Simplexa™ EBV - Focus Diagnostics
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1. 7 Pueden aparecer resultados falsos negativos cuando el microorganismo causante de la infecci n tiene mutaciones gen micas inserciones deleciones o reorganizaciones o cuando las pruebas se realizan en una fase muy temprana de la enfermedad 8 Pueden aparecer resultados falsos negativos si en la muestra hay un n mero inadecuado de microorganismos debido a una recogida un transporte o una manipulaci n incorrectos 9 Al igual que con cualquier otra prueba pueden producirse resultados falso positivos En determinadas circunstancias podr a estar indicada la repetici n de la prueba o la realizaci n de una prueba con un dispositivo diferente 10 No se ha establecido el rendimiento de este ensayo para su uso en la selecci n de donantes 11 No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en presencia de medicamentos destinados al tratamiento de la mononucleosis infecciosa que podr an potencialmente interferir con los resultados 12 Esta prueba no permite descartar enfermedades causadas por otras bacterias o virus pat genos CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO COMPARACI N DE M TODOS En el estudio de acuerdo cl nico particip un centro de pruebas interno Los resultados utilizados como referencias se obtuvieron utilizando una prueba desarrollada en el laboratorio LDT Laboratory Developed Test de alto rendimiento Se obtuvo un total de 56 muestras de sangre completa a partir de una combinaci n de muestras recogidas prospectivament2. 0 370351 0 965335 Log esperado BKV Linealidad de Simplexa EBV Extracci n easyMag Conc Simplexa EBV Log10 copias ml 0 5D 60 Conc EBV esperada Log10 copias ml Ecuaci n de regresi n Log_Simplexa_EBW 0 2166 26 0 969417 Log esperado BKW INTERVALO NOTIFICABLE Ambos m todos de extraccci n fueron lineales hasta 8 07 x 10 copias l El intervalo notificable del ensayo se bas en el m todo de extracci n con el valor mayor para el l mite inferior del rango lineal Las muestras por debajo del intervalo lineal se notificar n como lt 900 copias ml las muestras por encima del intervalo lineal se notificar n como gt 8 07 x 10 copias ml A Simplexa M EBV p gina 11 Focus P a REACTIVIDAD ANAL TICA REACTIVIDAD CRUZADA Los estudios han indicado que los cebadores son espec ficos para VEB y no que poseen reacci n cruzada con otros virus O bacterias entre las que se incluyes VHB VHC VIH 1 VIH 2 VHS 1 VHS 2 VHH 6 VHH 7 VHH 8 VHTL 1 VJA Parvovirus Toxoplasma gondii VVZ CMV y VKV Adicionalmente las bases de datos de las secuencias de cidos nucleicos indicaron que los cebadores eran espec ficos para VEB y que no pose an homolog a significativa con otros pat genos o con ADN humano INTERFERENCIAS El rendimiento de este ensayo no ha sido evaluado con sustancias que puedan interferir potencialmente Los procesos de extracci n de cidos nucleicos automatizados usando el sistema MagNA Pure o el
3. n bot n derecho para examinar el resumen de los valores diagn stico predicted values Marque la casilla de Include Graphs Incluir gr ficas para examinar las gr ficas de amplificaci n Para incluir de calibraci n asociado con el proceso de diagn stico seleccione la casilla de Include Calibration Result Incluir resultado de calibraci n Avance por las p ginas mediante los botones con flecha que se encuentran en la esquina superior izquierda de la ventana Print Preview Imprimir vista previa 4 Print Imprima o Save Guarde el informe 5 Exporte los valores diagn stico si es necesario CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de control de calidad y la frecuencia de la pruebas de control de calidad bas ndose en las leyes y normas locales aplicables y las buenas pr cticas de laboratorio INFORME DE LOS RESULTADOS 1 Validez de la ronda Determine si el proceso es v lido al examinar los resultados del VEB y el control interno Cl para el control positivo bajo LPC control positivo alto HPC y el control sin molde NTC Los tres controles deben reunir los criterios de aceptaci n para que un proceso sea v lido Si uno de los proceso resulta inv lido todas las muestras de los pacientes deben ser examinadas nuevamente E e a Criterios de aceptabilidad Control VEB No Template Control NTC Low Positive Control LPC dele esperes No corresponde e El control sin molde NTC re ne lo
