recuperacao Coniugato Conjug Konjugat Conjugado Micropiastra rivestita Microplaque sensibilis e Beschichtete Mikrotiterplatte Microplaca revestida Piastra ad aghi rivestita Pinplate sensibilis e Beschichtete Pinplatte Pinplate revestida Tampone di lavaggio Tampon de Lavage Waschpuffer Soluc o de lavagem Tampone substrato Substrat Substratpuffer Substrato Reagente bloccante Solution d Arr t Stopreagenz Soluc o de paragem Tampone campione Tampon Echantillons Probenpuffer Diluente de amostra For in vitro diagnostic use Para uso diagn stico in vitro In Vitro Alayvworik ECO 4 Cataloge number Numero de cat logo Api6udc Trapayyediac 4 Lot 4 Lote XapakTnpIon g TrapTidag EC Declaration of Conformity Declaraci n CE de Conformidad EupuTroik ouupwvia 4 96 tests 96 pruebas 96 Trpoo liopiouo See instructions for use Ver las instrucciones de uso M fete UTT WN TIG odnyleg xp on Use by Utilizar antes de Xp on p xpl 4 Store at 2 8 C 35 46 F Conservar a 2 8 C DuAdooETal orou 2 8 C Manufactured by Fabricado por KaraokKEUATETAI OTTO
10. de Muestra 5x 1 vial 20 ml concentrado 5x tap n blanco soluci n amarilla Contiene Tris NaCl BSA azida s dica lt 0 1 conservante Tampon de Lavado 50x 1 vial 20 ml concentrado 50x tap n blanco soluci n verde Contiene Tris NaCl Tween 20 azida s dica lt 0 1 conservante Listo para el uso Control Negativo 1 vial 1 5 ml tap n verde soluci n incolora Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Control Positivo 1 vial 1 5 ml tap n rojo soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradore Cut off 1 vial 1 5 ml tap n azul soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Calibradores 6 viales 1 5 ml cada uno 0 3 10 30 100 300 U ml el color aumenta con la concentraci n soluci n amarilla Contiene Suero humano diluido azida s dica lt 0 1 conservante Conjugado 1 vial 15 ml IgG tap n azul soluci n azul Contiene Inmunoglobulinas anti humanas conjugadas con peroxidasa Substrato TMB 1 vial 15 ml tap n negro Contiene TMB H202 estabilizado Soluci n de Paro 1 vial 15 ml tap n blanco soluci n incolora Contiene cido Clorh drico 1M Placa Microtiter 12x8 tiras rompibles de pocillos Revestimiento ver p rrafo 1 Material necesario pero no suministrado Filtro de lectura de 450 nm del lector de tiras microtiter y filtro de refe
11. do la densidad ptica DO de cada calibrador eje y con respecto a los correspondientes valores de concentraci n en U ml eje x Para unos mejores resultados recomendamos coordenadas log lin y un ajuste a 4 PL Partiendo de la DO de cada muestra lea la correspondiente concentraci n de anticuerpo expresada en U ml Rango Normal Indeterminado Resultados Positivos lt 12 U ml 12 18 U ml gt 18 U ml Ejemplo de curva standard Recomendamos dispensar los calibradores en paralelo para cada tanda Calibradores IgG DO 450 620 nm CV Variaci n 0 Um 0 032 3 Um 0 152 10 U ml 300 U ml 2 104 1 6 Ejemplo de c lculo Paciente Replicado DO Media DO Resultado U ml 0 794 0 792 0 793 1 453 1 477 1 465 135 8 Para conocer los datos espec ficos de lote consulte el documento adjunto de control de calidad Los laboratorios deber an realizar un Control de Calidad interno utilizando controles propios y o un pool de sueros interno tal y como contemplan las regulaciones de la UE No utilice este ejemplo para interpretar resultados de los pacientes Cada laboratorio deber a establecer su rango normal propio basado en sus propias t cnicas contro les equipamiento y poblaci n seg n sus propios procedimientos establecidos Para la interpretaci n cualitativa lea la densidad ptica del calibrador cut off y la de las muestras de los pacientes Compare las DO de los pacientes con la DO del calibrad
12. i n No mezcle o sustituya reactivos o microplacas de n meros de lote diferentes Esto podr a llevar a una variaci n de los resultados Deje que todos los componentes alcancen la temperatura 20 32 C 68 89 6 F antes de utilizarlos Ag telos bien y siga el esquema de incubaci n recomendado para una ptima realizaci n del ensayo Incubaci n se recomienda realizar las pruebas a 30 C 86 F para sistemas automatizados No exponga nunca los componentes a temperaturas m s altas de 37 C 98 6 F Pipetee siempre la soluci n de substrato con puntas nuevas Protega este reactivo de la luz Nunca pipetee el conjugado con puntas previamente utilizadas con otros reactivos Un diagn stico cl nico definitivo no debe estar basado solamente en los resultados del ensayo realizado Debe ser elaborado por el m dico despu s de haber evaluado todos los hallazgos cl nicos y de laboratorio Es necesario verificar el diagn stico por medio de distintos m todos 6 Toma manipulaci n y almacenamiento de las muestras Utilice preferentemente muestras de suero reci n extra das La extracci n de sangre debe seguir los requerimientos de protocolo de su pa s No utilice muestras ictericas lip micas hemolizadas o contaminadas por bacterias Los sueros con part culas deben ser purificados por centrifugaci n a baja velocidad lt 1000 x g Las muestras de sangre deben ser recogidas en tubos limpios secos y vacios Despu s de la separaci n
