(Dako Autostainer/Autostainer Plus) N.º de catálogo IK002
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1. Uso previsto Sin nimos del ant geno Resumen y explicaci n Reactivo suministrado Inmun geno 119819 001 C DuoFLEX Cocktail Anti CD3 Anti CD20cy Ready to Use Dako Autostainer Autostainer Plus N de cat logo IK002 Para uso en diagn stico in vitro Las combinaciones de anticuerpos DuoFLEX Cocktail Polyclonal Rabbit Anti Human CD3 y Monoclonal Mouse Anti Human CD20cy clon L26 Dako Autostainer Autostainer Plus est n indicadas para su uso en inmunohistoqu mica junto con los instrumentos Dako Autostainer Autostainer Plus El anticuerpo Polyclonal Rabbit Anti Human CD3 resulta til en la identificaci n de las c lulas T y neoplasias relacionadas 1 2 El anticuerpo Anti Human CD20cy marca c lulas del linaje de c lulas B y resulta til para la identificaci n de neoplasias derivadas de c lulas B 3 La interpretaci n de los resultados de cualquier tinci n o su ausencia debe complementarse con estudios morfol gicos con controles adecuados y debe evaluarla un anatomopat logo cualificado en el contexto de la historia cl nica del paciente y de otras pruebas diagn sticas CD3 T3 complejo CD3 4 CD20 L26 5 CDs El CD3 consta de por lo menos cuatro componentes diferentes y 6 de 20 28 kDa En la superficie celular de los linfocitos el CD3 se asocia sin covalencia con el receptor de c lulas T TCR Se cree que los componentes del CD3 del complejo TCR CD3 intervienen en transducci2. 17 y de los 40 linfomas de c lulas B con la excepci n de las leucemias linfobl sticas agudas comunes y del linfoma plasmac tico maligno En la enfermedad de Hodgkin en 9 27 casos se observ una fuerte tinci n de la membrana de superficie de las c lulas Reed Sternberg 18 De las enfermedades linfoproliferativas de linaje de c lulas T el anticuerpo marc 0 73 3 mientras que otros estudios mostraron 1 18 18 y 1 111 19 casos positivos Se han informado casos inusuales de linfomas perif ricos de c lulas T positivos para CD20 18 19 307771ES_001 p 3 4 Referencias bibliogr ficas 10 Ti 12 13 14 15 16 17 18 19 Mason DY Cordell J Brown M Pallesen G Ralfkiaer E Rothbard J et al Detection of cells in paraffin wax embedded tissue using antibodies against a peptide sequence from the CD3 antigen J Clin Pathol 1989 42 1194 1200 Pilozzi E Pulford K Jones M Muller Hermelink H K Falini B Ralfkiaer E et al Co expression of CD79a JCB117 and CD3 by lymphoblastic lymphoma J Pathol 1988 186 140 3 Takami T Qi C F Yamada T Yamashina M Kon S I Ishii Y et al B20 3 Reactivity and specificity of L26 pan B cell mAb on 322 cases of fresh and paraffin embedded lymphoproliferative diseases In Knapp W D rken B Gilks WR Rieber EP Schmidt RE Stein H et al editors Leukocyte typing IV White cell differentiation antigens Proceedings of the 4th International Workshop and Co
3. n de la se al sobre el reconocimiento del ant geno por la TCR 6 Las c lulas T expresan el CD3 en el timo la m dula sea el tejido linfoide perif rico y la sangre 7 8 Se sabe que el nico otro tipo de c lulas normales marcadas por los anticuerpos contra CD3 son las c lulas de Purkinje en el cerebelo 9 El ant geno CD3 se detecta primero en timocitos precoces y su aparici n probablemente representa uno de los primeros signos de compromiso del linaje de c lulas T 7 En los timocitos inmaduros la expresi n de CD3 es exclusivamente citoplasm tica el CD3 asociado con la membrana aparece posteriormente cuando madura la c lula 7 La mayor a de las neoplasias de c lulas T expresan el ant geno CD3 mientras que ste se encuentra ausente de los tumores malignos linfoides de c lulas no T 10 De acuerdo con el patr n de s ntesis del ant geno en timocitos normales el primer sitio donde se detecta el CD3 dentro de las c lulas neopl sicas es el citoplasma celular 7 Se ha considerado que el CD3 es un marcador fundamental en la evaluaci n inicial de los trastornos linfoproliferativos cr nicos 11 La leucemia de linfocitos granulares grandes de c lulas T T LGL se caracteriza por el inmunofenotipo CD3 CD57 CD56 y la reordenaci n clonal de los genes receptores de c lulas T 12 CD20 CD20 es una prote na transmembrana no glucosilada que se expresa en los precursores de c lulas B y en las c lulas B maduras pe
