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manuel 166-2400 - Bio-Rad

1. Contenu du kit Nombre Kit 3 Antig ne gamma globuline de poulet lyophilis 1 flacon Anticorps primaires anticorps polyclonaux de lapin anti poulet lyophilis s 1 flacon Anticorps secondaires anticorps de ch vre anti lapin conjugu s la peroxydase de raifort HRP lyophilis s 1 flacon Substrat enzyme HRP TMB 1 bouteille Solut physiologique tamponn par les phosphates 10x PBS 1 bouteille Tween 20 10 1 bouteille Pipettes de transfert en plastique jetables 80 Bouteilles et bouchons 30 ml 3 Microplaque avec bande de 12 puits 3 plaques de 8 bandes x 12 puits Tubes jaunes 2 ml 1 sachet Tubes color s 2 ml 15 verts bleus orange violets et bruns 1 sachet Accessoires requis Nombre Kit Micropipettes volume fixe 50 ul N 166 0515EDU 12 ou micropipettes r glables 20 200 ul N 166 0507EDU C nes N 223 9035EDU 150 Serviettes en papier 4 rouleaux ou paquets B chers 100 200 mi 12 Marqueurs noirs 12 Eprouvette gradu e 100 ml 1 Eprouvette gradu e 1 1 Eau distill e 11 Accessoires en option Quantit par Kit Lecteur de microplaques N 168 1002EDU 1 Racks de tubes 12 Les recharges sont disponibles s par ment Ensemble de recharge de r actifs du kit ELISA comporte antig nes anticorps primaires anticorps secondaires solut physiologique tamponn par les phosphates 10x Twe
2. 20 Mode op ratoire du a idian eierniie 23 Protocole II D tection des antig nes avec ELISA 26 Gu ide de l enseignant Se nan cananes scene cents ame ai daina 27 Pr sentation g n rale du TP sn 28 PDO c c ri 29 Liste de contr le des postes de travail TQ nnnnn HH nen 31 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion 32 706 51 1 i20 22 a rE SANEA EEA NERE AENEAN EEEN 34 Protocole IIl Test des anticorps avec ELISA 36 Guide de l enseignant SEE de iniaa ii daaa aa iaaa iasa aaa aaa 37 Pr sentation g n rale du TP b nh a da Ea gilciilcdsilolli dserT llRobdS tB sgddiculebasi 38 D OR 7 c n c c 6 C 39 Liste de contr le des postes de travail TQ nnnnn nen 41 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion 42 M d op ratoire d TP esere 20gl0nis0es2s sngils2csEiss2exeeEreararsroasies 45 Bulletin n 4110175FR Liste de contr le du contenu du Kit Cette rubrique r pertorie les composants fournis dans le kit ELISA Elle r pertorie galement les accessoires n cessaires et ceux en option Chaque kit contient suffisamment de mat riel pour quiper 12 postes de travail avec jusqu quatre l ves par poste Servez vous de cette liste de contr le pour r pertorier les fournitures avant de commencer votre pr paration
3. Biotechnology Explorer Kit ELISA Immuno Explorer Manuel d instructions Ref catalogue 166 2400EDU http explorer bio rad fr Les l ments de ce kit sont exp di s dans des emballages s par s Placez le sac contenant les r actifs au r frig rateur dans la semaine suivant la r ception Remarque ce kit ne contient aucune substance d origine humaine ou pathog ne La duplication de toute partie de ce document est autoris e uniquement pour une utilisation en salle de cours BIO RAD Pour le service technique composez le 01 47 95 69 64 Bulletin n 4110175FR A l attention de l enseignant L immunologie est la science qui tudie le syst me immunitaire et sa mise en action contre des virus micro organismes mol cules ou cellules que la propri t de faire r agir le syst me immunitaire conduit d signer comme tant des antig nes Le plus souvent les antig nes sont susceptibles de provoquer des maladies et sont donc pathog nes Chez les mammif res les plasmocytes issus de la diff renciation des lymphocytes B produisent des mol cules appel es anticorps qui reconnaissent les antig nes avec une tr s grande sp cificit Les anticorps se fixent sur les antig nes au niveau de sites mol culaires pr cis appel s pitopes ou d terminants antig niques et conduisent la formation de complexes immuns La formation de ces complexes immuns permet notamment gr ce l intervention de cellules phagocyt
4. tape 4 Distribuer les r actifs aux postes de travail a Distribuer les t moins positifs Etiqueter 12 tubes violets avec et ajouter chacun 0 5 mi de solution d anticorps primaire 1x b Distribuer les t moins n gatifs Etiqueter 12 tubes bleus avec et ajouter chacun 0 5 ml de solution tampon de lavage c Distribuer l antig ne Etiqueter 12 tubes verts AG et ajouter chacun 1 5 ml d antig ne 1x d Distribuer anticorps secondaire Etiqueter 12 tubes orange AS et ajouter chacun 1 5 mi de solution d anticorps secondaire 1x e Distribuer le substrat enzymatique Etiqueter 12 tubes bruns SUB et ajouter 1 5 ml de substrat enzymatique HRP TMB chacun Remarque le TMB est sensible la lumi re il est donc important d utiliser des tubes sombres pour stoker ce r actif f Distribuer l anticorps primaire chantillons de s rum simul Nous vous recommandons de faire en sorte que 50 de vos l ves aient un test positif et 50 aient un test n gatif Toutefois c est vous que revient le choix final du ratio Pr parez un chantillon de s rum simul pour chaque l ve de votre classe Pour un ratio de 50 50 dans votre classe ajoutez 0 25 mi de solution de d anticorps primaire1x 24 tubes jaunes sans tiquette et 0 25 ml de tampon de lavage 24 tubes jaunes sans tiquette M langez les tubes tape 5 Pr parer les postes de travail Liste de contr le des postes
5. Etiqueter votre bande de 12 puits Inscrivez pour les t moins positifs des trois premiers puits de chaque bande et un pour les trois puits suivants pour les t moins n gatifs Etiqueter les puits restants avec vos initiales et celles de votre partenaire 3 puits chacun Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de t moin positif dans les trois puits Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de t moin n gatif dans les trois puits Transf rer 50 ul de votre chantillon dans les trois puits ayant vos initiales en utilisant un nouveau c ne pour chaque chantillon Attendre 5 minutes que les prot ines des chantillons se lient aux puits en plastique LAVER a Renverser la bande de micro plaques sur les serviettes en papier et taper d licatement la bande plusieurs reprises l envers b Jeter la serviette en papier du haut de la pile c Utiliser une pipette de transfert pour remplir chaque puits avec la solution tampon de lavage d Renverser la bande de micro plaques sur les serviettes en papier et tapoter e Jeter les 2 3 serviettes du haut de la pile Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 uL d anticorps primaire AP dans les 12 puits de la bande de micro plaques Attendre 5 minutes que les anticorps se lient leurs cibles El ve A El ve B T moin ou chantillon Anticorps primaire Bulletin
6. drogues am liorant les performances marijuana m thamph tamine coca ne etc e Confirme la grossesse en d tectant la gonadotropine hCG dans les urines humaines Bulletin n 4110175FR 11 Guerre biologique et ELISA Nous estimons qu il est important d inclure un court traitement de la guerre biologique en effet de nombreux enseignants estimeront qu il est n cessaire de traiter ce sujet tant donn les pr occupations r centes relatives ce ph nom ne La guerre biologique et le bioterrorisme ont souvent t la une de l actualit au cours des r centes ann es toutefois l utilisation d agents biologiques pour nuire un ennemi n est pas un ph nom ne r cent Au sixi me si cle avant J sus Christ les Assyriens empoisonnaient les puits de leurs ennemis avec de l ergot de seigle et les Ath niens empoisonnaient l eau de leurs ennemis avec du symplocarpe f tide un purgatif Au 18 si cle il y eut plusieurs cas o l on offrit aux Indiens des cadeaux volontairement contamin s avec la variole Plus r cemment un d serteur bulgare fut tu Londres avec de la ricine une toxine du ricin la toxine fut inject e dans sa jambe avec la pointe d un parapluie alors qu il attendait un bus En 2001 aux tats Unis des spores d anthrax transform s en arme furent envoy s par courrier des journaux et des services gouvernementaux Au cours d une attaque biologique la d tection le diagnostic et l identificat
7. Les probl mes du syst me immunitaire se subdivisent en trois cat gories hypersensibilit immunod ficience et maladies auto immunes L hypersensibilit intervient lorsque le syst me immunitaire r agit de mani re trop violente un antig ne les r actions de lhypersensibilit comportent des r actions anaphylactiques des allergies et la sensibilit au contact par ex la r action au sumac v n neux Limmunod ficience signifie qu un individu ne peut pas monter une r ponse immunitaire efficace L immunod ficience peut tre g n tique par ex d ficit immunitaire avec d faut d expression des mol cules HLA ou maladie du b b bulle ou induite par une maladie par ex immunod ficience due une infection par le VIH ou par des m dicaments immunod presseurs par ex m dicaments administr s apr s une transplantation d organe pour pr venir le rejet Une maladie auto immune vient d un syst me immunitaire qui se monte de mani re inappropri e une r ponse immunitaire lui m me par exemple les maladies telles que le lupus ryth mateux diss min lupus LED l arthrite rhumatoidale la scl rose en plaques les diab tes insulino d pendants et la maladie coeliaque Bulletin n 4110175FR 21 6 Pourquoi les immunod presseurs sont ils n cessaires dans le cas d une greffe d organe Les immunod presseurs tels que la prednisolone et la cyclosporine emp chent le corps de traiter l organe transplant comm
8. Utiliser une nouvelle pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTICORPS SECONDAIRE r hydrat la bouteille et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec une certaine quantit de r actif dilu pour s assurer que la totalit de lanticorps est utilis e Fermer le bouchon et agiter pour m langer tape 4 Distribuer les r actifs aux postes de travail a Distribuer les t moins positifs Etiqueter 12 tubes violets avec et ajouter chacun 0 5 mi de solution dantig ne 1x b Distribuer les t moins n gatifs Etiqueter 12 tubes bleus avec et ajouter chacun 0 5 ml de PBS 1x c Distribuer l anticorps primaire Etiqueter 12 tubes verts P et ajouter chacun 1 5 mi de solution d anticorps primaire 1x d Distribuer anticorps secondaire Etiqueter 12 tubes orange AS et ajouter chacun 1 5 mi de solution d anticorps secondaire 1x e Distribuer le substrat enzymatique Etiqueter 12 tubes bruns SUB et ajouter 1 5 ml de substrat enzymatique HRP TMB chacun Remarque le TMB est sensible la lumi re il est donc important d utiliser des tubes sombres pour stoker ce r actif f Distribuer les chantillons infect s aux l ves Le nombre d l ves pr sents au cours d terminera le nombre d chantillons infect s que vous m langerez avec des chantillons Bulletin n 4110175FR 19 vierges Pour un r sultat o environ la moiti des l ves sont contamin s nous vous re
9. pour qu ils soient d tect s par ELISA bien avant que le virus VIH ne se r plique un niveau permettant sa d tection Comment choisir Nous proposons un manuel s par pour chaque protocole L enseignant ou les l ves peuvent s lectionner le test de diagnostic le plus pertinent pour le cours en question Les trois activit s refl tent une connaissance en profondeur croissante du sujet du Protocole qui propose une approche d introduction large aux probl mes d immunologie et de sant au Protocole Ill qui permet de creuser en profondeur les m canismes biologiques du syst me immunitaire Vous remarquerez que des manuels s par s pour chaque protocole tant fournis certaines informations se r p tent dans chacun d eux Les trois protocoles sont des variations sur le m me th me Mais chaque approche place les applications d ELISA dans le monde r el dans diff rents contextes Une fois que vous avez choisi lisez les pages 6 11 puis passez au manuel pour le protocole que vous avez choisi Protocole ELISA pour d pister les pid mies page 13 Protocole Il ELISA pour d tecter des antig nes page 26 Protocole Ill Test des anticorps ELISA page 36 Remarque importante pour la pr paration des travaux pratiques en laboratoire par l enseignant Avant de commencer la pr paration de cette activit s lectionnez le protocole utiliser ainsi qu un sc nario Veuillez vous assurer que vous suivez la bonne pr para
