Anyplex TM II STI-7 Detection (V1.1)
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1. 29 INFORMACI N DE PEDIDO Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 NOTIFICACIONES El usuario siempre deber poner atenci n a lo siguiente Este producto se puede utilizar con prop sitos de diagn stico in vitro IVD In Vitro Diagnostics en UE dado que la marca IVD CE est aprobada por la Directiva UE 98 79 Los tipos de muestras aplicables son orina hisopados uretrales vaginales y cervicales y muestras de citolog a en base l quida Esta prueba no se ha validado para otro tipo de muestras Las muestras de ADN deben almacenarse a 70 C hasta su uso y mantener hielo durante el uso La sensibilidad del ensayo puede disminuir en muestras que son repetidamente congeladas y descongeladas o almacenadas por largos periodos de tiempo La confiabilidad de los resultados depende de la recolecci n adecuada de la muestra el transporte almacenamiento y procesamiento Siempre use guantes desechables en cada rea y c mbielos antes de ingresar a las diferentes reas Cambie los guantes inmediatamente si se contaminan o tr telos con reactivo DNA decontaminante Dedicar suministros y equipo a las reas de trabajo separadas y no moverlos de un rea a otra No pipetee con la boca No coma beba o fume en las reas de trabajo del laboratorio Use guantes desechables libres de polvo bata de laboratorio y gafas protectoras cuando manipule muestras y reactivos Lave las manos desp2. FAM FAM FAM FAM FAM FAM HEX HEX HEX HEX HEX HEX HEX HEX Hi Cal Red 610 Cal Red 610 610 610 CalRed610 CalRed610 Cal Red 610 610 r 6 Quasar 670 Quasar 670 Quasar 670 Quasar 670 Quasar 670 Quasar 670 Quasar 670 Fig 6 Plate Setup 8 Haga clic en OK y guarde la nueva placa agregada al archivo 9 Se abrir la ventana de Experiment Setup FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 Fig 7 Experiment Setup Plate O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 C Inicio del ensayo 1 En Experiment Setup Start Run haga clic en Close Lid para cerrar la tapa del equipo File View User T View User ook Windows Z e a 2 Experiment Setup Optio ptions ip Protocol ig gt Statt Run Run information Protocol Prueba protocolo prci Plate Prueba placa pltd Notes Scan Mode Al Channels Start Run on Selected Block MEA 3 wor z Fig 8 Close Lid 2 Haga clic en Start Run 3 Guarde el archivo del ensayo en la carpeta que usted designe Llene en el archivo el nombre y de click en SAVE y la m quina dar inicio 1 2 An lisis de datos A Crear una carpeta espec fica para guardar los datos DATA Para salvar los datos de cada punto de resultados del archivo cree tres carpetas 2 El nombre de la carpeta por guardar del primer punto de fusi n es 1 el nombre de la segunda carpeta es
3. DESEMPE O 1 Especificidad La alta especificidad del kit Anyplex II STI 7 est garantizada por los cebadores espec ficamente dise ados para los objetivos de inter s y las condiciones de reacci n Anyplex STI 7 ha sido probado para reactividad cruzada en 69 diferentes pat genos Strain No ATCC ole B ATCC Chlamydia trachomatis Arcc Chlamydia trachomatis serotype C ATCC Chlamydia trachomatis serotype D mydia frachomaltis serotype E Chlamydia frachomatis serotype F Chlamydia trachomatis serotype GJ Chlamydia trachomatrs serotype H Chlamydia frachomal s serofype a t T ATCC ATCC Eymphograunoma Venereum LGV 1 ATCC Lymphograunoma Venereum LGV M L pep Venereurm LGV ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC KCCM 11423 ATCC 102310 5 KCTC 17427 ATCC 369090 C Seegene Anyplex II STI 7 Detection V1 1 ATSC 23715 Not Cirieciod verificar la veracidad de los resultados el experimento fue repetido tres veces O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 2 Sensibilidad Para determinar la sensibilidad de la prueba Anyplex STI 7 Detection se hicieron diluciones seriadas est ndar de 10 a 10 copias de ADN objetivo clonado por reacci n y fue analizado con
4. el agitador v rtex e Siga el protocolo del fabricante Hisopados e Equilibrar las muestras a temperatura ambiente 19 25 e Los hisopos colectados en medio de transporte deben ser homogenizados con el agitador v rtex e Las tapas de los tubos de muestra deben ser removidas cuidadosamente para evitar contaminaciones Presione el hisopo y el moco contra la pared del tubo para drenar el l quido Posteriormente descarte el hisopo y el moco e Centrifugue la muestra durante 10 minutos a 5 000 x g 7500 rpm e Descarte el sobrenadante Re suspenda el pellet en 1 000 uL de PBS 1X en v rtex e ome el volumen recomendado seg n el protocolo del fabricante Muestras de citolog a en base l quida e Equilibre las muestras a temperatura ambiente 19 25 C e Centrifugue 1 mL de la muestra de citolog a en base l quida durante 15 minutos 15 000 x g 13000 rpm Descarte el sobrenadante Despu s resuspender el volumen recomendado en PBS 1X y mezclar en el v rtex oiga el protocolo del fabricante O Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 B Control Interno El control Interno STI 7 IC se incluye en el kit Esto le permite al usuario monitorear el procedimiento de aislamiento de cidos nucleicos y la posibilidad de inhibici n de la PCR e Agregar 10 uL de STI 7 IC a cada mezcla de la soluci n de muestra y buffer de lisis o directamente al buffer de lisis Nota En el caso de adicionarlo directam