4. Consulte el manual del operador del equipo Integrated Cycler para configurar el software Integrated Cycler Studio para a adir una definici n de ensayo configurar los procesos y analizarlos en el equipo Integrated Cycler Nota Debe establecerse una curva est ndar v lida proceso de calibraci n antes de llevar a cabo un proceso de diagn stico ZONA DE PREPARACI N DE REACTIVOS Area espec fica para la preparaci n de la mezcla de reacci n de la prueba Simplexa EBV ls D Ur go Descongele la mezcla de cebadores y la mezcla maestra a temperatura ambiente aproximadamente a una temperatura entre 18 C y 25 C Cada vial del componente del kit contiene reactivos suficientes para 50 reacciones Antes de cada uso mezcle suavemente la mezcla de cebadores y la mezcla maestra invirti ndolas de 6 a 8 veces y centrifug ndolas brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo Prepare el volumen requerido de la mezcla de reacci n en un tubo para microcentr fuga de polipropileno del tama o adecuado pipeteando el volumen de cada componente como se indica en la tabla siguiente Vol menes de la mezcla de reacci n Volumen mezcla de Volumen mezcla de Reactivo reacci n reacci n 1 reacci n 10 reacciones Simplexa EBV Primer Mix 1 0 ul 10 ul Volumen total 50 ul Mezcle suavemente la mezcla de reacci n mediante inversi n o pipeteando de 8 a 10 veces Centrifugue brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo Contin
5. Simplexa M EBV p gina 12 Focus p pag REPRESENTANTE AUTORIZADO mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Alemania INFORMACI N PARA PEDIDOS PI MOL2400 0U5S ES Tel fono 800 838 4548 EE UU solamente 562 240 6500 Internacional Rev F Fax 562 240 6510 Fecha de redacci n 13 de diciembre de 2012 ASISTENCIA T CNICA FO C U S Tel fono 800 838 4548 EE UU solamente 562 240 6500 Internacional Fax 562 240 6526 Diagnostics Visite nuestro sitio web en www focusdx com Cypress California 90630 EE UU
6. aproximadamente de 8 a 10 veces el LoD y una mezcla alta intervalo superior del ensayo Adem s se incluy en la bater a cada nivel de patr n de cuantificaci n a partir de un solo lote de patr n de cuantificaci n de VEB QS Quantitation Standard n 5 En la tabla siguiente se muestran los resultados de reproducibilidad de cada muestra de la bater a Simplexa M EBV p gina 9 Focus P e Reproducibilidad Simplexa EBV AA Desviaci n est ndar Concentraci n Media Media N de decile esperada geom trica logar tmica resultados in aan pla Total copias ml copias ml copias ml medibles NTC nO No detectado No corresponde N C detectado mo ara rara s 60 os oo os oo 037 mo aea serio ars 60 os 002 oos ooa 019 asi astra asexi ese 60 oa 007 ooo 0o22 032 asa astro ass ess e os 00 oo 0o02 018 ass aono sormro ao e o2 os oo oo Toat asa f aao seem a7 e oz oo oo 00 02 ass neno eco os as ore o oo om 0x8 Mezcla No SENSIBILIDAD ANAL TICA L MITE DE DETECCI N El l mite de detecci n LoD se calcul creando muestras dise adas partir de un stock de una cepa de VEB cuantificada que se agreg a una matriz de sangre completa cl nicamente negativa La bater a incluy una matriz negativa sin agregados y muestras de concentraciones variables dilu das serialmente aproximadamente al LoD Se analiz veinticuatro 24 reproducciones proce
7. escarcha manual de 10 a 30 C para guardar congelados los componentes del kit Frigor fico de 2 C a 8 C para las muestras y los componentes del kit que han sido descongelados Cabina de bioseguridad campana de flujo laminar para las extracciones Microcentr fuga Mezclador v rtex Puntas de micropipetas est riles desechables exentas de ARNasas ADNasas con protecci n contra aerosoles Tubos para microcentr fuga de polipropileno de 1 5 ml y gradillas se recomienda usar tubos exentos de ARNasas ADNasas pero no es obligatorio Guantes sin polvo desechables Agua libre de nucleasas que se utiliza durante la extracci n y como el control sin molde No Template Control NTC Gradillas fr as para los tubos de microcentr fuga de 1 5 ml Para uso con el m todo de extracci n Roche MagNA Pure LC Para uso con el m todo de extracci n del bioM rieux easyMAG PER ODO DE VALIDEZ Y MANIPULACI N 1 2 3 4 Conserve los reactivos a una temperatura entre 10 C y 30 C no use un congelador de tipo no frost Deje que los reactivos se descongelen a temperatura ambiente antes de usarlos aproximadamente entre 18 y 25 C No use los kits ni los reactivos despu s de la fecha de caducidad Tras a adir la mezcla de Master use la mezcla de reacci n antes de que pase una hora Guarde la mezcla de reacci n a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C hasta que est listo para proceder con la PCR Una vez descongelado
