OFFICE KIRKPATRICK
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1. 30 mulsion contenant de petites v sicules lipidiques unilamellaires de moins de 200 nm 2000 et c on s pare lesdites petites v sicules unilamel laires de toute mati re non encapsul e Le proc d de l invention commence avec la pr paration d une solution de mati res capables de former des v sicules De pr f rence les liquides pour utilisation dans l invention sont des phospho lipides et peuvent comprendre la dipalmitoyl phosphatidyl choline DPPC la dist aroyl phosphatidylcholine DSPC ou des mati res analogues On peut galement utiliser des mol cules amphiphiles autres que les phospholipides tels que les phosphoglyc rides Voir d une mani re g n rale The Hydrophobic Effect par Charles Tanford Wiley Interscience 1980 Biological Lipids Ch 11 pg 106 109 Il est pr f rable d utiliser des compos s ayant des cha nes hydrocarbon es qui pr sentent des transitions de phases des temp ratures relativement lev es sup rieures 37 C pour former des v sicules ayant une stabilit accrue in vivo On sait que les points de transition de phase sont fonction de la longueur de la cha ne hydrocarbon e The Hydrophobic Effect Charles Tanford 2e Ed 1980 Ainsi les compos s formant v sicules ayant des cha nes carbon es d au moins 16 atomes de carbone sont pr f rables Cependant il est plus difficile de r aliser la forma tion de v sicules avec de telles cha nes hydrocarbo2. d selon la revendication 1 dans lequel l tape a comprend a i la dissolution desdites mol cules amphiphiles et d autres composants capables de former des v sicules lipidiques dans une solution de solvant organique 10 15 20 25 30 35 26 a ii la dessication de ladite solution en une pellicule lipidique et a iii la r hydratation de la pellicule lipidique s ch e 5 Proc d selon la revendication 4 pour la pr paration de v sicules appropri es pour uneutilisation dans le ciblage des tumeurs corporelles aux fins de localisation et de diagnostic des tumeurs dans lequel dans l tape a i on dissout les mol cules amphiphiles et au moins un autre composant y compris un ionophore dans l tape a iii on r hydrate la pellicule lipidique s ch e avec une solution physiologique de sel tamponn e auphosphate contenant un agent de ch lation faible dans l tape b on disperse ledit lipide r hydrat pour g n rer une micro mulsion contenant des v sicules lipidiques avec l ionophore incorpor dans la bicouche lipidique et lesdites v sicules contenant l agent de ch lation et apr s l tape c a on charge lesdites v sicules avec un cation radioactif pour d tecter la localisation desdites v sicules lorsqu on les administre dans un corps 6 Proc d selon la revendication 4 pour la pr paration de v sicules pour utilisation dans le traitement d une tumeur corp
3. n iseur consiste en une transmission 4 une vis d ajustement de la pression 5 un manom tre 6 une bouche de recyclage 7 et un assemblage de soupapes d homog n isation 8 10 15 20 25 30 13 La modification consiste en deux r servoirs changeurs de chaleur 9 et 10 qui maintiennent ia solution lipidique une temp rature choisie dans un intervalle de 40 80 C selon la pression laquelle on traite l chantillon mais de pr f rence entre 70 et 75 C Un r servoir 9 de la figure 2 est maintenu dans un intervalle de 5 10 C l autre r servoir 10 de la figure 2 est maintenu environ 80 C Au fonctionnement la solution lipidique pr par e comme ci dessus est mise dans le r ceptacle de solution 11 de la figure 1 puis d plac e dans la zone de soupape 12 de la figure 3 pression lev e et faible vitesse Des bulles de vapeur se forment dans la solution la suite de l augmentation rapide de vitesse accompagn e par une diminution de la pression au fur et mesure que la solution se d place travers le canal 13 entre la soupape 14 et le si ge de soupape 15 Les bulles de vapeur implosent alors au moment o la solution sort de la zone de soupape 12 une vitesse abaiss e et une pression accrue Ce proc d de formation et d implosion des bulles galement connu sous le nom de cavitation g n re les forces de cisaillement lev es qui micivo muisifient la sol
4. pr f r s pour produire de petites v sicules appropri es pour les bio istribu tions de cet exemple sont une micro mulsification pendant 60 minutes 69 MPa 10 000 p s i avec une temp rature de solution de 70 C On filtre alors la micro mulsion obtenue par des techniques standards de filtration sur gel pour s parer les mati res particulaires plus grandes et l exc s de NTA non encapsul d avec les petites v sicules encapsulant le NTA On concentre alors les petites v sicules en utilisant un appareil de concentration fibre creuse Amicon et on d termine la concentration de lipides totaux en utilisant un dosage au phosphate On utilise alors du STP pour diluer les v sicules une concentration lipidique totale finale de 25 mg ml CHARGEMENT PTI On charge alors les v sicules avec lilin en utilisant les proc d s d crits par Mauk amp Gamble Anal Bioc 94 pg 302 307 1979 En bref on fait incuber 500 ul 5 mg de lipide de v sicules et 35 ul d Incl 3 4 um dans du citrate de sodium 104 mM pH 7 4 et 1 50 ul de llin t requise On inclut dans le m lange d incubation un selon l activit volume de 2 x STP gal celui de l addition de our ue On r alise la charge maximale en faisant incuber 80 C On analyse les v sicules pour d terminer si elles conviennent pour les tudes de biodistribution 10 15 20 25 30 20 et de ciblage par comparaison avec des v sicules
