FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone
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1. Alle Inkubationsschritte sollten bei Zimmertemperatur durchgef hrt werden N here Einzelheiten sind dem Benutzerhandbuch f r das jeweilige Ger t zu entnehmen Bei F rbedurchl ufen mit lt 10 Objekttr gern sollte der Zusatz Schritt auf Puffersp lgang eingestellt werden F r F rbedurchl ufe mit mehr als 10 Objekttr gern den Zusatz Schritt auf Keine einstellen Dies sorgt f r vergleichbare Waschzeiten Optimale Bedingungen k nnen je nach Probe und Vorbereitungsverfahren unterschiedlich sein und sollten vom jeweiligen Labor selbst validiert werden 5 Die Leistung des angepassten Protokolls muss verifiziert werden indem berpr ft wird ob das F rbemuster mit dem unter Leistungsmerkmale beschriebenen F rbemuster identisch ist Die Gegenf rbung in H matoxylin sollte mit EnVision FLEX Hematoxylin Dako Autostainer Autostainer Plus Code Nr K8018 ausgef hrt werden Empfohlen wird ein nichtw ssriges permanentes Fixiermittel Es wird empfohlen Positiv und Negativkontrollen zur gleichen Zeit und mit demselben Protokoll wie die Patientenproben zu testen Idealerweise sollten die positiven Kontrollen ein schwach ER exprimierendes Mammakarzinomgewebe enthalten Alternativ kann benignes Zervixgewebe verwendet werden Die Zellen Strukturen m ssen in allen positiven Proben die f r dieses Gewebe unter Leistungsmerkmale beschriebenen Reaktionsmuster aufweisen Als Negativkontrolle wird die gebrauchsfertig2. autres tests diagnostiques par un pathologiste qualifi ER a Les r cepteurs st ro diens pr sentent une affinit et une sp cificit lev es envers leurs ligands Le r cepteur des osstrogenes humains ER est une prot ine dim re de 65 kDa situ e principalement sur la membrane des noyaux cellulaires et appartient une classe de prot ines trans activatrices qui stimulent la transcription en se liant des l ments ADN sp cifiques galement connus comme l ments de r ponse hormonale Via la liaison aux strog nes TER est induit pour stimuler la transcription g nique raison pour laquelle on parle galement d activateur de transcription inductible 1 2 Des tudes pr c dentes ont montr que le statut ER est positivement corr l au r sultat sans traitement c d le pronostic pour les cancers invasifs du sein bien diff renci s et avec la r ponse au traitement antihormonal p ex le tamoxif ne 2 On a d couvert que les cestrog nes sont concentr s de pr f rence dans les organes cibles de l oestrogene des animaux et dans les cancers du sein de la femme et que TER sert de m diateur aux effets mitog niques des strog nes Des recherches sur les m canismes biologiques de la croissance du cancer du sein ont mis en vidence que le taux de croissance d pend de la pr sence d osstrogenes ou de progest rone ou des deux dans la plupart des cancers du sein 2 Par cons quent on consid re que le sta
3. Chambon P Functional domains of the human estrogen receptor Cell 1987 51 941 51 2 Elledge RM Fuqua SAW Ch 31 Estrogen and Progesterone Receptors Diseases of the Breast Harris et al eds Lippincott Williams amp Wilkins 2000 471 85 3 Hammond MEH Hayes DF Dowsett M Allred C Hagerty KL Badve S et al American Society of Clinical Oncology College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer Arch Pathol Lab Med 2010 134 907 22 4 Fitzgibbons FK Page DL Weaver D Thor AD Allred DC Clark GM et al Prognostic factors in breast cancer College of American Pathologists Consensus Statement 1999 Arch Pathol Lab Med 2000 124 966 78 5 Fitzgibbons PL Murphy DA Hammond EH Allred C Valenstein PN Recommendations for Validating Estrogen and Progesterone Receptor Immunohistochemistry Assays Arch Pathol Lab Med 2010 134 930 35 6 Diaz LK Sneige N Estrogen receptor analysis for breast cancer current issues and keys to increasing testing accuracy Adv Anat Pathol 2005 12 10 9 Review 7 Clinical and Laboratory Standards Institute formerly NCCLS Quality assurance for immunocytochemistry Approved guideline CLSI document MM4 A 1 56238 396 5 CLSI 940 West Valley Road Suite 1400 Wayne PA 19087 1898 USA 1999 8 M3634 IHC003 D03803 Report on file ENGLISH Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 has been created by Epi
4. EnVision FLEX Hematoxylin Dako Autostainer Autostainer Plus R f K8018 L utilisation d un milieu de montage permanent non aqueux est recommand e Il est recommand de proc der des contr les positifs et n gatifs en m me temps et avec le m me protocole que les chantillons du patient Id alement les contr les positifs doivent inclure des tissus de carcinome mammaire a faible expression d ER Des tumeurs b nignes du col de l ut rus pourraient tre utilis es comme alternative Les cellules structures doivent pr senter les sch mas de r action d crits pour ces tissus dans les Caract ristiques de performance pour tous les chantillons positifs Le r actif de contr le n gatif recommand est le FLEX Universal Negative Control Rabbit pr t l emploi Dako Autostainer Autostainer Plus R f IS600 Le profil de coloration cellulaire est nucl aire Le marquage cytoplasmique s il est observ doit tre consid r comme non sp cifique Un r sultat positif est d fini comme une coloration nucl aire dans 21 des cellules tumorales 6 Ce dernier est coh rent avec la valeur seuil 21 de cellules tumorales positives recommand e par le groupe ASCO CAP pour l valuation positive 3 1 Des faux n gatifs peuvent tre dus une d gradation de l antigene dans les tissus au fil du temps Les chantillons doivent tre color s dans les 2 mois suivant le montage des tissus sur les lames lorsqu ils s
