Anti-68 kD (hsp-70)
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1. TROUBLESHOOTING GUIDE Strong band at 68 70kD on Negative Control strip Likely cause contaminated Negative Control vial or cross contamination from well containing a positive serum Positive Control appears like Negative Control strip Likely cause Negative Control vial was confused as Positive Control vial Strips are completely blank Likely cause addition of Conjugate A or B or Sub strate was omitted High background and poor contrast between bands and background Likely cause wash step s may have been omitted or incorrectly performed or incubations were overextended OTOblot Anti 68 kD hsp 70 Western Blot For Research Use only Code 1190 20 Determinations UTILISATION PR VUE Une analyse de Western Blot pour la d tection et l identification des anticorps l antig ne de 68 kD hsp 70 s est associ e la perte d audition neuro sensorielle SNHL SOMMAIRE ET EXPLICATION La perte d audition peut tre provoqu e par un certain nombre de conditions Certains types de perte d audition peuvent tre renvers s si le traitement t t et appropri diagnostiqu est institu La perte d audition neuro sensorielle SNHL g n ralement d sign e sous le nom de la surdit de nerf peut tre provoqu e par des facteurs g n tiques ou acquis tels que des infections ou peut tre immunologiquement n goci e Le diagnostic correct de SNHL peut tre fait l aide d une combinaison des tudes patientes com2. Bottiglia di compressione all amplificatore della lavata diluito stretta Pipette capaci di trasporti del 10 1000 ul A gettare pipettare le punte Temporizzatore ACCUMULAZIONE E MANEGGIAMENTO DELL ESEMPLARE Soltanto gli esemplari del siero dovrebbero essere usati in questa procedura Grossolanamente emolizzati gli esemplari lipemici o da microbi contaminati possono interferire con le prestazioni della prova e non dovrebbero essere usati Immagazzinare gli esemplari a 2 8 C per pi che una settimana Per immagazzinaggio pi di lunga durata gli esemplari del siero dovrebbero essere congelati Evitare il congelamento e lo scioglimento ripetuti dei campioni METODO Note Procedurali Leggere con attenzione prima le istruzioni cominciando dall analisi e Lasciare gli esemplari del siero ed i reagenti della prova equilibrare alla temperatura ambiente per il resoconto 30 prima dell iniziare il metodo di prova Restituire subito tutti gli esemplari e reagenti inutilizzati alla post utilizzazione del frigorifero e La tecnica di lavaggio adeguata critica alle prestazioni soddisfacenti dell analisi e Maneggiare i nastri di prova con i forcipi puliti soltanto Non toccare con le mani nude e Le strisce sono numerate individualmente alla parte superiore di ogni striscia Assegnare i numeri di identificazione dell esemplare alle strisce rispettive sul moduli di rapporto Completare tutte le altre informazioni relative sul moduli di
3. riaux doivent tre suivies 10 Attention l azoture de sodium NaN3 peut r agir avec le fil et la tuyauterie de cuivre aux azotures fortement explosifs en m tal de forme Sur la disposition des liquides clat avec de grands volumes de l eau pour emp cher l habillage d azoture NaN est toxique s ing r Rapportez les incidents imm diatement au centre de commande de directeur ou de poison de laboratoire Suivez les bonnes pratiques en mati re de laboratoire de r duire au minimum la contamina tion microbienne et en travers des r actifs Mat riaux fournis Code 1190 Le kit contient les r actifs suffisants pour effectuer 20 d terminations 20 bandelettes Western Blot 1 x 110 ul contr le positif pr t l emploi 1 x 110 ul contr le n gatif pr t l emploi 1 carte de contr e 1 x 240 ul conjugu A 1 x 240 ul conjugu B 1x 60 ml diluant pour chantillons 1x25ml substrat enzymatique 1 tampon de lavage pour 1 litre flacon 3 bains d analyse 1 fiches de rapport Contient 0 1 NaN 3 Mat riaux Requis Mais Non fournis Nettoyez le cylindre re u un dipl me 1000 par ml e forceps non dentel Culbuteur ou dispositif trembleur tournant de plateforme Papier absorbant ou serviettes de papier D sionis ou eau distill e Bouteille de compression l amortisseur de lavage dilu par prise Pipettes capables de fournir 10 1000 pl Jetable introduisez la pipette les bouts Tempori
4. Reinigung ergibt den hohen befleckenden Hintergrund 5 1 0 ml von Probendiluent pipettieren gut gefolgt von 10 uL von Konjugat A in jedes 30 Minuten 5 Minuten bei der Raumtemperatur auf Schalthebel oder drehendem Sch ttel Apparat ausbr ten 6 Schritt 4 wiederholen T 1 0 ml von Probendiluent pipettieren gut gefolgt von 10 uL von Konjugate B in jedes 30 Minuten 5 Minuten ausbr ten bei der Raumtemperatur auf Schalthebel oder drehendem Sch ttel Apparat 8 Schritt 4 wiederholen 9 1 0 ml Substrat in jedes pipettieren Brunnen und mit leichtem ausbr ten 20 Minuten 5 Minuten bei der Raumtemperatur und bei verringertem Licht r ttelnd 10 Schritt 4 wiederholen und anstelle von viermal zweimal waschen 11 Mit stumpfer Zange Streifen vom Probe Beh lter entfernen und sie auf saugf higes Papier leicht setzen Streifen nur an den Enden anfassen und sie 15 20 Minuten trocknen lassen Qualit tskontrolle Obwohl die Steuerkarten Losbesondere sind m ssen negative und positive Kontrollen in jedem Probelauf eingeschlossen werden um korrekte Leistung der Probe sicherzustellen Positive Kontrollereaktion Der positive Steuerstreifen stellt ein dichtes blau violettes Band an 70kD Band anti rhsp 70 und die Molekulargewichtausrichtung Markierung bei 116 kD aus Figure 1 Negative Kontrollereaktion Gew hnlich stellt die negative Steuerung nur ein Band an der 116 kD Molekulargewicht Ausrichtung Markierung aus Jedes schwachen
5. avec doux en secouant 20 minutes 5 minutes la temp rature ambiante et la lumi re r duite 10 R p tez L tape 4 lavant deux fois au lieu de quatre fois 11 En utilisant le forceps mouss enlevez les bandes du plateau d analyse et placez les doucement sur le papier absorbant Manipulez les bandes seulement aux extr mit s et laissez les s cher 15 20 minutes Contr le de qualit Bien que les cartes de commande soient d tail de sort des commandes n gatives et positives doivent tre incluses dans chaque essai pour assurer l ex cution appropri e de l analyse R action De Contr le Positive La bande positive de commande montrera une bande bleu violette dense 70kD bande anti rhsp 70 et le marqueur d alignement de poids mol culaire au 116 kD Figure 1 R action De Contr le N gative Typiquement la commande n gative montrera seulement une bande au marqueur d alignement de poids mol culaire de 116 kD N importe quelle bande faible au niveau de 70 kD sur la bande n gative de commande devrait tre consid r e la r action de ligne de base pour cet essai de d tail Figure 2 INTERPR TATION DES R SULTATS Les bandes d OTOblot contiennent deux prot ines une au 116 kD et l autre rHSP70 au 70 kD Figure 1 Les prot ine 116 kD servir de marqueur d alignement de poids mol culaire 1 Tenez la bande d essai entre les r actions de contr les positives et n gatives sur la carte de contr le fourni
6. et et alignez la bande d essai en utilisant le marqueur d alignement de poids mol culaire de 116 kD comme point de r f rence Figure 2 Une ligne de marqueur de 116 kD sur les cartes de contr les facilite l alignement pr cis des bandes d essai avec les bandes de contr le 2 Comparez la r action de la bande d essai ceux des commandes de chaque c t L utilisation d une loupe peut faciliter l alignement appropri des bandes d essai le long du marqueur de poids mol culaire et aider l observation des r actions faibles 3 V rifiez une bande croquante sur la bande d essai qui aligne avec la bande de 70 kD sur la bande positive de commande Une telle r action devrait tre consid r e positive Les r actions positives peuvent se produire dans des intensit s variables de faible fort Des r actions faibles devraient tre compar es aux intensit s de r action de ligne de base la position correspondante sur la bande n gative de commande Des r actions qui sont distinctement plus fonc es ou plus denses que l intensit de ligne de base 70kD devraient tre consid r es positives De temps en temps le poids mol culaire inf rieur mineur bandes peut soit vident avec certains s rums Cependant de telles r actions ne sont pas appropri es et devraient tre consid r es en tant que n gatif pour des anticorps l antig ne 68kD rhsp 70 Note Les machines automatis es de tache de Western peuvent montrer les ba
7. n del zida NaN es t xico si est injerido Divulgar los incidentes inmediatamente al centro de control del director o del veneno del laboratorio Seguir las buenas pr cticas del laboratorio de reducir al m nimo la contaminaci n microbiana y cruzada de reactivo Materiales proporcionados Code 1190 El OTOblot anti 68 kD hsp 70 kit contiene los suficientes reactivo para realizar 20 determinaciones 1x20 tiras Western Blot 1 x 110 pi control positivo listo para uso 1 x 110 pi control negativo listo para uso 1 tarjeta de control 1 x 240 ul conjugado A 1 x 240 ul conjugado B 1x 60 ml tamp n de diluci n para muestras 1x25ml substrato enzim tico 1 frasco tamp n de lavado para 1 litro vial 3 bandejas de an lisis 2 Hojas de informe Contiene lt 0 1 NaN 3 Materiales Requeridos Pero No proporcionados Limpiar el cilindro graduado 1000 ml F rceps No serrado Eje de balanc n o coctelera de la plataforma que rota Papel absorbente o toallas de papel Agua desionizada o destilada Botella del apret n al almacenador intermediario diluido asimiento de la colada Pipetas capaces de entregar 10 a 1000 ul Disponible medir con una pipeta las extremidades Contador de tiempo COLECCI N Y DIRECCI N DEL ESP CIMEN Solamente los espec menes del suero se deben utilizar en este procedimiento Hemolizadas grueso los espec menes lip micas o microbiano contaminados pueden interferir con el func