5. 50 80 C 10 15 20 Temp C 50 55 50 55 30 35 50 55 50 55 50 55 50 55 50 55 50 55 70 75 70 75 70 75 70 75 70 75 70 75 70 75 70 75 70 75 70 75 Pression MPa PSI 76 11000 76 11000 76 11000 76 11000 76 11000 83 12000 83 12000 83 12000 83 12000 76 11000 76 11000 76 11000 76 11000 76 11000 55 8000 55 8000 55 8000 55 8000 55 8000 16 TABLEAU I Diam tre moyen de pic princi pal des v si cules 67 61 57 57 56 59 55 51 47 63 57 52 50 51 5 7 59 54 52 52 Taille nm Diam tre de Stokes Einstein moyen 102 99 100 106 111 97 94 90 87 122 116 107 83 88 103 100 89 88 8 4 Dur e d homo g n isa tion min 15 30 60 75 90 15 30 60 75 15 30 60 75 90 15 30 60 75 90 10 15 20 25 30 17 Les donn es du tableau I montrent que l on obtient de petites v sicules lipidiques moins de 200 nm 2000 par une micro mulsification en utilisant les forces de cisaillement lev es g n r es dans l homog n iseur fonctionnant pression lev e A la faible temp rature de r servoir 50 55 C de petites v sicules sont g n r es de fa on reproductible des pressions plus lev es sup rieures 69 MPa 10 000 p s i On obtient de pr f rence des v sicules par micro mulsification la temp rature de r servoir plus lev e 70 75 C
6. PATENTS TRADE MARKS DESIGNS OFFICE KIRKPATRICK ESTABL 1852 S P R L Le 24 mai 1991 EUROPEAN PATENT ATTORNEYS SQUARE DE MEEUS 4 B 1040 BRUSSELS BELGIUM Minist re des Affaires Economiques BE Office de la Propri t Industrielle Bruxelles TTC OFFRE DE LA PE MIT POJET EL Messieurs NS eee me chosen 4 f D PS 104 5 st re Brevet europ en No 190050 a Po T du 30 janvier 1986 LUE 9 489 VESTAR INC PE RA S La mention de la d livrance de ce brevet europ en a t publi e au Bulletin Europ en des Brevets du 15 mai 1991 Afin d assurer la protection en Belgique et conform ment l article 65 de la Convention de Munich il y a lieu de d poser une traduction du fascicule du brevet europ en au Bureau des Brevets Je vous remets cet effet un pouvoir ainsi qu un exemplaire de cette traduction Je vous remercie de bien vouloir me confirmer la publication de cette traduction et vous prie d agr er Messieurs l expression de ma haute consid ration Guy PLUCKER GA PG v OFFICE KIRKPATRICK sprl NEOR ARTIC NEO a G RANT MEMBER BANKERS TELEPHONE 2 511 43 34 G C L PLUCKER D L C BELGIAN ASS amp INT FED PA V A T 426 603 921 B B L 310 0115119 66 TELEX 63196 OKIRK B CIVIL ENGINEER U S T A LTM A FM C LPA R C B 466 155 S G B 210 0717846 01 TELEFAX 2 513 55 05 POWER OF ATTORNEY The undersigned hereby constitute s and appoint s Special Attorne
7. e fournir un proc d efficace rapide et reproductible ayant les avantages num r s ci dessus pour produire des quantit s industrielles de petites v sicules uni lamellaires en particulier des v sicules appropri es pour le traitement et le diagnostic des tumeurs dans le corps L invention comprend un proc d de production de petites moins de 200 nm 2000 v sicules unilamellaires en quantit s industrielles dans lequel on met en suspension une solution contenant des lipides et d autres composants capables de former les v sicules d sir es dans un appareil d homog n isation modifi on les maintient une temp rature s lectionn e et on les y soumet des forces de cisaillement tr s lev es pendant une dur e s lectionn e Le proc d de l invention comprend en outre un proc d de pr paration de petites moins de 200 nm 2000 v sicules lipidiques unilamellaires appropri es pour l utilisation comme supports d agents de formation d images pour cibler des cellules tumorales dans le corps On pr pare ces v sicules en mettant une solution de composants capables de former des v sicules un ionophore un agent de ch lation et dans certaines applications un traceur radioactif li audit agent de ch lation dans un appareil d homog n isation et en soumettant la solution des forces de cisail lement tr s lev es tout en maintenant la solution 10 15 20 25 30 une temp rature c
8. e repr senter dans toutes proc dures relatives la publication en Belgique d une traduction fran aise du brevet europ en 0190050 accord le 15 mai 1991 En cons quence signer et d poser toutes pi ces signer tous registres verser et retirer toutes taxes pr senter toutes demandes relatives des additions perfectionnements prolongations ou introductions lever toutes exp ditions de titres proc s verbaux etc lever des copies officielles ou autres m me avant la d livrance ou la publication retirer la demande et la repr senter s il y a lieu lire domicile substituer tout ou partie des pr sents pouvoirs et faire en g n ral tout ce qui sera n cessaire ou utile pendant la dur e de la protection d clarant reconna tre et ratifier tous les actes accomplis pour la r alisation du pr sent mandat Fair San Dimas le 31 mai 1990 UK v 5 25 674 Traduction du brevet europ en No 190050 d pos le 30 janvier 1986 sous le No 86300641 7 accord le 15 mai 1991 Proc d pour la pr paration de petites v sicules par micro mulsification VESTAR INC 10 15 20 25 PROCEDE POUR LA PREPARATION DE PETITES VESICULES PAR MICROEMULSIFICATION La pr sente invention concerne un proc d de production de petites particules micellulaires de lipides sous formes de v sicules unilamellaires en quantit s commerciales par micro mulsification de compositions liquides en utilisant des forces de c