4. High pH 50x n de cat logo K8004 Se deben aplicar los siguientes par metros para PT Link temperatura de precalentamiento 65 temperatura y tiempo de recuperaci n del ep topo 97 durante 20 1 minutos enfriar a 65 Extraiga la gradi lla para portaobjetos Autostainer con los portaobjetos del tanque PT Link e introduzca los portaobjetos inmediatamente en un bote o tanque p ej PT Link Rinse Station c digo PT109 con EnVision FLEX Wash Buffer 20x Link n de cat logo K8007 diluido y a temperatura ambiente Deje los portaobjetos en Wash Buffer durante 1 5 minutos Cortes incluidos en parafina el m todo preferido para la colocaci n de cubreobjetos consiste en la utilizaci n del medio de montaje acuoso Dako Faramount n de cat logo S3025 Como m todo alternativo de preparaci n de una muestra tanto el desparafinado como la recuperaci n del ep topo se pueden realizar en el PT Link con un procedimiento modificado Consulte las instrucciones en la Gu a del usuario de PT Link Despu s de finalizar el procedimiento de tinci n se deben secar al aire a 60 durante una hora sumergir en xileno y montar los cortes usando un medio de montaje permanente Debe evitarse el uso de alcohol con los medios de montaje permanente dado que puede reducir la reactividad de la soluci n de crom geno rojo Antes de realizar el montaje los cortes de tejido no se deben secar durante el tratamiento previo ni durante el siguiente
5. ar a 2 8 No utilizar despu s de la fecha de caducidad impresa en el vial Si los reactivos se almacenan bajo condiciones diferentes a las especificadas dichas condiciones deben ser verificadas por el usuario No existen signos evidentes que indiquen la inestabilidad de este producto Por lo tanto los controles positivo y negativo deber n realizarse de manera simult nea con las muestras del paciente Si observa una tinci n inesperada que no puede explicarse por variaciones en los procedimientos del laboratorio y sospecha de la existencia de un problema con el anticuerpo p ngase en contacto el servicio t cnico de Dako La combinaci n de anticuerpos puede utilizarse para marcar cortes de tejido fijados con formol e incluidos en parafina Las muestras de tejido deben cortarse en secciones de aproximadamente 4 um Se requiere un tratamiento previo con recuperaci n del ep topo inducida por calor HIER por sus siglas en ingl s Se obtienen resultados ptimos al pretratar los tejidos con EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x n de cat logo K8004 Cortes desparafinados se recomienda el tratamiento previo de los cortes de tejido desparafinados fijados en formol e incluidos en parafina usando Dako PT Link n de cat logo PT100 PT101 Para m s detalles consulte la Gu a del usuario de PT Link Siga el procedimiento de tratamiento previo explicado en el prospecto de la EnVision FLEX Target Retrieval Solution
6. c 149 149 casos de leucemias linfomas linfobl sticos agudos ALL de c lulas T precursoras En 131 149 casos el 100 de las c lulas fueron positivas en 14 casos entre el 50 y el 90 de las c lulas fueron positivas y en 4 casos menos del 50 de las c lulas fueron positivas No se observ ning n marcado en 68 68 casos de ALL de c lulas B precursoras aparte de las c lulas T infiltrantes reactivas 2 CD20 el antigeno CD20 se marco en la mayor parte de las 131 neoplasias de c lulas B analizadas 3 El marcado con el anticuerpo mostr que en la diferenciaci n de las c lulas B el ant geno CD20 no se expres en c lulas linfoides muy inmaduras 0 6 leucemias no diferenciadas agudas sino que comenz a expresarse en los estadios madurativos tempranos 14 34 leucemias linfobl sticas agudas comunes y 7 9 leucemias linfoblasticas agudas pre B Adem s el ant geno CD20 se expres plenamente en las c lulas B maduras 15 15 leucemias linfociticas cr nicas 3 3 prolinfoc ticas 3 3 de c lulas peludas 6 7 de c lulas linfosarcomatosas y 45 46 linfomas malignos de c lulas B incluidos los linfomas de Burkitt de Waldenstr m e inmunobl sticos de c lulas B El ant geno CD20 desaparece en los plasmocitos y el anticuerpo s lo marc 1 2 leucemias de plasmocitos y 0 12 mielomas 3 Otros estudios brindaron resultados similares que muestran una tinci n positiva en 44 44 linfomas de c lulas B inmunobl sticos y de c lulas grandes