10. retir la bouteille du four micro ondes la laisser refroidir puis resserrer le bouchon Diluer uniquement la quantit d anticorps et d antig nes n cessaires pour chaque s ance de travaux pratiques Les anticorps r hydrat s sont des concentrats 50x Stocker les antig nes et anticorps concentr s restant dans le r frig rateur 4 C Il est d conseill de stocker lanticorps et l antig ne concentr s pendant plus de 2 semaines m me 4 C Ne pas congeler les solutions Mesures des volumes Ce kit contient des pipettes de transfert en plastique jetables gradu es utiliser pour pr parer certains r actifs lorsque des volumes entre 250 microlitres ul et 5 millilitres ml sont n cessaires Par ailleurs des micro pipettes volume ajustable ou fixe sont n cessaires pour assurer des volumes de 50 ul L illustration montre les graduations correspondant aux volumes mesurer Des volumes sup rieurs 1 ml exigeront des ajouts multiples Pour chaque tape de la pr paration du TP utiliser une nouvelle pipette ou un nouveau c ne Pour mesurer des liquides qui contiennent des d tergents qui moussent par ex le tampon de lavage vous devez lire le volume au niveau de l interface entre le liquide et les bulles Bulletin n 4110175FR 40 Guide de pr paration d roulement pas pas Ce guide est destin pr parer 12 postes de travail chacun avec 4 l ves tape 1 Pr parer les solutions tampon Nous
11. Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul d antig ne purifi AG dans les 12 puits de la bande de microplaques Antig ne 4 Attendre 5 minutes que les antig nes se purifi lient aux puits en plastique 5 LAVER a Renverser la bande de micro plaques sur les serviettes en papier et taper d licatement la bande plusieurs reprises l envers b Jeter la serviette en papier du haut de la pile c Utiliser une pipette de transfert pour remplir chaque puits avec la solution tampon de lavage d Renverser la bande de micro plaques sur les serviettes en papier et tapoter e Jeter les 2 3 serviettes du haut de EE la pile 6 Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 uL de t moin positif dans les trois puits 7 Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 uL de t moin n gatif dans les trois puits 8 Transf rer 50 ul de votre chantillon de 4 s rum dans les trois puits ayant vos gp initiales en utilisant un nouveau c ne pour chaque chantillon de s rum T moin ou s rum Bulletin n 4110175FR 46 10 11 12 13 14 15 Attendre 5 minutes que les anticorps se lient leurs cibles Laver les anticorps primaires non li s des puits en r p tant la totalit de l tape de lavage 5 Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 ul d anticorps secondaires AS dans les 12 puits de la bande de micro plaques Attendre 5 minutes
12. avec et ajouter chacun 0 5 mi de PBS 1x Bulletin n 4110175FR 31 c Distribuer l anticorps primaire Etiqueter 12 tubes verts AP et ajouter chacun 1 5 mi de solution d anticorps primaire 1x d Distribuer anticorps secondaire Etiqueter 12 tubes orange AS et ajouter chacun 1 5 mi de solution d anticorps secondaire 1x e Distribuer le substrat enzymatique Etiqueter 12 tubes bruns SUB et ajouter 1 5 ml de substrat enzymatique HRP TMB chacun Remarque le TMB est sensible la lumi re il est donc important d utiliser des tubes sombres pour stoker ce r actif f Distribuer les chantillons test aux l ves Nous vous recommandons de concevoir l exp rience de sorte que 50 de vos l ves aient un test positif et 50 aient un test n gatif Toutefois c est vous que revient le choix final du ratio Faites un chantillon test d l ve pour chaque l ve de votre classe Pour un ratio de 50 50 dans votre classe ajoutez 0 25 ml de solution d antig ne 1x 24 tubes jaunes sans tiquette et 0 25 mi de PBS 1x 24 tubes jaunes sans tiquette M langez les tubes tape 5 Pr parer les postes de travail Liste de contr le des postes de travail Un poste de travail pour 4 l ves El ment tiquette Contenu Tube jaune Echantillons test des l ves 0 25 ml Tube violet T moin positif 0 5 ml Tube bleu T moin n gatif 0 5 ml Tube vert AP Anticorps primaire
13. immunitaire nous prot ge t il des maladies 2 Le syst me immunitaire comporte des barri res physiques telles la peau et les membranes muqueuses qui emp chent les pathog nes de p n trer dans le corps et des r ponses cellulaires telles que la circulation des macrophages qui r pondent aux intrus Notre syst me immunitaire acquis monte une r ponse d anticorps sp cifique lorsque notre corps est expos un intrus et nos cellules immunitaires attaquent l intrus 2 Comment le m decin utilise t il la r ponse immunitaire pour nous prot ger des maladies 2 Les m decins utilisent la r ponse immunitaire lorsqu ils nous vaccinent contre certaines maladies Notre syst me immunitaire m morise les pathog nes auxquels nous avons t expos s et lors de l exposition suivante aux pathog nes notre syst me immunitaire les attaque plus rapidement et efficacement Les m decins tirent parti de l effet damorce en nous exposant aux pathog nes inactiv s organismes tu s ou affaiblis qui ne peuvent pas nous rendre malades de sorte que si nous sommes expos s ult rieurement aux pathog nes actifs notre corps montera une r ponse d anticorps puissante et imm diate r duisant ou liminant les risques d tre contamin s par la maladie 3 Pouvez vous nous donner un exemple de maladie qui s attaque au syst me immunitaire de Phomme Les maladies qui s attaquent au syst me immunitaire de l homme comportent les maladies auto immunes par ex ar
14. li s leurs cibles emp chant par l m me les prot ines non li es antig nes ou anticorps de donner des r sultats faux positifs Lorsque vous ajoutez l anticorps secondaire qu arrive t il si votre chantillon de s rum est positif S il est n gatif Si l chantillon est positif l anticorps secondaire s est li aux anticorps du s rum qui s taient li s l antig ne purifi absorb par les puits Si l chantillon est n gatif il n y avait pas d anticorps de s rum li s dans les puits et par cons quent les anticorps secondaires n avaient rien sur quoi se lier et ont t lav s Quels tests de type ELISA pouvez vous acheter dans votre pharmacie locale Les kits de test qui s appuient sur les m mes principes qu ELISA comportent les tests de d tection de grossesse ou d ovulation domicile et les tests pour d tecter la pr sence de drogues ill gales telles que la marijuana et la coca ne Bulletin n 4110175FR 45 Mode op ratoire du TP Test des anticorps avec ELISA 1 Etiqueter les tubes jaunes si besoin pour identifier les chantillons qui sont test s 2 Etiqueter votre bande de 12 puits Inscrivez pour les t moins positifs des trois premiers puits de chaque bande et un pour les trois puits suivants pour les t moins n gatifs Etiqueter les puits restants pour identifier les chantillons qui sont test s 3 puits chacun Exz Echantillon A Echantillon B 3
15. litre d eau distill e a Pr parer 100 mi de PBS 1x Mesurer 90 ml d eau distill e ajouter 10 mi de PBS 10x et m langer Etiqueter le conteneur PBS 1x Le PBS est utilis pour r hydrater les trois composants lyophilis s en tape 2 et pour diluer l ANTIGENE en tape 3 b Pr parer 900 mi de solution tampon de lavage Mesurer 805 ml d eau distill e ajouter 90 ml de PBS 10x et 4 5 mi de Tween 20 10 et m langer Etiqueter le conteneur solution tampon de lavage La solution tampon de lavage est utilis e pour diluer les ANTICORPS PRIMAIRES ET SECONDAIRES en tape 3 tape 2 R hydrater l antig ne l anticorps primaire et l anticorps secondaire lyophilis s a R hydrater les antig nes et les anticorps dans du PBS 1x Retirer d licatement les bouchons des trois r actifs lyophilis s et utiliser une pipette pour ajouter 0 5 ml de PBS 1x chacun Utiliser une nouvelle pipette pour chacun Remettre les bouchons et agiter pour m langer Ces solutions sont concentr es 50x Remarque ce stade vous ne devez pas utiliser la solution tampon de lavage tape 3 Diluer les r actifs a Diluer l antig ne Etiqueter une bouteille de 30 ml antig ne 1x et ajouter 24 5 ml de PBS 1x la bouteille Utiliser une pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTIG NES r hydrat s au PBS 1x et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec du r actif dilu et s assurer que la totalit de l antig ne es
16. n 41101 75FR 39 Pr paration du TP Cette rubrique est con ue pour vous aider pr parer efficacement cet exercice pratique Nous vous recommandons de r hydrater et diluer l antig ne et l anticorps primaire au maximum 3 jours avant la s ance et l anticorps secondaire moins de 24 heures avant la s ance Ces r actifs doivent tre conserv s dans le r frig rateur ou dans de la glace s ils ont t pr par s plus de 4 heures avant le TP Il est essentiel que les l ves mettrent les bons composants dans les bons puits de dosage et ceci dans le bon ordre par cons quent il est crucial pour la r ussite de l exercice que les tubes soient clairement tiquet s et correctement cod s par couleur Objectifs tape 1 Pr parer des solutions tampon tape 2 R hydrater l antig ne lyophilis l anticorps primaire et l anticorps secondaire tape 3 Diluer les r actifs tape 4 Distribuer les r actifs aux postes de travail tape 5 Pr parer les postes de travail Temps n cessaire 1 3 heures Remarque si vous envisagez d utiliser ce kit pour plusieurs sessions de TP sur une p riode de 1 ou 2 semaines nous vous recommandons fortement d utiliser de l eau st rilis e pour pr parer la solution tampon PBS afin d viter de contaminer les r actifs L eau peut tre st rilis e en la portant bullition dans un four micro ondes plus de 5 minutes dans une bouteille bouch e sans trop serrer apr s avoir
17. n gatif alors que l antig ne est en fait pr sent Un r sultat n gatif ne signifie pas forc ment que l antig ne n est pas pr sent Cela peut tre un faux n gatif Le test ELISA peut ne pas tre suffisamment sensible pour d tecter les niveaux tr s faibles d antig ne Une autre cause de r sultats faux n gatifs est l erreur exp rimentale comme par exemple mettre un t moin n gatif dans un puits alors que vous pensiez y mettre un chantillon exp rimental 15 Pourquoi avez vous effectu un dosage de vos chantillons en triple 2 Effectuer le dosage des chantillons en trois exemplaires est un autre contr le Si vous nobtenez pas les m mes r sultats dans les trois puits votre technique exp rimentale a sans doute un probl me ou vous avez fait une erreur de pipette Dans un laboratoire clinique l exp rience devrait tre reprise Si cette erreur intervient dans cette activit prenez le r sultat des deux puits qui coincident car il est sans doute correct 16 Quels tests base d anticorps pouvez vous acheter dans votre pharmacie locale 2 Les kits de test qui s appuient sur les m mes principes qu ELISA comportent les tests de d tection de grossesse ou d ovulation domicile et les tests pour d tecter la pr sence de drogues ill gales telles que la marijuana et la cocaine Bulletin n 4110175FR 34 Mode op ratoire du TP D tection des antig nes avec ELISA 1 2 Etiqueter un tube jaune avec vos initiales
18. notre syst me immunitaire les attaque plus rapidement et efficacement Les m decins tirent parti de l effet damorce en nous exposant aux pathog nes inactiv s organismes tu s ou affaiblis qui ne peuvent pas nous rendre malades de sorte que si nous sommes expos s ult rieurement aux pathog nes actifs notre corps montera une r ponse d anticorps puissante et imm diate r duisant ou liminant les risques d tre contamin s par la maladie 3 Pouvez vous nous citer certains modes de propagation des maladies propagann T e e a e U propagent par organiques Ingestion d aliments E coli 0157 H7 prions qui provoque la maladie de Creutzfeldt Jakob et la ou d eau contamin s maladie de la vache folle protozoaires qui provoquent la lambliase n matodes qui provoquent la trichinose Vecteur de transfert Maladies v hicul es par les moustiques malaria virus du West Nile fi vre de la dengue fi vre jaune maladies transport es par les tiques maladie de Lyme fi vre pourpr e des Montagnes rocheuses 4 Pouvez vous nous donner un exemple de maladie qui s attaque au syst me immunitaire de l homme 2 Les maladies qui s attaquent au syst me immunitaire de l homme comportent les maladies auto immunes par ex arthrite rhumatoidale lupus asthme ecz ma d ficit immunitaire avec d faut d expression des mol cules HLA et SIDA 5 Quels probl mes peuvent emp cher le syst me immunitaire de fonctionner correctement
19. pipettes ajustables 20 200 H El ment tiquette Contenu Num ro Tube jaune Echantillons test des l ves 0 75 ml 4 1 par l ve Tube violet T moin positif 0 5 ml 1 Tube bleu T moin n gatif 0 5 ml 1 Tube vert AP Anticorps primaire 1 5 ml 1 Tube orange AS Anticorps secondaire 1 5 ml 1 Tube brun SUB Substrat enzymatique 1 5 ml 1 2 1 C nes jaunes 10 20 Pipettes de transfert en plastique jetables 5 Solution tampon de lavage 70 80 ml Solut physiologique tamponn par les 1 dans b cher phosphates avec Tween 20 0 05 Pile de serviettes en papier Marqueur noir 1 Remarque sur le protocole de partage v rifier que les l ves partagent leur liquide organique avec les l ve d autres parties de la pi ce et pas seulement avec leurs voisins La meilleure mani re de le faire est d avoir un partage ordonn dites aux l ves de partager avec une autre personne puis de revenir leur poste de travail Une fois que tous les l ves ont termin le premier partage et sont revenus leur place demandez leur de partager avec un autre l ve Ici encore une fois que les l ves ont termin le second partage dites leur de partager avec un troisi me l ve Points d arr t m me si cette proc dure est con ue pour s int grer dans la dur e d un seul cours si vous d sirez arr ter l activit de travaux pratiques vous pouvez vous a