5. Blaylock MW Musatovova O Baseman JG and Baseman JB 2004 Determination of Infectious Load of Mycoplasma Genitalium in Clinical Samples of Human Vaginal Cells JCM 42 2 746 52 Hamasuna H Osada Y and Jensen JS 2005 Antibiotic Susceptibility Testing of Mycoplasma genitalium by TagMan 5 Nucloease Real Time PCR Antimicrob Agents Chemoter 49 12 4993 8 Vinayagamoorthy T Mulatz K and Hodkinson R 2003 Nucleotide Sequence Based Multitarget Identification JCM 41 7 3284 92 Chun Y and Yin ZD 1998 Glycogen Assay for Diagnosis of Female Genital Chalmydia trachomatis Infection JCM 36 4 1081 2 O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 SIMBOLOG A Explicaci n de los s mbolos utilizados en las etiquetas y el manual Simbolo Para Diagn stico in vitro N mero de Lote N mero de cat logo Fecha de vencimiento Temperatura de Almacenamiento d Precauci n k Mezcla de oligonucleotidos para amplificaci n y detecci n WATER Agua libre de Rnasas Mezcla Maestra para PCR Anyplex M ee ee Fecha de fabricaci n O Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 INFORMACI N DE PEDIDO Cat logo Producto Tama o Serie Anyplex STI SD7700Y Anyplex Il STI 7 Detection gt b gt 50rxns SD7200Y Anyplex CT NG Real time Detection b5O0rmns SD7201Y Anyplex TV MH Real time Detection bO0rmmns SD7300Y MG UU UP Real tim
6. Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 TM T Anyplex STI 7 Detection V1 1 Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 C2 Seegene Anyplex V n STI 7 Detection V1 1 Sistema de PCR Anyplex II para la detecci n de Chlamydia trachomatis CT Neisseria gonorrhoeae NG Mycoplasma genitalium MG Mycoplasma hominis MH Ureaplasma urealyticum UU Ureaplasma parvum UP y Trichomonas vaginalis TV a partir de muestras de orina hisopados uretral vaginal y de cuello uterino y citolog as en base l quida Para su uso con el 1 Sistema de PCR Tiempo real CFX 96 Bio Rad IVD Uso para Diagnostico In Vitro C Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 TABLA DE CONTENIDOS NOTIICAGIONES u 0 X 3 VSO PREVIS TO u u nies 4 PRINCIPIOS Y DESCRIPCI N GENERAL DEL PROCEDIMIENTO 4 ANTECEDENTES said 6 REACTIVOS 7 MANEJO Y ALMACENAMIENTTO U 8 MATERIAL REQUERIDO NO INCLUI DO PROTOCOLO enredo 10 PROGRAMACI N DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y AN LISIS DE RESULTADOS 16 SOLUCI N DE PROBLEMAG 0ccccccccccccceeeeseeceseeeeeeeeueueeeeeuseeveneueuenaeeeenas 27 DANO Ta rns snas aene rad sanas senden REFERENCIAS rama 28 SIMBOLOG A
7. oo Ra pli vas Ces aum sie Rus Cani a Fo cm ren Fig 13 Archivos de resultados exportados O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 6 Regrese al paso 3 y seleccione el paso n mero 14 Repita los pasos 4 y 5 y guarde los datos en la carpeta 2 Luego vuela al paso y seleccione el paso n mero 20 Repita los pasos 4 y 5 y guarde los datos en la carpeta 3 Los datos de cada paso es guardado como se muestra a continuaci n Numero de paso Carpeta designada 8 1 14 2 20 3 B Ajustes para el an lisis de datos en el Seegene Viewer 1 Abra en pantalla el programa Seegene Viewer haga clic en Open para encontrar los archivos guardados dari Curve Mat 12 ves rf atto Sax O Well Sampie No Patient 14 OOOOO OOOO OOO0O0O0O0C LAL LAA fw LAVA OO Vara LACS LAV Ve Sl il Fig 14 Seegene viewer 2 Despu s de abrir el archivo de resultados 1 Seleccione los pocillos de las muestras 2 Haga clic en la columna Men y seleccione la prueba realizada de las opciones de la lista 3 Haga clic en Apply para obtener el resultado final Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 ip NI VIE 11 T 1 TH mmu PA Djs dada J 1 60 2222 4
8. urealyticum UU U parvum UP T vaginalis TV y el Control Interno Internal Control IC La eficiencia en un ensayo de PCR se ve reducida por inhibidores que pueden estar presentes en las muestras cl nicas Debido a lo anterior se ha incorporado un control interno IC al producto para que funcione como un control ex geno global con el fin de monitorear el proceso de aislamiento de cidos nucleicos y para verificar una posible inhibici n de la PCR El control interno es co amplificado junto al material gen tico de las muestras cl nicas Adem s se utiliza el Uracil DNA glicosilasa UDG para evitar la mutag nesis por eliminaci n del uracil de las mol culas de ADN por escisi n del N glicosilico unido e inicia la v a de reparaci n por escisi n de base VER Este sistema es usado para el control de la contaminaci n cruzada de la muestra con amplicones Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 2 Procedimiento Muestra Orina hisopados uretrales vaginales y citolog as en base Aislamiento de cidos nucleicos cidos nucleicos Amplificaci n y detecci n mediante el Sistema Anyplex II An lisis de Resultados lt Procedimiento general con el kit Anyplex II STI 7 Detection gt O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 ANTECEDENTES C trachomatis N gonorrhoeae y T vaginalis son los 3 principales pat genos de Enfermedades de Transmisi n Sexual Sexual Transmision Diseases STD En l