5. e pendant 1 5 minutes 13 Incuber les coupes de tissu avec 200 uL d EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 5 1 minutes 14 Rincer dans de l eau d ionis e pendant 1 5 minutes 15 Monter les lames avec un milieu de montage permanent PED OVP Oo PO om P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 5 12 Interpr tation de la coloration Limites sp cifiques au produit Caract ristiques de performance 121910 001 Grille de programmation du dosage recommand Programming Grid Toutes les tapes d incubation doivent tre effectu es a temp rature ambiante Pour plus de d tails se r f rer au Manuel de l op rateur sp cifique l instrument L tape Auxiliary doit tre r gl e sur rinse buffer lors des cycles de coloration comportant 10 lames ou moins Pour les cycles de coloration comportant plus de 10 lames l tape Auxiliary doit tre r gl e sur none Cela confirme des temps de lavage comparables Les conditions optimales peuvent varier en fonction du pr l vement et des m thodes de pr paration et doivent tre valid es par chaque laboratoire de mani re individuelle 5 V rifier que l ex cution du protocole modifi est toujours valide en s assurant que le sch ma de coloration est identique au sch ma de coloration d crit dans les Caract ristiques de performance Il est recommand d effectuer une contre coloration dans de l h matoxyline l aide d
6. Liver 3 0 3 Lung 3 0 3 Mesothelial cells 3 0 3 Muscle cardiac 3 0 3 Muscle skeletal 3 0 3 Nerve peripheral 3 0 3 Ovary 3 3 3 Follicular epithelium 20 40 nuclear 2 3 Stromal cells 10 30 nuclear Pancreas 3 0 3 Parathyroid 3 0 3 Pituitary 3 0 3 Prostate 3 3 3 Stromal cells lt 5 30 nuclear Salivary gland 3 0 3 Skin 3 0 3 Small intestine 3 0 3 Spleen 3 0 3 Stomach 3 0 3 Testis 3 0 3 P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 3 12 Utilisation pr vue Synonymes de l antig ne R sum et explication 121910 001 Thymus 3 0 3 Thyroid 3 0 3 Tonsil 3 2 3 Epithelial cells 1 nuclear 1 3 Germinal center lymphocytes lt 1 nuclear Uterus 3 3 3 Myometrium lt 1 40 nuclear 3 3 Glandular epithelium 50 80 nuclear 3 3 Stromal cells 30 80 nuclear Method comparison Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 testing was performed with EnVision FLEX and scored according to ASCO CAP guidelines 21 cut off 3 Anti ER a cocktail Clones 1D5 and ER 2 123 testing was performed using Dako ER PR pharmDx Kit and scored using the Allred scoring guideline described in the package insert The method comparison data are presented in Table 2 Using these respective scoring guidelines Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 was highly concordant with the ER a antibody component of Dako ER PR pharmDx Kit staining exhib
7. Rabbit Ready to Use Dako Autostainer Autostainer Plus Code IS600 The cellular staining pattern is nuclear Cytoplasmic labeling if observed should be regarded as non specific A positive result is defined as nuclear staining in 21 of tumor cells 6 This is consistent with ASCO CAP s recommended cut off of 21 positive tumor cells for positive assessment 3 1 False negative results could be caused by degradation of the antigen in the tissues over time Specimens should be stained within 2 months of mounting of tissues on slides when stored at room temperature 7 2 For optimal and reproducible results the ER protein requires target retrieval when tissues are routinely fixed neutral buffered formalin and paraffin embedded 3 Use of Dako Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 on tissues with fixatives other than formalin has not been validated Precision Serial sections from each of three different formalin fixed paraffin embedded blocks of breast carcinoma were collected for testing Testing was performed as follows Intra run Precision Following the standard EnVision FLEX High pH protocol three sections from each tissue block were stained with Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 Concurrently one section from each block was stained with a negative control reagent Inter run Precision Staining one section from each tissue block the above procedure was repeated on two additional days Concurrently
8. Technical Support 800 424 0021 Customer Service 800 235 5763 www dako com PTO039 Rev C Edition 06 11 121910 001 P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 12 12
9. marquage des coupes tissulaires incluses en paraffine et fix es au formol L paisseur des coupes d chantillons de tissu doit tre d environ 4 um Le pr traitement avec un d masquage d pitope induit par la chaleur HIER est n cessaire l aide du Dako PT Link R f PT100 PT101 Pour plus de d tails se reporter au Guide d utilisation du PT Link Des r sultats optimaux sont obtenus en pr traitant les tissus l aide de l EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x R f K8010 K8004 pendant 20 minutes a 97 suivies de 5 minutes dans de Il EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 Coupes incluses en paraffine le pr traitement des coupes tissulaires fix es au formol et incluses en paraffine est recommand l aide de la proc dure 3 en 1 de pr paration de l chantillon pour Dako PT Link Suivre la proc dure de pr traitement indiqu e dans la notice de EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x R f K8010 K8004 Apr s la coloration les sections doivent tre d shydrat es claircies et mont es l aide d un milieu de montage permanent Les coupes de tissus ne doivent pas s cher lors du traitement ni lors de la proc dure de coloration immunohistochimique qui suit Pour une meilleure adh rence des coupes de tissus sur les lames de verre il est recommand d utiliser des lames Dako Silanized Slides R f S3003 Le systeme de visualisation recommand est le suiv