20. polyclonaux sont purifi s partir de s rum animal Les anticorps monoclonaux sont obtenus en fusionnant des cellules B venant de souris immunis es avec des cellules immortalis es en culture et en collectant les anticorps pomp s dans le fluide de croissance Il existe des m thodes plus avanc es technologiquement pour fabriquer des anticorps impliquant la technologie de l ADN recombinant 5 Pourquoi un test de d tection d antig ne rapide est il n cessaire En m decine les patients et les m decins ont rapidement besoin des r sultats des tests de mani re pouvoir prendre les d cisions cruciales pour le traitement du patient Les responsables charg s de veiller au respect de l application de la loi et les responsables sportifs ont besoin de r sultats rapides aux tests de consommation de drogue pour les aider d cider si oui ou non une action doit tre engag e contre une personne soup onn e d avoir consomm des drogues Les tests de s curit des aliments de l eau et de l environnement doivent donner des r sultats rapides car la sant et la s curit de la population peuvent tre en jeu Par ailleurs dans tous les cas ci dessus le temps consacr attendre les r sultats de tests peut avoir un impact conomique 6 Que signifie ELISA Enzyme linked immunosorbent assay r Pourquoi les enzymes sont elles utilis es dans ce dosage immunitaire Les enzymes permettent de voir si l anticorps primaire s est attac
21. que les anticorps se lient leurs cibles Laver les anticorps secondaires non li s des puits en r p tant deux reprises le lavage de l tape 5 Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de substrat enzymatique SUB dans les 12 puits de la bande de microplaques Attendre 5 minutes Observer et consigner les r sultats LAVAGE Anticorps secondaire Substrat enzymatique Bulletin n 41101 75FR 47
22. r agit avec un substrat incolore dans une r action chimique qui vire au bleu Si l anticorps secondaire est pr sent dans le puits le changement de couleur indique un r sultat positif 10 Pourquoi avez vous besoin de doser des chantillons t moins positifs et n gatifs ainsi que des chantillons exp rimentaux Les t moins sont n cessaires pour s assurer que l exp rience a fonctionn S il ny a pas de t moin positif et si l chantillon est n gatif nous ne pouvons savoir si l chantillon tait v ritablement n gatif ou si le dosage n a pas fonctionn l inverse sans t moin n gatif il n y a aucun moyen de savoir si tous les chantillons positifs ou non auraient donn un r sultat positif Questions clefs apr s la s ance de TP 11 Les chantillons que vous avez ajout s la bande de micro plaques contiennent de nombreuses prot ines et peuvent ou non contenir l antig ne de la maladie Qu est il advenu des prot ines du puits en plastique si l chantillon contenait de l antig ne 2 Qu en est il advenu s il ne contenait pas d antig ne Dans les deux cas toutes les prot ines pr sentes dans les chantillons se lient aux puits en plastique 12 Pourquoi avez vous eu besoin de laver les puits apr s chaque tape Le lavage retire toutes les prot ines qui ne se sont pas li es aux puits en plastique et tous les anticorps qui ne se sont pas li s leurs cibles emp chant par l m me les prot i
23. sup rieurs 1 ml exigeront des ajouts multiples Pour chaque tape de la pr paration du TP utiliser une nouvelle pipette ou un nouveau c ne Pour mesurer des liquides qui contiennent des d tergents qui moussent par ex le tampon de lavage vous devez lire le volume au niveau de l interface entre le liquide et les bulles Bulletin n 4110175FR 18 Guide de pr paration d roulement pas pas Ces instructions sont destin es pr parer 12 postes de travail chacun avec 4 l ves tape 1 Pr parer les solutions tampon Nous vous recommandons d utiliser un cylindre gradu de 1 litre et un de 100 mi pour pr parer les solutions tampons Vous aurez galement besoin d 1 litre d eau distill e a Pr parer 100 mi de PBS 1x Mesurer 90 mi d eau distill e ajouter 10 ml de PBS 10x et m langer Etiqueter le conteneur PBS 1x Le PBS est utilis pour r hydrater les trois composants lyophilis s en tape 2 et pour diluer l ANTIGENE en tape 3 b Pr parer 900 mi de solution tampon de lavage Mesurer 805 ml d eau distill e ajouter 90 mi de PBS 10x et 4 5 mi de Tween 20 10 et m langer Etiqueter le conteneur solution tampon de lavage La solution tampon de lavage est utilis e pour diluer les ANTICORPS PRIMAIRES ET SECONDAIRES en tape 3 tape 2 R hydrater l antig ne l anticorps primaire et l anticorps secondaire lyophilis s a R hydrater les antig nes et les anticorps dans du PBS 1x Ret
24. t moin positif Un chantillon n gatif qui donne un r sultat de dosage positif est appel un faux positif Un chantillon positif qui donne un r sultat de dosage n gatif est appel un faux n gatif De nombreux dosages de diagnostic donnent un pourcentage de r sultats faux positifs ou faux n gatifs de sorte qu il est important de confirmer les diagnostics par un second type de dosage Par exemple des immunoessais pour les anticorps au virus de l immunod ficience humaine VIH peut donner des r sultats faussement positifs ou faussement n gatifs Les faux positifs peuvent tre le r sultat de vaccinations ant rieures et les faux n gatifs peuvent r sulter d une immunosuppression par ex partir de m dicaments administr s apr s des transplants ou sont dus au fait que le test a t administr trop t t apr s l infection par le VIH Il faut attendre plusieurs semaines pour que les anticorps contre le VIH apparaissent apr s une contamination par le VIH l apparition d anticorps sp cifiques est appel e s roconversion C est pourquoi on confirme toujours des r sultats ELISA HIV positifs en effectuant un autre test de type western blot Bulletin n 4110175FR Dans un ELISA comme ceux des Protocoles et II o la concentration dantig nes est la variable exp rimentale des puits sans antig nes constitueraient un t moin n gatif appropri Tout produit de couleur dans ces puits serait le r sultat soit d un 1 bloca
25. 1 5 ml Tube orange AS Anticorps secondaire 1 5 ml Tube brun SUB Substrat enzymatique 1 5 ml Bandes de micro plaques 12 puits Micro pipettes volume fixe 50 pl ou micro pipettes ajustables 20 200 H C nes jaunes Pipettes de transfert en plastique jetables Solution tampon de lavage 70 80 ml Solut physiologique tamponn par les dans b cher phosphates avec Tween 20 0 05 Pile de serviettes en papier Marqueur noir Num ro 4 1 par l ve 1 10 20 1 v Points d arr t m me si cette proc dure est con ue pour s int grer dans la dur e d un seul cours si vous d sirez arr ter la proc dure vous pouvez ajouter de la solution tampon de lavage aux puits de micro plaques tout stade apr s l ajout dantig nes et avant l ajout de substrat enzymatique et placer les bandes de micro plaques et tous les r actifs dans le r frig rateur pour la nuit une temp rature de 4 C 32 Bulletin n 4110175FR R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion Questions clefs avant la s ance de TP 1 Comment le syst me immunitaire nous prot ge t il des maladies 2 Le syst me immunitaire comporte des barri res physiques telles la peau et les membranes muqueuses qui emp chent les pathog nes de p n trer dans le corps et des r ponses cellulaires telles que la circula
26. BS 1x la bouteille Utiliser une pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTIG NES r hydrat s au PBS 1x et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec du r actif dilu et s assurer que la totalit de l antig ne est utilis e Fermer le bouchon et agiter pour m langer Remarque vous ne devez pas ajouter de solution tampon contenant du Tween 20 l antig ne sinon l exp rience ne fonctionnera pas e Diluer lanficorps primaire Etiqueter une bouteille de 30 ml anticorps primaire 1x et ajouter 24 5 mi de solution tampon de lavage dans la bouteille Utiliser une nouvelle pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTICORPS PRIMAIRE r hydrat la bouteille et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec une certaine quantit de r actif dilu pour s assurer que la totalit de l anticorps est utilis e Fermer le bouchon et agitez pour m langer f Diluer l anticorps secondaire Diluer l anticorps secondaire moins de 24 heures avant le d marrage du TP Etiqueter une bouteille de 30 mi anticorps secondaire 1x et ajoutez 24 5 mi de solution tampon de lavage dans la bouteille Utiliser une nouvelle pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTICORPS SECONDAIRE r hydrat la bouteille et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec une certaine quantit de r actif dilu pour s assurer que la totalit de l anticorps est utilis e Fermer le bouchon et agiter pour m langer Bulletin n 4110175FR 41
27. SUB dans les 12 puits de la bande de microplaques Attendre 5 minutes Observer et consigner les r sultats Anticorps primaire LAVER Anticorps secondaire LAVER 2 X Substrat enzymatique Bulletin n 4110175FR 25 26 Bulletin n 4110175FR Protocole Il D tection des antig nes avec ELISA Guide de l enseignant 27 Pr sentation g n rale du TP 28 Pr paration du TP 29 Liste de contr le des postes de travail 31 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion32 Mode op ratoire du TP 34 Bulletin n 4110175FR 27 Protocole Il ELISA pour d tecter les antig nes Guide de l enseignant Cette activit interactive est con ue pour simuler la mise en uvre d un test pour d tecter la pr sence d un antig ne dans un chantillon donn Le protocole peut tre utilis pour discuter comment un dosage ELISA bas sur les anticorps peut d tecter des agents pathog nes dans des chantillons tels que les fluides organiques avant que le corps n ait eu la chance de monter une r ponse immunitaire La variole est lun des grands exemples Si elle est d tect e et trait e avec le vaccin dans les 2 3 jours suivant l exposition les patients ne d veloppent pas la variole D autres sc nari bas s sur des maladies incluent le virus du West Nile le VIH le SRAS et l anthrax On peut galement prendre des exemples de sources d antig nes li s aux maladies dans les animaux de la fe
28. a variole est l un des grands exemples Si elle est d tect e et trait e avec le vaccin dans les 2 3 jours suivant l exposition les patients ne d veloppent pas la variole Alternativement cette approche peut tre utilis e pour discuter d un ELISA non bas sur une maladie comme les tests de grossesse la d tection de la pr sence de drogues la contamination de l air ou de l eau ou la d tection de la pr sence d organismes pathog nes ou g n tiquement modifi s OGM dans les aliments Bulletin n 4110175FR Protocole IlI test anticorps ELISA Le protocole propos est celui qui correspond la d marche du programme de Terminale S Il s agit d utiliser le test ELISA dans l objectif du diagnostic d une maladie Ce diagnostic s applique un certain nombre de maladies VIH maladie de Lyme trichinose virus West Nile et SRAS On teste la pr sence d anticorps sp cifiques d antig nes de maladies dans un chantillon de s rum de patient chantillon simul Ce protocole peut tre utilis pour d tecter et diagnostiquer une infection lorsque l antig ne n est pas d tectable et qu la suite d une r ponse immunitaire les anticorps sont apparus dans le s rum sanguin Le test du SIDA VIH est un exemple classique R cemment encore les tests taient limit s la d tection ELISA des anticorps au virus plut t qu la d tection directe du virus lui m me Le corps produit des anticorps un niveau suffisamment lev