9. ec deux r servoirs d change de chaleur maintenus 5 10 C et 80 C et quip s d une boucle de r tro action pour aider transformer les composants forma teurs de v sicules hydrocarbon s cha ne plus longue en v sicules Lorsqu on utilise des temp ratures plus lev es dans les r servoirs changeurs de chaleur il est possible d utiliser une gamme de pression plus ten due pour obtenir des v sicules ayant la dimension d sir e Puisque la temp rature r elle de la solution lipidique est de quelques degr s sup rieurs dans la zone de la soupape d homog n isation o sont g n r es les forces de cisaille ment il est d conseill aux temp ratures du r servoir le v es d utiliser des pressions lev es car celles ci risquent d augmenter davantage la temp rature de la solution dans la zone de la soupape de dispersion Cette temp rature de fonc tionnement lev e permet ainsi de baisser la pression et de produire cependant des v sicules ayant les dimensions d si r es destin es diff rentes applications biologiques 10 15 20 25 30 10 Comme on l a not ci dessus cet effet est probablement d la facilit accrue de transformation de mol cules amphiphiles hydrocarbon es grande cha ne en v sicules de temp rature sup rieure leurs points de transition de phase L invention utilise galement un instrument de d termination des tailles particulaires laser Nicomp 200 qu
10. hoisie pendant une dur e choisie L invention comprend galement un proc d de pr paration de petites moins de 200 nm 2000 v sicules unilamellaires appropri es pour utilisation comme supports d agents th rapeutiques pour traiter les tumeurs dans le corps On obtient ces v sicules en mettant une solution de composants capables de former des v sicules un agent th rapeutique et dans certaines applications un ionophore un agent de ch lation et un traceur radioactif li audit agent de ch lation dans un appareil d homog n isation et en soumettant cette solution des forces de cisail lement tr s lev es tout en maintenant la solution une temp rature s lectionn e pendant une dur e s lectionn e L invention fournit un proc d pour la pr paration de petites v sicules unilamellaires d un diam tre inf rieur 2000 200 nm appropri es aux applications biologiques dans lequel a on hydrate des mol cules amphiphiles qui sont des phospholipides ou des phospho glyc rides ayant des cha nes hydrocarbon es d au moins 16 atomes de carbone et ventuel lement d autres composants capables de former des v sicules lipidiques qui sont stables in vivo b on disperse ledit lipide hydrat dans un appareil homog n isant ayant un moyen de recyclage une pression de 55 90 MPa 8000 13000 p s 1 et une temp rature de 50 C 80 C pour g n rer une micro 10 15 20 25
11. i d termine la distribution des tailles particulaires dans une solution en utilisant les principes de la dispersion dynamique de la lumi re En bref on fait passer un rayon laser travers une solution chantillon de v sicules et on d termine la taille particulaire partir du comportement dans le temps des fluctuations d intensit lumineuse dis pers e en utilisant une s rie de calculs en fonction du temps exprim s sous forme de fonctions d auto corr lation On calcule le rayon hydrodynamique Rh des particules par la relation de Stokes Einstein en utilisant l analyse des moindres carr s On obtient le rayon moyen et la variation de la distribution de tailles particulaires produites par l appareil Nicomp partir d un chantillon en supposant que la distribution est de forme gaussienne Cependant lorsqu il existe une distribution de tailles particu laire bimodale cette hypoth se n est pas appropri e et les fabricants de l appareil Nicomp ont fourni des programmes instrumentaux d pos s qui permettent d assigner aux donn es des chantillons des donn es bimodales afin d obtenir le diam tre moyen en fonction de Rh pour les particules dans une telle distribution On a obtenu une distribution de tailles bimodale pour les v sicules pr par es par les proc d s de 10 15 20 25 30 LE l invention En utilisant le programme d adaptation des donn es vendu par les fabricants de l appareil Nicomp San
12. ilamellaires par le proc d de micro mulsification On dissout les composants DSPC CH et A23187 dans 50 ml de chloroforme et on s che pour obtenir une mince pellicule lipidique comme ci dessus On r hydrate alors la pellicule lipidique s ch e avec une solution de STP de 0 5 litre contenant le ch lateur faible NTA 1 mM pH 7 4 La concentration de lipides totaux est d environ 25 mg ml Comme il est dit dans le brevet am ricain n 4 310 506 et Mauk et al P N A S USA 76 2 pg 765 769 1979 le NTA assure la force de pouss e pour le transfert net de cations en vue du radiomarquage dans les v sicules Bien que le NTA soit le ch lateur pr f r comme il est dit ci dessus on peut utiliser d autres ch lateurs En outre tandis que 111 3 est le cation pr f r pour radiomarquer les v sicules aux fins d tudes de biodistribution et de proc d s de diagnostic on peut utiliser n importe quel cation qui peut tre li un agent de ch lation Les cations sont de pr f rence choisis dans le groupe de marqueurs radio LLL 45 51 67 In actifs par exemple Ca Cr V rc Ga co et 65yn Apr s r hydratation avec le NTA dans le STP on micro mulsifie le m lange dans un homog n iseur 10 15 20 25 30 19 Gaulin modifi comme il est dit dans l exemple I On utilise un intervalle de r glag de dur e et de pression tel que d crit dans l exemple I On trouve que les param tres