13. or cut off Para la interpreta ci n cualitativa recomendamos que establezca un rango del 20 al rededor del valor del cut off como zona indeterminada Todas las muestras que tengan DO superior a este rango se consideran positivas y las muestras con valores de DO inferiores a este rango se consideran negativas Negativo DO paciente s 0 8 x DOcut off Indeterminado 0 8 x DO ut orr lt DO patient lt 1 2 x DOcut of Positivo DO paciente gt 1 2 x DO cut off P gina 5 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 9 Datos T cnicos Muestra suero Volumen de muestra 10 ul de muestra diluida a 1 101 con tamp n de muestra 1x Tiempo total de incubaci n 90 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Rango de calibraci n 0 300 U ml Sensibilidad anal tica 1 0 U ml Almacenamiento a 2 8 C 35 46 F utilice solo los viales originales Numero de determinaciones 96 tests 10 Datos de funcionamiento 10 1 Sensibilidad analitica La prueba del agente de muestra 30 veces en AESKULISA AMA M2 G REF 7 705 produjo una sen sibilidad analitica de 1 0 U ml 10 2 Especificidad y Sensibilidad La microplaca esta revestida con antigeno mitocondrial M2 elevadamente purificado No se encon traron reactividades cruzadas con otros autoantigenos Los anticuerpos anti M2 han sido mostrados como especificos para el diagnostico de la CBP Berg et al 1982 y se encontraron en el 96 de los pacientes con CBP Los datos se obtuvieron con AESKULISA AMA M2 G
14. rada junto con el desecante y s llela bien 2 8 C 35 46 F 7 2 Esquema de trabajo Vea Anexo A para el esquema de dispensaci n vea Anexo B para el procedimiento Recomendamos la medici n de pipeta de las muestras y calibradores por duplicado El Calibrador Cut off es solamente para uso en las pruebas cualitativas e Dispense 100 ul de cada suero diluido de paciente dentro del pocillo correspondiente Dispense 100 ul de los calibratores O calibradore cut off y controles positivo y negativo dentro de los pocillos designados Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de conjugado dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura 20 32 C 68 89 6 F Lave 3x con 300 ul de tamp n de lavado diluido 1 50 Dispense 100 ul de substrato TMB dentro de cada pocillo Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente 20 32 C 68 89 6 F protegido de la luz directa Dispense 100 ul de soluci n de paro dentro de cada pocillo siguiendo el mismo orden de pocillos que cuando dispens el substrato Incube un m nimo de 5 minutos Agite la placa cuidadosamente durante 5 segundos Lea la absorbancia a 450 nm opcionalmente a 450 620 nm dentro de los 30 minutos siguientes P gina 4 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 8 Interpretaci n Cuantitativa y Cualitativa Para una interpretaci n cuantitativa establezca la curva standard trazan
15. rencia opcional de 620 nm 600 690 nm Equipo de cristal cilindro 100 1000ml tubos de ensayo para disoluciones Mezclador espiral pipetas de precisi n 10 100 200 500 1000 ul o pipeta multiple ajustable 100 1000ul Dispositivo de lavado de la microplaca pipeta de repetici n o microcanal de 300 ul o sistema automatizado papel absorbente Nuestras pruebas se han dise ado para el uso con agua destilada seg n la definici n de la farmaco pea de los Estados Unidos USP 26 NF 21 y la europea Eur Ph 4 ed 4 Almacenamiento y Caducidad Guarde todos los reactivos y la microplaca a 2 8 C 35 46 F en sus envases originales Una vez preparadas las soluciones reconstituidas son estables durante 1 mes a 4 C por lo menos Los reactivos y la microplaca deben ser utilizados solamente dentro del margen de caducidad indicado en cada componente Evite la exposici n de la soluci n TMB a la luz intensa Guarde las microplacas en su sobre correspondiente incluyendo el desecante y s llelo bien P gina 2 de 9 002 2007 08 28 REF 3705 AMA M2 G 5 Precauciones 5 1 Datos de riesgo para la salud ESTE PRODUCTO ES SOLO PARA EL USO EN DIAGN STICO IN VITRO Por lo tanto solamente el personal formado y especialmente asesorado en los m todos de diagn stico in vitro puede realizar el ensayo Aunque no se considera este producto como particularmente t xico o peligroso en condiciones de uso normales rem tase a lo siguiente para una
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