9. 2 y el tercer nombre es 3 B Pre ajustes para el an lisis de datos en el CFX 96 1 Despu s del ensayo haga clic en la pesta a Melt curve para confirmar los resultados de los picos de las curvas H Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 Elie Wow geinas Toole f eg A Uds Pinta Group Al sola Cil Poa Ctrl Pes Cul Pea Cul Cul Heg ctl Fes Chl Poa Chi Fes cul Pea Cul Fea Em Compad Ste All Charla Plata Type BA Vihe Anlass mos Core Fr z e m Fig 9 Resultados de los picos de las curvas de disociaci n 2 Seleccione solo Quasar 670 el umbral de pico de fusi n debe ser ajustado a cero Eh orga O Ae aa Gi e gt Pas koa j r amp Le dM Fux Cmn F oem E rm A U LIE ax iac AE ST aD Ta a qum Fal Cq 57 7 Fr rr FEA AA mm 4 RR TRU IE Samm ET ing E TE m Tama dm a 8 E A e E 1 cue SS Ca Eg con an bce lk Cra oae t oe vacua Fira Cad 3 De click en el paso n mero 8 y seleccione Export All Data Sheets to Excel
10. 670 no es requerida para resultados positivos T tulos elevados de otros analitos pueden conducir a una reducci n o ausencia de la se al del Control Interno Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 1 4 Aplicaci n a Muestras Cl nicas lt Muestra 1 gt Pico de fusion 1ro primer punto CMTA Well Info Peak HEX Cal Red 610 Quasar 670 Ist 2nd 3 60 IC rn FAM A HEX Cal Red 610 20 7 A Lal y V Quasar 670 0 3 58 60 62 64 66 68 70 72 74 726 78 80 82 84 Temp Pico de fusion 2do Segundo punto CMTA Well Info Melt Peak Fam HEX Cal Red 610 Quasar 6701 1st 2 nd 3 rd h 250 200 FAM 150 HEX ce 100 Cal Red 610 T 50 Quasar 670 0 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 Temp Pico de fusion 3ro Tercer punto CMTA Well Info Melt Peak HEX Cal Red 610 Quasar 6701 List fend 280 FAM 210 HEX E 140 Cal Red 610 T Quasar 570 Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 lt Muestra 2 gt Pico de fusion 1ro primer punto CMTA Well Info Melt Peak FAM HEX Cal Red 510 Quasar 670 Tst 2nd CT 300 m FAM 200 Tu 100 Cal Red 610 N T an Quasar 670 58 60 62 64 66 68 0 72 4 76 78 80 82 84 Temp Pico de fusi
11. N gonorrhoeae NG M genitalium MG M hominis MH U urealyticum UU U parvum UP y T vaginalis TV a partir de muestras de orina hisopados uretrales vaginales y cervicales y citolog as en base l quida PRINCIPIOS Y DESCRIPCI N GENERAL DEL PROCEDIMIENTO 1 Principios La prueba de detecci n STI 7 de Anyplex Il es representativa de la tecnolog a de Seegene y est basada en la nueva tecnolog a TOCE la cual permite detectar m ltiples pat genos en un solo canal de fluorescencia en los instrumentos para PCR en tiempo real En los ensayos de curvas de disociaci n actuales se observan con frecuencia diferencias de temperatura entre los ADN que muestran una gran variaci n en sus secuencias lo que resulta problem tico en el rea de diagn stico cl nico donde es cr tica la exactitud y reproducibilidad de las pruebas No obstante la tecnolog a TOCE est dise ada para no verse afectada por variaciones en la secuencia por lo tanto garantiza valores de Tm consistentes La prueba de detecci n STI 7 de Anyplex Il representa una nueva clase de prueba molecular por CMTA c clico que es un un multiplexado Este m todo puede discriminar m s pat genos en muestras co infectadas El Anyplex Il es un ensayo de PCR multiplex en tiempo real que permite la amplificaci n detecci n y diferenciaci n simult nea del material gen tico de C trachomatis CT N gonorrhoeae NG M genitalium MG M hominis MH U
12. el menu Tools ge Deum Iw El D NL rre ruas 2 F sae MA kamas Mira Ciri Cun Chl 8102 8 Kar Sana Mi Gir EA rama Elan MP Mas Ciri MP EET D a i p a Corm Dl a qe 5ak him md cnm P Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 VI FAM V MEX 00 60 7 Quas 670 Ix e 9 gt i Scan Mode Channels Plate Type BR White Analysis Mode Baseline Subtracted Curve Fit Fig 11 Exports All Data Sheets to Excel 3 Guarde los resultados de la carpeta 1 cuando una nueva ventana se abra AO a m gue one f T 2 N a E u ee asi 1 m as s o Pe im A a EDD r NR ween w ME fete k t a cmt cure ME unrm WX ra pa E Lu verre k be E fre ta K ue 4 gt sm feta cw bra eres Hum chee s tents b om I Fig 12 todos los datos en hojas de c lculo en el an lisis de datos de la carpeta designada 5 Verifique que los resultados se guardaron en la ubicaci n designada w