7. d New York Tokyo Oxford University Press 1989 p 295 6 Garson JA Beverley PC Coakham HB Harper El Monoclonal antibodies against human T lymphocytes label Purkinje neurones of many species Nature 1982 298 375 7 Erber WN Mynheer LC Mason DY APAAP labeling of blood and bone marrow samples for phenotyping leukaemia Lancet 1986 i 761 5 Braylan RC Orfao A Borowitz MJ Davis BH Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias results of an international consensus meeting Cytometry 2001 46 23 7 Kingreen D Siegert W Chronic lymphatic leukemias of T and NK cell type Leukemia 1997 11 Suppl 2 S46 9 Tedder TF Engel P CD20 a regulator of cell cycle progression of B lymphocytes Immunology Today 1994 15 450 4 Ishii Y Takami T Yuasa H Takei T Kikuchi K Two distinct antigen systems in human B lymphocytes identification of cell surface and intracellular antigens using monoclonal antibodies Clin Exp Immunol 1984 58 183 92 Lanier LL Chang C Spitz H Pillips JH Expression of cytoplasmic CD3e proteins in activated human adult natural killer NK cells and CD3y 5 e complexes in fetal NK cells Implications for the relationship of NK and T lymphocytes J Immunol 1992 149 1876 80 Mason DY Comans Bitter WM Cordell JL Verhoeven MAJ van Dongen JJM Antibody L26 recognizes an intracellular epitope on the B cell associated CD20 antigen Am J Pathol 1990 136 1215 22 Cartun RW Coles FB Pa
8. las reas interfoliculares de la am gdala muestran una reacci n de tinci n de moderada a fuerte mientras que las c lulas T en los centros germinales de am gdala y en el epitelio del colon muestran una reacci n de tinci n de color rojo de leve a moderada CD20 El anticuerpo CD20 en el tejido linfoideo normal marca el centro de las c lulas germinales los linfocitos de la zona del manto y los linfocitos interfoliculares dispersos pero no las c lulas T los histiocitos y los plasmocitos 17 18 No se observ marcado en epidermis gl ndulas seb ceas fol culos pilosos y gl ndulas ecrinas de la piel epitelio folicular en la tiroides neumocitos y epitelio bronquial pulmonar y una gran cantidad de otros tejidos no linfoides normales analizados 17 Las c lulas B del centro germinal y de la zona del manto en am gdala muestran una reacci n a la tinci n de moderada a fuerte mientras que las c lulas B aisladas del h gado tienen una reacci n de tinci n marr n de d bil a moderada Tejidos anormales CD3 El anticuerpo marc 73 96 neoplasias de c lulas T incluidas 7 9 linfobl sticas 25 35 pleom rficas 5 5 inmunobl sticas 5 5 angioinmunoblasticas del tipo linfoadenopatico 2 2 linfomas de zona T 19 19 micosis fungoides sindromes de S zary 2 3 linfomas de Lennert 4 13 linfomas anaplasicos de c lulas grandes Ki 1 positivos 3 4 papulosis linfomatoides 1 1 linfoma asociado con enfermedad cel aca 1 El anticuerpo mar
9. nes de Dako o a un especialista del servicio t cnico para reprogramar el protocolo Verifique que el rendimiento del protocolo ajustado siga siendo v lido confirmando que el patr n de tinci n sea id ntico al descrito en Caracter sticas de resultados Se recomienda la contratinci n en hematoxilina usando EnVision FLEX Hematoxylin Dako Autostainer Autostainer Plus n de cat logo K8018 Despu s de finalizado el procedimiento de tinci n se deben secar al aire sumergir en xileno y montar los cortes usando un medio de montaje permanente Debe evitarse el uso de alcohol con los medios de montaje permanente dado que puede reducir la reactividad de la soluci n de crom geno rojo Los controles positivo y negativo deber n realizarse de manera simult nea empleando el mismo protocolo que para las muestras del paciente El tejido de control positivo debe incluir la am gdala Asimismo las c lulas y estructuras deben mostrar patrones de reacci n como se describe para este tejido en Caracter sticas de resultados en todas las muestras positivas CD3 las c lulas marcadas por el anticuerpo CD3 muestran tinci n citoplasm tica roja o de la membrana CD20 las c lulas B marcadas por el anticuerpo CD20 muestran tinci n marr n del lado citoplasm tico de la superficie de la membrana celular Tejidos normales CD3 El anticuerpo CD3 marca las c lulas T de diversos tejidos incluidos la am gdala y el colon Las c lulas T en