10. 1 kann auch in als ungefahrlich eingestuften Konzentrationen mit Blei und Kupferrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachsp len um Metallazidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen 3 Wie alle Produkte biologischen Ursprungs m ssen auch diese entsprechend gehandhabt werden Geeignete Schutzkleidung tragen um Augen und Hautkontakt zu vermeiden 5 Nicht verwendete L sung ist entsprechend den einschl gigen gesetzlichen Regelungen von Bund L ndern und Gemeinden zu entsorgen Bei 2 8 aufbewahren Nach Ablauf des auf dem Fl schchen aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr verwenden Werden die Reagenzien nicht entsprechend den angegebenen Bedingungen aufbewahrt m ssen die Bedingungen vom Anwender gepr ft werden Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen f r eine eventuelle Produktinstabilit t Positiv und Negativkontrollen sollten daher zur gleichen Zeit wie die Patientenproben getestet werden Falls es zu einer unerwarteten F rbung kommt die sich nicht durch Unterschiede bei Laborverfahren erkl ren l sst und auf ein Problem mit dem Antik rper hindeutet ist der technische Kundendienst von Dako zu verst ndigen Der Antik rper eignet sich zur Markierung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeschnitten Gewebeproben sollten in Schnitte von ca 4 um St rke geschnitten werden Es ist eine Vorbehandlung durch hitzeinduzierte Epitopdemaskierung HIER Verfa
11. S Intended use Synonyms for antigen Summary and explanation Reagent provided Immunogen Specificity Precautions Storage 121910 001 CE FLEX Monoclonal Rabbit Anti Human Estrogen Receptor a Clone EP1 Ready to Use Dako Autostainer Autostainer Plus English Code 15084 For in vitro diagnostic use FLEX Monoclonal Rabbit Anti Human Estrogen Receptor a Clone EP1 Ready to Use Dako Autostainer Autostainer Plus is intended for use in immunohistochemistry together with Dako Autostainer Autostainer Plus instruments to semi quantitatively detect human estrogen receptor in formalin fixed paraffin embedded tissue sections of human breast cancer The antibody labels estrogen receptor a positive cells and is useful in the assessment of estrogen receptor status in human breast carcinomas The clinical interpretation of any staining or its absence should be complemented by morphological studies using proper controls and should be evaluated within the context of the patient s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist ERa Steroid receptors exhibit a high affinity and specificity for their ligands The human estrogen receptor ER is a dimeric protein of 65 kDa located primarily on the membrane of cell nuclei and belongs to a class of trans acting proteins which stimulate transcription by binding to specific DNA elements also known as hormone response elements Through binding estrog
12. abbit Anti Human ER a Klon EP1 gem den Anweisungen der Packungsbeilage eingef rbt Tabelle 1 bersicht ber die Reaktivit t von Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 in gesundem Gewebe 8 Gewebetyp Anz getestet Gewebeelemente mit positiver F rbung Brust 2 2 von 2 Dr senepithelzellen 20 nukle r D nndarm 3 0 3 Eierstock 3 3 von 3 Follikelepithel 20 40 nukle r 2 von 3 Stromazellen 10 30 nukle r Haut 3 0 3 Herzmuskel 3 0 3 Hoden 3 0 3 Hypophyse 3 0 3 Knochenmark 3 0 3 Kolon 3 0 3 Leber 3 0 3 Lunge 3 0 3 Magen 3 0 3 Mandel 3 2 von 3 Epithelzellen lt 1 nukle r 1 von 3 Keimzentrum Lymphozyten lt 1 nukle r Mesothelzellen 3 0 3 Milz 3 0 3 Nebenniere 0 3 Nebenschilddr se 3 0 3 Nerv peripher 3 0 3 Niere 3 0 3 Pankreas 3 0 3 Prostata 3 3 von 3 Stromazellen lt 5 30 nukle r Schilddr se 3 0 3 Skelettmuskulatur 3 0 3 Speicheldr sen 3 0 3 Speiser hre 3 1 von 3 Epithelzellen lt 1 nukle r Thymus 3 0 3 Uterus 3 3 von 3 Myometrium lt 1 40 nukle r 3 von 3 Dr senepithel 50 80 nukle r 3 von 3 Stromazellen 30 80 nukle r Zerebellum 3 0 3 Zerebrum 3 0 3 Zervix 3 3 von 3 Epithelzellen 30 nukle r 3 von 3 Stromazellen 30 nukle r Vergleich der Methode
13. ant EnVision FLEX High pH Dako Autostainer Autostainer Plus R f K8010 utilis conform ment au protocole propos ci apr s Les r actifs doivent tre dilu s de mani re appropri e avant utilisation Toutes les tapes doivent tre r alis es temp rature ambiante 20 25 1 Incuber les coupes de tissu avec 200 uL d EnVision FLEX Peroxidase Blocking Reagent R f DM821 pendant 5 1 minutes Rincer dans de EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 1 5 minutes Incuber les coupes de tissu avec 200 uL de primary antibody R f IS084 pendant 20 1 minutes Rincer dans de EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 1 5 minutes Incuber les coupes de tissu avec 200 uL d EnVision FLEX HRP R f DM822 pendant 20 1 minutes Rincer dans de EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 1 5 minutes Incuber les coupes de tissu avec 200 uL d EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 5 1 minutes Rincer dans de EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 1 5 minutes Incuber les coupes de tissu avec 400 uL d EnVision FLEX Substrate Working Solution R f DM823 et DM827 pendant 10 1 minutes 10 Rincer dans de l EnVision FLEX Wash Buffer R f K8007 pendant 1 5 minutes 11 Proc der une contre coloration des lames avec de I EnVisionTM FLEX Hematoxylin R f K8018 pendant 5 1 minutes 12 Rincer dans de l eau d ionis