8. wells to obtain a 1 101 dilution Incubate 60 minutes 5 min at room temperature on a rocker or rotating shaker 4 Aspirate sample solution into waste container Thoroughly wash strips with Wash Buffer by squirting approximately 2ml of solution directly onto strips Wash strips with gentle agitation for 5 minutes and aspirate solution into waste container Repeat 3x Caution Complete washing of the strips between incubations is crucial to obtain valid results Improper washing will result in high background staining 5 Pipet 1 0 ml of Serum Diluent followed by 10 pl of Conjugate A into each well Incubate 30 minutes 5 min at room temperature on rocker or rotating shaker 6 Repeat Step 4 7 Pipet 1 0 ml of Serum Diluent followed by 10 ul of Conjugate B into each well Incubate 30 minutes 5 min at room temperature on rocker or rotating shaker 8 Repeat Step 4 9 Pipet 1 0 ml Substrate into each well and incubate with gentle shaking 20 minutes 5 min at room temperature and reduced light 10 Repeat Step 4 washing twice instead of four times 11 Using blunt forceps remove strips from assay tray and place them gently onto absor bent paper Handle strips only at the ends and let them dry 15 20 minutes Quality Control Though the control cards are lot specific negative and positive controls must be included in each test run to ensure proper performance of the assay Positive Control Reaction The positive control strip wi
9. 0 vor dem Beginnen des Testverfahrens abgleichen lassen Alle unbenutzten Probest cke und Reagenzien zum Nachgebrauch des K hlraums sofort zur ckbringen Korrekte waschende Technik ist zur ordnungsgem Ben Erf llung der Probe kritisch Teststreifen mit nur sauberen Zangen manipulieren Nicht mit den bloBen H nden ber hren 14 Streifen werden einzeln an der Oberseite jedes Streifens numeriert Probest ckkennummern den jeweiligen Streifen auf dem Report Formulare zuweisen Alle weiteren relevanten Informationen ber das Report Formulare vor dem Beginnen der Probe durchf hren Methode Pr fen 1 Mit stumpfer Zange erforderliche Zahl der Streifen beschrifteten Seite oben in einzelne Brunnen des Probe Beh lters setzen 2 1 0 ml von Probendiluent in jedes gut pipettieren 3 u L von Positive und von Negative Kontrolle und geduldige Probe in passende Brunnen pipettieren 10 um eine 1 101 Verd nnung zu erreichen 60 Minuten 5 Minuten ausbr ten bei der Raumtemperatur auf einem Schalthebel oder einem drehenden Sch ttel Apparat 4 Beispiell sung in Abfallbeh lter ansaugen Streifen mit Waschpuffer g nzlich waschen indem Sie ungef hr 2ml der L sung direkt auf Streifen sprizen Streifen mit leichter Bewegung f r 5 Minuten waschen und L sung in Abfallbeh lter ansaugen 3x wiederholen Vorsicht Komplette Reinigung der Streifen zwischen Ausbr tungen ist entscheidend g ltige Resultate zu erreichen Unsachgem Be
10. 1 0 ml substrato in ciascuno pozzo ed incubare con delicato agitando 20 minuti 5 minuti alla temperatura ambiente ed alla luce ridotta 10 Ripetere Punto 4 lavantesi due volte anzich quattro volte 11 Per mezzo del forcipe smussato rimuovere le strisce dal vassoio di analisi e disporle delicatamente su carta assorbente Maneggiare le strisce soltanto alle estremit e lasciarle asciugare 15 20 minuti Controllo di qualit Bench le schede di controllo siano lotto specifico i comandi negativi e positivi devono essere inclusi in ogni elaborazione di prova per accertare le prestazioni adeguate dell analisi Reazione di Controllo Positivo La striscia positiva di controllo esibir una fascia blu viola densa a 70kD fascia anti rhsp 70 e l indicatore di allineamento del peso molecolare 116 kD Figure 1 Reazione di Controllo Negativo Tipicamente il controllo negativo esibir soltanto una fascia all indicatore di allineamento del peso molecolare dei 116 kD Tutta la fascia debole al livello dei 70 kD sulla striscia negativa di controllo dovrebbe essere considerata la reazione della linea di base per quell elaborazione di prova di particolare Figure 2 RESULTI Le strisce del OTOblot contengono due proteine una a 116 kD e l altro rHSP70 a 70 kD Figure 1 116 kD proteina e da indicatore di allineamento del peso molecolare 1 Tenere il nastro di prova fra le reazioni do controllo positivo e controllo negativo sul forni
11. 101 Incubar 60 minutos 5 minutos en la temperatura ambiente en un eje de balanc n o una coctelera que rota 4 Aspirar la soluci n de la muestra en el recipiente para residuos Lavar a fondo las tiras con tamp n de lavado arrojando a chorros aproximadamente 2ml de la soluci n directamente sobre tiras Lavar las tiras con la agitaci n apacible por 5 minutos y aspirar la soluci n en el recipiente para residuos Repetir 3x Precauci n El lavado completo de las tiras entre las incubaciones es crucial obtener resultados v lidos El lavado incorrecto dar lugar al alto fondo que se mancha 5 Medir con una pipeta 1 0 ml de tamp n de diluci n seguidos por 10 ul de conjugado A en cada uno bien Incubar 30 minutos 5 minutos en la temperatura ambiente en eje de balanc n o la coctelera que rota 6 Repetir El Paso 4 YA Medir con una pipeta 1 0 ml de tamp n de diluci n seguidos por 10 pl de conjugado B en cada uno bien Incubar 30 minutos 5 minutos en la temperatura ambiente en eje de balanc n o la coctelera que rota 8 Repetir El Paso 4 9 Medir con una pipeta 1 0 ml substrato en cada uno pozo e incubar con apacible sacudariendo 20 minutos 5 minutos en la temperatura ambiente y la luz reducida 10 Repetir El Paso 4 lav ndose dos veces en vez de cuatro veces 11 Con el f rceps embotado quitar las tiras de la bandeja del an lisis y ponerlas suavemente sobre el papel absorbente Manejar las tiras solamente en los
12. Bandes auf dem 70 kD Niveau auf dem negativen Steuerstreifen sollte gelten als die Grundlinie Reaktion f r diesen Einzelheitprobelauf Figure 2 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Die OTOblot Streifen enthalten zwei Proteine eins bei 116 kD und das andere ist rHSP70 bei 70 kD Figure 1 Die 116 kD Protein ist ein Molekulargewichtausrichtung Markierung 1 Teststreifen zwischen den positiven und negativen Steuerreaktionen auf dem zur Verf gung gestellten lamellierten Kontrollkarte halten und Teststreifen mit der 116 kD Molekulargewicht Ausrichtung Markierung als der Bezugspunkt ausrichten Figure 2 Eine die 116 kD Markierung Linie auf den Steuerkarten erleichtert genaue Ausrichtung der Teststreifen mit den Steuerstreifen 2 Reaktion des Teststreifens mit denen der Kontrollen auf beiden Seiten vergleichen Gebrauch eines Vergr Berungsglases kann korrekte Ausrichtung der Teststreifen 15 entlang der Molekulargewichtmarkierung erleichtern und in der Beobachtung der schwachen Reaktionen unterst tzen 3 Auf ein klares Band auf dem Teststreifen berpr fen der mit dem 70 kD Band auf dem positiven Steuerstreifen bereinstimmt Solch einer Reaktion sollte als positiv gelten Positive Reaktionen k nnen in unterschiedlichen Intensit t von schwachem zu starkem auftreten Schwache Reaktionen sollten mit Grundlinie Reaktion Intensit t in der entsprechenden Position auf dem negativen Steuerstreifen verglichen werden Reaktionen die deutlich dunkler o
13. Blot vers le haut dans diff rents puits du plateau d analyse 2 Introduisez la pipette 1 0 ml du diluant pour chantillons dans chacun bien 3 Introduisez la pipette 10 ul du contr les positif et negatif et chantillon patient dans les puits appropri s pour obtenir une dilution de 1 101 Incubez 60 minutes 5 minutes la temp rature ambiante sur un culbuteur ou un dispositif trembleur tournant 4 Aspirez la solution t moin dans le bac vidange Lavez compl tement les bandes avec le tampon de lavage en injectant approximativement 2ml de solution directement sur des bandes Lavez les bandes avec l agitation douce pendant 5 minutes et aspirez la solution dans le bac vidange R p tez 3x Attention Le lavage complet des bandes entre les incubations est crucial d obtenir des r sultats valides Le lavage inexact aura comme cons quence le fond lev souillant 5 Introduisez la pipette 1 0 ml diluant pour chantillons suivi 10 ul de Conjugu A dans chacun bien Incubez 30 minutes 5 minutes la temp rature ambiante sur le culbuteur ou le dispositif trembleur tournant 6 R p tez L tape 4 7 Introduisez la pipette 1 0 ml diluant pour chantillons suivi 10 pl de Conjugu B dans chacun bien Incubez 30 minutes 5 minutes la temp rature ambiante sur le culbuteur ou le dispositif trembleur tournant 8 R p tez L tape 4 9 Introduisez la pipette 1 0 ml substrat dans chacun puits et incubez