10. nference 1989 Feb 21 25 Vienna Austria Oxford New York Tokyo Oxford University Press 1989 p 134 6 CD guide In Kishimoto T Kikutani H von dem Borne AEG Goyert SM Mason DY Miyasaka M et al editors Leucocyte typing VI White cell differentiation antigens Proceedings of the 6th International Workshop and Conference 1996 Nov 10 14 Kobe Japan New York London Garland Publishing Inc 1997 p 1111 Zhou L J Tedder TF CD20 workshop panel report In Schlossman SF Boumsell L Gilks W Harlan JM Kishimoto T Morimoto C et al editors Leukocyte typing V White cell differentiation antigens Proceedings of the 5th International Workshop and Conference 1993 Nov 3 7 Boston USA Oxford New York Tokyo Oxford University Press 1995 p 511 4 Jacobs H Pre TCR CD3 and TCR CD3 complexes decamers with differential signalling properties Immunol Today 1997 18 565 9 Campana D Thompson JS Amlot P Brown S Janossy G The cytoplasmic expression of CD3 antigens in normal and malignant cells of the T lymphoid lineage J Immunol 1987 138 648 55 Tunnacliffe HA Olsson C Traunecker A Krissansen GW Karjalainen K De la Hera A The majority of CD3 epitopes are conferred by the epsilon chain In Knapp W D rken B Gilks WR Rieber EP Schmidt RE Stein H et al editors Leukocyte typing IV White cell differentiation antigens Proceedings of the 4th International Workshop and Conference 1989 Feb 21 25 Vienna Austria Oxfor
11. o anti CD20 en el Fifth International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens 5 Taller y Conferencia Internacional sobre Antigenos para la diferenciaci n leucocitaria humana 5 El an lisis SDS PAGE de inmunoprecipitados formados entre el lisado de c lulas de amigdala marcadas con I y el anticuerpo muestra una reacci n principalmente con polip ptidos de 30 kDa y 33 kD 14 Los estudios con c lulas COS 1 transfectadas con ADNc que codifican la mol cula CD20 indican que el anticuerpo marca el ep topo intracitopl smico localizado en la mol cula de CD20 16 Para usuarios profesionales 2 Este producto contiene azida s dica NaN3 un compuesto qu mico altamente t xico en su forma pura Aunque no est clasificada como peligrosa a la concentraci n en la que se encuentra en el producto la azida s dica puede reaccionar con el cobre o el plomo de las ca er as para formar compuestos de azidas met licas altamente explosivas Una vez desechado deje correr abundante cantidad de agua para evitar acumulaciones de azidas met licas en las ca er as 3 Al igual que con cualquier producto derivado de fuentes biol gicas deber n aplicarse procedimientos adecuados de manejo 4 Utilice el equipo de protecci n personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel 5 La soluci n que no se utilice deber desecharse de acuerdo con las normativas locales provinciales y nacionales Almacen
12. procedimiento de tinci n inmunohistoqu mica Para una mejor adherencia de los cortes de tejidos a los portaobjetos se recomienda el uso de Dako FLEX IHC Microscope Slides n de cat logo K8020 307771ES_001 p 2 4 Procedimiento de tinci n incluido el material necesario pero no suministrado Interpretaci n de la tinci n Caracter sticas de resultados 119819 001 El sistema de visualizaci n recomendado es EnVision DuoFLEX Doublestain System Link n de cat logo K6807 Los pasos de tinci n y los tiempos de incubaci n han sido preprogramados en el software de los instrumentos Dako Autostainer Autostainer Plus usando los siguientes protocolos Plantilla del protocolo DuoFLEX2 volumen de aplicaci n 200 uL o DuoFLEX3 volumen de aplicaci n 300 uL Autoprograma CD3CD20 sin contratinci n o CD3CD20H con contratinci n Todos los pasos de incubaci n deben realizarse a temperatura ambiente Consulte el Manual del usuario para m s detalles sobre el instrumento correspondiente Si todav a no est n disponibles los protocolos en el instrumento Dako Autostainer utilizado comun quese con el servicio t cnico de Dako Las condiciones ptimas pueden variar seg n la muestra y el m todo de preparaci n Por lo tanto deber n determinarse individualmente en cada laboratorio Si el pat logo encargado de la evaluaci n desea otra intensidad de tinci n se puede solicitar informaci n a un especialista en aplicacio
