Legionella Urine Antigen EIA
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1. limination Autoclaver obligatoirement les utilis es et toutes les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La SUB est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiquement contr l es En cas de trousse d origine d t rior e en informer le fabricant Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium et la mettre la temp rature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es dans le sachet de conservati avec le d shydrazat et les conserver ainsi 2 8 C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques W1 laver 5 fois avec le tampon de lavage Pour cela liminer le liquide du puits et distribuer 300 ul de tampon de lavage Remplir le puits avec au moins 250 ul de tampon de lavage volume total 550 ll R p ter cette proc dure de lav2. partir de la DO moyenne des contr les n gatifs NCx laquelle on ajoute 0 200 Valeur seuil NCx 0 200 Exemple NCx 0 023 seuil 0 023 0 200 0 223 La zone grise est dans l intervalle des DO suivant DO gt DO moyenne de NC 0 100 et DO lt DO moyenne de NC 0 200 Exemple NKx 0 023 zone grise 0 123 0 223 Interpr tation des r sultats Les chantillons d urine ayant une valeur d extinction inf rieure au seuil sont consid r s comme n gatifs Remarque un r sultat n gatif n exclut pas la possibilit d une infection par Legionella Les chantillons d urine donnant une extinction gale ou sup rieure au seuil sont consid r s comme positifs pour la d tection de l antig ne de Legionella Les chantillons positifs peuvent tre r p t s pour confirmation Les chantillons faiblement positifs dans la r gion de 0 200 doivent tre r p t s pour confirmation Si l chantillon est au dessus du seuil apr s une nouvelle analyse il doit tre consid r comme positif Les chantillons d urine ayant une extinction dans la zone grise doivent tre analys s nouveau Si la valeur de DO est nouveau dans la zone grise l chantillon est alors consid r comme positif Si la valeur de DO de l chantillon est inf rieure la zone grise l chantillon est alors n gatif Interpr tation du diagnostic Un r sultat sup rieur au seuil ou plusieurs reprises dans la zone grise r sultat
3. positif pr sum positif pour les antig nes de Legionella dans l urine Un tel r sultat permet de suspecter une infection existante ou ancienne par Legionella les chantillons faiblement positifs doivent tre r p t s pour confirmation voir ci dessus Un r sultat lt NCx 0 200 r sultat n gatif pr sum n gatif pour les anti g nes de Legionella dans l urine La possibilit d une infection par Legionella ne peut pas tre exclue car la sensibilit du test n est pas suffisante pour reconna tre absolument tous les cas de toutes les esp ces de Legionella La s cr tion d antig nes peut tre soumise des variations Il convient de tester d autres chantillons au cours de la surveillance Limitations de la m thode Ce test a t valid en utilisant des chantillons d urine D autres mati res par exemple plasma s rum ou fluides corporels pouvant galement contenir des antig nes de Legionella n ont pas t test es En d pit de sa large r activit avec diverses esp ces de Legionella le test Legionella Urine Antigen EIA de Bio Rad n est pas capable de d tecter les 39 esp ces de Legionella avec une gale sensibilit 6 7 Le diagnostic de l gionellose ne peut pas tre tabli sur la seule base des preuves cliniques ou radiologiques La d tection des antig nes les r sultats de culture et les tests s rologiques apportent d autres aides au diagnostic en association avec les observations cliniqu
4. 7 1 C BR 1 Notice du coffret Laver 5x voir W1 550 550 550 550 MB tape 3 puits ul SUB 100 100 100 100 Incubation 10 1 mn la temp rature ambiante dans obscurit Processeur 10 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans la minute suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit CE 187774 11 08 2010 Contr le de qualit Les contr les positif et n gatif doivent tre inclus dans chaque s rie de tests pour valuer les chantillons des patients et surveiller la performance du test Des chantillons d urine positifs ou n gatifs connus peuvent tre inclus constituant des contr les suppl mentaires La valeur moyenne des contr les n gatifs apr s soustraction du blanc doit tre inf rieure 0 100 La valeur de DO du contr le positif doit tre sup rieure 0 600 La valeur de DO du blanc doit tre inf rieure 0 150 Si ces conditions ne sont pas respect es les r sultats du test sont invalides et le test doit tre recommenc Calcul de la valeur seuil La DO du blanc est retranch e de toutes les valeures de DO des t moins et des pr l vements La valeur seuil est calcul e