13. las instrucciones del fabricante para la toma de muestras cervicales en los medios ThinPrep y SurePath O Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 B Almacenamiento de muestras La sensibilidad de un ensayo puede disminuir si las muestras son congeladas y descongeladas rutinariamente durante per odos de tiempo prolongados M r rin Las muestras de orina pueden ser almacenadas a temperatura ambiente 19 23 C si la prueba se llevar a cabo en las siguientes 24 horas Puede guardar las muestras hasta 7 d as a 2 8 C Hisopados e Los hisopos pueden almacenarse a 2 8 C hasta 7 d as si se procesar n Inmediatamente despu s de la toma de muestra Muestr itolog a en l qui Las muestras de c lulas cervicales recolectadas en ThinPrep como medio de transporte pueden almacenarse 2 8 C hasta 6 semanas Las recolectadas SurePath pueden almacenarse a 2 8 C hasta 2 semanas si no se inmediatamente despu s de la toma de muestra C Transporte de muestras Para garantizar una alta calidad de la muestra se deben ser transportadas tan pronto como sea posible en la temperatura indicada Muestras de Orina e Las muestras de orina pueden almacenarse a 2 8 C hasta su procesamiento Aseg rese de conocer todas las regulaciones locales nacionales e instrucciones de laboratorio relevantes con respecto al transporte de materiales etiol gicos Hisopados Los hisop
14. 2 5 IN ect aq cae T Fig 15 Ajustes para el an lisis de datos en el Seegene viewer 3 Verifique el resultado en cada pozo A cmd dnt o l Ml u w tet cm as o A cM y a u Pn 9 o oe y m o sse 04 Fig 16 Resultados de la prueba en el CFX 96 mediante el Seegene viewer O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 RESULTADOS 1 Informaci n del analito Fluorophore Anyplex 1 STI 7 Detection gt pr E FAM w Temperature MG MH Hm mji HEX Temperature NG CT Red 610 w E ili Quasar 670 E E Temperature O Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 2 Interpretaci n de Resultados Resultado Control Interno CG O AS NS ADN de objetivo no detectado 0 Inv lido Se al d bil o negativa del control interno es indicativa de una toma de muestra inadecuada o errores en el procedimiento o presencia de inhibidores Resultados Interpretaci n Procese otra al cuota de la muestra original y repita la prueba cyclic CMTA cyclic Catcher Melting Temperature Analysis First CMTA point second CMTA point Third CMTA point e El control Interno y otras se ales no observadas ver Soluci n de Problemas TROUBLESHOOTING La detecci n del Control Interno IC en el canal de detecci n del Quasar
15. ados deber n transportarse a 2 8 C despu s de la toma de muestra y forma previa al traslado al laboratorio e Aseg rese de conocer todas las regulaciones locales nacionales e instrucciones de laboratorio relevantes con respecto al transporte de materiales etiol gicos Muestras de citolog a en base l quida e Embalar las muestras cuidadosamente para prevenir fugas y rupturas e Las muestras deben transportarse en frio e Las muestras deben ser llevadas al laboratorio lo m s pronto posible despu s de la recolecci n siguiendo las instrucciones de transporte Deben cumplir con las instrucciones locales y nacionales para el transporte de material pat geno O Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 2 Aislamiento de cidos Nucleicos Diversos fabricantes ofrecen kits para aislamiento de cidos nucleicos La cantidad de muestra resultante puede variar dependiendo del protocolo utilizado Los siguientes kits de aislamiento han sido validados para su uso con este kit A Pre tratamiento de la muestra Nota el proceso de pre tratamiento de la muestra para extraer cidos nucleicos es el mismo entre los diferentes kits de sistemas purificaci n automatizados SEEPREP12 MICROLAB Nimbus IVD MICROLAB STARlet M r rin e Equilibrar las muestras a temperatura ambiente 19 23 C e Centrifugar 1 mL de la muestra de orina por 15 minutos a 15 000 x g 13000 rpm e Descartar el sobrenadante Re suspenda PBS 1X
16. as mujeres C trachomatis ocasiona cervicitis uretritis endometritis y salpingitis Una infecci n cr nica con C trachomatis puede resultar en cicatrizaci n de las trompas de Falopio infertilidad y embarazo ect pico N gonorrhoeae es el agente causal de la gonorrea y sin tratamiento puede ocasionar vulvovaginitis y enfermedad inflamatoria p lvica vaginalis un par sito protozoario es el agente causal de la tricomoniasis Una infecci n con vaginalis puede ocasionar vaginitis cervicitis y uretritis Estos tres pat genos tambi n son una causa significativa de leucorrea en las mujeres Los Micoplasmas son bacterias peque as 0 2 0 3 nm sin pared celular y son organismos intracelulares obligados Las variedades m s comunes que se observan en el tracto genital son U urealyticum M hominis y M genitalium Los ni os pueden ser colonizados con micoplasmas genitales en el momento del nacimiento Despu s de la pubertad la colonizaci n con micoplasmas ocurre principalmente a trav s del contacto sexual Los micoplasmas genitales se a slan en mujeres embarazadas aproximadamente con la misma frecuencia que en mujeres no embarazadas con la misma frecuencia de actividad sexual Los micoplasmas y ureaplasmas son fuertemente asociados con infertilidad infecci n intraamni tica infecci n post parto enfermedad inflamatoria p lvica Pelvic Inflammatory Disease PID y corioamnionitis histol gica El est ndar actual para las