14. HL idiop tico Um subgrupo de casos idiop tico de SNHL trat vel com terapia imunossupressor com resultados gratos 2 O trabalho do laborat rio identifica at estes casos deve incluir testes do anticorpo do soro ao ant geno da orelha interna de 68 kD hsp 70 38 Vinte e dois por cento dos pacientes com r pidamente o SNHL e os 30 progressivos bilateral dos pacientes com doen a de Meniere tiveram os anticorpos que reagiram com o ant geno 68kD atual na orelha interna extrato 7 dos Bov deos Os anticorpos do Anti 68 kD hsp 70 ocorrem tamb m em aproximadamente 60 dos pacientes com bilateral e 35 dos pacientes com o s ndrome de Meniere unilateral e 37 dos pacientes com hydrops endolymphatic atrasados contralateral Nas situa es onde os corticoster ides est o n o indicado methotrexate ou tratamento cytoxan pode ser prescrito 9 PRINC PIO DO PROCEDIMENTO Este teste Western Blot usos o ant geno purifico hsp 70 induz vel recombinante rhsp 70 do rim dos Bov deos Durante o processo de manufatura o ant geno induz vel recombinante do hsp 70 kD misturado com um marcador do alinhamento do peso molecular do 116 kD Esta mistura ent o sujeitada ao electroforese do gel de polyacrylamide e transferida a uma membrana de PVDF Estas membranas s o cortadas em 3 mil metros x tiras de 5 cm para immuno manchar Para executar o teste as tiras incubado com o soro paciente dilu do Os anticorpos ligam especificamente prote na r
15. OTOblot Anti 68 kD hsp 70 Western Blot For Research Use only PRODUCT INSERT Code 1190 20 Determinations INTENDED USE A Western Blot assay for the detection and identification of antibodies to the 68 kD hsp 70 antigen associated with sensorineural hearing loss SNHL SUMMARY AND EXPLANATION Hearing loss may be caused by a number of conditions Certain types of hearing loss can be reversed if diagnosed early and appropriate treatment is instituted Sensorineural hearing loss SNHL commonly referred to as nerve deafness may be caused by genetic or acquired factors such as infections or can be immunologically mediated Correct diagnosis of SNHL can be made with the aid of a combination of comprehensive patient history and laboratory studies In the majority of cases no cause of SNHL is apparent such cases are referred to as idiopathic SNHL A subgroup of idiopathic SNHL cases are treatable with immunosuppressive therapy with gratifying results The laboratory work up to identify these cases should include serum antibody tests to 68 kD hsp 70 inner ear antigen Twenty two percent of patients with bilateral rapidly progressive SNHL and 30 of the patients with Meniere s disease had antibodies that reacted with 68kD antigen present in the bovine inner ear extracts7 Anti 68 kD hsp 70 antibodies also occur in approximately 60 of patients with bilateral and 35 of patients with unilateral Meniere s Syndrome and 37 of patients wit
16. Positif appara t comme la bande de Contr le Negative Cause prob able La fiole Contr le N gative a t confondue comme fiole de Contr le Positif Les bandes sont compl tement blanches Cause probable addition de Conjugu A ou B ou Substrat ont t omis Contraste de fond lev et de pauvres entre les bandes et le fond Cause probable L tape de lavage a pu avoir t omis ou inexactement ex cut ou des incubations ont t tendues OTOblot Anti 68 kD hsp 70 Western Blot For Research Use only Code 1190 20 Determinations USO PREVISTO Un an lisis de Western Blot para la detecci n y la identificaci n de anticuerpos al ant geno de 68 kD hsp 70 se asoci a la p rdida de o do sensori neural SNHL RESUMEN Y EXPLICACI N La p rdida de o do se puede causar por un n mero de condiciones Ciertos tipos de p rdida de o do pueden ser invertidos si se instituye el tratamiento temprano y apropiado diagnosticado La p rdida de o do sensori neural SNHL designada com nmente sordera del nervio se puede causar por factores gen ticos o adquiridos tales como infecciones o puede ser mediada inmunol gico La diagnosis correcta de SNHL se puede hacer con la ayuda de una combinaci n de los estudios pacientes comprensivos de la historia y del laboratorio En la mayor a de casos no hay causa de SNHL evidente tales casos se refieren como SNHL idiop tico Un subgrupo de casos idiop tico de SNHL es trata
17. Positivo compare come la striscia di Controllo Negativo Causa probabile La fialadi controllo negativo di stata confusa come fiala di controllo positivo Le strisce sono completamente in bianco Causa probabile aggiunta di coniugato A o B o substrato sono stati omessi e Alta priorit bassa e contrasto insufficiente fra le fasce e la priorit bassa Causa probabile lo punto della lavata pu essere omesso o essere effettuato in modo errato o le incubazioni erano sovraestese 20 OTOblot Anti 68 kD hsp 70 Western Blot For Research Use only Code 1190 20 Determinations USO PRETENDIDO Um teste Western Blot para a detec o e a identificac o dos anticorpos ao ant geno de 68 kD hsp 70 associou com a perda de ouvido sens rio neural SNHL SUM RIO E EXPLANA O A perda de ouvido pode ser causada por um n mero de circunst ncias Determinados tipos de perda de ouvido podem ser invertidos se o tratamento adiantado e apropriado diagnosticado for institu do A perda de ouvido sens rio neural SNHL consultada geralmente como ao surdez do nervo pode ser causada por fatores gen ticos ou adquiridos tais como infec es ou pode imunol gico ser mediada O diagn stico correto de SNHL pode ser feito com o dae dispositivo autom tico de entrada de uma combina o de estudos pacientes detalhados do hist ria e do laborat rio Na maioria dos casos nenhuma causa de SNHL aparente tais casos s o consultados como a SN
18. SNHL und 30 der Patienten mit Krankheit Menieres hatten Antik rper die mit dem Antigen 68kD reagierten das im Innenohr Extrakt 7 des rinderartigen Tiers vorhanden ist Anti 68 kD hsp 70 Antik rper treten auch in ungef hr 60 von Patienten mit bilateralem und 35 von Patienten mit Syndrom einseitigen Menieres und 37 von Patienten mit kontralateralen verz gerten endolymphatisch hydrops auf In den Situationen in denen Corticosteroide sind nicht angezeigt methotrexate oder cytoxan Behandlung k nnen vorgeschrieben werden 9 GRUNDREGEL DES VERFAHRENS Dieses Western Blot reinigte Probe Gebrauch rekombinant durch Induktion erh ltliches An tigen hsp 70 rhsp 70 von der Tierniere W hrend des Herstellungsverfahrens wird rekombinant gereinigtes hsp 70 Antigen mit einer Molekulargewichtausrichtung Markierung von 116 kD gemischt Diese Mischung wird dann Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen und gebracht auf eine PVDF Membrane Diese Membranen werden in 3 Millimeter x die 5 Zentimeter Streifen f r das Immuno Beflecken geschnitten Um den Test durchzuf hren werden Streifen mit verd nntem geduldigem Serum ausgebr tet Antik rper binden spezifisch an das Protein rhsp 70 auf dem Streifen Nach korrekter Reinigung und zwei Ausbr tungschritten mit Konjugat A und Konjugat B werden Streifen mit einem pr zipitierbaren Substrat gewaschen und ausgebr tet Positive Reaktionen des Antik rpers Anti hsp 70 erscheinen als blau violettes Band a
19. alinhamento do peso molecular no 116 kD Figure 1 Rea o do Controle Negativo Tipicamente o controle negativo exibir somente uma faixa no marcador do alinhamento do peso molecular de 116 kD Toda a faixa fraca no n vel de 70 kD na tira negativa do controle deve ser considerada a reac o da linha de base para esse funcionamento de teste do detalhe Figure 2 INTERPRETA O DOS RESULTADOS As tiras do OTOblot cont m duas prote nas uma no 116 kD e o outro rHSP70 no 70 kD Figure 1 Os 116 kD prote na saques como um marcador do alinhamento do peso molecular 1 Prender a tira de teste entre as rea es controles positivos e controles negativos fornecido laminado cart o de controle e alinhar a tira de teste usando o marcador do alinhamento do peso molecular de 116 kD como o ponto de refer ncia Figure 2 Uma linha do marcador de 116 kD nos cart es de controle facilita o alinhamento exato das tiras de teste com as tiras do controle 2 Comparar a reac o da tira de teste com as aquelas dos controles em um ou outro lado O uso de um vidro ampliando pode facilitar o alinhamento apropriado de tiras de teste ao longo do marcador do peso molecular e ajud lo na observa o de rea es fracas 23 3 Verificar para ver se h uma faixa distinta na tira de teste que alinha com a faixa de 70 kD na tira positiva do controle Tal reac o deve ser considerada positiva As reac es positivas podem ocorrer em intensidades variando de frac
20. ative by US FDA required tests However all human blood derivatives and patient specimens should be considered potentially infectious and good laboratory practices in storing dispensing and disposing of these materials must be followed WARNING Sodium azide NaN3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides Upon disposal of liquids flush with large volumes of water to prevent azide buildup NaN is toxic if ingested Report incidents immediately to laboratory director or poison control center Follow good laboratory practices to minimize microbial and cross contamination of reagents Materials provided Code 1190 The OTOblot anti 68 kD hsp 70 antibody Western Blot kit contains sufficient reagents to perform 20 determinations 1x20 Western Blot Strips containing rhsp 70 1 x 110 pi Positive Control red vial cap 1 x 110 pl Negative Control yellow vial cap 1 Control Card 1 x 240 ul Conjugate A blue vial cap 1 x 240 ul Conjugate B white vial cap 1x 60 ml Serum Diluent 1x25ml Enzyme Substrate amber bottle 1 vial Powdered Wash Buffer reconstitute to one liter with deionized or distilled water 3 Assay trays 2 Report Forms Contains lt 0 1 NaN3 Materials Required But Not Provided Clean 1000 ml graduated cylinder Non serrated forceps Filter forceps Rocker or rotating platform shaker Absorbent paper or paper towels Deionized or distilled water S