29. aires la destruction de l antig ne Par ailleurs les anticorps sont devenus des outils pr cieux en biotechnologie ils sont utilis s en recherche ainsi que pour le diagnostic et le traitement de maladie Dans la partie consacr e l immunologie du programme de Terminale S la r alisation d un test de type Elisa figure parmi les activit s envisageables pour construire la notion de s ropositivit Ce kit tr s facile d emploi et particuli rement fiable permet de faire r aliser aux l ves toutes les tapes d un test Elisa depuis la fixation des antig nes dans les cupules jusqu la lecture des r sultats et ceci dans un d lai tout fait compatible avec la dur e de la s ance de TP Qu est ce qu ELISA 2 ELISA est lacronyme de enzyme linked immunosorbent assay Ce puissant test bas sur les anticorps est utilis pour diagnostiquer les maladies telles que le Sida et le SRAS et pour rechercher les agents pathog nes dans l eau les aliments et lair que ces derniers mergent naturellement ou par le biais d actes d agression ELISA est galement utilis pour identifier les organismes g n tiquement modifi s OGM pour tracer des allerg nes alimentaires et des marqueurs mol culaires de grossesse et de consommation de drogues Ce kit permet d adopter trois approches d ELISA voir page 4 Le kit comporte des guides d instructions pour chacune des approches L enseignant ou les l ves peuvent s lectionner le prot
30. cial de d tecter tr s t t l infection Les personnes infect es par le VIH peuvent n avoir aucun sympt me pendant de nombreuses ann es mais si elles commencent le traitement avant le d clenchement de la maladie l apparition des sympt mes peut tre repouss e ind finiment Par ailleurs durant la phase asymptomatique de l infection les individus infect s par le VIH et ignorant leur infection ont pu transmettre le virus d autres personnes avec lesquelles ils ont eu des contacts intimes 6 Que signifie ELISA 2 Enzyme linked immunosorbent assay r Pourquoi les enzymes sont elles utilis es dans ce dosage immunitaire 2 Les enzymes permettent de voir si l anticorps primaire s est attach sa cible antig ne dans le puits de micro plaques Les anticorps primaires et secondaires sont invisibles une m thode de d tection est donc n cessaire L enzyme la peroxydase de raifort HRP est li e lanticorps secondaire La HRP r agit avec un substrat incolore dans une r action chimique qui vire au bleu Si l anticorps secondaire est pr sent dans le puits le changement de couleur indique un r sultat positif 8 Pourquoi avez vous besoin de doser des chantillons t moins positifs et n gatifs ainsi que des chantillons exp rimentaux Les t moins sont n cessaires pour s assurer que l exp rience a fonctionn S il ny a pas de t moin positif et si l chantillon est n gatif nous ne pouvons savoir si l chantillon tai
31. commandons de faire un chantillon infect pour 16 l ves Remarque si votre classe comporte moins de 10 l ves utiliser un seul chantillon et effectuer simplement deux tours de partage Pour r aliser chaque chantillon infect ajoutez 100 ul de solution d antig ne 1x 650 ul de PBS 1x dans un tube jaune et m langer Remarque Vous ne devez pas ajouter de tampon contenant du Tween 20 l antig ne sinon l exp rience ne fonctionnera pas Vous pouvez vouloir s parer les chantillons infect s des chantillons vierges jusqu au cours pour avoir une trace de ceux qui les re oivent g Distribuer les chantillons vierges aux l ves Ajouter 0 75 ml de PBS 1x suffisamment de tubes jaunes non tiquet s pour votre nombre d l ves moins les chantillons infect s Remarque Vous devez utiliser du PBS 1x et non pas la solution de tampon de lavage pour les chantillons vierges de vos l ves sinon l exp rience ne fonctionnera pas h Option Pour votre propre information vous pouvez vouloir num roter chaque tube d chantillon d l ve contamin et vierge de 1 48 et consigner quels tubes num rot s contiennent des chantillons contamin s voir page 16 tape 5 Pr parer les postes de travail Liste de contr le des postes de travail Un poste de travail pour 4 l ves Bandes de micro plaques 12 puits Micro pipettes volume fixe 50 pl ou micro
32. corps primaire L HRP est une enzyme qui oxydera un substrat produisant de la couleur Rincer les puits avec la solution tampon de lavage pour retirer l anticorps secondaire non li tape 5 ajouter le substrat enzymatique 50 ul chaque puits les l ves surveillent l volution de la couleur Si de l HRP est pr sent ce qui signifie que lantig ne tait pr sent dans l chantillon la solution dans les puits vire au bleu dans les 5 minutes En l absence antig ne dans l chantillon les puits restent incolores 16 Bulletin n 4110175FR R sultats ELISA typiques Utilisation des r sultats ELISA des l ves pour d pister la maladie Le nombre d essais positifs dans les r sultats de la classe d pend de la quantit d chantillons positifs que vous avez lib r s au d but Vous pouvez d sormais d pister le progr s de la maladie dans votre classe Peut tre voulez vous que les l ves laborent une m thode pour remonter eux m mes la source de la maladie Demander chaque l ve d crire s il a obtenu un r sultat positif ou non au test puis apposer un plus c t du nom des l ves avec qui il a partag son chantillon si son ELISA a donn un r sultat positif ou un moins c t du nom des l ves avec qui il a partag son chantillon si le r sultat de son test a t n gatif Par exemple si Kiko a donn un r sultat positif et a partag avec Abraham Florence
33. d finir une ligne de base puis lisent l absorption de chaque puits une longueur d onde sp cifi e Par exemple labsorbance de cr te pour le TMB est 655 nm Les t moins ELISA quantitatifs incluent une s rie de dilutions de concentrations connues qui est utilis e pour cr er une courbe standard Cette courbe standard permet de quantifier la concentration dantig nes dans un chantillon qui son tour peut aider un chercheur un clinicien ou un m decin d terminer le niveau d infection d une maladie particuli re Les tests ELISA sont effectu s avec une telle fr quence dans les laboratoires de recherche et les laboratoires cliniques que les dosages de nombreux antig nes sont disponibles sous forme de kit Le kit comporte normalement tous les composants et les t moins n cessaires pour un test donn en dehors des chantillons exp rimentaux Par exemple le groupe de Diagnostics cliniques de Bio Rad produit plus de 100 kits qui sont utilis s pour d tecter les maladies autoimmunes les virus sanguins les perturbations g n tiques les microorganismes les Un Kit ELISA en vente dans le commerce destin tester toxines et l enc phalopathie bovine spongiforme les anticorps du HIV 2 du Groupe de diagnostics cliniques BSE de Bio Rad Le kit Immuno Explorer ELISA de Bio Rad d montre une m thode permettant de d tecter la pr sence d antig nes ou d anticorps sp cifiques dans une vari t d chantillons Un certain no
34. d tecter les anticorps chez les gens qui n ont pas l air malades C est important parce que les gens peuvent tre porteurs de la maladie m me s ils ne sont pas malades eux m mes La fi vre typhoide est un exemple de maladie qui a des porteurs chroniques jusqu 5 des individus infect s par la fi vre typho de excr tent les bact ries pendant un an Par exemple dans le cas historique de la Iyphoide Mary Mary Mallon a contamin 47 personnes avec la fi vre typhoide sur 15 ans m me si elle n a jamais t malade elle m me Bulletin n 4110175FR 43 Le virus West NILE WNC est un autre bon exemple de l importance de d tecter les anticorps chez des gens qui ne sont pas malades Le WNC se propage par les moustiques La plupart des personnes qui sont infect s par ce virus ne pr sentent pas de sympt mes ou de tr s l gers sympt mes Pour obtenir une v ritable image de l pid miologie du virus West Nile il est n cessaire de tester les anticorps contre le WNC chez des individus beaucoup plus nombreux que les quelques uns qui d veloppent les sympt mes Par exemple si une personne dans une rue est atteinte du WNC si l on teste tous ses voisins on peut constater que des douzaines ont t infect es par le virus sans tomber malades Des informations sur les taux d infection pas simplement sur les taux de maladie sont n cessaires pour obtenir une image pr cise de la maladie Pour une maladie telle que le VIH SIDA il est cru
35. dans chaque type de puits Dans ce cas on peut proposer aux l ves une repr sentation sch matique des diff rentes mol cules mises en jeu exemple de repr sentation Ya antig ne Anticorps primaire Anticorps secondaire Substrat de Produit color gr ce enzyme l enzyme l enzyme Bulletin n 4110175FR 10 Applications d ELISA dans le monde r el M me si ELISA est un outil de diagnostic puissant dans le domaine de la m decine humaine la technique est utilis e dans une grande vari t d autres domaines notamment la m decine v t rinaire les tests de produits alimentaires et l agriculture Vous trouverez ci dessous quelques exemples Domaines Utilisations M decine humaine et Diagnostic d une vari t de maladies telles que le virus West Nile chez l Homme ou les v t rinaire animaux le VIH le SRAS la maladie de Lyme la trichinose la tuberculose et de nombreuses autres en d tectant les anticorps s riques V t rinaire e D tecte les virus tel que le virus de la leuc mie f line FLV et le virus de limmunod ficience FIV chez les chats e D tecte les parasites tels que des dirofilaria immitis chez les chiens e Diagnostic de probl mes thyroidiens chez les chiens et les chats en mesurant les concentrations de thyroxine s rique t4 e Diagnostic de enc phalite quine chez les chevaux en d tectant les arbovirus Agriculture r coltes D tecte des virus tels que le virus Y d
36. de travail Un poste de travail pour 4 l ves El ment tiquette Contenu Tube jaune Echantillons test des l ves 0 25 ml Tube violet T moin positif 0 5 ml Tube bleu T moin n gatif 0 5 ml Tube vert AG Antig ne purifi 1 5 ml Tube orange AS Anticorps secondaire 1 5 ml Tube brun SUB Substrat enzymatique 1 5 ml Bandes de micro plaques 12 puits Micro pipettes volume fixe 50 pl ou micro pipettes ajustables 20 200 H C nes jaunes Pipettes de transfert en plastique jetables Solution tampon de lavage 70 80 ml Solut physiologique tamponn par les dans b cher phosphates avec Tween 20 0 05 Pile de serviettes en papier Marqueur noir Num ro 4 1 par l ve 1 NN 10 20 V Points d arr t m me si cette proc dure est con ue pour s int grer dans la dur e d une seule s ance si vous d sirez arr ter la s ance de TP vous pouvez ajouter de la solution tampon de lavage aux puits de micro plaques tout stade apr s l ajout dantig nes et avant l ajout de substrat enzymatique et placer les bandes de micro plaques et tous les r actifs dans le r frig rateur pour la nuit une temp rature de 4 C 42 Bulletin n 4110175FR R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion Questions clefs avant la s ance de TP 1 Comment le syst me
37. e ambiante Au del de ce d lai ou de la temp rature on aura une augmentation d intensit de couleur et ventuellement une certaine couleur de fond dans les contr les n gatifs Blocage des agents de blocage sont ajout s apr s l absorption des prot ines antig nes pour viter le blocage non sp cifique des anticorps sur le plastique ce qui produirait de faux r sultats positifs L agent de blocage peut tre une prot ine ou un d tergent ou les deux L agent de blocage utilis ici est un d tergent non ionique le Tween 20 Anticorps primaires 1 les anticorps qui reconnaissent et bloquent l antig ne dans un immunoessai sont des anticorps primaires Dans ce kit l anticorps primaire est un anticorps polyclonal de lapin dirig contre de la gamma globuline de poulet Cet anticorps primaire simule les anticorps humains d un chantillon de s rum humain Anticorps secondaires 2 les anticorps secondaires reconnaissent et bloquent les anticorps primaires lls sont produits par des animaux d une esp ce diff rente de celle utilis e pour r aliser l anticorps primaire Pour ce kit des ch vres ont t immunis es avec de l IgG de lapin pour obtenir des anticorps secondaires Bulletin n 4110175FR D tection colorim trique les anticorps secondaires pour ELISA sont li s des enzymes La d tection des anticorps secondaires qui sont li s aux anticorps primaires intervient par une r action enzyme substrat Dan
38. e la pomme de terre et le virus mosa que du concombre dans les r coltes alimentaires e D tecte les mycotoxines dans les r coltes telles que laflatoxine dans les grains de c r ales et les mais e D tecte les virus dans les plantes d coratives tels que le virus de la mosa que jaune du haricot dans les gla euls e D tecte la falsification de r coltes non modifi es g n tiquement non OGM avec des produits OGM par ex d tection de la teneur en Roundup Ready et en Bt Environnement e Test de la qualit d air int rieur comme par ex d tection de toxines dues la moisissure dans les b timents S curit et qualit vite la transmission de l enc phalite spongiforme bovine maladie de la vache folle BSE alimentaires en d pistant les tissus du syst me nerveux central dans la viande crue dans les viandes trait es et cuisin es et sur les surfaces e D termine si l tiquetage alimentaire est correct par exemple en v rifiant la pr sence de prot ines de lait de vache dans les produits laitiers de ch vre ou la pr sence de bl non dur dans les produits base de bl dur e Pr vient les r actions allergiques en d tectant les ingr dients qui ne figurent pas sur les tiquettes de contenu alimentaire par exemple en d tectant les arachides dans les produits dans lesquelles les arachides ne figurent pas comme ingr dients Autres e D tecte la consommation restreinte ou ill gale de drogues par ex