17. atendiendo estrictamente con las siguientes reglas e instrucciones Nota para asegurarla calidad de las muestra las muestras deben transportadas lo m s pronto posible Deben ser transportadas siguiendo las indicaciones de temperatura A Toma de muestra M r rin Los pacientes no deber n orinar en al menos las dos horas previas a la toma de muestra e Colectar 10 30 mL de la primera parte del chorro de orina en un contenedor limpio de polipropileno Cierre y etiquete el contenedor de la muestra Ap guese a las instrucciones dadas para el almacenamiento y transporte Hisopados Para la toma de hisopados genitales por favor utilice los siguientes materiales e Utilice nicamente hisopos de pl stico con punta de Alginato de Calcio Dacron ray n hisopos sin aluminio No utilice hisopos de aluminio de madera e Los hisopos genitales pueden tomarse y transportarse en 1 3 mL de los siguientes medios eNat Copan Flocked swabs Copan Kit de recolecci n de muestras Qiagen Corporation e Deje el hisopo en el medio de transporte Cierre y etiquete el contenedor de la muestra Siga las instrucciones de almacenamiento y transporte oiga las recomendaciones del protocolo para recolectar las c lulas epiteliales escamosas y de columna despu s remover el moco cervical Muestras de citolog a en base l quida e Utilice los medios para citolog a en base l quida ThinPrep de HOLOGIC y SurePath de BD Siga
18. e Detection el caso del equipo SmartCycler Il el n mero total de reacciones se reduce 50 rxns gt 40 rxns Seeplex STI Series SD6600Y Seeplex STD6 ACE Detection V2 0 50 rxns SD6511Y Seeplex STI Master Panel 1 V2 0 50 rxns SD6510X Seeplex STI Master ACE Detection MP1 MP5 100rxns X5 SD6511X Seeplex STI Master Panel 1 MP1 100 rxns SD6512X Seeplex STI Master Panel 2 MP2 100 rxns SD6513X Seeplex STI Master Panel 3 100 rxns SD6514X Seeplex STI Master Panel 4 MP4 100 rxns SD6515X Seeplex STI Master Panel 5 MP5 100 rxns Productos accesorios 561701 Spin vRD 50 prep Sistemas de Purificaci n Automaticos SPN1200 SEEPREP12 EA SPN1004 SEEPREP12 VIRAL NA Kit 96 preps SPN1101 SEEPREP12 Tip Set 96 puntas 65415 02 MICROLAB NIMBUS IVD EA 173000 075 MICROLAB STARlet EA 744300 4 STARMag 96 Tissue 3841 1 caja
19. el STI 7 Detection L mite de detecci n para la sensibilidad es 10 copias reacci n 2 pat genos Chlamydia trachomatis Neisserieae gonorrhoeae Limite de detecci n para la sensibilidad es de 50 copias reacci n 5 pat genos Ureaplasma urealyticum Ureaplsma parvum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Trichomonas vaginalis 3 Reproducibilidad La prueba de reproducibilidad usando como referencia la cadena mostrada de reproducibilidad con diferentes lotes de productos diferentes experimientos diferentes tiempos y diferentes lugares confirmaron la significancia de la reproducibilidad del Anyplex STI 7 Detection O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 REFERENCIAS 1 10 11 12 13 14 15 A Mata A Gibello A Casamayor M M Blanco Dom nguez and J F Fern ndez Garayzabal 2004 Multiplex PCR Assay for Detection of Bacterial Pathogens Associated with Warm Water Streptococcosis in Fish Appl Environ Microbiol 70 5 3183 3187 Baczynska Svenstrup Fedder J Birkelund 5 and Christiansen G 2004 Development of real time PCR for detection of Mycoplasma hominis BMC Microbiol 6 4 35 Jackson CR Fedorka Cray PJ and Barrett JB 2004 Use of a genus and species specific multiplex PCR for identification of enterococci JCM P 3558 3565 Vol 42 No 8 Kong and Gilbert GL 2004 Postgenomic taxonomy of human ureaplasmas a case study based on multiple g
20. enamiento incorrecto de la muestra Error en la extracci n de cido nucleico Error en la adici n del cido nucleico al tubo de PCR correspondiente Presencia de inhibidores Los fluor foros para el an lisis de datos no cumplen con el protocolo Programaci n incorrecta Mezcla de reacci n de PCH incorrecta oe dejaron los reactivos por largo tiempo a temperatura ambiente o se almacenaron en condiciones no apropiadas Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 Tome una nueva muestra Tome una nueva muestra y repita el procedimiento completo Asegure que la muestra sea almacenada en las condiciones apropiadas la extracci n del cido nucleico Verifique el n mero de muestras asegure que se adicione el cido nucleico al tubo de PCR correcto durante el proceso de detecci n Diluya el cido nucleico en D W est ril 10 100X y repita el paso de con el cido nucleico diluido si a n est presente la muetsra reinicie desde la extracci n de cido nucleico Seleccione los fluor foros correctos para an lisis de datos la PCR con la configuraci n corregida Verifique que todos los componentes se hayan adicionado Cada reactivo se debe homogenizar y centrifugar para que el contenido de las tapas baje antes de la hacer la mezcla Verifique la fecha de vencimiento de los reactivos y use uno nuevo si es necesario Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1