14. d at room temperature For details please refer to the Operator s Manual for the dedicated instrument The Auxiliary step should be set to rinse buffer in staining runs with lt 10 slides For staining runs with gt 10 slides the Auxiliary step should be set to none This ascertains comparable wash times Optimal conditions may vary depending on specimen and preparation methods and should be validated by each individual laboratory 5 Verify that the performance of the adjusted protocol is still valid by evaluating that the P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 2 12 Staining interpretation Product specific limitation Performance characteristics 121910 001 staining pattern is identical to the staining pattern described in Performance characteristics Counterstaining in hematoxylin is recommended using EnVision FLEX Hematoxylin Dako Autostainer Autostainer Plus Code K8018 Non aqueous permanent mounting medium is recommended It is recommended that positive and negative controls should be run simultaneously using the same protocol as the patient specimens Ideally the positive controls should include a low ER expressing breast carcinoma tissue As an alternative benign cervix may also be used The cells structures should display reaction patterns as described for this tissue in performance characteristics in all positive specimens The recommended negative control reagent is FLEX Universal Negative Control
15. e 3 0 3 Moelle osseuse 3 0 3 Muscle cardiaque 3 0 3 Muscle squelettique 3 0 3 Nerf p riph rique 3 0 3 sophage 3 1 3 cellules pith liales lt 1 noyau Ovaire 3 3 3 pith lium folliculaire 20 40 noyau 2 3 cellules stromales 10 30 noyau Pancr as 3 0 3 Parathyro de 3 0 3 Peau 3 0 3 Poumon 3 0 3 Prostate 3 3 3 cellules stromales lt 5 30 noyau Rate 3 0 3 Rein 3 0 3 Sein 2 2 2 cellules pith liales glandulaires 20 noyau Surr nale 3 0 3 Testicule 3 0 3 Thymus 3 0 3 Thyro de 3 0 3 Ut rus 3 3 3 myom tre lt 1 40 noyau 3 3 pith lium glandulaire 50 80 noyau 3 3 cellules stromales 30 80 noyau Comparaison des m thodes les tests au Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 ont t r alis s avec l EnVision FLEX et not s conform ment aux directives du groupe ASCO CAP valeur seuil 21 3 Les tests du cocktail anti ER a clones 1D5 et ER 2 123 ont t r alis s l aide du Dako ER PR pharmDx Kit et not s en suivant les directives de notation Allred d crites dans la notice Les donn es sur la comparaison des m thodes sont pr sent es dans le tableau 2 l aide de ces directives de notation respectives le Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 a t hautement concordant avec la coloration l anticorps ER a du Dako ER PR pharmDx Kit pr sentant des valeurs pour une concorda
16. e FLEX Universal Negative Control Rabbit Dako Autostainer Autostainer Plus Code Nr IS600 empfohlen Das zellul re F rbemuster ist nukle r Zytoplasmische Markierung ist sofern sie auftritt als unspezifisch einzustufen Als positives Ergebnis wird eine nukle re F rbung von 21 der Tumorzellen bezeichnet 6 Dies entspricht den Empfehlungen der American Society of Clinical Oncology ASCO und des College of American Pathologists CAP die einen Cut off von 21 bei positiven Tumorzellen f r die positive Beurteilung angeben 3 1 Falsch negative Ergebnisse k nnen die Folge eines mit der Zeit stattfindenden Antigenabbaus in den Geweben sein Werden Proben bei Raumtemperatur aufbewahrt so sollten diese innerhalb von 2 Monaten nach dem Aufbringen der Schnitte auf Objekttr ger gef rbt werden 7 2 Zum Erzielen optimaler und reproduzierbarer Ergebnisse f r ER Protein ist dieses einer Demaskierung zu unterziehen wenn die Gewebe routinem ig in neutralem gepufferten Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet werden 3 Die Verwendung von Dako Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 mit Geweben die mit anderen Mittels als Formalin fixiert worden sind wurde nicht validiert Pr zision F r den Test wurden serielle Schnitte von jedem von drei verschiedenen formalinfixierten paraffineingebetteten Mammakarzinom Gewebebl cken entnommen Die Tests wurden wie folgt durchgef hrt Pr zision innerhalb eines Durchlaufs Ge
17. en the ER is induced to stimulate gene transcription hence is also known as an inducible enhancer factor 1 2 Historical studies have shown that ER status is positively correlated with untreated outcome ie prognostic for well differentiated invasive breast cancer and with response to anti hormonal therapy e g tamoxifen 2 Estrogens have been found to be preferentially concentrated in the estrogen target organs of animals and in human breast cancers and it is well documented that the mitogenic effects of estrogen are mediated by ER Investigations into the biological mechanisms for breast cancer growth have found that the growth rate is dependent on the presence of estrogen or progesterone or both in most breast cancers 2 Thus estrogen receptor status in breast carcinomas is considered to be a validated prognostic and predictive factor for patient management for anti hormonal therapy 2 4 Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining or the detection system instructions of IHC procedures for 1 Principle of Procedure 2 Materials Required Not Supplied 3 Storage 4 Specimen Preparation 5 Staining Procedure 6 Quality Control 7 Troubleshooting 8 Interpretation of Staining 9 General Limitations Ready to use monoclonal rabbit antibody provided in liquid form in a buffer containing stabilizing protein and 0 015 mol L sodium azide Clone EP1 Recombinant protein of ER a amino acids 1 300 In We
18. hren mit dem Dako PT Link Code Nr PT100 PT101 erforderlich Weitere Informationen finden Sie im PT Link Benutzerhandbuch Optimale Ergebnisse werden durch 20 min tige Vorbehandlung der Gewebe bei 97 mit EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x Code Nr K8010 K8004 gefolgt von 5 Minuten in EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 erzielt Paraffineingebettete Schnitte Die Vorbehandlung der formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitte mit dem 3 in 1 Probenvorbereitungsverfahren f r Dako PT Link wird empfohlen Vorbehandlung gem der Beschreibung in der Packungsbeilage f r EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x Code Nr K8010 K8004 durchf hren Nach dem F rben m ssen die Schnitte dehydriert gekl rt und mit permanentem Einbettmedium auf den Objekttr ger aufgebracht werden Die Gewebeschnitte d rfen w hrend der Behandlung oder des anschlie enden immunhistochemischen F rbeverfahrens nicht austrocknen Zur besseren Haftung der Gewebeschnitte an den Glasobjekttr gern wird die Verwendung von Dako Silanized Slides Code Nr S3003 empfohlen Als Visualisierungssystem wird EnVision FLEX High pH Dako Autostainer Autostainer Plus Code Nr K8010 empfohlen Zu verwenden gem dem unten aufgef hrten Protokoll Die Reagenzien m ssen vor der Verwendung entsprechend verd nnt werden Alle Schritte sollten bei Zimmertemperatur 20 25 durchgef hrt werden 1 Gewebeschn