21. ble con terapia inmunosupresiva con los resultados gratificantes El trabajo del laboratorio hasta identifica estos casos debe incluir pruebas del anticuerpo del suero al ant geno del oido interno de 68 kD hsp 70 3 8 Veintid s por ciento de pacientes con r pidamente SNHL y el 30 progresivos bilaterales de los pacientes con la enfermedad de Meniere ten an anticuerpos que reaccionaron con el ant geno 68kD presente en el oido interno extracto 7 de los b vidos Los anticuerpos Anti 68 kD hsp 70 tambi n ocurren en el aproximadamente 60 de pacientes con bilateral y el 35 de pacientes con s ndrome de Meniere unilateral y el 37 de pacientes con los hydrops endolymphatic retrasados contralaterales En situaciones donde est n los corticoesteroides no indicado methotrexate o tratamiento cytoxan se puede prescribir 9 PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO Este las aplicaciones immuno ensayo de Western Blot purificaron el ant geno recombinaci n hsp 70 rhsp 70 del ri n de los b vidos Durante el proceso de fabricaci n el ant geno purificado recombinaci n del hsp 70 se mezcla con un marcador de la alineaci n del peso molecular del 116 kD Esta mezcla despu s se sujeta al electroforesis del gel de polyacry lamide y se transfiere a una membrana de PVDF Estas membranas se cortan en 3 milimetros x las tiras de 5 cent metros para immuno mancharse Para realizar la prueba las tiras se incuban con el suero paciente diluido Los anticuerpos ata
22. ction intensities at the corresponding position on the nega tive control strip Reactions that are distinctly darker or denser than the baseline intensity at 70kD should be considered positive Occasionally minor lower molecular weight bandsmay be visible with certain sera However such reactions are not relevant and should be considered as negative for antibodies to 68kD rhsp 70 antigen Note Automated Western blot machines can occassionally show extra bands that may not be related to the 70kD band Ensure the washing cycle is thorough Repeat process manually for clarity EXPECTED VALUES Antibodies to 68 kD hsp 70 occur in patients with active idiopathic SNHL and antibody titers are shown to correlate with disease activity See tables 1 and 2 at the end of this document Studies evaluating 34 patients with rapidly progressive hearing loss demonstrated that anti rhsp 70 OTOBlot had 42 sensitivity 90 specificity and 91 positive predictive value for predicting steroid responsiveness LIMITATIONS OF THE PROCEDURE The OTOblot anti 68 kD hsp 70 antibody Western Blot assay should be used as an aid to diagnosis Positive results may be found in other autoimmune conditions or certain infectious diseases Hence results should be evaluated and interpreted by a medical authority in light of the patient s clinical history and other laboratory findings Some sera may react to the MW marker occasionally the significance of which is not known
23. d gedeutet werden Einige Seren k nnen zur MW Markierung gelegentlich reagieren dessen Bedeutung nicht bekannt BERPR FUNGSF HRER Starkes Band an 68 70kD auf Negative Kontrollle Streifen Wahrscheinliche Ursache verschmutzte Negative Kontrolle Phiole oder Kreuzverschmutzung vom Brunnen der ein positives Serum enth lt Positive Kontrolle erscheint wie Negative Kontrolle Streifen Wahrscheinliche Ursache Negative Kontrolle Phiole wurde als Positive Kontrolle Phiole verwirrt Streifen sind vollst ndig leer Wahrscheinliche Ursache Hinzuf gung von Konjugat A oder B oder Substrat wurden ausgelassen Kontrast des hohen Hintergrundes und der Armen zwischen B ndern und Hintergrund Wahrscheinliche Ursache W sche Schritt kann ausgelassen worden sein oder falsch durchgef hrt worden sein oder Ausbr tungen wurden bernommen OTOblot Anti 68 kD hsp 70 Western Blot For Research Use only Code 1190 20 Determinations USO PROGETTATO Un analisi di Western Blot per la rilevazione e l identificazione degli anticorpi all antigene dei 68 kD hsp 70 si associata con perdita della capacit uditiva neuro sensoriale SNHL SOMMARIO E SPIEGAZIONE La perdita della capacit uditiva pu essere causata da un certo numero di circostanze Determinati tipi di perdite della capacit uditiva possono essere invertiti se il trattamento iniziale ed adatto diagnosticato istituito La perdita della capacit uditiva neuro sens
24. dad de la enfermedad Ver las tablas 1 y 2 en el extremo de este documento Los estudios que evaluaban a 34 pacientes con p rdida de o do r pidamente progresiva demostraron que contra rhsp 70 OTOBlot ten a sensibilidad del 42 la especificidad del 90 y el valor prof tico positivo del 91 para predecir la sensibilidad esteroide 12 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO El an lisis de OTOblot anti 68 kD hsp 70 se debe utilizar como ayuda a la diagnosis Los resultados positivos se pueden encontrar en otras condiciones autoinmunes o ciertas enfermedades infecciosas Por lo tanto los resultados se deben evaluar e interpretar por una autoridad m dica en la luz de la historia cl nica del paciente y de otros resultados del laboratorio Algunos sueros pueden reaccionar al marcador del MW de vez en cuando la significaci n de el cual no se sabe GU A DE LOCALIZACI N DE AVER AS e Banda fuerte en 68 70kD en la tira de Control Negativo Causa probable frasco contaminado de Control Negativo o contaminaci n cruzada del pozo que contiene un suero positivo Control Positivo aparece como la tira de Control Negativo Causa probable El frasco de Control Negativo fue confundido como frasco de Control Positivo Las tiras estan totalmente en blanco Causa probable adici n de conjugado A o B o substrato fueron omitidos Contraste del alto fondo y de los pobres entre las bandas y el fondo Causa probable el paso s de la colada pudo haber sido
25. der dichter sind als die Grundlinie Intensit t an 70kD sollten als positiv gelten Gelegentlich ist das kleine unterere Molekulargewicht die B nder k nnen mit bestimmten Seren sichtbar Jedoch sind solche Reaktionen nicht relevant und sollten als Negativ f r Antik rper zum Antigen 68kD rhsp 70 betrachtet werden Anmerkung Automatisierte Western Fleckmaschinen k nnen Extrab nder zeigen die m glicherweise nicht mit dem Band 70kD zusammenh ngen k nnen Den waschenden Zyklus sicherstellen ist vollst ndig Proze f r Klarheit manuell wiederholen ERWARTETE WERTE Antik rper bis 68 kD hsp 70 bei Patienten mit aktiven idiopathisch SNHL und Antik rpertitern auftreten werden zum Korrelat mit Krankheitt tigkeit gezeigt Tabellen 1 und 2 am Ende dieses Dokumentes sehen Die Studien die 34 Patienten mit schnell progressivem Verlust der H rf higkeit auswerten zeigten da Anti rhsp 70 OTOBlot die 42 Empfindlichkeit hatte die 90 Besonderheit und 91 den positiven vorbestimmten Wert f r das Voraussagen des Steroide Reaktionsverm gens 12 BESCHR NKUNGEN DES VERFAHRENS Die OTOblot Probe sollte als Hilfsmittel f r Diagnose verwendet werden Positive Resultate k nnen in anderen autoimmunen Bedingungen oder in bestimmten ansteckenden Krankheiten gefunden werden Folglich sollten Resultate durch eine medizinische Berechtigung im Licht der klinischen Geschichte des Patienten und anderer Laborentdeckungen ausgewertet werden un
26. do diretor ou do veneno do laborat rio Seguir pr ticas boas do laborat rio minimizar a contamina o microbial e transversal dos reagentes Materiais fornecidos Code 1190 O jogo de OTOblot anti 68 kD hsp 70 contem reagentes suficientes para executar 20 determina es 1x20 tiras Western Blot 1 x 110 pi controle positivo pronto para uso 1 x 110 pi controle negativo pronto para uso 1 cart o de controle 1 x 240 pl conjugado A 1 x 240 ul conjugado A 1x 60 ml diluente de amostras 1x25ml substrato enzime 1 frasco tamp o de lavagem do 1 litro viale 3 bandejas do assay 2 relat rio Contem 0 1 NaN Materiais Requeridos Mas Nao fornecidos Limpar o cilindro graduado 1000 ml f rtceps Non serrilhado Balancim ou sacudidor girando da plataforma Papel absorvente ou toalhas de papel gua desionizado ou destilada e Frasco do aperto ao amortecedor dilu do preens o da lavagem e Pipetas capazes de entregar o 10 a 1000 ul Descart vel introduzir com pipeta pontas Temporizador COLE O E MANIPULA O DO ESP CIME Somente os esp cimes do soro devem ser usados neste procedimento Hemolizados bruta os esp cimes lip micos ou microbial contaminados podem interferir com o desempenho do teste e n o devem ser usados Armazenar esp cimes em 2 8 C para n o mais por muito tempo de uma semana Para um armazenamento mais longo os esp cimes do soro devem ser congelados Evitar congelar se e dege
27. eproduct Immunol 1992 28 208 210 Silveira LH Lopez LR Uzzle RT et al IgA IgG and IgM anticardiolipin antibodies in black patients with systemic lupus erythematosus Arthr Rheum 56th Annual Meeting 1992 S125 Harris NE The second international anti cardiolipin standardization workshop The Kingston antiphospholipid antibody study KAPS group Am J Clin Path 1990 94 476 484 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Centers for Disease Control National Institutes of Health 1993 HHS Pub No CDC 93 8395 Alarc n Segovia D Delez M Oria CV et al Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus A perspective analysis of 500 consecutive patients Medicine 1987 68 353 365 25 Positive Negative Reaction Reaction 116 kD Alignment marker Alignment Marker 116 kD E oo Figure 1 Figure 2 pasa 70 kD anti hsp 70 anti hsp70 70 KD Place test strip here 4 and compare reactions Table 1 Anti 68 kD hsp 70 Antibodies in Patients with Idiopathic Bilateral SNHL 11 Disease Group No Tested No Positive Positive IPBSNHL 72 42 58 Otosclerosis 11 0 0 Cogan s Syndrome 8 0 0 Normals 53 1 2 Table 2 Correlation of Anti 68 kD hsp 70 Antibody Reactivity to Disease Activity 11 Disease Activity Anti 68 kD Antibody Active 89 Inactive 0 26 NOTES 27 For technical assistance please co