8. los reactivos del kit use equipos de protecci n personal como guantes y batas de laboratorio entre otros L vese las manos minuciosamente cuando termine de realizar la prueba No pipetee con la boca No fume beba coma manipule lentes de contacto ni se aplique maquillaje en las zonas en las que se usan los reactivos del kit o muestras de origen humano Elimine los reactivos del kit que no se hayan usado y las muestras humanas seg n las normas locales estatales y federales El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder en una sola direcci n comenzando en las zonas de preamplificaci n y prosiguiendo en la zona de amplificaci n detecci n a continuaci n se muestra la secuencia de acontecimientos desde la extracci n de la muestra hasta la amplificaci n de PCR en tiempo real e Empiece por la extracci n de la muestra contin e con la configuraci n del equipo de PCR en tiempo real la preparaci n del reactivo y finalice con la amplificaci n mediante PCR en tiempo real e No use materiales fungibles ni equipos en las reas destinadas a la extracci n y preparaci n de muestras No se recomienda ning n tipo de movimiento cruzado entre las diferentes reas e El equipo usado para la preparaci n de las muestras no debe usarse para la preparaci n de reactivos ni para procesar el ADN amplificado ni otras fuentes de cido nucleico diana e Los materiales fungibles de amplificaci n y los equipos deben estar siempre en el rea
9. nucle dos del VEB han sido identificados en tejidos afectados por el linfoma de Burkitt enfermedad de Hodakin carcinoma nasofar ngeo enfermedades linfoproliferativas postrasplante linfoma del sistema nervioso central relacionado con SIDA y otros linfomas de c lulas T y B Los m todos de diagnostico habituales rara vez son tiles para la evaluaci n de enfermedades relacionadas con el VEB en pacientes inmunodeprimidos Los cultivos no son pr cticos ni tiles para prop sitos cl nicos a la vez que la serolog a es dif cil de interpretar en condiciones de inmunodepresion Los m todos de diagnostico basados en la reacci n en cadena de la polimerasa PCR de las muestras son tiles en la detecci n del VEB El seguimiento de la carga viral del VEB es til en la identificaci n de las enfermedades linfoproliferativas postrasplante y en el seguimiento de linfomas en pacientes con el s ndrome de inmunodeficiencia adquirida PRINCIPIOS DEL PROTOCOLO El ensayo es un sistema de amplificaci n y detecci n de PCR en tiempo real que utiliza un cebador sonda fluorescente bifuncional para la detecci n del ADN del virus de Epstein Barr en la sangre completa La prueba consta de dos etapas principales 1 Extracci n del ADN de las muestras del paciente 2 Empleo de un cebador sonda fluorescente bifuncional junto con un cebador inverso para amplificar una diana espec fica para cada analito y control interno El ensayo proporci
10. NucliSENS easyMAG eliminan eficazmente las impurezas de la muestra ya que a slan y lavan los cidos nucleicos durante el proceso de extracci n Los controles internos alertan al usuario final de una potencial inhibici n de la PCR si ninguna de las dianas ni de los controles internos se detectan el ensayo es inv lido CONTAMINACION POR ARRASTRE Se evalu la amplificaci n por arrastre para el equipo y el Disco Universal utilizando otros ensayos Los estudios se centraron en la b squeda de contaminaci n en muestras altamente negativas El estudio se dise colocando de manera alterna muestras con resultado positivo alto y resultado negativo alto en cada disco El efecto de arrastre se evalu comparando la tasa de negativos observados en las muestras con resultado negativo alto con la tasa esperada en condiciones de reproducibilidad normales No se observ contaminaci n por efecto de arrastre en pruebas anteriores REFERENCIAS 1 Zur Hausen H Schulte Holthausen H Klein G et al EBV DNA in biopsies of Burkitt s tumors and anaplastic carcinomas of the nasopharynx Nature 1970 228 1056 8 2 Weiss LM Movahed LA Warnke RA et al Detection of Epstein Barr virus genomes in Reed Sternberg cells of Hodgkin s disease N Engl J Med 1989 320 502 6 3 Herbert H Steinbecher E Niedobitek G et al Distribution and phenotype of Epstein Barr virus harboring cells in Hodgkin s disease Blood 1992 80 484 91 4 Khan G Norton AJ Slavin G Ep
11. Simplexa Y EBV MOL2400 Rev F Un ensayo de PCR en tiempo real para la cuantificaci n in vitro del virus de Epstein Barr VEB OCUS Diagnostics Para uso diagn stico in vitro INDICACIONES DE USO El ensayo Simplexa EBV de Focus Diagnostics est dise ado para la cuantificaci n in vitro de los cidos nucl icos del virus de Epstein Barr en muestras de sangre completa utilizando el 3M Integrated Cycler Este ensayo est dise ado para ser utilizado en el tratamiento cl nico de los pacientes infectados con el VEB junto con la presentaci n cl nica y otros marcadores de laboratorio que eval an el progreso de la enfermedad Este ensayo no se ha dise ado para la selecci n de donantes RESUMEN Y EXPLICACI N El virus de Epstein Bar VEB un herpesvirus ampliamente diseminado con tropismo para los linfocitos es el agente causal de la mononucleosis infecciosa y se encuentra fuertemente asociado con diversos tipos de c ncer humano La infecci n causada por el VEB es com n y se presenta generalmente de manera asintom tica o como una enfermedad autolimitada con una duraci n de 2 a 3 semanas Debido a que es miembro de la familia herpes el VEB puede permanecer latente durante largos per odos y reactivarse en un estad o posterior A pesar de que la infecci n inicial puede resultar en un s ndrome relativamente benigno la reactivaci n en una persona inmunodeprimida puede causar serios inconvenientes Las prote nas o cidos