19. iting values for overall positive and negative agreement of 96 2 98 9 and 92 2 respectively Table 2 Agreement between Anti ER a Clone EP1 and Anti ER o Component of ER PR pharmDx Kit Anti ER a Component of ER PR pharmDx Kit Positive Negative Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 Negative 2 Im Positive 183 10 Total Positive Percent Agreement 183 185 98 9 Negative Percent Agreement 119 129 92 2 Overall Percent Agreement 302 314 96 2 Kappa 0 9203 95 Confidence Interval 0 8761 0 9645 Fran ais Ref 15084 Pour utilisation diagnostique in vitro Le FLEX Monoclonal Rabbit Anti Human Estrogen Receptor a clone EP1 pr t l emploi Dako Autostainer Autostainer Plus est destin tre utilis en immunohistochimie en combinaison avec les instruments Dako Autostainer Autostainer Plus en vue de la d tection semi quantitative du r cepteur des strog nes dans des coupes tissulaires de cancer du sein incluses en paraffine et fix es au formol L anticorps marque les cellules a positives du r cepteur des strog nes et est utile dans l valuation du statut du r cepteur des strog nes dans les carcinomes mammaires humains L interpr tation clinique de toute coloration ou son absence doit tre compl t e par des tudes morphologiques en utilisant des contr les appropri s et doit tre valu e en fonction des ant c dents cliniques du patient et d
20. itt mit 200uL EnVision FLEX Peroxidase Blocking Reagent Code Nr DM821 5 1 Minuten inkubieren Mit EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 1 5 Minuten absp len Gewebeschnitt mit 200 uL primary antibody Code Nr IS084 20 1 Minuten inkubieren Mit EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 1 5 Minuten absp len Gewebeschnitt mit 200 uL EnVision FLEX HRP Code Nr DM822 20 1 Minuten inkubieren Mit EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 1 5 Minuten absp len Gewebeschnitt mit 200 uL EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 5 1 Minuten inkubieren Mit EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 1 5 Minuten absp len Gewebeschnitt mit 400 uL EnVision FLEX Substrate Working Solution Code Nr DM823 und DM827 10 1 Minuten inkubieren 10 Mit EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 1 5 Minuten absp len 11 Objekttrager mit EnVision FLEX Hematoxylin Code Nr K8018 5 1 Minuten gegenfarben 12 Mit entionisiertem Wasser 1 5 Minuten absp len 13 Gewebeschnitt mit 200 uL EnVision FLEX Wash Buffer Code Nr K8007 5 1 Minuten inkubieren 14 Mit entionisiertem Wasser 1 5 Minuten absp len 15 Objekttr ger mit permanentem Fixiermittel fixieren SEND ARD Programmierraster f r empfohlenes Assay P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 9 12 Auswertung der F rbung Produktspezifische Beschrankungen Leistungsmerkmale 121910 001 Programming Grid Edit lists
21. m dem EnVision FLEX High pH Standardprotokoll wurden von jedem Gewebeblock drei Schnitte mit Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 gef rbt Gleichzeitig wurde ein Schnitt von jedem Block mit einer Negativkontrolle eingef rbt Pr zision bei verschiedenen Durchl ufen Das oben beschriebene Verfahren wurde an zwei weiteren Tagen wiederholt wobei wieder je ein Schnitt von jedem Gewebeblock eingef rbt wurde Gleichzeitig wurde ein Schnitt von jedem Gewebeblock mit einer Negativkontrolle eingef rbt P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 10 12 Pr zision bei verschiedenen Ger ten Das oben beschriebene Verfahren wurde mit drei verschiedenen Autostainer Ger ten durchgef hrt wobei jeweils drei Schnitte von jedem Gewebeblock eingefarbt wurden Gleichzeitig wurde ein Objekttrager von jedem Gewebeblock mit einer Negativkontrolle eingefarbt Prazisionsexperimente mit Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 ergaben sowohl bei Tests innerhalb eines Durchlaufs als auch in verschiedenen Durchlaufen und mit verschiedenen Geraten Ubereinstimmende Ergebnisse Wahrend der gesamten Studie wurden gleich bleibende Versuchsbedingungen beibehalten die Reagenzien wurden zwischen den Durchl ufen bei 2 8 aufbewahrt Gesunde Gewebe Tabelle 1 gibt einen berblick ber die Immunreaktivit t von Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 mit den empfohlenen gesunden Geweben Alle Gewebe wurden formalinfixiert paraffineingebettet und mit Monoclonal R
22. n Tests mit Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 wurden unter Verwendung von EnVision FLEX durchgef hrt und gem den ASCO CAP Richtlinien 21 Cut off ausgewertet 3 Tests mit dem Anti ER a Cocktail Klone 1D5 und ER 2 123 wurden unter Verwendung des Dako ER PR pharmDx Kit durchgef hrt und gem den in der Packungsbeilage beschriebenen Allred Richtlinien ausgewertet Die Daten des Methodenvergleichs sind in Tabelle 2 aufgef hrt Die Anwendung der jeweiligen Auswertungsrichtlinien ergab eine hohe bereinstimmung von Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 mit der ER a Antik rperkomponente der Dako ER PR pharmDx Kit F rbung Die Ergebnisse f r die Gesamt bereinstimmung sowie die positive und negative bereinstimmung lagen bei 96 2 98 9 und 92 2 P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 11 12 References Bibliographie Literaturhinweise Tabelle 2 bereinstimmung zwischen Anti ER a Klon EP1 und der Anti ER a Komponenten des ER PR pharmDx Kit Anti ER a Komponente des ER PR pharmDx Kit Positiv Negativ Gesamt Monoclonal 1 Rabbit Anti Positiv 183 10 193 Human ER a F Clone EP1 Negativ 2 119 121 Gesamt 314 Prozent positive bereinstimmung 183 185 98 9 Prozent negative bereinstimmung 119 129 92 2 Prozent Gesamt bereinstimmung 302 314 96 2 Kappa 0 9203 95 Konfidenzintervall 0 8761 0 9645 1 Kumar V Green S Stack G Berry M Jin J R