5. Legionella Urine Antigen EIA Test immunoenzymatique pour la d tection in vitro de l antig ne de Legionella dans les urines Conditionnement 807 600 Usage pr vu La maladie des l gionnaires est provoqu e par Legionella pneumophila et il s agit d une maladie respiratoire aigu Elle peut prendre la forme d une maladie grippale d intensit moyenne dite fi vre de Pontiac ou peut provoquer une pneumonie qui si elle n est pas trait e peut pr senter un taux de l talit relativement lev 1 Le taux de mortalit qui dans le cas de sujets immunocomp tents peut atteindre 20 en l absence d un traitement ad quat peut tre r duit si l on met en place un traitement antimicrobien appropri d s le stade pr coce gr ce un diagnostic rapide Si l on consid re les infections chez l homme l esp ce Legionella pneumophila est celle d tect e le plus fr quemment 80 85 et plus rarement 18 autres esp ces de Legionella sont susceptibles d entra ner une pneumonie Les souches d esp ces de Legionella isol es de patients appartiennent surtout au s rogroupe 1 mais il existe 14 autres s rogroupes 2 Depuis 1979 la d tection d un antig ne sp cifique dans l urine a en diverses occasions t d crite comme un test simple et fiable 3 4 mais jusqu pr sent cette technique se limite la d tection du s rogroupe 1 Le test pr sent ici d tecte l antig ne sp cifique de Legionella et reconna t tou
6. Proc dure de pipetage pour la d termination de la performance du test 1 5 ml Contr le positif Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Antig ne de Legionella pneumophila pr t l emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pipetage des contr les et des Conservateur 0 095 d azoture de sodium chantillons mettre la plaque incuber imm diatement surnageant de culture tape 1 puits ul CONJ 15 ml Anticorps anti Legionella de lapin marqu s par de la A1 B1 C1 D1 E1 peroxydase de raifort HRP dans un tampon Tris avec BI stabilisateur de prot ine ane Conservateur 0 05 de Proclin 300 NC double test 100 5 6 ml Tampon de lavage concentr 500 x PC 100 Tampon phosphate 0 08 M pH 7 2 Echantill _ nu 100 conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 SE propanediol MTP 2 x 11 ml Solution de substrat pr te l emploi Incubation 60 2 mn 37 1 C Processeur 60 2 mn 37 1 C Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 Laver 5x voir W1 dans H20 Voir avertissement et pr cautions we S 590 390 229 STOP 15ml Solution d arr t pr te l emploi tape 2 puits ul Acide sulfurique lt 1 N H2SO4 CONJ 100 100 100 100 1 Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour MTP conserver les barrettes de microplaques inutilis es avec d shydrazat Incubation 60 2 mn 37 1 C Processeur 60 2 mn 3
7. age 5 fois Effectuer les tapes suivantes imm diatement apr s Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher Pr paration des r actifs Diluer le tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e 1 501 par exemple 1 ml plus 500 ml Le tampon de la lavage ainsi pr par est stable pendant 2 semaine conserv 2 8 C En cas de cristallisation apr s stockage entre 2 et 8 C remettre le tampon de lavage concentr en solution en le portant 37 C Bien m langer le tampon avant de le diluer Tous les autres composants de la trousse du test sont pr ts l emploi Pr paration des chantillons Les chantillons d urine doivent tre recueillis dans des conteneurs standards st riles conserv s la temp rature ambiante et test s dans les 24 heures On peut aussi conserver les chantillons 2 8 C pendant 14 jours ou les congeler 20 C Dans le cas d chantillons d urine contenant de grandes particules de mati re utiliser le surnageant limpide Les chantillons d urine congel s contenant de grandes concentrations de sels phosphates ur ates risquent de donner de plus grandes quantit s de sels par pr cipi Conservateurs concentration totale lt 0 2 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm laveur de micropla
8. es La s cr tion des antig nes de Legionella dans l urine peut varier en fonction du patient des maladies concomitantes et du traitement De plus la s cr tion peut varier chez un m me patient dans le temps ce qui n cessite le test d une s quence de plusieurs chantillons d urine Un traitement ant rieur par des antibiotiques appropri s peut r duire la s cr tion des antig nes chez certains patients La s cr tion d antig nes peut persister longtemps chez certains patients Quelles que soient la sensibilit et la sp cificit du test il faut noter que la d tection positive d antig nes dans l urine doit tre mise en corr lation avec les sympt mes cliniques La mise en relation de signes cliniques avec un test d antig nes positif peut constituer un indicateur pr coce Caract ristiques de performance 300 chantillons d urine provenant de sujets sains et 176 chantillons d urine provenant de sujets pour lesquels on suspecte une infection des voies urinaires ont t test s 475 chantillons ont t n gatifs dans le test urinaire des antig nes de Legionella Un des sujets suspicion d infection des vois urinaires tait faiblement positif sp cificit 99 78 Distribution des valeurs d extinction des chantillons n gatifs Absorption 0 001 0 099 0 100 0 199 0 200 0 299 Seuil Nombre 449 26 1 0 225 d chantillons total 476 46 chantillons d urine de patients pour les
9. fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 2 Coloration jaune dans tous les puits a contamin pr parer un nouveau tampon de lavage b contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 3 Valeur de DO moyenne de PC inf rieure lt 0 600 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de ou 2b Cl Souligner Addition ou modification significative Effacement du texte CE 187774 11 08 2010