13. iloac tique NTA bien qu on puisse galement utiliser d autres ch lateurs Par exemple lorsque les cations sont des ions m talliques poly valents on peut employer des ch lateurs acide poly aminocarboxylique pour de tels ions comme l acide thyl nediamine t traac tique l acide di thyl ne triamine pentaac tique l acide diamino cyclohexane t traac tique et l acide imino diac tique D autres 10 15 20 25 30 agents utiles pour donner une image de tumeurs peuvent inclure les agents de contraste pour les images par rayons X comme les sels diatrizo ques par exemple l Hypaque m glumine ou des agents de formation d images par r sonance magn tique nucl aire RMN comme les ions paramagn tiques et leurs complexes avec des agents de ch lation forts par exemple le Gadolinium DTPA L invention envisage galement l utilisation de v sicules pour porter des agents th rapeutiques afin de traiter des anomalies telles que les tumeurs chez un malade On peut attacher des agents chimio th rapeutiques tels que les antibiotiques y compris la daunomycine la bl omycine l adriamycine l actinomycine D la mytomycine ou la mithramycine des agents alcoylants y compris le chlorambucil le cyclophosphamide ou la tri thyl nem lamine ou des antim tabolites y compris le m thotr xate le 5 fluorouracil la 6 mercaptopurine l arabinosyl ad nine ou l arabinosylcytosine peuvent tre attach s aux v sic
14. inomycine D la Mytomycine C ou la Mithramycine 27 Proc d selon la revendication 25 dans lequel ledit agent chimioth rapeutique est un agent alcoylant comprenant le chlorambucil le cyclophosphamide ou la tri thyl ne m lamine 28 Proc d selon la revendication 25 dans lequel ledit agent chimioth rapeutique est un antim tabolite comprenant le m thotrexate le fluoro 5 uracile la mercapto 6 purine ou l arabinosylcytosine 29 Proc d selon la revendication 25 dans lequel ledit agent chimioth rapeutique est le m thotrexate 30 Proc d selon l une quelconque des revendications 6 ou 22 24 dans lequel ledit agent th rapeutique est un agent radioth rapeutique 31 Proc d selon la revendication 30 dans lequel ledit agent radioth rapeutique est un radionuclide qui comprend l iode 131 l yttrium 90 ou le phosphore 32
15. isaillement tr s lev es Les particules micellulaires de phospholipides unilamellaires sous forme de v sicules galement connues sous le nom de liposomes ont re u une attention accrue de la part des chercheurs comme supports de diverses substances comme les agents de formation d images et pour le diagnostic des anomalies comme les tumeurs chez l homme en utilisant des mod les animaux En particulier on a montr que de petites v sicules de moins de 200 nm 2000 peuvent tre marqu es pour cibler des tumeurs Proffitt et al J Nucl Med 24 1 p 45 50 1983 Ces v sicules sont galement utiles comme supports potentiels d agents th rapeutiques pour le traitement des 10 15 20 25 30 tumeurs Les petites v sicules sont galement utiles pour les immunodosages in vitro brevet am ricain n 4 342 826 et D Papahadjopoulos dir publ Annals N Y Acad Sci 308 1978 En outre les v sicules contenant des agents de formation d images ou des agents th rapeutiques peuvent tre modifi es par _ incorporation de divers d riv s d hydrates de carbone la surface de la v sicule pour augmenter la sp cifi cit tissulaire des v sicules ou en ajoutant du cholest rol afin d accro tre la stabilit des v sicules Mauk and Gamble Anal Bioc 84 pg 302 307 1979 Mauk et al P N A S U S A 77 8 pg 4430 4434 1980 et Liposome Technology Targeted Drug Delivery and Biological I
16. n es plus longues On a trouv ici de fa on surprenante que l utilisation d un appareil homog n isant que l on 10 15 20 25 30 fait fonctionner des pressions sup rieures aux pressions sp cifi es et quip d un r servoir capable de maintenir des temp ratures s lectionn es peut convertir de tels compos s hydrocarbon s longue cha ne en v sicules am lior es qui peuvent ainsi tre produites des quantit s industrielles On peut incorporer du cholest rol dans la solution lipidique pour accro tre la stabilit des v sicules que l on pr pare en utilisant les proc d s ici d crits En outre si les v sicules sont utilis es pour porter des agents de formation d images afin de localiser et de diagnostiquer des tumeurs on peut ajouter un compos de ch lation la solution lipidique pour qu il soit pi g dans les v sicules ainsi qu un ionophore pour charger des cations externes aux fins de radiomarquage dans l agent de ch lation l int rieur des v sicules La formation d images s effectue en utilisant une cam ra gamma L ionophore pr f r est A23187 mais d autres ionophores utiles comprennent les polyesters tels que le lasalocide A X 537A et les d riv s 5 bromo du lasolocide les depsipeptides cycliques comme la beauv ricine les peptides cycliques comme la valinomyline et les toxines antifongiques comme l ar naciolide L agent de ch lation est de pr f rence l acide nitr
17. ns un rapport molaire de 1 2 0 004 18 Proc d selon la revendication 16 ou 17 dans lequel l ionophore est le A23187 19 Proc d selon l une quelconque des revendications 5 16 17 ou 18 dans lequel l agent de ch lation est l acide nitriloac tique 20 Proc d selon l une quelconque des revendications 5 16 17 18 ou 19 dans lequel le cation radioactif est ou 21 Proc d selon l une quelconque des revendications 5 ou 16 20 dans lequel la concentration finale de lipide total dans la micro mulsion est de 25 mg ml 22 Proc d selon la revendication 6 dans lequel le phospholipide est la dist aroyl phosphatidylcholine 23 Proc d selon la revendication 6 ou 22 dans lequel ladite tape de dissolution de substances lipidiques dans un solvant organique comprend en outre l addition de cholest rol 24 Proc d selon l une quelconque des revendications 6 22 ou 23 dans lequel la composition des v sicules comprend un phospholipide du cholest rol et un agent th rapeutique ledit agent th rapeutique tant contenu dans la solution utilis e pour hydrater les mol cules amphiphiles 25 Proc d selon l une quelconque des revendications 6 ou 22 24 dans lequel ledit agent th rapeutique est un agent chimioth rapeutique 05 10 15 20 29 26 Proc d selon la revendication 25 dans lequel ledit agent chimioth rapeutique est un antibiotique qui comprend la Daunomycine la Bl omycine l Adriamycine l Act