23. nce totale positive et n gative de 96 2 98 9 et 92 2 respectivement 121910 001 P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 7 12 Verwendungszweck Synonyme f r das Antigen Zusammenfassung und Erkl rung Geliefertes Reagenz Immunogen Spezifitat VorsichtsmaBnahmen 121910 001 Tableau 2 Concordance entre Tan ER a clone EP1 et le composant anti ER o du ER PR pharmDx Kit Composant anti ER a du ER PR pharmDx Kit Positifs N gatifs Total Monoclonal wae Rabbit Anti Positifs 183 10 193 Human ER a ares Clone EP1 N gatifs 2 119 121 Total 185 129 314 Concordance positive en pourcentage 183 185 98 9 Concordance n gative en pourcentage 119 129 92 2 Concordance totale en pourcentage 302 314 96 2 Kappa 0 9203 Intervalle de confiance 95 0 8761 0 9645 Deutsch Code IS084 Zur In vitro Diagnostik FLEX Monoclonal Rabbit Anti Human Estrogen Receptor a Klon EP1 gebrauchsfertig Dako Autostainer Autostainer Plus ist zur Verwendung mit den Dako Autostainer Autostainer Plus Geraten in der Immunhistochemie bestimmt um den humanen Ostrogenrezeptor in formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeschnitten humaner Mammakarzinome semiquantitativ nachzuweisen Der Antik rper markiert Ostrogenrezeptor a positive Zellen und dient der Beurteilung des Ostrogenrezeptor Status bei humanen Mammakarzinomen Die klinische Auswertung einer eventuell eintrete
24. nden F rbung sollte durch morphologische Untersuchungen mit geeigneten Kontrollen erg nzt und von einem qualifizierten Pathologen unter Ber cksichtigung der Krankengeschichte und anderer diagnostischer Tests des Patienten vorgenommen werden ERa Steroidrezeptoren weisen eine hohe Affinit t und Spezifit t f r ihre Liganden auf Der humane strogenrezeptor ER ist ein dimeres Protein von 65 kDa das berwiegend auf der Membran von Zellkernen vorkommt Er geh rt zu einer Klasse trans agierender Proteine die durch Bindung an spezifische DNA Elemente auch bekannt als hormonempfindliche Bereiche die Transkription stimulieren Da die Ostrogenbindung den Ostrogenrezeptor zur Stimulation der Gentranskription veranlasst wird dieser auch als induzierbarer Enhancer Faktor bezeichnet 1 2 Historische Studien haben gezeigt dass der ER Status positiv mit dem Verlauf der Erkrankung ohne Behandlung d h der Prognose f r gut differenzierten invasiven Brustkrebs und mit der Reaktion auf antihormonelle Therapie z B mit Tamoxifen korreliert 2 Ostrogene wurden in hoher Konzentration vor allem in tierischen Zielorganen f r Ostrogene und in menschlichen Brustkrebsgeweben nachgewiesen und es ist hinreichend dokumentiert dass die mitogene Wirkung von Ostrogen durch ER vermittelt wird Die Untersuchung der f r das Brustkrebswachstum verantwortlichen biologischen Mechanismen hat gezeigt dass die Wachstumsrate der meisten Brustkrebsarten vom Vorhande
25. nsein von Ostrogen oder Progesteron oder beidem abh ngig ist 2 Daher gilt der Ostrogenrezeptor Status bei Mammakarzinomen als validierter prognostischer und pr diktiver Faktor f r das Patientenmanagement bei antihormoneller Therapie 2 4 Folgende Angaben sind den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen F rbung von Dako oder den Anweisungen des Detektionssystems f r IHC Verfahren zu entnehmen 1 Verfahrensprinzip 2 Erforderliche aber nicht mitgelieferte Materialien 3 Aufbewahrung 4 Vorbereitung der Probe 5 F rbeverfahren 6 Qualit tskontrolle 7 Fehlersuche und behebung 8 Auswertung der F rbung 9 Allgemeine Beschr nkungen Gebrauchsfertiger monoklonaler Kaninchen Antik rper in fl ssiger Form in einem Puffer der stabilisierendes Protein und 0 015 mol L Natriumazid enth lt Klon EP1 Rekombinantes Protein aus ER a Aminos uren 1 300 Beim Western Blot von MCF7 Zelllysaten markiert der Antik rper eine starke Bande von ungef hr 67 kDa was mit dem erwarteten Molekulargewicht von ER a bereinstimmt Es wurde keine Kreuzreaktivit t mit ER beobachtet 1 F r Fachpersonal 2 Dieses Produkt enth lt Natriumazid NaN eine in reiner Form u erst giftige Chemikalie Natriumazid P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 8 12 Lagerung Vorbereitung der Probe und erforderliche aber nicht mitgelieferte Materialien F rbeverfahren und erforderliche aber nicht mitgelieferte Materialien 121910 00
26. nts must be appropriately diluted before use All steps should be performed at room temperature 20 25 1 Incubate tissue section with 200 uL EnVision FLEX Peroxidase Blocking Reagent DM821 for 5 1 minutes Rinse in EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 1 5 minutes Incubate tissue section with 200 uL primary antibody Code IS084 for 20 1 minutes Rinse in EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 1 5 minutes Incubate tissue section with 200 uL EnVision FLEX HRP Code DM822 for 20 1 minutes Rinse in EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 1 5 minutes Incubate tissue section with 200 uL EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 5 1 minutes Rinse in EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 1 5 minutes Incubate tissue section with 400 uL EnVision FLEX Substrate Working Solution Codes DM823 and DM827 for 10 1 minutes 10 Rinse in EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 1 5 minutes 11 Counterstain slide with EnVision FLEX Hematoxylin Code K8018 for 5 1 minutes 12 Rinse in deionized water for 1 5 minutes 13 Incubate tissue section with 200 uL EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 for 5 1 minutes 14 Rinse in deionized water for 1 5 minutes 15 Mount slides with permanent mounting medium Programming grid for recommended assay DONNER TRS Hiah G Manual Step RS High Protocol Template All incubation steps should be performe