39. e un intrus la pr sence des immunod presseurs est largement responsable du succ s de la transplantation comme traitement en cas d organes d faillants Le rejet d organe est un type de r action dhypersensibilt dans laquelle le corps monte une forte r ponse immunitaire la transplantation L inconv nient est que l action des immunod presseurs n est pas sp cifique et qu ils suppriment toutes les r actions immunologiques Les b n ficiaires de transplantation sont donc tr s vuln rables aux infections 7 Pourquoi est il important de d tecter rapidement l exposition une maladie La d tection rapide de l exposition une maladie est importante pour plusieurs raisons Pour de nombreuses maladies la d tection pr coce de l infection et la rapidit de l engagement du traitement peuvent r duire la gravit des sympt mes voire m me totalement pr venir la maladie La d tection rapide de l exposition la maladie est galement importante pour viter la propagation de cette derni re 8 Que signifie ELISA 2 Enzyme linked immunosorbent assay 9 Pourquoi les enzymes sont elles utilis es dans ce dosage immunitaire Les enzymes permettent de voir si l anticorps primaire s est attach sa cible antig ne dans le puits de micro plaques Les anticorps primaires et secondaires sont invisibles une m thode de d tection est donc n cessaire L enzyme la peroxydase de raifort HRP est li e lanticorps secondaire La HRP
40. en 20 10 et substrat enzyme HRP Ref catalogue 166 2401EDU Substrat enzyme HRP Ref catalogue 166 2402EDU solut physiologique 10x tamponn par les phosphates 100 ml Ref catalogue 166 2403EDU Tween 20 10 5 ml Ref catalogue 166 2404EDU Microplaques avec bandes de 12 puits 3 plaques de 8 bandes x 12 puits Ref catalogue 166 2405EDU Bulletin n 4110175FR Fonctionnement de ce kit Ce kit vous apporte la souplesse permettant d effectuer avec vos l ves trois diff rents types de protocoles bas s sur ELISA Type d ELISA Application dans le monde r el Protocole I ELISA pour d pister les pid mies Pages 13 24 tape 1 change en salle de classe de liquides Virus VIH SRAS et West Nile organiques simul s rhume banal chol ra variole anthrax grippe et MST tape 2 TP ELISA tape 3 d pistage de la transmission de la maladie Protocole Il ELISA pour d tecter des antig nes Grossesse drogues OGM et Pages 26 35 tests allerg nes ELISA pour d tecter les antig nes sp cifiques Test de l air des aliments et de dans un chantillon l eau VIH variole virus du West Nile et SRAS Protocole III Test anticorps ELISA Pages 36 46 ELISA pour diagnostiquer l exposition une VIH maladie de Lyme trichinose maladie en testant la pr sence des anticorps des virus West Nile et SRAS maladies dans un chantillon de sang simul Protocole I ELISA pour d pister les pid mies Engagez totalement v
41. et Mustafa nous devons inscrire un c t du nom d Abraham de Florence et de Mustafa Les l ves qui ont des plus en regard de leur nom seront r v l s en tant que sources pr coces de l infection Question pourquoi est ce que la classe ne pourra pas faire remonter l infection un seul tudiant R ponse lorsqu un seul l ve qui est la source primaire de l infection partage en premier son chantillon avec un second l ve le second l ve aura galement des plus partout Ceci est repr sentatif du type de probl mes auxquels sont confront s les pid miologistes dans le monde r el Vous pouvez tourner ceci votre avantage en demandant pourquoi les pid miologistes examinent de nombreux facteurs lorsqu ils d pistent des maladies notamment la situation g ographique des patients leur historique et leurs comportements en plus du test de l infection Vous pouvez galement faire effectuer par vos l ves une analyse plus d taill e impliquant le suivi de l ordre dans lequel les chantillons ont t partag s et en d duisant si certains des l ves peuvent tre limin s du groupe d l ves soup onn s d tre la source de d part Les pid miologistes disposent rarement des chantillons de patients avant le d clenchement de l infection et ils peuvent rarement faire remonter une pid mie une source unique Toutefois vous avez l avantage de tenir des archives des l ves qui ont re u les chan
42. eux qui sont assez faciles transmettre et ont un taux de mortalit moins lev tels que la brucellose Brucella species la toxine epsilon du Clostridium perfringens les menaces pour la s curit alimentaire par ex Salmonella species Escherichia coli O157 H7 Shigella la morve Burkholderia mallei la m lioidosis Burkholderia pseudomallei le psittacosis Chlamydia psittaci la fi vre Q Coxiella burnetii la toxine de ricin venant du ricin Ricinus communis lent rotoxine staphylococcale B la fi vre du typhus Rickettsia prowazekii enc phalite virale alphaviruses par ex enc phalite quine du Venezuela enc phalite quine occidentale et enc phalite quine orientale et les menaces pour la s curit de l eau par ex Vibrio cholerae et Cryptosporidium parvum e Les agents priorit inf rieure Cat gorie C sont des pathog nes mergeants qui peuvent devenir une menace l avenir tel que le virus Nipah et le hantavirus Les diagnostics et l identification des agents biologiques sont des l ments importants de la r ponse l attaque biologique La pr vention de telles attaques ainsi que l tat d alerte au cas o elles interviennent sont galement importants notamment l utilisation de sources de renseignements pour pr venir les attaques de bioterrorisme la formulation de plans d urgence l tablissement de m thodes de surveillance pour d tecter les attaques la formation de professionnels m dicaux
43. ge non sp cifique des anticorps secondaires ou 2 d une erreur exp rimentale Un t moin positif appropri serait un chantillon dont on sait qu il contient de lantig ne Dans un test d anticorps ELISA tel que celui du Protocole III o la concentration d anticorps est la variable exp rimentale des puits sans anticorps primaire constitueraient un bon t moin n gatif Tout produit de couleur dans ces puits serait le r sultat de 1 un blocage non sp cifique des anticorps secondaires ou 2 d une erreur exp rimentale Un t moin positif appropri serait un chantillon dont on sait qu il contient de l anticorps primaire Pour de nombreux ELISA cliniques des solutions t moin sont fournies avec les kits vendus dans le commerce Analyses des r sultats un ELISA peut donner des informations qualitatives oui ou non ou quantitatives combien 2 On peut d terminer les r sultats qualitatifs visuellement sans utiliser d instrumentation complexe Les r sultats quantitatifs peuvent tre estim s visuellement et not s symboliquement par ex pour un signal fort pour un signal faible pour un signal ambigu et pour un signal non d tectable Pour une d termination pr cise des concentrations il est n cessaire de disposer d un lecteur de microplaques Les lecteurs de microplaques quantifient l absorption de lumi re par le substrat color dans chaque puits de microplaques lls utilisent les puits t moins n gatifs pour
44. h sa cible antig ne dans le puits de micro plaques Les anticorps primaires et secondaires sont invisibles une m thode de d tection est donc n cessaire L enzyme la peroxydase de raifort HRP est li e lanticorps secondaire La HRP r agit avec un substrat incolore dans une r action chimique qui vire au bleu Si l anticorps secondaire est pr sent dans le puits le changement de couleur indique un r sultat positif Bulletin n 4110175FR 33 8 Pourquoi avez vous besoin de doser des chantillons t moins positifs et n gatifs ainsi que des chantillons exp rimentaux Les t moins sont n cessaires pour s assurer que l exp rience a fonctionn S il ny a pas de t moin positif et si l chantillon est n gatif nous ne pouvons savoir si l chantillon tait v ritablement n gatif ou si le dosage n a pas fonctionn l inverse sans t moin n gatif il n y a aucun moyen de savoir si tous les chantillons positifs ou non auraient donn un r sultat positif Questions clefs apr s la s ance de TP 9 Est ce que votre chantillon contenait des antig nes Les l ves donnent des explications en utilisant les donn es provenant de leurs r sultats 10 Les chantillons que vous avez ajout s la bande de micro plaques contiennent de nombreuses prot ines et peuvent ou non contenir l antig ne Qu est il advenu des prot ines du puits en plastique si l chantillon contenait de l antig ne Qu en est il adven
45. ion des agents biologiques et des maladies li es sont essentiels pour confiner la maladie Les tests de diagnostic sont n cessaires pour identifier l agent et pour d terminer qui a t infect de sorte que ceux qui sont expos s puissent tre soumis un traitement et ou mis en quarantaine Par exemple si une infection de variole est d tect e dans les 2 3 jours une vaccination post exposition prot ge contre la maladie Une vaccination dans les 4 5 jours suivant l exposition peut emp cher une issue fatale Toutefois le vaccin contre la variole en lui m me est associ des risques et par cons quent la question se pose de savoir si seuls les individus contamin s doivent tre trait s Le CDC Center for Disease Control tablit une priorit entre les agents biologiques en fonction de leur danger principalement leur facilit de diss mination transmission e Les agents ayant la plus haute priorit Cat gorie A sont ceux qui sont facilement transmis ont des taux de mortalit lev s et peuvent provoquer la panique publique Des exemples d agents forte priorit comportent lanthrax Bacillus anthracis le botulisme toxine du Clostridium botulinum la peste Yersinia pestis la variole Variola major la tular mie Francisella tularensis les fi vres h morragiques virales filovirus par ex Ebola et Marburg et les ar navirus par ex Lassa et Machupo e Les agents de seconde priorit Cat gorie B sont c
46. irer d licatement les bouchons des trois r actifs lyophilis s et utiliser une pipette pour ajouter 0 5 ml de PBS 1x chacun Utiliser une nouvelle pipette pour chacun Remettre les bouchons et agiter pour m langer Ces solutions sont concentr es 50x Remarque ce stade vous ne devez pas utiliser la solution tampon de lavage tape 3 Diluer les r actifs a DIiluer l antig ne Etiqueter une bouteille de 30 ml Antig ne 1x et ajouter 7 5 ml de PBS 1x la bouteille Utiliser une micro pipette pour ajouter 150 ul d ANTIG NES r hydrat s au PBS 1x Fermer le bouchon et agiter pour m langer Remarque vous ne devez pas ajouter de solution tampon contenant du Tween 20 l antig ne sinon l exp rience ne fonctionnera pas b Diluer l anticorps primaire Etiqueter une bouteille de 30 ml anticorps primaire 1x et ajouter 24 5 mi de solution tampon de lavage dans la bouteille Utiliser une nouvelle pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTICORPS PRIMAIRE r hydrat la bouteille et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec une certaine quantit de r actif dilu pour s assurer que la totalit de l anticorps est utilis e Fermer le bouchon et agitez pour m langer c Diluer l anticorps secondaire Diluer l anticorps secondaire moins de 24 heures avant le d marrage du cours Etiqueter une bouteille de 30 ml anticorps secondaire 1x et ajoutez 24 5 mi de solution tampon de lavage dans la bouteille
47. istribuer les r actifs aux postes de travail tape 5 Pr parer les postes de travail Temps n cessaire 1 3 heures Remarque si vous envisagez d utiliser ce kit pour plusieurs sessions de TP sur une p riode de 1 ou 2 semaines nous vous recommandons fortement d utiliser de l eau st rilis e pour pr parer la solution tampon PBS afin d viter de contaminer les r actifs L eau peut tre st rilis e en la portant bullition dans un four micro ondes plus de 5 minutes dans une bouteille bouch e sans trop serrer apr s avoir retir la bouteille du four micro ondes la laisser refroidir puis resserrer le bouchon Diluer uniquement la quantit d anticorps et d antig nes n cessaire pour chaque s ance de laboratoire Les anticorps r hydrat s sont des concentrats 50x Stocker les antig nes et anticorps concentr s restant dans le r frig rateur 4 C Nous ne recommandons pas de stocker l anticorps et l antig ne concentr s pendant plus de 2 semaines m me 4 C Ne pas congeler les solutions Mesures des volumes Ce kit contient des pipettes de transferts en plastique jetables gradu es utiliser pour pr parer certains r actifs lorsque des volumes entre 250 microlitres ul et 5 millilitres ml sont n cessaires Par ailleurs des micro pipettes volume ajustable ou fixe sont n cessaires pour assurer des volumes de 50 ul L illustration montre les graduations correspondant aux volumes mesurer Des volumes