28. extremos y dejarlos secar 15 20 minutos Control de calidad Aunque las tarjetas de control son espec fico de la porci n los controles negativos y positivos se deben incluir en cada funcionamiento de prueba para asegurar el funcionamiento apropiado del an lisis Reacci n Control Positivo La tira positiva del control exhibir una banda azul violeta densa en 70kD banda anti rhsp 70 y el marcador de la alineaci n del peso molecular en el 116 kD Figure 1 Reacci n Control Negativo T picamente el control negativo exhibir solamente una banda en el marcador de la alineaci n del peso molecular de 116 kD Cualquier banda d bil en el nivel de 70 kD en la tira negativa del control se debe considerar la reacci n de la l nea de fondo para ese funcionamiento de prueba del detalle Figure 2 RESULTADOS Las tiras del OTOblot contienen dos prote nas una en el 116 kD y el otro es rHSP70 en el 70 kD Figure 1 Los 116 kD servicios de la prote na del como marcador de la alineaci n del peso molecular 1 Llevar a cabo la tira de prueba entre las reacciones del control positivas y control negativas en el proporcionado laminado tarjeta de control y alinear la tira de prueba usando el marcador de la alineaci n del peso molecular de 116 kD como el punto de referencia Figure 2 Una l nea del marcador de 116 kD en las tarjetas de control facilita la alineaci n exacta de las tiras de prueba con las tiras del control 2 Comparar la reacc
29. h contralateral delayed endolymphatic hydrops In situations where corticoster oids are contraindicated methotrexate or cytoxan treatment can be prescribed PRINCIPLE OF PROCEDURE This Western Blot immunoassay uses purified recombinant inducible hsp 70 antigen rhsp 70 from the bovine kidney During the manufacturing process recombinant purified hsp 70 kD antigen is mixed with a molecular weight alignment marker of 116 kD This mixture is then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a PVDF membrane These membranes are cut into 3 mm x 5 cm strips for immunostaining To perform the test strips are incubated with diluted patient serum Antibodies specifically bind to the rhsp 70 protein on the strip After proper washing and two incubation steps using Conjugate A and Conjugate B strips are washed and incubated with a precipitable substrate Anti hsp 70 antibody positive reactions appear as a blue violet band at 70kD REAGENTS Storage and Preparation Store all reagents at 2 8 C Do not freeze Do not use if liquid reagents are turbid or a precipitate is present Prior to starting the assay reagents must be equilibrated to room temperature 22 Antigen strips can only be used once Do not interchange components of different lots Do not use reagents beyond expiration date indicated on labels Precautions All human derived components used have been tested for HBsAg HCV HIV 1 and 2 and HTLV I and found neg
30. hsp 70 na tira Ap s a lavagem apropriada e as duas etapas do incuba o usando Conjugado A e Conjugado B as tiras s o lavadas e incubado com uma carca a precipitado As rea es positivas do anticorpo Anti hsp 70 aparecem como uma faixa azul violeta em 70kD REAGENTES Armazenamento e Prepara o Armazenar todos os reagentes em 2 8 C N o se congelar N o usar se os reagentes l quidos forem turvo ou um precipitado estiver atual Antes de come ar o teste os reagentes devem equilibrado temperatura de quarto 22 As tiras do ant geno podem somente ser usadas uma vez N o intercambiar componentes de lotes diferentes N o usar reagentes al m da data de expira o indicada em etiquetas Precau es Todos os componentes derivados humanos usados foram testados para HBsAg HCV HIV 1 e 2 e HTLV i e negativo encontrado por testes requeridos FDA dos E U Entretanto todos os derivativos humanos do sangue e esp cimes pacientes devem ser considerados potencial 21 infeccioso e as pr ticas boas do laborat rio em armazenar em dispensar e em disp r destes materiais devem ser seguidas 10 Cuidado o azido de s dio NaN3 pode reagir com a liga o e o encanamento de cobre aos azidos altamente explosivos do metal do formul rio Em cima da elimina o dos l quidos resplendor com volumes grandes da gua para impedir o ac mulo do azido NaN t xico se mastigado Relatar incidentes imediatamente ao centro de controle
31. i n de la tira de prueba con las de los controles de cualquier lado El uso de una lupa puede facilitar la alineaci n apropiada de las tiras de prueba a lo largo del marcador del peso molecular y asistir a la observaci n de reacciones d biles 11 3 Comprobar para saber si hay una banda quebradiza en la tira de prueba que alinea con la banda de 70 kD en la tira positiva del control Tal reacci n se debe considerar positiva Las reacciones positivas pueden ocurrir en intensidades que var an de d bil a fuerte Las reacciones d biles se deben comparar con intensidades de la reacci n de la l nea de fondo en la posici n correspondiente respecto a la tira negativa del control Las reacciones que son distintamente m s oscuras o m s densas que la intensidad de la l nea de fondo en 70kD se deben considerar positivas De vez en cuando el peso molecular m s bajo de menor importancia bandas pueden ser visibles con ciertos sueros Sin embargo tales reacciones no son relevantes y se deben considerar como negativa para los anticuerpos al ant geno 68kD rhsp 70 Nota Los instuments automatizados para la Western Blot pueden causar las vendas adicionales no relacionadas con la banda 70kD Asegurar el ciclo que se lava es cuidadoso Repetir el proceso manualmente para la claridad VALORES PREVISTOS Los anticuerpos a 68 kD hsp 70 ocurre en pacientes con t tulos idiop ticos activos de SNHL y del anticuerpo se demuestran al correlativo con activi
32. il processo di fabbricazione l antigene purificato ricombinanto del hsp 70 mescolato con un indicatore di allineamento del peso molecolare di 116 kD Questa miscela allora sottoposta all elettroforesi del gel di poliacrilammide ed trasferita ad una membrana di PVDF Queste membrane sono tagliate in 3 millimetri x lle strisce da 5 centimetri per immuno macchiatura Per effettuare la prova le strisce sono incubate con il siero paziente diluito Gli anticorpi specificamente si legano alla proteina rhsp 70 sulla striscia Dopo il lavaggio adeguato e due punti di incubazione usando coniugato A e coniugato B le strisce sono lavate ed incubate con un substrato precipitabile Le reazioni positive dell anticorpo Anti hsp 70 compaiono come fascia blu viola a 70kD REAGENTI Immagazzinaggio e Preparazione Immagazzinare tutti i reagenti a 2 8 C Non congelare Non usare se i reagenti liquidi sono torbidi o un precipitato presente Prima dell iniziare l analisi i reagenti devono essere equilibrati alla temperatura ambiente 722 Le strisce dell antigene possono essere usate soltanto una volta Non interscambiare i componenti dei lotti differenti Non usare i reagenti oltre la data di scadenza indicata sulle etichette Precauzioni Tutte le componenti derivate umane usate sono state esaminate a HBsAg HCV HIV 1 e 2 e HTLV i e negazione trovata dalle prove richieste FDA degli Stati Uniti Tuttavia tutti i derivati 17 umani di anima ed ese
33. ionamiento de la prueba y no deben ser utilizados Almacenar los espec menes en 2 8 C para no m s de largo de una semana Para un almacenaje m s largo los espec menes del suero deben ser congelados Evitar congelar y deshelar repetidos de muestras M todo Notas Procesales Leer las instrucciones cuidadosamente antes comenzando con el an lisis Dejar los espec menes del suero y los reactivo de la prueba equilibrear a la temperatura ambiente por los minutos 30 antes de comenzar el m todo de prueba Volver todos los espec menes y reactivo inusitados al uso posterior del refrigerador puntualmente La t cnica que se lava apropiada es cr tica al funcionamiento satisfactorio del an lisis Manipular las tiras de prueba con los f rceps limpios solamente No tocar con las manos peladas Las tiras se numeran individualmente en la tapa de cada tira Asignar los n meros de identificaci n del esp cimen a las tiras respectivas en la Hoja de informe 10 Terminar el resto de la informaci n relevante sobre la Hoja de informe antes de comenzar el an lisis Probar El M todo 1 Con el f rceps embotado poner el n mero requerido del lado etiquetado tiras para arriba en los pozos individuales de la bandeja del an lisis 2 Medir con una pipeta 1 0 ml de tamp n de diluci n en cada uno bien 3 Medir con una pipeta 10 pl de control positivo y de negativo y muestra paciente en pozos apropiados para obtener una dilusi n de 1