12. de equipos de PCR en tiempo real e El equipo de protecci n personal como las batas de laboratorio o los guantes desechables debe ser espec fico de cada rea La contaminaci n de las muestras de pacientes o de reactivos puede dar lugar a resultados err neos Utilice t cnicas as pticas Pipetee y manipule los reactivos con cuidado para evitar que se mezclen con muestras de pocillos adyacentes Utilice t cnicas de pipeteo adecuadas y mantenga las mismas condiciones de pipeteo durante todo el procedimiento para garantizar valores ptimos y reproducibles No sustituya los reactivos ni los mezcle con reactivos procedentes de diferentes lotes de kits o de otros fabricantes No intercambie las tapas de los tubos de reactivos Ello puede provocar su contaminaci n y alterar los resultados de la prueba Use nicamente el protocolo descrito en este prospecto Las desviaciones del protocolo o el uso de tiempos o temperaturas diferentes de las especificadas puede producir resultados err neos La preparaci n de la prueba debe realizarse a temperatura ambiente aproximadamente en el intervalo de 18 a 25 C Cuando mezcle los reactivos mantenga fr as las enzimas mediante un bloque refrigerador No reutilice los Universal Discs que ya han estado expuestos a muestras de pacientes o reactivos Deseche el disco usado sin separar ni retirar la cinta de cobertura Si se preparan en el mismo disco diferentes kits o lotes Simplexa en la prueba s
13. del gen que codifica la unidad IC Control de extracci n y amplificaci n de ADN N metiltransterasa grande de la ribulosa 1 5 bifosfato carboxilasa oxigenasa de la IC planta Arabidopsis thaliana T Simplexa EBV Low Positive Control LPC Control VEB inactivado en una base de matriz extracelular humana positivo bajo Comro positivo ato ona o HPC VEB activado en una base de matiz extracelular humana Control positivo alto VEB inactivado en una base de matriz extracelular humana Simplexa EBV Barcode Card Tarjeta de c digo Par i de b de barras arametros espec ficos de la prueba MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 4 2 3 4 S 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 a b O Patrones de cuantificaci n Simplexa EBV MOL2410 Equipo Integrated Cycler 3M con Integrated Cycler Studio versi n 3 0 o superior Universal Discs para el equipo Integrated Cycler Cinta de cubierta para Universal Discs a Sistema Roche MagNA Pure LC y elementos fungibles asociados 2 Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit N de cat de Roche 03038505001 2 Equipo NucliSENS easyMAG de bioM rieux y consumibles y reactivos asociados P Pipeta multicanal Biohit bioM rieux Placa de tiras ELISA Micropipeta s de canal nico multicanal y o de repetici n de una precisi n comprendida en el rango de 1 10 ul 10 100 ul y 100 1000 ul Congelador eliminaci n de
14. dentes de tres 3 extracciones diferentes y fases de PCR a cada nivel con el an lisis de Probit para determinar la concentraci n mas baja que pudiera ser detectada con una probabilidad del 95 El protocolo LoD se realiz para cada uno de los dos m todos de extracci n Los valores LoD individuales se muestran en la tabla siguiente Se determin que el LoD para el ensayo VEB basado en el LdD mayor a partir de ambos m todos de extracci n era 900 copias ml Sangre entera INC IEA E TE LINEALIDAD La linealidad se determin mediante muestras creadas artificialmente a partir de una cepa de VEB cuantificada que se agreg a una matriz de sangre entera cl nicamente negativa El panel consisti en al menos 10 mezclas de copias conocidas a lo largo del intervalo lineal esperado De las mezclas al menos 3 concentraciones estaban cerca del L mite inferior de cuantificaci n LLOQ 2 cerca del l mite superior de cuantificaci n ULOQ y las mezclas restantes estaban distribuidas aproximadamente a partes iguales entre el LLOQ y el ULOQ Cada muestra se analiz aleatoriamente en al menos 3 r plicas El protocolo de linealidad se realiz para cada uno de los dos m todos de extracci n Los valores individuales del intervalo de notificaci n se muestran en la tabla siguiente Simplexa EBV p gina 10 Conc Simplexa EBV Log 10 copias ml 30 0 so 60 Conc EBV esperada Log10 copias ml Ecuaci n de regresi n Log _Simplexa_EBV