18. nteraction Vol III G Gregoriadis dir publ C R C Press Inc 1984 La technique ant rieure montre que des v sicules telles que des liposomes peuvent tre produites en utilisant les proc d s de traitement aux ultrasons de dialyse d injection ou d vaporation phase invers e Ces proc d s sont bien connus et peuvent se trouver dans les articles suivants Huang Biochemistry 8 pg 344 1969 traitement aux ultra sons Rhoden and Goldin Biochemistry 18 pg 4173 1979 dialyse et Kremer et al Biochemistry 16 pg 3932 3935 1977 injection et Liposome TEchnology Preparation of Liposomes Vol I 6 Gregoriadis dir publ CRC Press Inc 1984 Ces proc d s ont en commun plusieurs inconv nients y compris l inaptitude produire commod ment des quantit s industrielles de telles v sicules L utilisation de dispositifs homog n isants pour produire des mulsions partir de solutions 10 15 20 25 30 avec des composants solubles et insolubles est bien connue des sp cialistes brevet am ricain n 4 127 332 Plusieurs de ces dispositifs d homog n isation fonctionnent en cr ant des forces de cisaillement pour disperser les composants insolubles et solubles Ces forces de cisaillement r sultent du proc d connu sous le nom de cavitation qui comporte la formation rapide de bulles dans la solution chantillon lorsqu elle passe travers des canaux troits provoquant une r duc
19. obtenues par traitement aux ultrasons On pr pare des v sicules trait es aux ultrasons comme il est dit par Mauk amp Gamble Anal Bio 94 pg 302 307 1979 et le brevet am ricain n 4 310 506 En bref on s che une solution lipidique de la m me composition que celle pr sent e ci dessus pour l exemple I puis on la r hydrate avec 0 5 ml de NTA l millimolaire dans le STP On traite le m lange aux ultrasons dans un bain d eau temp rature ambiante pendant 10 minutes puis on le fait incuber 60 C pendant 10 minutes pour liminer par recuit les d fauts structuraux ventuels On centrifuge alors les v sicules faible vitesse pour enlever le titane et toute mati re fortement agglutin e ventuellement pr sente On enl ve le NTA qui ne s incorpore pas en faisant passer la pr paration sur une colonne de Sephadex G 50 quilibr e avec STP On caract rise alors les v sicules comme il est dit ci dessous DETERMINATION DE LA TAILLE DES VESICULES On proc de la d termination de la taille les v sicules produites par le proc d de cet exemple comme il est dit pour l exemple I en utilisant l ins trument de d termination de tailles Nicomp et on compare avec des r sultats obtenus en produisant des v sicules trait es aux ultrasons Comme on le voit au tableau II les proc d s de l invention donnent des v sicules ayant des tailles situ es dans un inter valle de 40 100 nm 400 1000 comparables aux
20. orelle dans lequel dans l tape a iii on r hydrate la pellicule lipidique s ch e avec une solution contenant un agent th rapeutique et dans l tape b on disperse ledit lipide hydrat pour g n rer une micro mulsion contenant des v sicules lipidiques contenant l agent th rapeutique 7 Proc d selon la revendication 4 5 ou 6 dans lequel ledit solvant organique est un ther le chloroforme ou un alcool 05 10 15 20 25 30 35 27 8 Proc d selon l une quelconque des revendications pr c dentes dans lequel on conduit ladite tape de dispersion dans un appareil d homog n isation dans lequel ladite so lu tion lipidique peut tre maintenue dans un intervalle de temp rature s l ctionn 9 Proc d selon la revendication 8 dans lequel ledit ap pareil comprend un r servoir d change de chaleur 10 Proc d selon l une quelconque des revendications pr c dentes dans lequel on conduit ladite tape de dispersion en faisant fonctionner ledit appareil d homog n isation une pression de 55 83 MPa 8 880 12 000 p s i et une temp rature de solution maintenue entre 50 et 80 C pendant une dur e allant de 15 90 minutes 11 Proc d selon l une quelconque des revendications 1 9 dans lequel on conduit ladite tape de dispersion en fai sant fonctionner ledit appareil d homog n isation une pression de 55 69 MPa 8 000 10 000 p s i et une temp ratu
21. qui g n re de petites v sicules appropri es des pressions sup rieures 55 MPa 8000 p s i Cet effet de temp rature lev e permet donc d utiliser un plus grand intervalle de pressions qui peuvent tre une fonction de la difficult de transformer des hydrocarbures longue cha ne en v sicules tant donn les points de transition de phase plus lev s Une temp rature r duite n cessite un fonctionnement de l appareil d homog n isation des pressions plus lev es pour g n rer des forces de cisaillement suffisantes pour transformer de tels pr curseurs de v sicules en v sicules Ces v sicules sont utiles pour diverses applications biologiques comme le diagnostic et le traitement de tumeurs et les dosages in vitro EXEMPLE IT PREPARATION DE VESICULES MODIFIEES POUR REALISER DES IMAGES DE TUMEURS On pr pare des solutions de v sicules comme dans l exemple I avec les modifications suivantes on ajoute l ionophore A23187 au m lange DSPC CH pour donner un rapport molaire de DSPC CH A23187 10 15 20 25 30 18 de 2 1 0 004 5 g de lipide total DSPC et CH en utilisant les proc d s d crits dans les brevets am ricains Nos 4 310 506 3 960 667 et dans Mauk et al P N A S U S A 76 2 765 769 1979 A23187 permet le chargement de v sicules lipidiques avec 111 3 L inclusion un cation de radiomarquage tel que de faibles quantit s d A23187 ne g ne pas la formation de v sicules un