21. ene sequences Int J Syst Evol Microbiol 54 Pt 5 1815 21 Madico G Quinn TC Rompalo A McKee KT Jr and Gaydos CA 1998 Diagnosis of Trichomonas vaginalis Infection by PCR Using Vaginal Swab Samples JCM 36 11 3205 10 Svenstrup HF Jensen JS Bj rnelius E Lidbrink P Birkelund S and Christiansen G 2005 Development of a Quantitative Real Time PCR Assay for Detection of Mycoplasma genitalium JCM 43 7 3121 8 Mahony JB Luinstra KE Tyndall M Sellors JW Krepel J and Chernesky M 1995 Multiplex PCR for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genitourinary Specimens JCM P 3049 3053 Vol 33 No 11 Chun JY Kim KJ Hwang IT Kim YJ Lee DH Lee IK and Kim JK 2007 Dual priming oligonucleotide system for multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene Nucleic Acids Res 35 6 e40 Alvarez J Sota M Vivanco AB Perales 1 Cisterna R Rementeria A and Garaizar J 2004 Development of a Multiplex PCR Technique for Detection and Epidemiological Typing of Salmonella in Human Clinical Samples JCM 42 4 1734 8 otellrecht KA Woron AM Mishrik NG and Venezia RA 2004 Comparison of Multiplex PCR Assay with Culture for Detection of Genital Mycoplasmas JCM 42 4 1528 33 Orle KA Gates CA Martin DH Body BA and Weiss JB 1996 Simultaneous PCR Detection of Haemophilus ducreyi Treponema pallidum and Herpes Simplex Virus Types 1 and 2 from Genital Ulcers JCM 34 1 49 54
22. ente al buffer de lisis es posible que se formen burbujas debe ser cuidadoso C Kit de preparaci n manual Kit de aislamiento Fabricante Vol recomendado QlAamp DNA Mini Kit QUIAGEN Muestra 190 Eluci n 50 ul Hibo spin vRD B Muestra 190 ul Viral RNA DNA extraction ee kit Eluci n 50 ul D Sistema de Purificaci n Automatizado 0 1 SEEPREP12 i Fabricante Vol recomendado Automatizado SEEPREP12 Noia Sistema de Purificaci n M 2 SEEPREP12 Viral NA Kit NorDiag i Eluci n 60 ul e Adicione 10 uL de proteinasa 20 mg ml de cada tubo de muestra debidamente etiquetado y est ril de 1 5 ml e ransfiera 240 ul de muestra incluyendo 10 ul al tubo STI 7 IC que contiene 10 ul de prote na K mezclar el tubo cuidadosamente e cartucho y la bomba montada punta se colocan en el instrumento e Ponga 1 5 ml del tubo de eluci n dentro del instrumento e Presione CONTINUE en la primer pantalla para inicializar el instrumento Presione STAR PROTOCOL el men principal del SEEPREP12 e el men de selecci n de protocolo presione SPN Viral NA HT e En el menu de selecci n de volumen de muestra presione 250 uL Y en la selecci n de volumen de eluci n presione 60 uL Siga las instrucciones en pantalla para el montaje del instrumento O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 e Una vez que todos los pasos se han completado cierre la p
23. i n la ausencia de se al del Control Extracci n de ADN fallida Interno puede indicar la p rdida de cidos nucleicos durante la extracci n Aseg rese de utilizar los m todos de extracci n recomendados La muestra debe ser diluida con buffer PBS de 1 10 veces y despu s se agrega el STI 7 la muestra diluida Si la se al del objetivo es observada es probable que sea positiva para el pat geno aunque la se al del control interno no se observe Si desea verificar el control interno diluya el cido nucl ico en D W esterilizada 10 100X y repita el La se al del control paso de PCR con el cido nucleico interno no es observada diluido Alta carga del cido nucleico del pat geno Diluya el cido nucleico aislado en D W est ril 10 100x y repita la PCR con el cido nucleico diluido Si la muestra est todav a presente reinicie desde la extracci n de cido nucleico Presencia de inhibidores de PCR Descontamine todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de sodio y etanol Use solo puntas con filtro Presencia de contaminaci n durante el procedimiento de cruzada extracci n Cambie puntas entre ubos Repita el procedimiento de extracci n de cidos nucleicos con un nuevo set de reactivos Falsos positivos o se al observada en el control Negativo C2 Seegene Falso negativo o no se observa en los controles positivos Error en la toma de muestra Almac