34. itac o delicado por 5 minutos e aspirar a soluc o no recipiente res duo Repetir 3x Cuidado A lavagem completa das tiras entre incubag os crucial obter resultados v lidos A lavagem impr pria resultar no fundo elevado que mancha 5 Introduzir com pipeta 1 0 ml de amostras seguido seguido perto 10 ul de conjugado A em cada um bem Incubar 30 minutos 5 minutos na temperatura de quarto no balancim ou no sacudidor girando 6 Repetir Etapa 4 Le Introduzir com pipeta 1 0 ml de diluente de amostras seguido perto 10 ul de conjugado B em cada um bem Incubar 30 minutos 5 minutos na temperatura de quarto no balancim ou no sacudidor girando 8 Repetir Etapa 4 9 Introduzir com pipeta 1 0 ml substrato em cada um poco e incubar com delicado agitando 20 minutos 5 minutos na temperatura de quarto e na luz reduzida 10 Repetir Etapa 4 lavando se duas vezes em vez de quatro vezes 11 Usando o f riceps sem corte remover as tiras da bandeja do teste e coloc las delicadamente no papel absorvente Segurar tiras somente nas extremidades e deix las secar 15 20 minutos Controle De Qualidade Embora os cart es de controle s o espec fico do lote os controles negativos e positivos devem ser inclu dos em cada funcionamento de teste para assegurar o desempenho apropriado do teste Reac o do Controle Positivo A tira positiva do controle exibir uma faixa azul violeta densa em 70kD faixa anti rhsp 70 e o marcador do
35. lados repetidos das amostras PROCEDURE Notas Processuais e Ler instru es com cuidado antes de come ar com o teste e Deixar esp cimes do soro e reagentes do teste equilibrado temperatura de quarto por os minutos 30 antes de come ar o procedimento de teste Retornar todos os esp cimes e reagentes n o utilizados ao depois de uso do refrigerador prontamente e A t cnica de lavagem apropriada cr tica ao desempenho satisfat rio do teste e Manipular tiras de teste com f rtceps limpos somente N o tocar com m os desencapadas As tiras s o numeradas individualmente no alto de cada tira Atribuir n meros de identifica o do esp cime s tiras respectivas no relat rio e Terminar toda informa o relevante restante no relat rio antes de come ar o teste 22 Testar O M todo 1 Usando o f rtceps sem corte colocar o n mero requerido do lado etiquetado tiras acima em pocos individuais da bandeja do teste 2 Introduzir com pipeta 1 0 ml de diluente de amostras em cada um bem 3 Introduzir com pipeta 10 pl de controle positiv e de controle negativo e amostra paciente em pocos apropriados para obter uma diluic o de 1 101 Incubar 60 minutos 5 minutos na temperatura de quarto em um balancim ou em um sacudidor girando 4 Aspirar a soluc o da amostra no recipiente res duo Lavar completamente tiras com tamp o de lavagem esguinchando aproximadamente 2ml da soluc o diretamente em tiras Lavar tiras com ag
36. lamide et transf r une membrane de PVDF Ces membranes sont coup es en 3 millim tres X des bandes de 5 centim tres pour immuno souillure Pour r aliser l essai des bandes sont incub es avec le s rum patient dilu Les anticorps lient sp cifiquement la prot ine rhsp 70 sur la bande Apr s le lavage appropri et deux tapes d incubation en utilisant Conjugu A et Conjugu B des bandes sont lav es et incub es avec un substrat pr cipitable Les r actions positives de l anticorps Anti hsp 70 apparaissent comme bande bleu violette 70kD R ACTIFS Stockage et Preparation Stockez tous les r actifs 2 8 C Ne gelez pas N employez pas si les r actifs liquides sont troubles ou un pr cipit est pr sent Avant de commencer l analyse des r actifs doivent tre quilibr s la temp rature ambiante 22 Des bandes d antig ne peuvent seulement tre employ es une fois N changez pas les composants de diff rents sorts N employez pas les r actifs au del de la date d ch ance indiqu e sur des tiquettes Pr cautions Tous les composants d riv s humains utilis s ont t examin s pour HBsAg HCV Hiv 1 et 5 2 et Htlv i et n gatif trouv par les essais exig s par FDA des USA Cependant tous les d riv s humains de sang et sp cimens patients devraient tre consid r s potentiellement infectieux et de bonnes pratiques en mati re de laboratoire en stockant en distribuant et en ayant ces mat
37. ll exhibit a dense blue violet band at 70kD anti rhsp 70 band and the molecular weight alignment marker at 116 kD Figure 1 Negative Control Reaction Typically the negative control will exhibit only one band at the 116 kD molecular weight alignment marker Any weak band at the 70 kD level on the negative control strip should be considered the baseline reaction for that particular test run Figure 2 RESULTS Reading and Interpretation Guidelines The OTOblot strips contain two proteins one at 116 kD and the other is rHSP70 at 70 kD Figure 1 The 116 kD protein serves as a molecular weight alignment marker 1 Hold test strip between the positive and negative control reactions on the provided laminated Control Card and align test strip using the 116 kD molecular weight align ment marker as the reference point Figure 2 A 116 kD marker line on the control cards facilitates accurate alignment of the test strips with the control strips 2 Compare reaction of test strip with those of the controls on either side Use of a magnifying glass can facilitate proper alignment of test strips along the molecular weight marker and assist in observation of weak reactions 3 Check for a crisp band on the test strip that aligns with the 70 kD band on the positive control strip Such a reaction should be considered positive Positive reactions can occur in varying intensities from weak to strong Weak reactions should be com pared with baseline rea
38. mplari pazienti dovrebbero essere considerati potenzialmente contagiosi e le buone pratiche del laboratorio nella memorizzazione nell erogazione e nell avere dei questi materiali devono essere seguite 1 Attenzione l azide di sodio NaN3 pu reagire con cavo e l impianto idraulico di rame agli azoturi altamente esplosivi del metallo della forma Su eliminazione dei liquidi a livello di grandi volumi di acqua per impedire accumulazione dell azoturo NaN tossico se ingerito Segnalare immediatamente gli avvenimenti al centro di controllo del direttore o del veleno del laboratorio Seguire le buone pratiche del laboratorio minimizzare la contaminazione microbica e trasversale dei reagenti Materiali forniti Code 1190 Il corredo di OTOblot anti 68 kD hsp 70 Western Blot contiene i reagenti sufficienti per realizzare 20 determinazioni 1x20 strisce Western Blot 1 x 110 pi controllo positivo pronto al uso 1 x 110 pi controllo negativo pronto al uso 1 scheda di controllo 1 x 240 ul coniugato A 1 x 240 pl coniugato B 1x 60 ml diluente per campioni 1x25ml substrato enzimatico 1 fiala tampone di lavaggio per 1 litro fiala 3 bagni di analisi 2 moduli di rapporto Contiene 0 1 NaN Materiali Richiesti Ma Non forniti Pulire il cilindro laureato 1000 ml forcipe Non seghettato Attuatore o agitatore di rotazione della piattaforma Carta assorbente o tovaglioli di carta Deionizzato o acqua distillata
39. n 70kD REAGENS Ablage und Vorbereitung Alle Reagenzien an 2 8 C speichern Nicht einfrieren Nicht verwenden wenn fl ssige Reagenzien tr b sind oder ein Niederschlag anwesend ist Vor dem Beginnen der Probe m ssen Reagenzien zur Raumtemperatur 22 abgeglichen werden Antigenstreifen k nnen nur einmal benutzt werden Bestandteile der unterschiedlichen Lose nicht austauschen Reagenzien ber dem Verfallsdatum hinaus nicht benutzen das auf Aufklebern angezeigt wird Vorkehrungen Alle menschlichen abgeleiteten benutzten Bestandteile sind auf HBsAg HCV Hiv 1 und 2 und Htlv i und gefundenes Negativ durch US FDA erforderliche Tests gepr ft worden Jedoch sollten alle menschlichen Blutableitungen und geduldigen Probest cke als m glicherweise ansteckend gelten und gute Laborpraxis in der Speicherung dem Zuf hren und dieser Materialien entledigend mu gefolgt werden 19 ACHTUNG Natrium Azid NaN3 kann mit Leitung und kupferner Klempnerarbeit explosiven Aziden der Form reagieren zu den in hohem Grade Metall Nach Beseitigung der Fl ssigkeiten b ndiges mit gro e Volumen Wasser zum von von Azidanh ufung zu verhindern NaN ist giftig wenn es eingenommen wird Ereignissen Labordirektor oder giftsteuermitte sofort berichten Guter Laborpraxis folgen Mikroben und Kreuzverschmutzung der Reagenzien herabzusetzen Materialien bereitgestellt Code 1190 Der OTOblot anti 68 kD hsp 70 Antik rper Western Blot Installationssa
40. n espec ficamente a la prote na rhsp 70 en la tira Despu s del lavado apropiado y de dos pasos de la incubaci n usando conjugado A y conjugado B las tiras se lavan y se incuban con un substrato precipitado Las reacciones positivas del anticuerpo Anti hsp 70 aparecen como banda azul violeta en 70kD REACTIVOS Almacenaje y preparaci n Almacenar todos los reactivo en 2 8 C No congelar No utilizar si los reactivo l quidos son turbios o un precipitado est presente Antes de comenzar el an lisis los reactivo se deben equilibrear a la temperatura ambiente 22 Las tiras del ant geno se pueden utilizar solamente una vez No intercambiar los componentes de diversas porciones No utilizar los reactivo m s all de la fecha de vencimiento indicada en etiquetas Precauciones Todos los componentes derivados humanos usados han sido probados para HBsAg HCV 9 Hiv 1 y 2 y Htlv i y negativa encontrada por las pruebas requeridas FDA de los E E U U Sin embargo todos los derivados humanos de la sangre y espec menes pacientes se deben considerar potencialmente infecciosos y las buenas pr cticas del laboratorio en almacenar dispensar y disponer de estos materiales deben ser seguidas 10 Precauci n el azide de sodio NaN3 puede reaccionar con el plomo y la plomer a de cobre a los zidas altamente explosivos del metal de la forma Sobre la disposici n de l quidos rubor con los vol menes grandes de agua para prevenir la acumulaci