15. e con la preparaci n de la PCR Use la mezcla de reacci n antes de que pase una hora de la preparaci n Guarde la mezcla de reacci n a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C si la PCR no se llevara a cabo inmediatamente despu s de preparar la mezcla de reacci n ZONA DE AMPLIFICACI N POR PCR EN TIEMPO REAL Realice la preparaci n del disco universal de 96 pocillos para la prueba Simplexa M EBV en un rea habilitada exclusivamente para ello Simplexa M EBV p gina 6 Focus j Consulte el ejemplo de disposici n del disco de la secci n C mientras realiza lo siguiente A ada 5 0 ul de mezcla de reacci n a cada pocillo A ada 5 uL del control positivo extra do al pocillo del control positivo alto HPC y del control positivo bajo LPC A ada 5 0 ul de la muestra del paciente extra da al pocillo del S correspondiente A ada 5 uL de control negativo sin molde extra do al pocillo del NTC Cubra el disco con cinta de cubierta para Universal Discs Abra la tapa del equipo Integrated Cycler Coloque el disco universal sellado sobre el plato Cierre la tapa suavemente Pulse sobre Run Proceso 10 Pulse sobre Start Iniciar F AN LISIS DE DATOS 1 Cuando el proceso finalice pulse Analyze Analizar 2 Revise los colorantes uno por uno o seleccione todos los colorantes canales al marcar la casilla de selecci n de cada colorante 3 Presione el bot n de vista Print Preview Previa de la impresi
16. e deber n usar los controles positivos y negativos correspondientes a cada kit La mezcla maestra contiene m s de un 1 de glicerol lo que puede causar irritaci n si se inhala o entra en contacto con la piel En caso de inhalaci n o contacto con la piel deben tomarse medidas de primeros auxilios No se recomienda almacenar las muestras extra das a temperaturas de entre 2 C y 8 C de forma prolongada puesto que el rendimiento no se ha establecido Si el envase del kit o su contenido tienen aspecto de estar rotos o deteriorados no los use y p ngase en contacto con Focus Diagnostics La informaci n de contacto aparece en la ltima p gina de este documento INSTRUCCIONES DE USO A RECOGIDA DE MUESTRAS El tipo de muestra aceptable es sangre completa extra da a trav s de una punci n venosa No utilice tubos recolectores de muestra que contengan heparina como anticoagulante La heparina inhibe la PCR B ZONA DE EXTRACCI N DE MUESTRAS Realice la extracci n de muestras y controles en una zona destinada exclusivamente para ello La preparaci n de muestras para la extracci n debe realizarse en una cabina de bioseguridad Focus Simplexa EBV p gina 4 Extracci n mediante el m todo Roche MagNA Pure LC 1 N AU p E Los cidos nucleicos se extraen de las muestras de los pacientes y de los controles de la prueba mediante el kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid y el equipo Roche MagNA Pure LC Automated Nucle
17. e y enviadas al centro de recogida para la detecci n o cuantificaci n del VEB La extraccion de las muestras se llevo a cabo utilzando el m todo de extracci n MagNA Pure Las muestras incluidas en el an lisis se encontraban dentro del intervalo de combinaci n notificable del LDT de referencia y del ensayo Simplexa EBV El m todo de regresi n Passing Bablok arroj una pendiente de 0 82 y un sesgo consistente de 0 44 Simplexa M EBV p gina 8 focus P p g M todo de comparaci n Simplexa EBV Regresi n de Passing y Bablok P B L nea de reg 0 44 0 82 X IC 95 para intersecci n 0 1250 0 7401 IC 95 para pendiente 0 7507 0 8920 n 56 Coeficiente de correlaci n R 0 96 Z J o O A O O O gt m U Y Xx Q Q 0 g O O 45 Conc LDT EBV Log10 copias ml REPRODUCIBILIDAD El estudio de reproducibilidad se llev a cabo en dos sistemas un operador por sistema cuatro replicaciones de cada bater a de muestra por fase dos fases al d a durante cinco d as La bater a de muestras reproducible est formada por muestras de sangre completa dise ada a las que se le agreg concentraciones diversas de una cepa de VEB La bater a contiene los controles NTC HPC y LPC una mezcla negativa sangre completa sin agregados una mezcla baja a la que se le agreg una concentraci n aproximadamente de 2 a 4 veces el l mite de detecci n LoD Limit of Detection una mezcla media
18. ic Acid Extractor Consulte las instrucciones de uso del fabricante para extraer cidos nucleicos con este kit En el men desplegable Protocol Protocolo del equipo MagNA Pure LC seleccione Total NA cido nucleico total y luego Total NA Variable_elution_volume blk Se cargar n los ajustes apropiados para el proceso El Sample Protocol Protocolo de la muestra debe ser Total NA Variable_elution_volume El volumen de la muestra debe ajustarse en 200 pl y el volumen de eluci n en 50 pul El volumen de diluci n debe ajustarse a cero para todas las muestras Aseg rese de que el protocolo tras la eluci n se sit a en None Ninguno Aseg rese de que las muestras y los controles est n en la posici n correcta en el cartucho de muestras Mezcle cada muestra en el mezclador v rtex durante 2 a 4 segundos y centrifugue brevemente para que el contenido baje al fondo del tubo Pipetee 200 uL de cada muestra del control sin molde NTC control positivo bajo LPC y del control positivo alto HPC en la posici n correspondiente del cartucho de muestras Inspeccione visualmente el nivel de las muestras y los controles en el cartucho de muestras para asegurarse de que se haya agregado la muestra o las muestras Dele un pulso en el agitador v rtex al ADN para control de extracci n y amplificaci n Cl 2 veces y centrifugue brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo Por cada conjunto de 16 muestras muestra