22. re de r servoir de 70 75 C pendant environ 60 minutes 12 Proc d selon l une quelconque des revendications 1 9 dans lequel on conduit ladite tape de dispersion en faisant fonctionner l appareil d homog n isation une pression de 69 83 MPa 10 000 12 000 p s i et une temp rature de r servoir de 50 55 C pendant environ 60 minutes 13 Proc d selon l une quelconque des revendications 1l 9 dans lequel on conduit ladite tape de dispersion en faisant fonctionner ledit appareil d homog n isation une pression d environ 69 MPa 10 000 p s i et une temp ra ture de r servoir de 70 75 C pendant environ 60 minutes 14 Proc d selon la revendication 1 ou 6 dans lequel lesdites mol cules amphiphiles sont des phospholipides qui Sont la phosphatidylcholine la phosphatidyl thanolamine ou la phosphatidyls rine 15 Proc d selon la revendication 1 ou 5 dans lequel le phospholipide est la dist aroyl phosphatidylcholine et ou la dipalmitoyl phosphatidylcholine 10 15 20 25 30 35 28 16 Proc d selon la revendication 15 lorsqu elle se rattache la revendication 5 dans lequel lesdites mol cules amphiphiles sont des phospholipides et lesdits autres composants capables de former des v sicules comprennent du cholest rol et un ionophore 17 Proc d selon la revendication 16 dans lequel la composition des v sicules comprend un phospholipide du cholest rol et un ionophore da
23. s chantillons dans le compteur Gamma pendant une minute pour calculer le pourcentage de dose inject e radioactivit par gramme pour chaque tissu On compte deux standards de v sicules avec les chantillons de tissus Les r sultats de la biodistribution des v sicules radiomarqu es pr par es par micro mulsifi cation 69 MPa 10 000 p s i des temp ratures de 70 75 C sont r sum s au tableau III Le tableau III compare galement ces r sultats avec les donn es obtenues pour la biodistribution des v sicules pr par es par traitement avec les ultrasons et marqu es tlla 3t avec In 10 15 20 25 30 24 TABLEAU III DISTRIBUTION BIOLOGIQUE DES VESICULES moyenne en pourcentage de dose inject e g de tissu pour 5 souris TISSU VESICULES MICROEMULSIFIEES VESICULES TRAITEES AUX ULTRASONS 1 sang 8 1 10 4 2 tumeur 34 0 34 0 3 poumon 5 3 6 2 4 foie 19 8 18 4 5 rate 26 2 25 1 6 rein 10 6 9 2 7 muscle 1 2 0 8 8 intestin 4 1 31 9 estomac 2 3 2 95 10 peau 3 3 3 7 11 queue 2 6 2 0 12 carcasse l 3 1 7 1 5 On trouve ainsi que les distributions tissu laires sont comparables pour les v sicules micro mulsifi es et trait es aux ultrasons Ces r sultats montrent que les v sicules produites par le proc d de micro mulsion ici d crit poss dent des attributs de taille et de stabilit comparables ceux des v sicules produites par trai tement aux ultrasons et qu elles conviennent po
24. ta Barbara Californie on a obtenu les valeurs du diam tre moyen Stokes Einstein Rh x 2 des v sicules dans un chantillon En outre l examen microscopique des v sicules dans plusieurs chantillons que l on a fait passer travers l instru ment de d termination de la taille Nicomp a r v l que les diam tres d une majorit de v sicules tombent en fait l int rieur du pic principal de la courbe de distribution de tailles bimodale obtenue partir de l appareil Nicomp Ainsi pour les donn es concer nant les tailles repr sent es dans les exemples les diam tres des v sicules dans un chantillon donn pr par par les proc d s de l invention sont donn s la fois sous la forme de la moyenne de Stokes Einstein et des diam tres principaux moyens des v sicules des pics Pour obtenir une explication plus d taill e de la dispersion dynamique de la lumi re on se r f rera B Chu Laser Light Scattering Academic Press N Y 1974 et aux instructions accompagnant l appareil de d termination des tailles Nicomp Les exemples suivants sont pr sent s afin de pr ciser l invention Dans les exemples on se r f re aux figures l 2 et 3 des dessins et aux tableaux TLEL La figure 1 est une vue ant rieure d un appareil d homog n isation de Gaulin modifi La figure 2 est une vue lat rale d un appareil d homog n isation de Gaulin modifi La figure 3 est une coupe de l assemblage de so
25. tailles de v sicules par ultrasons et l inventeur trouve que ces proc d s conviennent pour utilisation dans les tudes de biodistribution et de ciblage 10 L3 20 25 30 21 TABLEAU II Caract ristiques des v sicules micro mulsifi es par opposition aux v sicules trait es aux ultrasons Taille nm Efficacit de la charge avec 111r 3 Diam tre Diam tre de Stokes Einstein pic moyen Rh x 2 1 micro mulsifi 87 66 80 1 2 trait aux ultrasons 8 3 51 83 1 EFFICACITE DE LA CHARGE On d termine l efficacit de la charge de ne 111 3 dans les v sicules comme suit on ajoute 100 ul de pr paration de v sicules avec ie charg es comme il est dit ci dessus 0 5 g de Chelex Dow Chemical Corp humidifi pr alablement ajust pH 7 4 et on m lange pendant 2 minutes On ajoute 900 ul de STP et on centrifuge le m lange dans une centrifugeuse de table pendant 5 minutes la temp rature ambiante On enl ve 500 ul de sur nageant et on d termine l efficacit de la charge pourcentage de v sicules charg es en comptant dans un compteur Gamma la radioactivit de l chantillon de 500 ul divis e par la radioactivit des 10 15 20 25 30 22 100 ul de pr paration v siculaire d origine et en multipliant par 200 Comme il est indiqu au tableau II on trouve que l efficacit de la charge du cation st dans les v sicules produites par micro mulsifica