13. ro se pierde tras la diferenciaci n en los plasmocitos 13 En las c lulas B en reposo CD20 aparece en una forma no fosforilada de 33 kDa Tras la estimulaci n mitogena CD20 se vuelve altamente fosforilada isoformas de 35 37 kDa y es una fosfoproteina dominante en las c lulas B activadas en las l neas celulares B y en las leucemias de c lulas peludas 5 Los extremos largos N y C terminal de la prote na se ubican en el lado citopl smico de la membrana y s lo una porci n menor de la prote na est expuesta en la superficie de la c lula 13 A los anticuerpos que reaccionan con los ep topos citopl smicos CD20 se los denomina CD20cy 5 Se sugiere que CD20 participa directamente en la regulaci n del flujo conductivo transmembrana de Ca de las c lulas B lo que indica la posible funci n de CD20 como regulador de la proliferaci n y la diferenciaci n 13 Consulte las Instrucciones generales para la tinci n inmunohistoqu mica de Dako o las instrucciones del sistema de detecci n de los procedimientos de IHQ para 1 Principio del procedimiento 2 Material necesario pero no suministrado 3 Almacenamiento 4 Preparaci n de la muestra 5 Procedimiento de tinci n 6 Control de calidad 7 Soluci n de problemas 8 Interpretaci n de la tinci n 9 Limitaciones generales Combinaci n de anticuerpo policlonal de conejo y monoclonal de rat n listos para usar suministrados en forma l quida en un tamp n que contiene prote na e
14. stabilizadora y 0 015 mol L de azida s dica Anticuerpo policlonal de conejo anti humano CD3 Anticuerpo monoclonal de rat n anti humano CD20cy clon L26 Isotipo lgG2a kappa CD3 p ptido sint tico compuesto por 156 168 amino cidos de la parte citoplasmatica de la cadena e del CD3 humano unido a la tiroglobulina 1 CD20 c lulas B de amigdala humana 14 307771ES_001 p 1 4 Especificidad Precauciones Almacenamiento Preparacion de las muestras incluido el material necesario pero no suministrado 119819 001 CDs En la transferencia de Western el anticuerpo CD3 detecta bandas de los pesos moleculares esperados para los ant genos CD3 2 El anticuerpo reconoce el CD3e tanto en la l nea celular T Jurkat como en una l nea celular citol tica natural NK11 pero no reacciona con lisados preparados de varias l neas de c lulas B Raji Ramos y JY con una l nea celular mieloide U937 o con una l nea celular de carcinoma de colon Colo 205 15 En la inmunoprecipitaci n de lisados Nonidet P40 de linfoblastos T con superficie yodada el anticuerpo precipita las cadenas y 26 kDa 21 kDa y e 19 kDa de la mol cula de CD3 con un patr n de precipitaci n similar al observado con el anticuerpo monoclonal de rat n anti humano CD3 bien caracterizado clon UCHT1 1 En el ELISA el anticuerpo marca el p ptido CD3 utilizado como inmun geno CD20 El anti CD20cy humano clon L26 fue agrupado com
15. stuszak WT Utilization of monoclonal antibody L26 in the identification and confirmation of B cell lymphomas A sensitive and specific marker applicable to formalin and B5 fixed paraffin embedded tissues Am J Pathol 1987 129 415 21 Norton AJ Isaacson PG Monoclonal antibody L26 an antibody that is reactive with normal and neoplastic B lymphocytes in routinely fixed and paraffin wax embedded tissue J Clin Pathol 1987 40 1405 12 Blakolmer K Vesely M Kummer JA Jurecka W Mannhalter C Chott A Immunoreactivity of B cell markers CD79a L26 in rare cases of extranodal cytotoxic peripheral T NK T cell lymphomas Mod Pathol 2000 13 766 72 Numero de catalogo A Limite de temperatura Consulte las instrucciones de uso atal TEC REP Fabricante PTOO39 Rev C Edicion 03 09 119819 001 Dako North America Inc Dako Denmark A S rg 6392 Via Real Produktionsvej 42 C digo de lote Fecha de caducidad Tel 805 566 6655 Tel 45 4485 9500 Fax 805 566 6688 Fax 45 4485 9595 Representante autorizado en la Comunidad Europea Producto sanitario para diagn stico in vitro Technical Support 800 424 0021 Customer Service 800 235 5763 www dako com 307771ES_001 p 4 4
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