19. nutos use 8 puntas por cada tira ELISA y utilizando el modo P3 de la pipeta Biohit transfiera100 ul de la mezcla de s lice magn tica a cada muestra del recipiente para muestras Coloque las puntas en los pocillos de la tira ELISA y pulse Start Iniciar para mezclar y aspirar la mezcla de s lice magn tica 14 Transfiera la mezcla de s lice magn tica al recipiente para muestras apropiado y coloque las puntas de la pipeta en las muestras por debajo del nivel del l quido Pulse Start Iniciar para aspirar dispensar y mezclar x3 la s lice magn tica y las muestras Aseg rese de que las puntas est n bajo el nivel del l quido para garantizar una mezcla adecuada 15 Repita los pasos 13 y 14 para el resto de recipientes para muestras adicionales 16 Despu s de a adir la mezcla de s lice magn tica a todos los recipientes para muestras inicie el proceso de extracci n 17 Cuando el proceso haya terminado retire los recipientes para muestras del equipo Si las muestras no se van a utilizar inmediatamente transfiera el contenido a tubos individuales para minimizar la probabilidad de que la s lice magn tica vuelva a caer en la muestra Guarde el ADN extra do a una temperatura de entre 2 C y 8 C antes de usarlo No se recomienda el almacenamiento prolongado a esta temperatura de las muestras extra das Mantenga el ADN extra do en un bloque refrigerador mientras carga el disco CONFIGURACI N DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL 1
20. o del seg n corresponda nombre del proceso Sample ID prefix Prefijo de ID seg n corresponda de muestra Sample Type Tipo de Primary Primaria muestra Workflow Defaults Flujo de On board lysis Incubation Incubaci n de lisis en placa trabajo predeterminado On board Silica Incubation Incubaci n de s lice en placa Sample Addition Guidance Off Gu a de adici n de muestras apagada Reagent Tracking Seguimiento de reactivos de lisis s lice y control interno desactivado Seguimiento de reactivos Introduzca la informaci n individual de cada muestra en la pantalla Extraction Request Solicitud de extracci n tal y como se indica a continuaci n Sample ID Identificaci n de introduzca el nombre de la muestra las muestras Request Solicitud Generic 2 0 1 o equivalente Volume ml Volumen en ml 0 100 Eluate ul Eluato en ul 25 Type Tipo Primary Primaria Priority Prioridad Normal Matrix Matriz Other Otro G Simplexa EBV p gina 5 FOCUS 4 Inicie un proceso de extracci n en el software NucliSENS6O easyMAG siguiendo el manual de usuario 5 Mezcle cada muestra control positivo bajo LPC y control negativo alto HPC en el mezclador v rtex durante 2 a 4 segundos y centrifugue brevemente para que el contenido baje al fondo del tubo 6 Pipetee 100 uL de la muestra control negativo control positivo y control sin molde NTC en los recipientes para muestras 7 Dele dos 2 pul
21. ona un resultado una regi n altamente conservada del gen Lmp2A del genoma del VEB es la diana para identificar el ADN viral en la muestra Por ltimo a fin de monitorizar el proceso de extracci n y detectar la inhibici n de la PCR se emplea un control interno La se al de amplificaci n que se obtiene por cada muestra se compara con una curva de calibraci n y se cuantifica MATERIALES SUMINISTRADOS El kit de Focus Diagnostics Simplexa para VEB contiene una cantidad suficiente de reactivos para un total de 100 reacciones Descripci n del Kit Nombre del compuesto S mbolo UE Nombre Color dell N mero dui cae En Etiqueta Abreviado i por vial kit por vial Simplexa EBV Primer Mix MOL2401 50 100 SimplexaTM Master Mix MOL2000 50 100 200 yl this Extraction 8 Amplification Control DNA M 50 150 250 yl Simplexa EBV Low Positive Control MOL2402 1 6 200 yl Simplexa EBV High Positive Control MOL2403 1 6 200 ul Focus Simplexa EBV p gina 2 Descripci n del componente Componente Descripci n Cebadores espec ficos marcados con colorante fluorescente para la cuantificaci n de VEB y para el control interno Fluor foro de la sonda Gen diana colorante Simplexa M EBV Primer Mix PM Mezcla de Control interno Q670 gen A thaliana Simplexa M Master Mix MM Mezcla maestra ADN polimerasa tamp n y dNTPs SimplexaTM Extraction amp Amplification Control DNA Un fragmento de ADN de 577 pares de bases derivado