27. one section from each tissue block was stained with a negative control reagent Inter instrument Precision Staining three sections from each tissue block the above procedure was performed on three different Autostainer instruments Concurrently one slide from each tissue block was stained with a negative control reagent Precision experiments with Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 yielded consistent results with intra run inter run and inter instrument testing Consistent test conditions were maintained throughout the study and reagents were stored at 2 8 C between test runs Normal tissues Table 1 contains a summary of Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 immunoreactivity on the recommended panel of normal of normal tissues All tissues were formalin fixed and paraffin embedded and stained with Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 according to the instructions in the package insert Table 1 Summary of Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Clone EP1 Normal Tissue Reactivity 8 Tissue Type tested Positively Staining Tissue Elements Adrenal 3 0 3 Bone marrow 3 0 3 Breast 2 2 2 Glandular epithelial cells 20 nuclear Cerebellum 3 0 3 Cerebrum 3 0 3 Cervix 3 3 3 Epithelial cells 30 nuclear 3 3 Stromal cells 30 nuclear Colon 3 0 3 Esophagus 3 1 3 Epithelial cells lt 1 nuclear Kidney 3 0 3
28. ont conserv s temp rature ambiante 7 2 Pour des r sultats optimaux et reproductibles la prot ine ER requiert une restauration des cibles lorsque les tissus sont fix s en routine formol neutre tamponn et inclus en paraffine 3 L utilisation de l anticorps Dako Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 sur des tissus fix s par d autres produits que le formol n a pas t valid e Pr cision des coupes en s rie ont t pr lev es pour valuation sur chacun des trois blocs de carcinome mammaire diff rents fix s au formol et inclus en paraffine L analyse a t r alis e comme suit Pr cision intra cycle conform ment au protocole standard EnVision FLEX High pH trois coupes de chaque bloc tissulaire ont t color es au Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 Simultan ment une coupe provenant de chaque bloc a t color e l aide d un r actif de contr le n gatif P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 6 12 Pr cision inter cycles en colorant une coupe provenant de chaque bloc tissulaire la proc dure a t r p t e sur deux jours suppl mentaires Simultan ment une coupe provenant de chaque bloc tissulaire a t color e l aide d un r actif de contr le n gatif Pr cision inter instruments en colorant trois coupes provenant de chaque bloc tissulaire la proc dure ci dessus a t r alis e sur trois instruments Autostainer diff rents Simultan ment une lame pr
29. ovenant de chaque bloc de tissu a t color e l aide d un r actif de contr le n gatif Les exp riences de pr cision avec le Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 ont donn des r sultats coh rents avec les analyses intra cycle inter cycles et inter instruments Les m mes conditions d analyse ont t conserv es tout au long de l tude et les r actifs ont t stock s entre 2 et 8 C entre les cycles de test Tissus sains le tableau 1 contient un r sum de l immunor activit au Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 avec le panel recommand de tissus sains Tous les tissus ont t fix s au formol et inclus en paraffine puis color s au Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 conform ment aux instructions de la notice Tableau 1 R sum de la r activit au Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 dans les tissus sains 8 Type de tissus nombre test l ments tissulaires color s positivement Amygdale 3 2 3 cellules pith liales lt 1 noyau 1 3 lymphocytes du centre germinatif lt 1 noyau Cellules m soth liales 3 0 3 Cerveau 3 0 3 Cervelet 3 0 3 Col de l ut rus 3 3 3 cellules pith liales 30 noyau 3 3 cellules stromales 30 noyau C lon 3 0 3 Estomac 3 0 3 Foie 3 0 3 Glande salivaire 3 0 3 Hypophyse 3 0 3 Intestin gr l
30. pplied Staining procedure including materials required but not supplied 121910 001 The antibody can be used for labeling formalin fixed paraffin embedded tissue sections Tissue specimens should be cut into sections of approximately 4 um Pre treatment with heat induced epitope retrieval HIER is required using Dako PT Link Code PT100 PT101 For details please refer to the PT Link User Guide Optimal results are obtained by pretreating tissues using EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x Code K8010 K8004 for 20 minutes at 97 followed by 5 minutes in EnVision FLEX Wash Buffer Code K8007 Paraffin embedded sections Pre treatment of formalin fixed paraffin embedded tissue sections is recommended using the 3 in 1 specimen preparation procedure for Dako PT Link Follow the pre treatment procedure outlined in the package insert for EnVision FLEX Target Retrieval Solution High pH 50x Code K8010 K8004 After staining the sections must be dehydrated cleared and mounted using permanent mounting medium The tissue sections should not dry out during the treatment or during the following immunohistochemical staining procedure For greater adherence of tissue sections to glass slides the use of Dako Silanized Slides Code S3003 is recommended The recommended visualization system is EnVision FLEX High pH Dako Autostainer Autostainer Plus Code K8010 used according to the protocol given below Reage