10. nstitut 1996 Epidemiologisches Bulletin 35 3 Edelstein P H et coll 1993 Legionnaires disease state of the art clinical article Clin Infect Dis 16 741 749 4 Tang P W et coll 1986 Broad Spectrum Enyzme Llinked Immunosorbent Assay for Detection of Legionella Soluble Antigens J Clin Microbiol 24 556 558 5 Harrison T et coll 1998 A multicenter evaluation of the Biotest Legionella urinary antigen EIA Clin Microbiol Infect 4 359 365 6 Okada C et coll 2002 Cross Reactivity and Sensitivity of Two Legionella Urinary Antigen Kits Biotest EIA and Binax NOW to Extracted Antigens from Various Serogroups of L pneumophila and Other Legionella Species Microbiol Immunol 46 51 54 7 Horn J et coll 2002 Comparison of non serogroup 1 detection by Biotest and Binax Legionella urinary antigen enzyme immunoassays In Marre R et coll eds Legionella ASM Press 207 210 8 Plouffe J F et coll 1995 Clin Infect Dis 20 1286 1291 9 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices Guide de d pannage 1 Valeur de NC sup rieure au crit re de validit DO gt 0 100 a devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Utiliser le de Bio Rad contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la
11. quels la Legionella a t confirm e par culture ont t test s par le test Legionella Urine Antigen EIA Bio Rad Les 46 chantillons d urine ont tous donn un r sultat positif Le tableau ci dessous pr sente la distribution des valeurs d absorption obtenues pour l ensemble des 46 chantillons M Bio Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr 1 D 63303 Dreieich Germany Tel 49 6103 801 95 Fax 49 6103 801 724 www bio rad com techsupport bmd bio rad com Distribution des valeurs d extinction d chantillons positifs culture positive Absorption 0 001 0 200 0 500 1 000 gt 2 000 seuil 0 199 0 499 0 999 1 999 Nombre d chantillons 0 0 1 2 43 0 225 total 46 Sp cificit du test Legionella Urine Antigen EIA 99 8 Sensibilit du test Legionella Urine Antigen EIA 100 0 Remarque On escompte pour la sensibilit absolue du test Legionella Urine Antigen EIA chez les patients ayant une l gionellose certaine une valeur de 50 70 la publication du CDC 8 donne une valeur de 55 9 avec des tests comparables L tude multicentrique europ enne du European Working Group on Legionella Infections EWGLI 5 a donn une sensibilit de 94 6 pour le s rogroupe 1 de Legionella pneumophila et une sensibilit de 86 en incluant les chantillons des s rogroupes 2 3 4 6 10 Litt rature 1 Frazer D W et coll 1977 N Engl J Med 297 1189 1197 2 Robert Koch I
12. ques avec lavage de fond et incubateur 37 C pour les MTP Avertissement et pr cautions Ne pas ing rer les r actifs Eviter le contact avec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons d urine les contr les et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les urines contr les ont t pass es l autoclave et filtr es de fa on st rile mais elles doivent n anmoins tre trait es comme potentielle ment infectieuses Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des 1 Microplaque tation lors de la d cong lation Apr s m lange et s dimentation on peut 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par utiliser le surnageant ou redissoudre les cristaux par chauffage 37 C une IgG anti Legionella de lapin concentration gt 0 5 ug ml incluant un cadre de i Performance du test p 2x 15 mil Etalon Contr le n gatif Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage NC 2e A9 T a ps onto ps 1 riene ce Utiliser 100 pl de contr le positif de contr le n gatif et d chantillon dans nne umane negaive pour anugene qe L gions chaque puits Les barrettes ne sont pas ferm es par un film auto adh sif pr t l emploi humain autoclav Conservateur 0 095 d azoture de sodium
13. s les s rogroupes de L pneumophila avec un spectre de r activit crois e relativement large ainsi que d autres esp ces de Legionella 5 96 tests coffret de tests complets Principe de la m thode Les barrettes d une microplaque sont tapiss es par des anticorps mono clonaux de lapins qui r agissent avec l antig ne de Legionella pneumophila de tous les s rogroupes ainsi que d autres esp ces de Legionella L urine du patient est ajout e dans les puits de la microplaque et tout antig ne de Legionella pr sent se liera l anticorps sp cifique sur la phase solide Apr s la premi re incubation les puits sont lav s et un anticorps marqu par une peroxydase qui r agit avec l antig ne de Legionella pneumophila est ajout il se lie aux sites de liaison libres de l antig ne pendant une seconde incu bation Apr s une autre tape de lavage la pr sence de peroxydase li e est mise en vidence dans une r action color e avec un substrat La r action est stopp e par addition d acide sulfurique et la densit optique DO est mesur e avec un spectrophotom tre 450 nm et une longueur d onde de r f rence de 615 690 nm La trousse contient lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur
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