41. ndes suppl mentaires qui ne peuvent tre li es la bande 70kD Assurez le cycle de lavage est complet R p tez le processus manuellement pour la clart VALEURS PR VUES Des anticorps 68 kD hsp 70 se produisent dans les patients pr sentant des titres idiopathiques actifs de SNHL et d anticorps sont montr s la corr lation avec l activit de la maladie Voir les tableaux 1 et 2 la fin de ce document Les tudes valuant 34 patients pr sentant la perte d audition rapidement progressive ont d montr qu anti rhsp 70 OTOBlot a eu la sensibilit de 42 la sp cificit de 90 et la valeur pr dictive positive de 91 pour pr voir la r ponse st ro de 12 LIMITATIONS DU PROC D L OTOblot Western Blot anti 68 kD hsp 70 kit devrait tre employ e comme aide au diag nostic Des r sultats positifs peuvent tre trouv s en d autres conditions autoimmunes ou certaines maladies infectieuses Par cons quent des r sultats devraient tre valu s et interpr t s par une autorit m dicale la lumi re de l histoire clinique du patient et d autres r sultats de laboratoire Quelques s rums peuvent r agir au marqueur de MW de temps en temps dont la signification n est pas connue GUIDE DE D PANNAGE Bande forte 68 70kD sur la bande de Contr le Negative Cause probable fiole souill e de Contr le Negative ou contamination en travers partir du puits contenant un s rum positif Contr le
42. nfecciosas Daqui os resultados devem ser avaliados e interpretado por uma autoridade m dica na luz do hist ria cl nico do paciente e de outros resultados do laborat rio Alguns soro podem reagir ao marcador do MW ocasionalmente o significado de que n o sabido GUIA DE PESQUISA DE DEFEITOS Faixa forte em 68 70kD na tira de Controle Negativo Causa prov vel frasco contaminado de Controle Negativo ou contamina o transversal do po o que contem um soro positivo Controle Positivo aparece como a tira de Controle Negativo Causa prov vel O frasco de controle negativo foi confundido como o frasco de controle positivo As tiras sao completamente em branco Causa prov vel adi o de Conjugado A ou B ou Substrato foram omitidos Contraste do fundo elevado e dos pobres entre faixas e fundo Causa prov vel o Etapa da lavagem pode ter sido omitido ou incorretamente executado ou os incuba o prolongado 24 10 11 12 13 14 15 16 17 18 REFERENCES REFERENCIAS LITERATUR RIFERIMENTI Harris EN Phil M Asherson RA et al Antiphospholipid antibodies antibodies with a difference Ann Rev Med 1988 39 261 271 Harris EN Gharavi AE Wasley GD and Hughes GRV Use of an enzyme linked immunosorbent assay and inhibition studies to distinguish between antibodies to car diolipin from patients with syphilis or autoimmune disorders J Infect Dis 1988 157 23 31 Lockshin MD Anti cardiolipin an
43. ntact OTOIMMUNE Diagnostics a division of IMMCO Diagnostics Inc ar 60 Pineview Drive O Buffalo NY 14228 2120 Telephone 716 691 0091 Fax 716 691 0466 immune Toll Free USA Canada 1 800 537 TEST E mail info immcodiagnostics com or your local distributor CE EU Authorized Representative Autorisierter Repr sentant Rappresentante Autorrizzato Representante Autorizado Repr sentant Autoris EMERGO Group Inc Molenstraat 15 2513 BH The Hague The Netherlands REV DEC2003 Tel 31 345 8570 Fax 31 346 7299 Document No PI4190 www emergogroup com 28
44. o a forte As rea es fracas devem ser comparadas com as intensidades da rea o da linha de base na posi o correspondente na tira negativa do controle As rea es que s o distintamente mais escuras ou mais densas do que a intensidade da linha de base em 70kD devem ser consideradas positivas Ocasionalmente o peso molecular mais baixo menor faixa seja vis vel com determinados soro Entretanto tais rea es n o s o relevantes e devem ser consideradas como o negativo para anticorpos rhsp 70 ao ant geno 68kD Nota As m quinas automatizadas do borr o de Western podem mostrar as faixas extra que n o podem ser relacionadas faixa 70kD Assegurar o ciclo de lavagem completo Repetir o processo manualmente para maior clareza VALORES PREVISTOS Os anticorpos a 68 kD hsp 70 ocorre nos pacientes com titula o idiop tico ativos de SNHL e de anticorpo s o mostrados ao correlacionado com atividade da doen a Ver as tabelas 1 e 2 na extremidade deste original Os estudos que aval am 34 pacientes com perda de ouvido r pidamente progressiva demonstraram que anti rhsp 70 OTOBlot teve a sensibilidade de 42 o especifica o de 90 e o valor predi o positivo de 91 para predizer da resposta aos ester ides 12 LIMITA ES DO PROCEDIMENTO O teste OTOblot anti 68 kD hsp 70 deve ser usado como um dae ao diagn stico Os resultados positivos podem ser encontrados em outras circunst ncias autoimune ou determinadas doen as i
45. omitido o haber sido realizado incorrectamente o las incubaciones fueron extendidas demasiado OTOblot Anti 68 kD hsp 70 Western Blot For Research Use only Code 1190 20 Determinations BEABSICHTIGTER GEBRAUCH Eine Western Blot Probe f r die Abfragung und die Kennzeichnung der Antik rper zum 68 kD hsp 70 Antigen verband mit neurosensorialem Verlust der H rf higkeit SNHL ZUSAMMENFASSUNG UND ERKL RUNG Verlust der H rf higkeit kann durch eine Anzahl von Bedingungen verursacht werden Bestimmte Arten des Verlusts der H rf higkeit k nnen aufgehoben werden wenn bestimmte fr he und passende Behandlung eingeleitet wird Der neurosensoriale Verlust der H rf higkeit SNHL allgemein gekennzeichnet als Nerv Taubheit kann durch die genetischen oder erworbenen Faktoren wie Infektion verursacht werden oder kann immunologisch vermittelt werden Korrekte Diagnose von SNHL kann mit dem Hilfsmittel einer Kombination der kompletten geduldigen Geschichte und Laborstudien gebildet werden In der Mehrheit einen F llen ist keine Ursache von SNHL offensichtlich solche F lle gekennzeichnet als idiopathisch SNHL Eine Untergruppe der idiopathisch SNHL F lle sind mit immunosuppressiver Therapie mit erfreulichen Resultaten 1 2 umg nglich Die Laborarbeit kennzeichnen bis diese F lle sollte Serumantik rper Tests 68 kD hsp 70 zum Innenohrantigen 3 8 einschlie en Zweiundzwanzig Prozent Patienten mit bilateralem schnell progressivem
46. oriale SNHL citata comunemente come sordit del nervo pu essere causata dai fattori genetici o acquistati quali le infezioni o pu essere mediata immunologicamente La diagnosi corretta di SNHL pu essere fatta con l aiuto di una combinazione delle ricerche pazienti complete di laboratorio e di storia Nella maggior parte dei casi non c nessuna causa di SNHL apparente tali casi si riferiscono a come SNHL idiopatico Un sottogruppo di casi idiopatico di SNHL trattabile con la terapia immunosopressiva con i risultati piacevoli 1 2 Il lavoro del laboratorio fino a identifica questi casi dovrebbe includere le prove dell anticorpo del siero all antigene dell orecchio interno dei 68 kD hsp 70 3 8 Ventidue per cento dei pazienti con velocemente SNHL e 3096 progressivi bilaterali dei pazienti con la malattia del Meniere hanno avuti anticorpi che hanno reagito con l antigene 68kD presente nell orecchio interno estratto 7 del bovino Anticorpi Anti 68 kD hsp 70 del inoltre si presentano in circa 60 dei pazienti con bilaterale e 3596 dei pazienti con sindrome del Meniere unilaterale e 3796 dei pazienti con i hydrops endolimphatico in ritardo controlaterali Nelle situazioni dove i corticosteroidi sono non indicato methotrexate o trattamento cytoxan pu prescriversi PRINCIPIO DELLA PROCEDURA Questo gli usi immuno analisi di Western Blot hanno purificato hsp 70 l antigene viscoelastico ricombinante rhsp 70 dal rene del bovino Durante
47. pl tes d histoire et de laboratoire Dans la majorit de cas aucune cause de SNHL n est vidente de tels cas d sign sous le nom de SNHL idiopathique Un sous groupe de cas idiopathiques de SNHL sont traitable avec la th rapie immunosuppressive avec les r sultats agr ables 2 Le travail de laboratoire identifient jusqu ces caisses devrait inclure des essais d anticorps de s rum l antigene d oreille int rieure de 68 kD hsp 70 38 Vingt deux pour cent de patients avec rapidement SNHL et 30 progressifs bilat raux des patients pr sentant la maladie de Meniere ont eu les anticorps qui ont r agi avec de l antigene 68kD actuel dans l oreille int rieure extraits 7 de bovin Les anticorps du Anti 68 kD hsp 70 se produisent galement dans approximativement 60 de patients avec bilat ral et 35 de patients avec Syndrome de Meniere unilat ral et 37 de patients pr sentant les hydrops endolymphatique retard s contralat raux Dans les situations o les corticost roides sont non indiqu methotrexate ou traitement cytoxan peut tre prescrit 9 PRINCIPE DE PROC D Ce les utilisations immunoessai de Western Blot ont purifi l antigene hsp 70 induisible de recombinaison rhsp 70 du rein de bovin Pendant le processus de fabrication l antig ne purifi de recombinaison du hsp 70 est m lang un marqueur d alignement de poids mol culaire du 116 kD Ce m lange est alors soumis l lectrophor se de gel de polyacry