22. pstein Barr virus infections N Engl J Med 1988 318 733 41 13 Telenti A Epstein Barr virus and lymphoproliferative disorders basic concepts and diagnostic approach Clin Immunol Newsl 1991 11 81 88 14 Au W Y et al Quantification of circulating Epstein Barr virus EBV DNA in the diagnosis and monitoring of natural killer cell and EBV positive lymphomas in immunocompetent patients Blood 1 July 2004 _ Volume 104 Number 1 243 249 15 Cornelissen J Molecular monitoring of EBV positive lymphoma Blood 1 July 2004 _ Volume 104 Number 1 9 16 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2nd Ed 1999 17 CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th ed And National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A El uso de sondas Scorpions para diagn sticos in vitro en seres humanos est cubierto por una licencia de Focus Diagnostics Inc de DxS Ltd Los colorantes Black Hole Quencher CAL Fluor y QuasarTM son marcas registradas de Biosearch Technologies Inc BTI La tecnolog a de los colorantes Black Hole Quencher CAL Fluor y Quasar est autorizada seg n un acuerdo con BTI y estos productos se venden exclusivamente con fines cl nicos diagn sticos o de investigaci n y desarrollo
23. s guarde la mezcla de cebadores la mezcla maestra y el control de extracci n y amplificaci n de ADN a una temperatura de 2 C a 8 C durante no m s de 30 d as No vuelva a congelar la mezcla de cebadores la mezcla maestra el ADN para control de extracci n y amplificaci n ni el control positivo No combine los reactivos de distintos lotes Focus Simplexa M EBV p gina 3 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1 2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Para uso diagn stico in vitro Todo el material utilizado que sea de origen humano debe ser tratado como potencialmente infeccioso La materia prima utilizada para la fabricaci n de los componentes incluyendo los controles ha sido analizada con m todos aprobados por el FDA con resultados negativos a la presencia de ant genos de superficie de hepatitis B anticuerpos de hepatitis C y de VIH 1 2 SIDA Sin embargo como ning n m todo de ensayo conocido puede ofrecer 100 de garant a de que los productos derivados de la sangre humana no transmitir n estos u otros agentes infecciosos todos los controles muestras de suero y equipos que entren en contacto con estas muestras deben considerarse potencialmente infecciosos y descontaminarse o eliminarse con las precauciones adecuadas de riesgo biol gico El CDC y los institutos nacionales de la salud recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos est n manejados en el nivel 2 de Biosafety Cuando manipule
24. s 1 16 pipetee 100 uL del ADN del Cl en 6 ml del amortiguador de lisis en un tubo de fondo c nico Mezcle con el agitador v rtex brevemente A ada a la bandeja apropiada del sistema de extracci n MagNA Pure o Por ejemplo si se extraen m s de 16 muestras 17 32 muestras pipetee 200 uL del Cl en 12 ml del amortiguador de lisis en un tubo de fondo conuco Mezcle con el agitador v rtex brevemente A ada a la bandeja apropiada del sistema de extracci n MagNA Pure Transfiera el cartucho de muestras con las muestras al extractor MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie el proceso de extracci n Despu s de completar la extracci n de cido nucleico se puede retirar el cartucho que contiene los controles extra dos y las muestras de paciente del MagNA Pure y sellarse Guarde el ADN extra do a una temperatura de entre 2 C y 8 C antes de usarlo No se recomienda el almacenamiento prolongado a esta temperatura de las muestras extra das Mantenga las muestras de ADN extra do en un bloque refrigerador mientras carga el disco Extracci n mediante el m todo NucliSENSO easyMAG de bioM rieux 1 2 3 Consulte el manual de usuario del equipo NucliSENSO easyMAG para ver el funcionamiento del equipo y del software Elija la plantilla Generic Gen rica en el software NucliSENSO easyMAG M con los siguientes par metros Default Request Solicitud por Generic 2 0 1 o equivalente defecto Run Name Prefix Prefij
25. s criterios de aceptaci n si el VEB no es detectable y el Cl es detectable La detecci n de VEB en el control sin molde indica que las muestras pudieron contaminarse durante el proceso Control de extracci n y amplificaci n de ADN IC No detectado Detectado Dentro del valor de tolerancia de la etiqueta e El control positivo bajo LPC re ne los criterios de aceptaci n si el VEB es detectable en el LPC dentro de los limites de tolerancia tal como se indica en la etiqueta de lote espec fico y el control interno Cl deber a detectarse pero no requiere ser detectado e El control positivo alto HPC re ne los criterios de aceptaci n si el VEB es detectable en el HPC dentro de los limites de tolerancia tal como se indica en la etiqueta de lote espec fico y el control interno Cl deber a detectarse pero no requiere ser detectado Simplexa M EBV p gina 7 Focus P A 2 Interpretaci n de los resultados Interpretaci n de los resultados Ejemplo valor de VEB valor de Cl Interpretaci n No detectado Detectado VEB No detectado lt 900 copias ml VEB detectado por debajo del l mite inferior de cuantificaci n j LLoQ Lower Limit of Quantitation ar e e aseo cnc a a gt 807x10copiasimi NC VEB detectado sobre el l mite superior de cuantificaci n ULOQ Upper Limit of Quantitation 3 Validez del resultado de la muestra Una muestra es v lida si 1 El VEB no es detectado y el Cl es detectado 2 VEB e