26. tion de la pression de vapeur du fluide Les bulles s effondrent alors et la solution sort de ces zones de canaux g n rant une force de cisaille ment Cependant on a fait fonctionner de tels dispo sitifs d homog n isation des pressions relativement faibles g n ralement en dessous de 69 MPa 10 000 psi dans le but de cr er des mulsions ayant de grandes particules plus de 1 um comme les lipoprot ines utilis es dans la boulangerie brevet am ricain n 4 360 537 ou simplement pour former une mulsion d huile et d eau brevet am ricain n 4 026 817 R cemment on a employ divers dispositifs m caniques comme des homog n iseurs pour produire des v sicules brevet am ricain n 4 41i 894 Cependant ces dispositifs ont t utilis s pour aider la dispersion initiale de substances pr curseurs des v sicules comme la l cithine de soja ou d oeuf qui ne n cessitent pas de forces de cisaillement lev es pour former des v sicules et qui ne forment pas de v sicules ayant une stabilit optimale in vivo En outre on a utilis le dispositif Press and Pressure Cell de French pour g n rer de petites v sicules brevet am ricain n 4 263 428 Un incon 10 15 20 25 30 v nient de ce dispositif est qu il n cessite un d lai suppl mentaire pour recharger un chantillon car il ne fournit pas de moyen pour recycler la solution lipidique travers le dispositif L invention a donc pour objet d
27. tion est sup rieure 80 ce qui est comparable aux valeurs ant rieurement obtenues 111 3 pour les v sicules charg es avec pr par es par traitement aux ultrasons Mauk amp Gamble Anal Bioc 94 pg 302 307 1979 BIODISTRIBUTION Pour explorer le caract re appropri des v sicules obtenues dans cet exemple aux fins d uti lisation in vivo on administre des v sicules contenant 111 3 des souris femelles le marqueur radioactif BALB C auxquelles on a implant au pr alable par voie sous cutan e dans la cuisse droite des tumeurs EMT 6 neuf dix jours avant le d but de ces exp riences pour permettre l analyse de la biodistribution des v sicules dans le tissu animal On effectue une injection intraveineuse par une veine caudale lat rale On p se alors toutes les souris et on les loge pendant 24 heures Avant de les sacrifier on anesth sie les souris avec de l ther et on pr l ve de 1 2 1 millilitre de sang par l orbite et on le met dans un tube de d compte Gamma Beckman Gamma Counter 5500 On sacrifie alors les souris par dislocation cervicale et on diss que les chantillons suivants tumeur poumon foie rate rein muscle intestin estomac peau queue et carcasse On rince fond ces chantillons 10 15 20 23 sauf le muscle l intestin l estomac la peau la queue et la carcasse dans le STP et on les met dans les tubes de d compte Gamma et on p se On compte tous le
28. ules pendant le proc d de microencapsulation de l invention On peut galement attacher des agents radioth rapeutiques y compris des radionucl ides tels que l iode 131 l yttrium 90 ou le phosphore 32 aux v sicules produites en utilisant les proc d s ici d crits pour la radioth rapie des tumeurs L invention n cessite l utilisation d un appareil homog n isant capable de fonctionner des pressions lev es pour g n rer les forces de cisaille ment localis es tr s lev es n cessaires pour produire la micro mulsion de petites v sicules lipidiques unilamellaires partir des solutions de mati res 10 15 20 25 30 formant v sicules ici d crites Un tel appareil est un homog n iseur Gaulin modifi Mod le 15M qui accomplit la dispersion de la solution lipidique au moyen d une soupape d homog n isation La sp cifi cation de l homog n iseur prescrit une pression de fonctionnement continu de 55 MPa 8000 p s i ou une pression de fonctionnement intermittent de 69 MPa 10 000 p s i On a trouv cependant qu avec des mesures de s curit appropri es l homog n iseur peut fonctionner pendant de courtes dur es une pression allant jusqu 83 MPa 12 000 p s i ou m me 90 MPa 13 000 p s i Dans le mode de r alisation pr f r l homog n iseur recycle la solution travers la soupape d homog n isation raison de l litre par minute L homog n iseur Gaulin est modifi av
29. upape d homog n isation prise selon la ligne 3 3 de la figure 2 LRO 10 15 20 25 30 12 EXEMPLE I PREPARATION D UNE SOLUTION DE VESICULES On pr pare des solutions de v sicules en utilisant les techniques d crites par Mauk et al Anal Bioc 94 pg 302 307 1979 et expos es dans le brevet am ricain n 4 310 506 En bref on utilise de la L a dist aroyl phosphatidylcholine DSPC de Calbiochem comme composant phospholipidique de la solution de v sicules sans autre purification On ach te le cholest rol CH aupr s de Sigma et le sel trisodique de l acide nitriloac tique NTA aupr s d Aldrich Chemical Co L ionophore A23187 est obtenu aupr s de Eli Lilly and Co sa pr paration est d crite dans le brevet am ricain n 3 960 667 Pour cet exemple on utilise la DSPC et le cholest rol dans un rapport molaire de 2 1 5 g de lipide total DSPC et CH et on les dissout dans 50 ml de chloroforme puis on s che pour obtenir une pellicule dans un vaporateur rotatif On s che la pellicule sous vide pendant la nuit et on la r hydrate avec 0 5 1 de sel physiologique tamponn au phosphate P NaCl Nacl 0 9 phosphate de sodium 5 mM un pH de 7 4 La concentration en lipide total est d environ 10 mg ml de lipide total On utilise un homog n iseur Gaulin modifi Mod le 15M tel que pr sent dans les figures 1l et 2 pour r aliser la micro mulsification de la solution lipidique L homog