48. iti de l chantillon m lang Chaque l ve r p te le processus de partage avec un l ve diff rent 1 ou 2 fois de plus en fonction de la taille de la classe et consigne les partenaires de partage Remarque pour s assurer de la diss mination de la maladie le partage doit tre effectu en deux ou trois rounds s par s El ve El ves B Le El ve B El ve C El ve D tape 2 en utilisant une pipette ajouter 50 ul de l chantillon de chaque l ve inconnu avec les t moins positifs et n gatifs aux puits de la bande de microplaques et laisser incuber pendant 5 minutes ce qui permet aux prot ines de l chantillon de se lier aux puits Rincer les puits avec une solution tampon de lavage PBST solut physiologique tamponn par les phosphates contenant 0 05 de Tween 20 qui bloque galement les sites liant les prot ines non occup s dans les puits tape 3 ajouter l anticorps primaire 50 ul chaque puits et laisser incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante L anticorps primaire est un anticorps qui reconna t et se lie l agent antig ne de la maladie Rincer les puits avec le solut physiologique pour retirer l anticorps non li tape 4 ajouter de la peroxydase de raifort HRP marqu e anticorps secondaire 50 ul chaque puits et laisser incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante L anticorps secondaire est un anticorps qui reconna t et se lie lanti
49. liant les prot ines dans les puits tape 2 ajouter l anticorps primaire 50 ul aux puits et laisser incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante L anticorps primaire est un anticorps qui reconna t et se lie lantig ne Rincer les puits avec le solut physiologique pour retirer l anticorps non li tape 3 ajouter de la peroxydase de raifort HRP li e l anticorps secondaire 50 ul aux puits et laisser incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante L anticorps secondaire est un anticorps qui reconna t et se lie lanticorps primaire L HRP est une enzyme qui oxydera un substrat produisant de la couleur Rincer les puits avec la solution tampon de lavage pour retirer l anticorps secondaire non li tape 4 ajouter le substrat enzymatique 50 ul chaque puits les l ves surveillent l volution de la couleur Si de l HRP est pr sent ce qui signifie que lantig ne tait pr sent dans l chantillon la solution dans les puits vire au bleu dans les 5 minutes En l absence antig ne dans l chantillon les puits restent incolores R sultats ELISA typiques Bulletin n 41101 75FR 29 Pr paration du TP Cette section est con ue pour vous aider pr parer efficacement cet exercice pratique Nous vous recommandons de r hydrater et diluer l antig ne et l anticorps primaire au maximum 3 jours avant le cours et l anticorps secondaire moins de 24 heures avant le cours Nou
50. mbre de proc d s ELISA a t d velopp ils diff rent essentiellement dans la s quence dans laquelle les antig nes et les anticorps sont ajout s aux puits Dans un dosage de capture d anticorps tel qu utilis dans ce kit les antig nes sont bloqu s dans les puits en plastique et l anticorps primaire bloque ou est captur par lantig ne immobilis L anticorps secondaire est li l enzyme peroxydase de raifort HRP qui en la pr sence de son substrat TMB fait virer la solution du dosage au bleu Antigen d s Rues Capture d anticorps ELISA Antigen Antig ne Antibody Anticorps HRP enzyme Enzyme HRP Enzyme substrate TMB Substrat enzymatique TMB Bulletin n 4110175FR Dans un dosage de capture d antig ne lanticorps primaire est bloqu dans les puits en plastique l antig ne est captur par l anticorps primaire immobilis et l antig ne captur est d tect par un anticorps secondaire galement li l HRP qui fait virer la solution du dosage au bleu Antigen Antibody HRF ercyme Hy substrate TPE Capture d antig ne ELISA Pistes pour la construction d un exercice Dans l exercice dans lequel s int grera la r alisation du protocole on peut demander aux l ves de justifier l utilisation de t moins positifs et n gatifs de justifier les temps d incubation de sch matiser les r sultats exp rimentaux de repr senter les interactions mol culaires
51. n 41101 75FR 35 10 11 12 13 14 15 Laver les anticorps primaires non li s des puits en r p tant la totalit de l tape de lavage 7 Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 ul d anticorps secondaires AS dans les 12 puits de la bande de micro plaques Attendre 5 minutes que les anticorps se lient leurs cibles Laver les anticorps secondaires non li s des puits en r p tant deux reprises le lavage de l tape 7 Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de substrat enzymatique SUB dans les 12 puits de la bande de microplaques Attendre 5 minutes Observer et consigner les r sultats Anticorps secondaire LAVAGE pri Substrat enzymatique 36 Bulletin n 4110175FR Protocole Ill Test des anticorps avec ELISA Guide de l enseignant 37 Pr sentation g n rale du TP 38 Pr paration du TP 39 Liste de contr le des postes de travail 41 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion42 Mode op ratoire du TP 45 Bulletin n 4110175FR 37 Protocole Ill Test des anticorps avec ELISA Guide de l enseignant Ce protocole est con u pour simuler un examen de diagnostic sanguin pour d tecter des anticorps dans le s rum Avec ce protocole les l ves effectuent un dosage ELISA pour d tecter les anticorps circulant dans le sang comme indication de l exposition un agent pathog ne Chaque l ve re oit un chantillo
52. n de s rum simul et il est charg de doser l chantillon et de rechercher la pr sence d anticorps Vous pouvez galement choisir de vous concentrer sur une vari t de maladies telles que le VIH le virus West Nile chez les personnes et les animaux le SRAS la maladie de Lyme la trichinose la tuberculose ou toute autre maladie qui stimule l int r t de vos l ves Cette technique est utile pour d tecter et effectuer un diagnostic post infection alors que l antig ne lui m me n est pas d tectable dans le corps Une fois que le corps a mont une r ponse immune les anticorps sont pr sents dans le s rum sanguin et peuvent tre d tect s Par exemple tr s r cemment encore il n tait pas possible d utiliser ELISA pour d tecter directement le virus VIH mais les anticorps du s rum contre le virus pouvaient tre d tect s in vitro en utilisant ELISA Par cons quent le test des anticorps ELISA tait le seul moyen rapide de diagnostiquer l infection par le VIH Aujourd hui la suite de lourds investissements dans la recherche sur la biologie du VIH SIDA il est possible de d tecter l antig ne VIH dans le sang directement avec ELISA ce qui permet un traitement pr coce et permet de prolonger la vie Mise en uvre d lai Jour 1 Mise en sc ne Cours et discussion Jour 2 TP Elisa Bulletin n 4110175FR 38 Pr sentation g n rale du TP Ce protocole est con u pour simuler un examen de diagnostic sanguin par d tecti
53. nes non li es antig nes ou anticorps de donner de faux r sultats positifs 13 Lorsque vous avez ajout l anticorps primaire aux puits que s est il produit si votre chantillon contenait de l antig ne S il n en contenait pas Si l chantillon contenait de l antig ne l anticorps primaire s est li antig ne S il n en contenait pas l anticorps primaire ne s est pas li 14 Lorsque vous avez ajout l anticorps secondaire aux puits que s est il produit si votre chantillon contenait de l antig ne S il n en contenait pas 2 Si l chantillon contenait de l antig ne lanticorps secondaire s est li lanticorps primaire lui m me d j li l antig ne dans les puits Si l chantillon test ne contenait pas dantig ne l anticorps primaire ne s est pas li dans les puits de sorte que l anticorps secondaire n avait rien sur quoi se lier Bulletin n 4110175FR 22 15 Si l chantillon a donn un r sultat n gatif pour l agent provoquant la maladie est ce que cela signifie que vous n avez pas la maladie 2 Comment peut on expliquer un r sultat n gatif alors que vous avez en fait contract la maladie Un r sultat n gatif ne signifie pas forc ment que vous n tes pas contamin Cela peut tre un faux n gatif Le test ELISA peut ne pas tre suffisamment sensible pour d tecter les niveaux tr s faibles d agents de la maladie par exemple les niveaux pr sents juste apr s l infection Une a
54. ocole de test le plus pertinent pour le travail qui les int resse Vous pouvez t l charger la totalit de ce manuel d instruction sur Internet Visitez notre site explorer bio rad com ou contactez nous au num ro suivant 01 47 95 69 65 Nous cherchons continuellement am liorer nos programmes et nos produits Vos commentaires id es et suggestions seront les bienvenus Avec nos meilleurs sentiments L quipe Bio Education Bio Rad division Bio Recherche 3 bd Raymond Poincar 92430 Marnes la Coquette Bulletin n 4110175FR SOMMAIRE Page Liste de contr le du contenu du KIT nier dithiolienene tee idate teste ienene tentent 3 Fonctionnement de ce KD sua sieeieiasbianneiniisonoattiaaltisssiiallaaaiolseganieusasanuenlisugipgaslbeiieslNalB04liisielt slssintl sasiif6essixsitsEigis 4 Description pas pas dE 0e syeppedyeinEsislieebibpe cuecbibiei daolkidondSE3atieedsiasbaEBaz 6 Pr sentation g n rale de ce kit ELISA Q00 n0 2n HH ng HT ng TK nen k x T Guerre biologique et ELISA sienne enneseeeneseeennes 11 Protocole ELISA pour d pister les pid mies 13 Guide de F NSCIQNANT 2 hsnesnenstessntmneecmpeensneomsonentmenseeDebeinense demo esmiecrsoesnrcebe 14 Pr sentation g n rale du TP nes 15 PS AO TR ae ae 17 Liste de contr le des postes de travail 19 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion
55. ois puits ayant vos initiales en utilisant un nouveau c ne pour chaque chantillon Attendre 5 minutes que les prot ines des chantillons se lient aux puits en plastique LAVER a Renverser la bande de micro plaques sur les serviettes en papier et taper d licatement la bande plusieurs reprises l envers b Jeter la serviette en papier du haut de la pile c Utiliser une pipette de transfert pour remplir chaque puits avec la solution tampon de lavage d Renverser la bande de micro plaques sur les serviettes en papier et tapoter e Jeter les 2 3 serviettes du haut de la pile DEEE EEE El ve A El ve B Control sample ar T moin ou chantillon 24 Bulletin n 4110175FR 10 11 12 13 14 15 16 17 Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 uL d anticorps primaire AP dans les 12 puits de la bande de micro plaques Attendre 5 minutes que les anticorps se lient leurs cibles Laver les anticorps primaires non li s des puits en r p tant le lavage de l tape 9 Utiliser un nouveau c ne pour transf rer 50 ul d anticorps secondaires AS dans les 12 puits de la bande de micro plaques Attendre 5 minutes que les anticorps se lient leurs cibles Laver les anticorps secondaires non li s des puits en r p tant deux reprises le lavage de l tape 9 Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de substrat enzymatique
56. on des anticorps dans le s rum Avec ce protocole les l ves effectuent un dosage ELISA pour d tecter les anticorps circulant dans le sang comme indication de contamination par un agent pathog ne Chaque l ve re oit un chantillon de s rum simul et est charg de rechercher et de doser les anticorps Dans le cas du SIDA d s que la r ponse immunitaire est r alis e les anticorps sont pr sents dans le s rum sanguin et peuvent tre d tect s Tr s r cemment encore il n tait pas possible d utiliser ELISA pour d tecter directement le virus VIH Par cons quent le test des anticorps ELISA tait le seul moyen rapide de diagnostiquer l infection par le VIH Aujourd hui la suite de lourds investissements dans la recherche sur la biologie du VIH SIDA il est possible de d tecter l antig ne VIH dans le sang directement avec ELISA ce qui permet un traitement pr coce et plus efficace tape 1 en utilisant une pipette ajouter 50 ul d antig ne pathog ne purifi simul e aux puits de la bande de microplaques et laisser incuber pendant 5 minutes ce qui permet l antig ne de se lier aux puits Rincer les puits avec une solution tampon de lavage PBST solut physiologique tamponn par les phosphates contenant 0 05 de Tween 20 pour liminer l antig ne non fix et bloquer les sites liant les prot ines non occup s dans les puits tape 2 ajouter les chantillons de s rum et les t moins positifs et n gatif