24. infecciones de transmisi n sexual Sexually Transmitted Infection STI implica el uso de pruebas individuales para la detecci n de cada uno de los pat genos posibles La mayor a de las pruebas comerciales se enfocan en la detecci n de las dos principales bacterias causantes de STI CT y NG Sin embargo ya que la mayor a de las STI no presentan s ntomas notables la detecci n de una gama amplia de pat genos es de suma importancia Una complicaci n adicional en el diagn stico de las STI se debe a que diferentes pat genos pueden ocasionar s ntomas similares pero r gimen de tratamiento con antibi tico var a dependiendo del microorganismo causante de la enfermedad La detecci n simult nea y precisa en las pruebas de STI es la clave en la resoluci n de estos problemas y en una atenci n efectiva y de bajo costo para el paciente C Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 REACTIVOS Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 50 reacciones Informaci n de compra Anyplex II STI 7 Detection SD7700Y Anyplex II STI 7 Detection NES Mezcla de Oligos TOM 4X STI 7 TOM 250 uL gt Reactivos para la n RR y detecci n DNA Polimerasa npe Uracil DNA glicosilasa UDG Buffer con dNTPs Control Positivo PC CONTROL CONTROL adiu ile P los pat genos Agua libre de RNasa 1000 uL Calidad ultra pura grado PCR ONTROL STI 7 IC 900 uL Co
25. leicos a su tubo respectivo 15 uL PCR Mastermix 5 uL Muestra de cidos nucleicos 20 uL Volumen Total de reacci n Nota Utilice una punta de pipeta nueva con cada muestra diferente Nota Para el Control Negativo utilice 5 uL de agua libre de RNasa en lugar de muestra de cido nucleico Nota Para el Control Positivo utilice 5 uL de STI 7 PC Nota Evite la contaminaci n cruzada del PCR Mastermix y las muestras con el Control Positivo Nota En el caso del CFX 96 no etiquete la tapa de los tubos de reacci n ya que la fluorescencia es detectada a trav s de la tapa CONFIGURACI N DEL EQUIPO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y AN LISIS DE RESULTADOS 1 Equipo para PCR en tiempo real CFX 96 Bio Rad 1 1 Configuraci n del Equipo para PCR en tiempo real Nota La programaci n del ensayo en el Equipo de PCR en tiempo real CFX 96 Bio Rad para la detecci n de C trachomatis CT N gonorrhoeae NG M genitalium MG M hominis MH U urealyticum UU U parvum UP T vaginalis TV y el Control Interno IC puede dividirse en los siguientes pasos A Programaci n del protocolo 1 En el men principal haga clic en Protocol para abrir la ventana de Experiment Setup O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 Hin Hard Manager admin PES Ferari lala Flan al Gena Shidi E Open 0 Pale Fepeul d Exit Fig 1 Programaci n del P
26. ntrol Interno Ex geno IC Anyplex Il es una marca registrada de Seegene Inc O Seegene Anyplex 1 STI 7 Detection V1 1 MANEJO Y ALMACENAMIENTO Los componentes de Anyplex I STI 7 Detection deben almacenarse a 20 C todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta bajo las condiciones de almacenamiento recomendadas congelamiento descongelamiento repetido debe evitarse ya que podr a reducir la sensibilidad Si los reactivos ser n usados de manera intermitente deber n almacenarse en al cuotas MATERIAL REQUERIDO NO INCLU DO e Guantes desechables libres de talco l tex o nitrilo Pipetas ajustables y puntas est riles e Tubos para microcentrifuga de 1 5 ml e Kit para aislamiento de cidos nucleicos ver Aislamiento de cidos Nucleicos e e M quina de hielo e Centr fuga de mesa e Agitador vortex e Equipo para PCR en tiempo real CFX 96 Bio Rad e iras de 8 tubos bajo perfil de 0 2 ml sin tapas color blanco No Cat 1150851 Bio Rad e Tiras de 8 tapas planas de grado ptico No Cat TCS0803 Bio Rad e Soluci n PBS 1X pH 8 0 C Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 PROTOCOLO 1 Toma de Muestra Almacenamiento y Transporte Nota Todas las muestras deben ser tratadas como potencialmente infecciosas Solo los materiales de muestras son permitidos los cuales son recolectados transportados y almacenados
27. on 2do Segundo punto CMTA Well Info Melt Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 1st 2nd 3rd 400 EN N 300 FAM 2 HEX t IC x Red 610 100 t Quasar 670 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 Pico de fusion 3ro Tercer punto Well Info Melt Peak FAM HEX Cal Red 610 Quasar 670 Ast 2 C 400 I 300 FAM lt HEX 200 cc v 100 Cal Red 510 0 Quasar 570 C Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 SOLUCI N DE PROBLEMAS Anyplex STI 7 Detection OBSERVACIONES CAUSAS DEL PROBLEMA SOLUCI N Los fluor foros para el an lisis Seleccione los fluor foros de datos no cumplen con el correctos para el an lisis de datos Ciclos de PCR y o Verifique las condiciones de la temperaturas en el equipo PCR y repita con los ajustes incorrectos adecuados de ser necesario Los reactivos permanecierona Verifique las condiciones de temperatura ambiente almacenamiento y la fecha tiempo prolongado O se caducidad ver la etiqueta en el almacenaron en condiciones kit de los reactivos utilice un kit No se observa la incorrectas nuevo de ser necesario se al del Control m Interno ni ninguna Programaci n incorrecta otra se al Repita el procedimiento de detecci n con los ajustes adecuados Si el Control Interno fue adicionado previo la extracc