30. ur utilisation in vivo afin de cibler les tumeurs dans des buts de diagnostic et de traitement ainsi que d autres applications biologiques comme les biodosages in vitro 25 REVENDICATIONS l Proc d pour la pr paration de petites v sicules unilamellaires d un diam tre inf rieur 200 nm 2000 A appropri es pour les applications biologiques dans lequel a on hydrate des mol cules amphiphiles qui sont des phospholipides ou des phosphoglyc rides ayant des chaines hydrocarbon es d au moins 16 atomes de carbone et ventuellement d autres composants capables de former des v sicules lipidiques qui sont stables in vivo b on disperse ledit lipide hydrat dans un appareil d homog n isation ayant un moyen de recirculation une pression de 55 90 Mpa 8 000 13 000 p s i et une temp rature de 50 C 80 C pour g n rer une micro mulsion contenant de petits v sicules lipidiques unilamellaires de moins de 200 nm 2000 A et c on s pare lesdit s petites v sicules unilamellaires de toute mati re ventuellement non encapsul e 2 Proc d selon la revendication l dans lequel les mol cules amphiphiles et autres composants capables de former des v sicules lipidiques comprennent un phospholipide et du cholest rol dans un rapport molaire de 2 1 3 Proc d selon la revendication 1 ou 2 dans lequel la concentration finale de lipide total dans la micro mulsion est de 10 mg ml 4 Proc
31. use Eppendorf Mod le 5414 Les grandes particules qui feraient appara tre une erreur dans la mesure de dispersion de la lumi re sont tir es vers le fond tandis que les v sicules restent en suspension On rince un tube essais de 6 x 50 mm avec du STP sel physiologique tamponn au phosphate filtr puis on le remplit jusqu 5 mm du sommet avec du STP On met alors 3 4 ul des v sicules centrifug es dans le tube essais et on m lange le contenu en renversant le tube plusieurs fois On utilise un instrument de d termination des particules laser Nicomp 200 pour d terminer le diam tre moyen et le diam tre des pics principaux comme il est dit ci 10 15 I5 dessus pour un chantillon de v sicules L utilisation de l appareil de d termination de la taille des particules Nicomp est d crite dans le manuel d instructions La temp rature est r gl e 20 C On choisit une largeur de canal appropri e de pr f rence l 4El m sec et un facteur de pr graduation de pr f rence 1 On fait alors passer l chantillon travers l appareil Nicomp Au bout de 50 000 coups on obtient une estimation raisonnable de la taille particulaire Le tableau I montre les donn es de tailles des v sicules r sum es pour les v sicules pr par es par les proc d s de micro mulsification d crits dans le pr sent exemple diff rentes pressions pendant des dur es diff rentes et des temp ratures de r servoirs allant de
32. ution lipidique La micro mulsion sort alors de la zone de soupape 12 frappe l anneau d impact 16 et est recycl e travers l homog n iseur Il est pr f rable que l appareil d homog n i sation fonctionne pendant une dur e suffisante pour permettre un certain nombre de recyclages de la solution lipi dique tout enti re travers la zone de soupape d homog n isation 12 de la figure 3 pour obtenir une micro mulsification optimale En tenant compte du volume 0 5 litre 10 15 20 25 30 14 et du d bit un litre par minute de l appareil d homo g n isation Gaulin modifi utilis dans cet exemple on trouve qu au moins 20 circulations correspondant environ 10 minutes mais au plus 200 circulations 100 minutes suffisent pour produire une micro mulsion de petites v sicules appropri es pour les applications biologiques Dans cet exemple on fait passer les composi tions de v sicules travers l homog n iseur des temp ratures choisies dans un intervalle de 50 80 C pendant des dur es allant de 15 90 minutes La pression pour chaque op rat on varie entre 55 MPa et 83 MPa 8000 p s i 12000 p s i Apr s chaque op ration on d termine la taille des v sicules dans la micro mulsion DETERMINATION DE LA TAILLE DES VESICULES On centrifuge environ l millilitre de la suspension de v sicules homog n is e 15 000 tpm pendant 10 minutes en utilisant une microcentrifuge
33. y for and in name s and stead to take all necessary steps to secure In the execution of this Power the said Attorney is hercby authorized and empowered to sign and file all necessary documents sign registers pay and withdraw all taxes introduce of file petitions and request for additions improvements extention of terms request all proceedings etc obtain copies official or not before grant or publication with draw the application and refile same if necessary elect domicile substitute all or any part of the present power and do generally all that may be necessary or useful during the protection period the undersigned acknowledging and ratifying all acts accomplished in connection herewith San Dimas California U S A day of May 1990 Signed at this 31 VESTAR INC LA VAAIA Paul Gardner Schmidt Vice President Research amp Development FOR FATFXTR TRADPF AIARKS OR DFSIGKA TX BrIAIT D ANDARPPFUNLIC OPAA RE POUVOIR SP CIAL La soussign se VESTAR INC 650 Cliffside Drive California 91773 _ Etats Unis d Am rique San Dimas constitue nt pour Mandataires MM Guy PLUCKER GilbertADYNS Charles DEVILLE Frans DUYCK Daniel GRISAR Guy MARTIN et Jean Pierre VAN BUGGENHOUT mandataires agr es conform ment l article 60 de la loi belge sur les brevets et ayant tous leur adresse professionnelle L OFFICE KIRKPATRICK sprl Square de Me s 4 b 1040 Bruxelles l effet de m
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