48. queeze bottle to hold diluted wash buffer Pipettes capable of delivering 10 to 1000 ul Disposable pipet tips Timer SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING Only serum specimens should be used in this procedure Grossly hemolyzed lipemic or microbially contaminated specimens may interfere with the performance of the test and should not be used Store specimens at 2 8 C for no longer than one week For longer storage serum specimens should be frozen Avoid repeated freezing and thawing of samples PROCEDURE Procedural Notes Read instructions carefully before starting with the assay Let serum specimens and test reagents equilibrate to room temperature for 30 min utes prior to starting the test procedure Return all unused specimens and reagents to the refrigerator promptly after use Proper washing technique is critical to the satisfactory performance of the assay Manipulate test strips with clean forceps only Do not touch with bare hands Strips are individually numbered at the top of each strip Assign specimen identification numbers to the respective strips on the Report Form Complete all other relevant information on the Report Form prior to starting the assay Test Method 1 Using blunt forceps place required number of Strips labeled side up into individual wells of the assay tray 2 Pipet 1 0 ml of Serum Diluent into each well 3 Pipet 10 ul of Positive and Negative Control and patient sample into appropriate
49. rapporto prima dell iniziare l analisi 18 Verificare Il Metodo 1 Per mezzo del forcipe smussato disporre il numero richiesto di lato identificato strisce in su nei diversi pozzi del vassoio di analisi 2 Pipettare 1 0 ml di diluente per campioni in ciascuno 3 Pipettare 10 pl di controllo positivo e di controllo negativo e campione paziente nei pozzi adatti per ottenere una diluzione di 1 101 Incubare 60 minuti 5 minuti alla temperatura ambiente su un attuatore o su un agitatore di rotazione 4 Aspirare la soluzione del campione nel contenitore di rifiuti Lavare completamente le strisce con tampone di lavaggio erogazione approssimativamente 2ml della soluzione direttamente sulle strisce Lavare le strisce con agitazione delicata per 5 minuti ed aspirare la soluzione nel contenitore di rifiuti Ripetere 3x Attenzione Il lavaggio completo delle strisce fra le incubazioni cruciale da ottenere i risultati validi Il lavaggio improprio provocher l alta priorit bassa che macchia 5 Pipettare 1 0 ml di diluente per campioni seguito bene 10 pl di coniugato A in ciascuno Incubare 30 minuti 5 minuti alla temperatura ambiente sull attuatore o sull agitatore di rotazione 6 Ripetere Punto 4 Ti Pipettare 1 0 ml di diluente per campioni seguito bene 10 pl di coniugato B in ciascuno Incubare 30 minuti 5 minuti alla temperatura ambiente sull attuatore o sull agitatore di rotazione 8 Ripetere Punto 4 9 Pipettare
50. sateur COLLECTION ET MANIPULATION DE SP CIMEN Seulement des sp cimens de s rum devraient tre employ s dans ce proc d H molys s excessivement les sp cimens lip miques ou par microbes souill s peuvent interf rer l ex cution de l essai et ne devraient pas tre employ s Stockez les sp cimens 2 8 C pour plus qu une semaine Pour un entreposage plus prolong des sp cimens de s rum devraient tre gel s vitez la cong lation et le d gel r p t s des chantillons M thode Notes Proc durales Lisez les instructions soigneusement avant commen ant par l analyse Laissez les sp cimens de s rum et les r actifs d essai quilibrer la temp rature ambiante pendant les minutes 30 avant de commencer la m thode d essai Renvoyez tous les sp cimens et r actifs inutilis s au apr s utilisation de r frig rateur promptement La technique de lavage appropri e est critique l ex cution satisfaisante de l analyse Manoeuvrez les bandes d essai avec les forceps propres seulement Ne touchez pas avec les mains nues Des bandes sont individuellement num rot es au dessus de chaque bande Assignez les num ros d identification de sp cimen aux bandes respectives sur le rapport Remplissez toute autre information appropri e sur le rapport avant de commencer l analyse Examinez La M thode 1 En utilisant le forceps mouss placez le nombre requis de c t marqu par les bandelettes Western
51. te della macchia di Western possono mostrare le fasce supplementari che non possono essere collegate con la fascia 70kD Accertare il ciclo di lavaggio completo Ripetere manualmente il processo per chiarezza VALORI PREVISTI Gli anticorpi a 68 kD hsp 70 si presenta in pazienti con i titoli idiopatici attivi dell anticorpo e di SNHL sono indicati alla componente con attivit di malattia Vedere le tabelle 1 e 2 all estremit di questo documento Gli studi che valutano 34 pazienti con perdita della capacit uditiva velocemente progressiva hanno dimostrato che anti rhsp 70 OTOBlot ha avuto sensibilit di 42 la specificit di 90 ed il valore di previsione positivo di 91 per la predizione della risposta steroide 12 LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA L analisi OTOblot anti 68 kD hsp 70 dovrebbe essere usata come sussidio alla diagnosi risultati positivi possono essere trovati in altre circostanze autoimmuni o determinate malattie contagiose Quindi i risultati dovrebbero essere valutati ed interpretati da un autorita medica alla luce della storia clinica del paziente e di altri risultati del laboratorio Alcuni sieri possono reagire occasionalmente all indicatore di MW l importanza di cui non conosciuta GUIDA D ANALISI GUASTI Fascia forte a 68 70kD sulla striscia di Controllo Negativo Causa probabile fiala contaminata di Controllo Negativo o contaminazione trasversale dal pozzo che contiene un siero positivo e Controllo
52. tibody Arth Rheum 1987 30 471 472 Derksen RHWM Beisma D Bouma BN et al Discordent effects of prednisone on anticardiolipin antibodies and the lupus anti coagulant Arth Rheum 1986 29 1295 1296 Alarconegovia D Deleze M Oria CV et al Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus Medicine 1989 68 353 365 Triplett DA Antiphospholipid antibodies and recurrent pregnancy loss Am J Reprod Immunol 1989 20 52 67 Montecucco C Longhi M Caporali R et al Hematological abnormalities associated with anticardiolipin antibodies Hematologica 1989 74 195 204 Asherson RA Khamashta MA ORDI Ros J et al The primary antiphospholipid syndrome major clinical and serological features Medicine 1989 68 366 374 Walport MJ Pregnancy and antibodies to phospholipids Ann Rheum Dis 1989 48 795 797 Machworth Young CG Loizou S and Walport MJ Antiphospholipid antibodies and disease Medicine 1989 72 767 777 Harris EN Gharavi AE Hughes GRV Antiphospholipid antibodies Clin Rheumatol 1985 1 591 609 Lubbe WF Palmer SJ Butler WS and Laggins GC Fetal survival after prednisone suppression of maternal lupus anticoagulant Lancet 1983 1 1361 1363 Hogan MJ Brunet DG Ford PM et al Lupus anticoagulant antiphospholipid antibodies and migraine Can J Neurological Sci 1988 15 420 425 Harris EN Pierangeli S Antiphospholipid antibodies method of detection Am J R
53. to scheda di controllo laminato ed allineare il nastro di prova usando l indicatore di allineamento del peso molecolare dei 116 kD come il punto di riferimento Figure 2 Una linea dell indicatore dei 116 kD sulle schede di controllo facilita l allineamento esatto dei nastri di prova con le strisce di controllo 2 Paragonare la reazione del nastro di prova a quelle dei comandi da qualsiasi lato L uso di una lente d ingrandimento pu facilitare l allineamento adeguato dei nastri di prova lungo l indicatore del peso molecolare ed aiutare nell osservazione delle reazioni deboli 3 Controllare per vedere se c una fascia croccante sul nastro di prova che si allinea con la fascia dei 70 kD sulla striscia positiva di controllo Una tal reazione dovrebbe essere considerata positiva Le reazioni positive possono accadere nelle intensit di variazione da debole a forte Le reazioni deboli dovrebbero essere paragonate 19 alle intensit di reazione della linea di base alla posizione corrispondente sulla striscia negativa di controllo Le reazioni che sono distintamente pi scure o pi dense dell intensit della linea di base a 70kD dovrebbero essere considerate positive Occasionalmente il peso molecolare pi basso secondario fasce possono essere visibili con determinati sieri Tuttavia tali reazioni non sono relative e dovrebbero essere considerate come negazione per gli anticorpi all antigene 68kD rhsp 70 Nota Le macchine automatizza
54. tz enth lt gen gende Reagenzien um 20 Ermittlungen durchzuf hren 1x20 Western Blot Streifen 1x 110 pL Positive Kontrolle gebrauchsfertig 1x 110 uL Negative Kontrolle gebrauchsfertig 1 Kontrollkarte 1 x 240 uL Konjugat A 1 x 240 uL Konjugat B 1 x 60 ml Gepuffertes Probendiluent 1x25 ml Enzym Substrat 1 Phiole Waschpuffer f r je 1 Liter 3 Assay Wannen 2 Report Formulare Enth lt lt 0 1 NaNg Materialien Erfordert Aber Nicht Bereitgestellt 1000 ml graduierten Zylinder s ubern Nicht gezackte Zange Schalthebel oder drehender Plattformsch ttel Apparat Saugf higes Papier oder Papiert cher Entionisiert oder destilliertes Wasser Pressungflasche zu Einflu verd nntem W schepuffer Pipetten f hig zum Liefern von von u 10 bis 1000 L Wegwerf Spitzen pipettieren Timer PROBEST CK ANSAMMLUNG UND BEHANDLUNG Nur Serumprobest cke sollten in diesem Verfahren benutzt werden H molytische grob k nnen lip mische oder durch Mikroben verschmutzte Probest cke die Leistung des Tests behinderen und sollten nicht verwendet werden Probest cke an 2 8 C f r nicht mehr als eine Woche speichern F r l ngere Lagerung sollten Serumprobest cke eingefroren werden Das wiederholte Einfrieren und das Auftauen der Proben vermeiden METHODE Verfahrensanmerkungen Anweisungen beginnend mit der Probe sorgf ltig vorher lesen Serumprobest cke und Testreagenzien zur Raumtemperatur f r Minuten 3
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