28. rotocolo Realice un nuevo protocolo cargue un protocolo ya existente para el experimento 2 En Protocol Editor defina el perfil t rmico como se menciona a continuaci n BIN 72 30 seg 55 C 30 seg Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 de fusi n 55 C 85 C 5 s 0 5 C Nota Lectura placa el segmento 7 12 y 17 Fluorescencia es detectada durante el punto de fusi n _ 1 El arar Ef 45 E Incas Sip Pig irene gaden sS esee GO TO En inves Curve sdi Prae Fend Enc Sep igbzna ut Culata Sing Fig 2 Protocol Editor 3 Haga clic en Sample Volume y modifique el valor a 20 uL 4 Haga clic en se abrir la ventana Experiment Setup Fsnaerlmant Saup gu Protocol mancus Leele Select Ex sina Ealecied Frozen 3TI T Detector Cl Freire Est Tme 02 50000 i ele Crannels Sample volume dul Fig 3 Experiment Setup Protocol e Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 B Programaci n de la placa 1 En Experiment Setup Plate haga clic en Create New para abrir la ventana Plate Editor para crear una nueva placa Express Load QuickPlate_96 wells All Channels pkd QuickPlate 96 wells All Channels pltd Preview Fluorophores FAM HEX Texas Red Cy5 Quasar 705 Plate Type BR Clear 5 6 10 X o g
29. t 4 4 4 ele deleted lela 0000005 0000004 fel ele Fig 4 Plate Editor Realice una nueva o cargue una ya existente para el experimento 2 Haga clic en Select Fluorophores para indicar los fluor foros FAM HEX CAL Red 610 y Quasar 670 que ser n utilizados en el experimento Plate Editor New X j File Settings Tools Zoom 100 v fi Scan Mode All Channels gt Ey Well Groups Plate Loading Guide FAM 3 none SYBR HEX TET Cal Gold 540 VIC ROX Texas Red Cal Red 610 Cy5 Quasar 670 Quasar 705 Plate Type BR Clear Cancel Fig 5 Select Fluorophores FAM HEX CAL Red 610 y Quasar 670 4 Seleccione los pocillos y haga clic en Sample Type en el menu desplegable Unknown Muestras cl nicas Negative Control Positive Control 5 Haga clic en las casillas de verificacion apropiadas FAM HEX CAL Red 610 y Quasar 670 para cargar los fluoroforos en los pocillos seleccionados Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 6 Escriba el nombre de la muestra en Sample Name y presione Enter 7 En Settings del men principal del Plate Editor elija el tama o del plato Plate size y el Tipo de Placa Plate Type BR White 100 e 4 _ _ 2 3
30. u s de manipular muestras y los reactivos de la prueba Evite contaminar los reactivos al extraer al cuotas de los tubos de reactivos Se recomienda el uso de puntas para pipetas est riles desechables y con filtro resistente a aerosoles No mezcle los reactivos de diferentes lotes o de tubos diferentes del mismo lote No use este producto despu s de la fecha de vencimiento Use tubos de tapa rosca y evite las salpicaduras o contaminaci n cruzada de muestras durante la preparaci n Se cuidadoso para no contaminar los reactivos con cidos nucleicos extraidos productos de la PCR y control positivo Para prevenir la contaminaci n delos reactivos se recomienda usar puntas con filtro Use reas separadas para cada experimento Use un set diferente de pipetas para cada rea extracci n de ADN mezcla de reactivos y post PCR Despu s de la amplificaci n abra los tubos o tiras de reacci n en la zona de post PCR para evitar contaminaci n con amplicones Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit Los procedimientos de seguridad en el laboratorio se deben tener en cuenta para manipular las muestras Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 e limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0 596 en agua desionizada o destilada USO PREVISTO La prueba STI 7 Detection de Anyplex Il es un ensayo cualitativo in vitro para la detecci n de C trachomatis CT
31. uerta e inicie la corrida D 2 MICROLAB NIMBUS IVD Nota Mirar el manual de operaci n del MICROLAB NIMBUS IVD Sistema de Purificaci n Fabricante Vol recomendado Automatizado MICROLABNIMBUSIVD Hamilton Muestra 450 ul D 3 MICROLAB STARIet Nota Observar el manual de operaci n del MICROLAB STARIet Sistema de Purificaci n Fabricante Vol recomendado Automatizado MICROLAB STARIet__ Hamiton Muestra 450 ul 3 Preparaci n de la PCR tiempo real Nota Deben usarse los tubos y las tapas correctos ver MATERIALES REQUERIDOS NO INCLU DOS Nota Puntas con filtro resistente a aerosoles y guantes ajustados deben usarse cuando se preparen las muestras Poner mucho cuidado para evitar las contaminaciones cruzadas Nota Descongele los reactivos por completo en hielo Nota Centrifugue los tubos de reactivos brevemente para remover las gotas del interior de las tapas A Prepare el PCR Mastermix 5 uL 4X STI 7 TOM 5 uL Agua libre de RNasa 5 uL 4X Anyplex PCR Master Mix con UDG 15 uL Vol men total del PCR Mastermix Nota Calcule la cantidad necesaria de cada reactivo bas ndose en el n mero de reacciones muestras controles O Seegene Anyplex 11 STI 7 Detection V1 1 B Mezcle por inversi n 5 veces mediante agitador v rtex y centr fugue brevemente C Coloque al cuotas de 15 uL del PCR Mastermix en tubos para PCR y cierre las tapas D Agregue 5 uL de cada muestra de cidos nuc
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