26. s detectado El Cl no requiere ser detectado para resultados positivos de VEB 3 Se deben examinar las curvas de amplificaci n para cada resultado en especial cuando se notifica un mensaje de Calidad de datos Data Quality Una curva de amplificaci n v lida muestra un incremento exponencial regular Consulte el manual del usuario para obtener m s recomendaciones LIMITACIONES 1 Los analistas deben tener una buena formaci n y estar familiarizados con los procedimientos de las pruebas y la interpretaci n de los resultados antes de realizar la prueba 2 El 3M Integrated Cycler Studio conserva el ltimo archivo de calibraci n v lido para cuantificar muestras de pacientes desconocidas Las normas de cuantificaci n y las muestras de los pacientes deben extraerse utilizando la misma metodolog a de extracci n o usted recibir resultados err neos 3 Cuando se realiza el seguimiento de un paciente el m todo de extracci n utilizado para realizar la determinaci n inicial en la muestra debe ser utilizado en todas las determinaciones posteriores 4 Todos los resultados de esta prueba o de cualquier otra prueba deben contrastarse con los antecedentes cl nicos los datos epidemiol gicos y otros datos en poder del m dico a cargo de la evaluaci n del paciente 5 La prevalencia de la infecci n influir en el valor diagn stico de la prueba 6 Como ocurre con otras pruebas los resultados negativos no descartan una infecci n por VEB
27. sos en el agitador v rtex al control interno Cl y centrifugue brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo 8 Pipetee 5uL del Cl en cada muestra y en todos los pocillos de control Cambie las puntas entre muestras 9 Cargue los recipientes de las muestras los nuevos desechables del aspirador y los reactivos en el extractor easyMAG siguiendo el manual del usuario 10 Inicie la lisis en la placa e incube las muestras lisadas durante 10 minutos antes de a adir la mezcla de s lice magn tica 11 Durante el periodo de incubaci n de lisis prepare la mezcla de s lice magn tica Mezcle la s lice y dil yala en agua sin nucleasas a adiendo 1 parte de s lice magn tica a 1 parte de agua sin nucleasas p ej 540 ul de s lice magn tica 540 ul de agua sin nucleasas Prepare un m nimo de 135 ul de mezcla de s lice magn tica por muestra 12 Para transferir la mezcla de s lice a los pocillos de las tiras ELISA mezcle la mezcla de s lice magn tica y use 1 punta h galo con el modo P2 de la pipeta Biohit Pulse Start Iniciar para aspirar 1050 uL de mezcla de s lice magn tica y pulse otra vez Start Iniciar para dispensar la primera administraci n en el tubo de mezcla de s lice Pulse Start Iniciar para dispensar 125 ul de la mezcla de s lice magn tica en 8 pocillos individuales de la tira ELISA Repita la operaci n seg n el n mero de tiras ELISA adicionales 13 Despu s del periodo de incubaci n de lisis de 10 mi
28. stein Barr virus in Hodgkin s disease Relation to age and subtype Cancer 1993 1 3124 9 5 Young LS Dawson CW Clark D et al Epstein Barr virus gene expression in nasopharyngeal carcinoma J Gen Virol 1988 69 1051 65 6 Hanto DW Frizzera G Gajl Peczalska KJ et al The Epstein Barr virus in the pathogenesis of post transplant lymphoma Transplant Proc 1981 13 756 60 7 Hanto DW Frizzera G Gajl Peczalska KJ et al Epstein Barr virus induced B cell lymphoma after renal transplantation Acyclovir therapy and transition from polyclonal to monoclonal B cell proliferation N Engl J Med 1982 306 913 8 8 Borisch B Gatter KC Tobler A et al Epstein Barr virus associated anaplastic large cell lymphoma in renal transplant recipients Am J Clin Pathol 1992 98 312 8 9 Cinque P Brytting M Vago L et al Epstein Barr virus DNA in cerebrospinal fluid from patients with AIDS related primary lymphoma of the central nervous system Lancet 1993 342 398 401 10 Arribas JR Clifford DB Fichtenbaum CJ et al Detection of Epstein Barr virus DNA in cerebrospinal fluid for diagnosis of AIDS related central nervous system lymphoma J Clin Microbiol 1995 33 1580 1583 11 Gaillard F Mechinaud Lacroix F Papin S et al Primary Epstein Barr virus infection with clonal T cell lymphoproliferation Am J Clin Pathol 1992 98 324 33 12 Jones JF Shurin S Abramowsky C et al T cell lymphomas containing Epstein Barr viral DNA in patients with chronic E
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