31. stern blotting of MCF7 cells lysates the antibody labels a major band of approximately 67 kDa corresponding to the expected molecular weight of ER a No cross reactivity was seen with ER 1 For professional users 2 This product contains sodium azide NaNs3 a chemical highly toxic in pure form At product concentrations though not classified as hazardous sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build ups of metal azides Upon disposal flush with large volumes of water to prevent metal azide build up in plumbing 3 As with any product derived from biological sources proper handling procedures should be used 4 Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin 5 Unused solution should be disposed of according to local State and Federal regulations Store at 2 8 Do not use after expiration date s tamped on vial If reagents are stored under any conditions other than those specified the conditions must be verified by the user There are no obvious signs to indicate instability of this product Therefore positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimens If unexpected staining is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures and a problem with the antibody is suspected contact Dako Technical Support P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 1 12 Specimen preparation including materials required but not su
32. t de l azide de sodium NaN un produit chimique hautement toxique sous sa forme pure Aux concentrations du produit bien que non class comme dangereux l azide de sodium peut r agir avec le cuivre et le plomb des canalisations et former des accumulations d azides m talliques hautement explosifs Lors de l limination rincer abondamment leau pour viter toute accumulation d azide m tallique dans les canalisations 3 Comme avec tout produit d origine biologique des proc dures de manipulation appropri es doivent tre respect es 4 Porter un v tement de protection appropri pour viter le contact avec les yeux et la peau 5 Les solutions non utilis es doivent tre limin es conform ment aux r glementations locales et nationales Conserver entre 2 et 8 Ne pas utiliser apr s la date de p remption imprim e sur le flacon Si les r actifs sont conserv s dans des conditions autres que celles indiqu es celles ci doivent tre valid es par l utilisateur Il n y a aucun signe vident indiquant l instabilit de ce produit Par cons quent des contr les positifs et n gatifs doivent tre test s en m me temps que les chantillons de patients Si une coloration inattendue est observ e qui ne peut tre expliqu e par des diff rences dans les proc dures du laboratoire et si un probl me li l anticorps est suspect contacter l assistance technique de Dako L anticorps peut tre utilis pour le
33. tomics Inc using Epitomics proprietary rabbit monoclonal antibody technology covered under Patent Nos 5 675 063 and 7 402 409 FRAN AIS Le Monoclonal Rabbit Anti Human ER a clone EP1 a t cr par Epitomics Inc en utilisant la technologie exclusive d anticorps monoclonal de lapin d Epitomics couverte par les num ros de brevet suivants 5 675 063 et 7 402 409 DEUTSCH Monoclonal Rabbit Anti Human ER a Klon EP1 wurde von Epitomics Inc unter Verwendung proprietarer Technologie mit monoklonalen Kaninchen Antik rpern entwickelt und ist durch die Patente Nr 5 675 063 und 7 402 409 gesch tzt Catalogue number Temperature limitation Consult instructions for use R f rence du catalogue Limites de temp rature Consulter les instructions d utilisation sl Bestellnummer Zul ssiger Temperaturbereich Gebrauchsanweisung beachten REP Manufactu Batch cod Use b Dako North America Inc Dako Denmark A S januracturer alch code se by 6392 Via Real Produktionsvej 42 Fabricant Code du lot Utiliser jusque Carpinteria California 93013 USA DK 2600 Glostrup Denmark Hersteller Chargenbezeichnung Verwendbar bis Authorized representative in the European Community In vitro diagnostic medical device Tel 805 566 6655 Tel 45 4485 9500 REP Repr sentant Autoris dans la Communaut Europ enne Dispositif m dical de diagnostic in vitro Fax 805 566 6688 Fax 45 4485 9595 Autorisierter Reprasentant in der EU In vitro Diagnostikum
34. tut du r cepteur des strog nes dans les carcinomes mammaires est un pronostic valide et un facteur pr dictif de la prise en charge des patientes pour la th rapie antihormonale 2 4 Se reporter aux Instructions g n rales de coloration immunohistochimique de Dako ou aux instructions du syst me de d tection relatives aux proc dures IHC pour plus d informations concernant les points suivants 1 Principe de proc dure 2 Mat riels requis mais non fournis 3 Conservation 4 Pr paration des chantillons 5 Proc dure de coloration 6 Contr le qualit 7 D pannage 8 Interpr tation de la coloration 9 Limites g n rales P01470EFG_002_1S084 2011 06 p 4 12 R actifs fournis Immunog ne Sp cificit Pr cautions Conservation Pr paration des chantillons y compris le mat riel requis mais non fourni Proc dure de coloration y compris le mat riel requis mais non fourni 121910 001 Anticorps monoclonal de lapin pr t l emploi fourni sous forme liquide dans un tampon contenant une prot ine stabilisante et 0 015 mol L d azide de sodium Clone EP1 Prot ine recombinante des acides amin s du ER a 1 300 Par Western Blot de lysats de cellules MCF7 l anticorps marque une bande principale d environ 67 kDa correspondant au poids mol culaire attendu du ER a Aucune r activit crois e au ER n a t observ e 1 Pour utilisateurs professionnels 2 Ce produit contien
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