57. orps l EBV pendant des ann es apr s avoir limin la maladie S ils se pr sentent leur m decin avec une fi vre et une angine ils peuvent donner un r sultat positif au test de l EBV sans que l EBV soit la cause de leurs sympt mes Une troisi me cause de faux positifs est une erreur exp rimentale par exemple mettre une r f rence positive dans un puits alors que vous pensiez avoir mis un chantillon exp rimental Pourquoi avez vous effectu un dosage de vos chantillons en triple 2 Effectuer le dosage des chantillons en trois exemplaires est un autre contr le Si vous n obtenez pas les m mes r sultats dans les trois puits votre technique exp rimentale a sans doute un probl me ou vous avez fait une erreur de pipette Dans un laboratoire clinique l exp rience devrait tre reprise Si cette erreur intervient dans cette activit prenez le r sultat des deux puits qui coincident car il est sans doute correct Lorsque vous avez ajout les chantillons de s rum aux puits qu est il arriv aux anticorps de s rum si l chantillon tait positif S il tait n gatif Les anticorps de s rum qui reconnaissent les antig nes purifi s dans le puits se sont li s l antig ne Si l chantillon est n gatif aucun anticorps ne s est li Pourquoi faut il nettoyer les puits apr s chaque tape Le lavage retire les prot ines qui ne se sont pas li es aux puits en plastique et tous les anticorps qui ne se sont pas
58. os l ves avant d effectuer la d tection d antig nes ELISA ou le test d anticorps ELISA Dans cette approche interactive les l ves suivent la progression d un agent pathog ne simul dans leur classe ce qui leur permet d avoir une vision r aliste de la propagation d une maladie contagieuse au sein d une population Les l ves changent des liquides organiques simul s in vitro un ou deux l ves y sont infect s au hasard Ils effectuent ensuite un test ELISA sur les chantillons partag s r sultants et utilisent leurs r sultats pour d pister la progression de la maladie dans la classe Cette activit est con ue pour g n rer une discussion suppl mentaire sur les probl mes de sant et d pid miologie Les maladies topiques qui fonctionnent bien avec le protocole de d pistage sont notamment le SRAS le virus West Nile le VIH le SIDA les rhumes la variole l anthrax la grippe et les MST maladies sexuellement transmissibles En tant qu enseignant vous pouvez d terminer le contexte le plus appropri votre le on et vos l ves Protocole II ELISA pour d tecter des antig nes Test de la pr sence d un antig ne avec un chantillon d fini Ce protocole peut tre utilis pour discuter de la mani re dont ELISA peut d tecter des agents pathog nes dans les chantillons tels que des liquides organiques avant que le corps n ait eu la possibilit de monter une r ponse immunitaire d tectable L
59. ou du personnel charg de faire respecter la loi la pr paration des vaccins et de traitements linoculaton de populations si besoin ainsi que l ducation du public Bulletin n 4110175FR 12 13 Bulletin n 4110175FR Protocole I ELISA pour d pister les pid mies Gaede OSSI a a a a 14 Pr sentation g n rale du TP 2288 taitlagsslielinil54SyShagisl8a VesEahidua ee deizliad gu 15 Preparation AE a nh 17 Liste de contr le des postes de travail 19 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion 20 Mode op ratoire du TP destin aux l ves ng KH mm xu 23 Bulletin n 4110175FR 14 Protocole I ELISA pour d pister les pid mies Guide de l enseignant Cette activit interactive est con ue pour fournir un contexte pour la pr sentation d une application topique du monde r el d ELISA Les l ves commencent par mod liser la propagation de la maladie dans une population en simulant le partage de liquides organiques Chaque l ve re oit un chantillon partager dont un ou deux d entre eux sont positifs pour l agent pathog ne Une fois que les l ves ont partag leur liquide organique simul ils effectuent un dosage des chantillons partag s en utilisant ELISA Les r sultats ELISA des l ves r v lent qu une partie importante de la classe donne d sormais un r sultat positif au test pour cette maladie Ceci entra ne une activit guid e s app
60. out aux puits et incub pour permettre la couleur d appara tre On value les r sultats du dosage Les puits qui restent incolores sont n gatifs et les puits qui virent au bleu sont positifs Antigen Antigen Antig ne Antibody Antibody Anticorps HRP enzyme Enzyme HRP ATETA Enzyme substrate TMB Substrat enzymatique TMB Ereyme subelrate TME Bulletin n 4110175FR Pr sentation g n rale de ce kit ELISA La rubrique suivante d crit bri vement les points techniques et conceptuels qui sont directement li s aux activit s de laboratoire de ce programme Il est extr mement important pour le succ s de l exp rience que l l ve comprenne bien ces points Bandes de microplaques les microplaques sont r alis es en polystyr ne qui absorbe les prot ines bloque par interaction hydrophobe Les plaques fournies dans ce kit ont 96 puits elles sont organis es en 8 rang es individuelles de bandes de 12 puits Chaque puits contient environ 250 microlitres H Antig ne dans ce kit l antig ne est de la gammaglobuline de poulet purifi e partir de jaunes d oeufs qui sert de repr sentatif g n rique de tout antig ne prot ine hypoth tiques ou autres Dur es d incubation la vitesse laquelle intervient le blocage d pend de la temp rature d incubation et des concentrations des r actifs Ce kit a t optimis de sorte que chaque incubation puisse tre effectu e en 5 minutes temp ratur
61. rme les produits agricoles les produits alimentaires et l eau Vous pouvez galement choisir de vous concentrer sur des applications non bas es sur une maladie telles que la d tection de l hormone hCG dans un test de grossesse la d tection de st roides ill gaux dans un test de pr sence de drogues la pr sence de toxines bact riennes dans un test de s curit alimentaire ou la d tection de la pr sence d organismes g n tiquement modifi s OGM dans des aliments non OGM ou tout autre sc nario qui peut stimuler l int r t de vos l ves Ce dosage ELISA s appuie sur des anticorps qui sont fabriqu s pour d tecter des antig nes sp cifiques dans des fluides organiques ou dans des chantillons provenants d animaux de la ferme de produits alimentaires ou d eau Chaque l ve va recevoir un chantillon simul pour doser la pr sence de l antig ne Mise en uvre d lai Jour 1 Mise en sc ne Cours et discussion Jour 2 TP Elisa Bulletin n 4110175FR 28 Pr sentation g n rale du TP tape 1 en utilisant une pipette ajouter 50 ul de l chantillon de chaque l ve inconnu avec les t moins positifs et n gatifs aux puits de la bande de microplaques et laisser incuber pendant 5 minutes ce qui permet l antig ne s il est pr sent de se lier aux puits Rincer les puits avec une solution tampon de lavage PBST solut physiologique tamponn par les phosphates contenant 0 05 de Tween 20 pour bloquer les sites
62. rr ter apr s avoir partag les liquides organiques et plac tous les r actifs dans le r frig rateur pour une nuit une temp rature de 4 C Alternativement si vous voulez arr ter pendant le dosage ELISA vous pouvez ajouter de la solution tampon de lavage aux puits de micro plaques tout stade apr s l ajout dantig nes et avant l ajout de substrat enzymatique et placer les bandes de micro plaques et tous les r actifs dans le r frig rateur pour la nuit une temp rature de 4 C Bulletin n 4110175FR 20 R ponses des enseignants aux questions clefs et sujets de discussion Questions clefs avant la s ance de TP 1 Comment le syst me immunitaire nous prot ge t il des maladies 2 Le syst me immunitaire comporte des barri res physiques telles la peau et les membranes muqueuses qui emp chent les pathog nes de p n trer dans le corps et des r ponses cellulaires telles que la circulation des macrophages qui r pondent aux intrus Notre syst me immunitaire acquis monte une r ponse d anticorps sp cifique lorsque notre corps est expos un intrus et nos cellules immunitaires attaquent l intrus 2 Comment le m decin utilise t il la r ponse immunitaire pour nous prot ger des maladies 2 Les m decins utilisent la r ponse immunitaire lorsqu ils nous vaccinent contre certaines maladies Notre syst me immunitaire m morise les pathog nes auxquels nous avons t expos s et lors de l exposition suivante aux pathog nes
63. s 50 ul aux puits et laisser incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante Dans ce protocole les chantillons de s rum contiennent des anticorps primaires qui repr sentent les anticorps primaires du sang d un patient Si les anticorps contre la maladie sont pr sents dans l chantillon de s rum ils se lieront l antig ne de la maladie purifi d j fix dans les puits Rincer les puits avec la solution tampon de lavage pour retirer l anticorps non li tape 3 ajouter de la peroxydase de raifort HRP li e l anticorps secondaire 50 pul aux puits et laisser incuber pendant 5 minutes temp rature ambiante L anticorps secondaire est un anticorps qui reconna t et se lie l anticorps primaire Dans cette simulation l anticorps secondaire repr sente un anticorps anti humain L HRP est une enzyme qui oxydera un substrat en un produit color bleu Rincer les puits avec la solution tampon de lavage pour retirer l anticorps secondaire non li tape 4 ajouter le substrat enzymatique 50 ul chaque puits les l ves surveillent l volution de la couleur Si de l HRP est pr sente ce qui signifie que l antig ne tait pr sent dans l chantillon la solution dans les puits vire au bleu dans les 5 minutes indiquant un diagnostic positif S il n y a pas d anticorps l antig ne de la maladie les puits restent incolores indiquant un diagnostic n gatif R sultats ELISA typiques Bulletin
64. s ce kit lanficorps secondaire est li la peroxydase de raifort HRP En la pr sence de peroxyde d hydrog ne H202 l HRP catalyse l oxydation du substrat chromog ne 3 3 5 5 t tramethylbenzidine TMB Cette oxydation du TMB par le HRP forme un produit bleu Remarque le TMB est sensible la lumi re et les r sultats du dosage doivent tre d termin s 5 10 minutes apr s que le substrat ait t ajout aux puits Au del de cette dur e une couleur non sp cifique peut se d velopper La couleur qui se d veloppe apr s une incubation de 5 minutes ne doit pas tre prise en compte dans les r sultats du dosage Apr s 20 30 minutes la couleur bleue peut commencer s estomper au fur et mesure que le TMB se pr cipite dans la solution Enzyme HRP H202 Enzyme HRP O H202 Enzyme HRP O dd 00 t tramethylbenz idine TMB incolore Radical cation double iminium quinone de TMB Couleur bleue Enzyme HRP H20 WH t H CH D tection colorim trique Oxydation de TMB par HRP T moins les t moins sont toujours effectu s parall lement aux chantillons r els pour s assurer que la proc dure fonctionne correctement Les t moins peuvent permettre de r soudre des r sultats ambigus dus une erreur de l exp rimentateur ou la contamination de r actifs tout ELISA valide doit inclure des t moins Dans le t moin n gatif il ny a pas d anticorps primaire contrairement au
65. s contacts intimes pr c dents de cette personne Bulletin n 4110175FR 23 Mode op ratoire du TP D tection des pid mies avec ELISA 1 2 Etiqueter un tube jaune et une pipette de transfert en plastique avec vos initiales Utiliser la pipette pour transf rer la totalit de votre fluide organique dans le tube d un autre l ve M langer d licatement les chantillons puis prendre la moiti de l chantillon partag 750 ul dans votre propre tube Consigner le nom de l l ve c t de partenaire de partage N 1 Lorsque le professeur le demande r p ter deux fois le protocole de partage El ve A El ve B LE j El ves A B El ve C pis El ves A B C El ve B Point d arr t ventuel les chantillons Partenaire de partage N 1 Partenaire de partage N 2 Partenaire de partage N 3 peuvent tre stock s 4 C pour la nuit Etiqueter votre bande de 12 puits Inscrire pour les t moins positifs des trois premiers puits de chaque bande et un pour les trois puits suivants pour les t moins n gatifs Etiqueter les puits restants avec vos initiales et celles de votre partenaire 3 puits chacun Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de t moin positif dans les trois puits Utiliser un nouveau c ne de pipette pour transf rer 50 ul de t moin n gatif dans les trois puits Transf rer 50 ul de votre chantillon dans les tr
66. s sugg rons galement d utiliser de l eau distil e st rile pour pr parer la solution tampon PBS afin d viter de contaminer des agents r hydrat s Ces r actifs doivent tre conserv s dans de la glace ou dans le r frig rateur s ils ont t pr par s plus de 4 heures avant le cours La chose la plus importante pour les l ves est de mettre les bons composants dans les puits de dosage dans le bon ordre par cons quent il est crucial pour la r ussite de l exercice que les tubes soient clairement tiquet s et correctement cod s par couleur Objectifs tape 1 Pr parer des solutions tampon tape 2 R hydrater l antig ne lyophilis l anticorps primaire et l anticorps secondaire tape 3 Diluer les r actifs tape 4 Distribuer les r actifs aux postes de travail tape 5 Pr parer les postes de travail Temps n cessaire 1 3 heures Remarque si vous envisagez d utiliser ce kit pour plusieurs sessions de TP sur une p riode de 1 ou 2 semaines nous vous recommandons fortement d utiliser de l eau st rilis e pour pr parer la solution tampon PBS afin d viter de contaminer les r actifs L eau peut tre st rilis e en la portant bullition dans un four micro ondes plus de 5 minutes dans une bouteille bouch e sans trop serrer apr s avoir retir la bouteille du four micro ondes la laisser refroidir puis resserrer le bouchon Diluer uniquement la quantit d anticorps et d antig nes n ces
67. saires pour chaque s ance de travaux pratiques Les anticorps r hydrat s sont des concentrats 50x Stocker les antig nes et anticorps concentr s restant dans le r frig rateur 4 C Nous ne recommandons pas de stocker l anticorps et l antig ne concentr s pendant plus de 2 semaines m me 4 C Ne pas congeler les solutions Mesures des volumes Ce kit contient des pipettes de transfert en plastique jetables gradu es utiliser pour pr parer certains r actifs lorsque des volumes entre 250 microlitres ul et 5 millilitres ml sont n cessaires Par ailleurs des micro pipettes volume ajustable ou fixe sont n cessaires pour assurer des volumes de 50 L L illustration montre les graduations correspondant aux volumes mesurer Des volumes sup rieurs 1 ml exigeront des ajouts multiples Pour chaque tape de la pr paration du TP utiliser une nouvelle pipette ou un nouveau c ne Pour mesurer des liquides qui contiennent des d tergents qui moussent par ex le tampon de lavage vous devez lire le volume au niveau de l interface entre le liquide et les bulles Bulletin n 4110175FR 30 Guide de pr paration d roulement pas pas Ces instructions sont destin es pr parer 12 postes de travail chacun avec 4 l ves tape 1 Pr parer les solutions tampon Nous vous recommandons d utiliser un cylindre gradu de 1 litre et un de 100 ml pour pr parer les solutions tampons Vous aurez galement besoin d 1
68. t utilis e Fermer le bouchon et agiter pour m langer Remarque vous ne devez pas ajouter de solution tampon contenant du Tween 20 l antig ne sinon l exp rience ne fonctionnera pas b Diluer l anticorps primaire Etiqueter une bouteille de 30 ml anticorps primaire 1x et ajouter 24 5 ml de solution tampon de lavage dans la bouteille Utiliser une nouvelle pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTICORPS PRIMAIRE r hydrat la bouteille et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec une certaine quantit de r actif dilu pour s assurer que la totalit de lanticorps est utilis e Fermer le bouchon et agitez pour m langer d Diluer l anticorps secondaire Diluer l anticorps secondaire moins de 24 heures avant le d marrage du cours Etiqueter une bouteille de 30 ml anticorps secondaire 1x et ajoutez 24 5 mi de solution tampon de lavage dans la bouteille Utiliser une nouvelle pipette pour ajouter le contenu du flacon d ANTICORPS SECONDAIRE r hydrat la bouteille et utiliser la pipette pour rincer le flacon avec une certaine quantit de r actif dilu pour s assurer que la totalit de l anticorps est utilis e Fermer le bouchon et agiter pour m langer tape 4 Distribuer les r actifs aux postes de travail a Distribuer les t moins positifs Etiqueter 12 tubes violets avec et ajouter chacun 0 5 ml de solution d antig ne 1x b Distribuer les t moins n gatifs Etiqueter 12 tubes bleus
69. t v ritablement n gatif ou si le dosage n a pas fonctionn l inverse sans t moin n gatif il n y a aucun moyen de savoir si tous les chantillons positifs ou non auraient donn un r sultat positif Questions clefs apr s la s ance de TP 10 Est ce que votre s rum contenait des antig nes de la maladie Les l ves donnent des explications en utilisant les donn es provenant de leurs r sultats 11 Si votre test a donn un r sultat positif aux anticorps est ce que cela signifie que vous avez t expos la maladie Un r sultat positif ne signifie pas forc ment que vous avez t expos la maladie 12 Comment pourrait on expliquer un r sultat positif alors que vous n avez pas en fait la maladie Cela peut tre un faux positif Tous les dosages ne sont pas sp cifiques un seul agent pathog ne Par exemple le test ELISA pour l exposition la maladie de Lyme qui teste l IgG et l IgM contre les bact ries qui causent la maladie a une sp cificit de 72 seulement et un ELISA positif doit tre confirm par un test plus sp cifique tel qu un transfert de type western Bulletin n 4110175FR 44 13 14 15 16 17 Une autre cause de faux positifs est une exposition pass e une maladie Par exemple la plupart des adultes ont t expos s au virus d Epstein Barr EBV la cause de nombreuses mononucl oses mais pas de toutes et certaines personnes maintiennent des niveaux d antic
70. thrite rhumato dale lupus asthme ecz ma d ficit immunitaire avec d faut d expression des mol cules HLA et SIDA 4 Quels probl mes peuvent emp cher le syst me immunitaire de fonctionner correctement Les probl mes du syst me immunitaire se subdivisent en trois cat gories hypersensibilit immunod ficience et maladies auto immunes L hypersensibilit intervient lorsque le syst me immunitaire r agit de mani re trop violente un antig ne les r actions de lhypersensibilit comportent des r actions anaphylactiques des allergies et la sensibilit au contact par ex la r action au sumac v n neux L immunod ficience signifie qu un individu ne peut pas monter une r ponse immunitaire efficace Limmunod ficience peut tre g n tique par ex d ficit immunitaire avec d faut d expression des mol cules HLA ou maladie du b b bulle ou induite par une maladie par ex immunod ficience due une infection par le VIH ou par des m dicaments immunod presseurs par ex m dicaments administr s apr s une transplantation d organe pour pr venir le rejet Une maladie auto immune vient d un syst me immunitaire qui se monte de mani re inappropri e une r ponse immunitaire lui m me par exemple les maladies telles que le lupus ryth mateux diss min lupus LED l arthrite rhumato dale la scl rose en plaques les diab tes insulino d pendants et la maladie coeliaque 5 Pourquoi est il important de
71. tillons infect s ce qui pour l exercice peut s av rer utile Alternativement pour une approche plus anonyme vous pouvez num roter s quentiellement tous les chantillons des l ves et consigner les num ros des tubes qui sont infect s La source peut tre r v l e la fin de l activit pour voir si elle co ncide avec l analyse des donn es de vos l ves Bulletin n 41101 75FR 17 Pr paration du TP Cette section est con ue pour vous aider pr parer efficacement cet exercice pratique Nous vous recommandons de r hydrater et diluer l antig ne et l anticorps primaire au maximum 3 jours avant le cours et l anticorps secondaire moins de 24 heures avant le cours Nous sugg rons galement d utiliser de l eau distill e st rile pour pr parer la solution tampon PBS afin d viter de contaminer des agents r hydrat s Ces r actifs doivent tre conserv s dans de la glace ou dans le r frig rateur s ils ont t pr par s plus de 4 heures avant le cours La chose la plus importante pour les l ves est de mettre les bons composants dans les puits de dosage dans le bon ordre par cons quent il est crucial pour la r ussite du r sultat que les tubes soient clairement tiquet s et correctement cod s par couleur Objectifs tape 1 Pr parer des solutions tampon tape 2 R hydrater l antig ne lyophilis l anticorps primaire et l anticorps secondaire tape 3 Diluer les r actifs tape 4 D
72. tion des macrophages qui r pondent aux intrus Notre syst me immunitaire acquis monte une r ponse d anticorps sp cifique lorsque notre corps est expos un intrus et nos cellules immunitaires attaquent l intrus 2 Comment le m decin utilise t il la r ponse immunitaire pour nous prot ger des maladies 2 Les m decins utilisent la r ponse immunitaire lorsqu ils nous vaccinent contre certaines maladies Notre syst me immunitaire m morise les pathog nes auxquels nous avons t expos s et lors de l exposition suivante aux pathog nes notre syst me immunitaire les attaque plus rapidement et efficacement Les m decins tirent parti de l effet damorce en nous exposant aux pathog nes inactiv s organismes tu s ou affaiblis qui ne peuvent pas nous rendre malades de sorte que si nous sommes expos s ult rieurement aux pathog nes actifs notre corps montera une r ponse d anticorps puissante et imm diate r duisant ou liminant les risques d tre contamin s par la maladie 3 Comment les anticorps sont ils fabriqu s dans notre corps Les anticorps du corps sont fabriqu s par les cellules immunes appel es lymphocytes B ou cellules B La production d un anticorps pour un antig ne particulier augmente lorsque vous tes expos l antig ne 4 Comme sont fabriqu s les anticorps qui sont utilis s dans ELISA Les anticorps utilis s par les scientifiques sont en g n ral fabriqu s en immunisant des animaux Des anticorps
73. tion pour le protocole que vous avez retenu La pr paration du TP varie de mani re subtile pour chacun des trois protocoles Bulletin n 4110175FR Description pas pas d ELISA Les protocoles du kit s appuient sur la capture indirecte des anticorps par ELISA Les tapes de ce dosage sont les suivantes tape 1 l antig ne est ajout aux puits de la bande de microplaques et on laisse incuber pour permettre la fixation au fond des puits des mol cules d antig ne apr s quoi les antig nes non li s sont vacu s des puits par lavage avec du d tergent Le d tergent sert galement d agent de blocage il bloque en effet tous les sites de lien de prot ines non utilis s dans les puits et emp chant ainsi un lien non sp cifique de l anticorps tape 2 une solution d anticorps primaires est ajout e aux puits et incub e pour permettre l anticorps sp cifique de se lier l antig ne Ensuite l anticorps primaire non li est vacu des puits par lavage Remarque si la solution ne contient pas d anticorps sp cifiques de l antig ne aucun anticorps ne se fixe tape 3 une solution d anticorps secondaires li s une enzyme est ajout e aux puits et incub e pour permettre lanticorps secondaire de se lier lanticorps primaire Ensuite l anticorps secondaire non li est vacu des puits par lavage tape 4 un substrat denzyme chromog ne pouvant se transformer en un produit color est aj
74. u s il ne contenait pas d antig ne 2 Dans les deux cas toutes les prot ines pr sentes dans les chantillons se lient aux puits en plastique 11 Pourquoi avez vous eu besoin de laver les puits apr s chaque tape Le lavage retire toutes les prot ines qui ne se sont pas li es aux puits en plastique et tous anticorps qui ne se sont pas li s leurs cibles emp chant par l m me les prot ines non li es antig nes ou anticorps de donner de faux r sultats positifs 12 Lorsque vous avez ajout l anticorps primaire aux puits que s est il produit si votre chantillon contenait de l antig ne S il n en contenait pas S il est positif pour l antig ne l anticorps primaire s est li lantig ne S il est n gatif l anticorps primaire ne s est pas li 13 Lorsque vous avez ajout l anticorps secondaire aux puits que s est il produit si votre chantillon contenait de l antig ne S il n en contenait pas 2 Si l chantillon contenait de l antig ne l anticorps secondaire s est li l anticorps primaire lui m me d j li l antig ne dans les puits Si l chantillon test ne contenait pas dantig ne l anticorps primaire ne s est pas li dans les puits de sorte que l anticorps secondaire n avait rien sur quoi se lier 14 Si l chantillon a donn un r sultat n gatif pour l antig ne est ce que cela signifie que l antig ne n est pas pr sent Comment peut on expliquer un r sultat
75. utre cause de r sultats faux n gatifs est l erreur exp rimentale comme par exemple mettre un t moin n gatif dans un puits alors que vous pensiez y mettre un chantillon exp rimental 16 Pourquoi avez vous effectu un dosage de vos chantillons en triple 2 Effectuer le dosage des chantillons en trois exemplaires est un autre contr le Si vous nobtenez pas les m mes r sultats dans les trois puits votre technique exp rimentale a sans doute un probl me ou vous avez fait une erreur de pipette Dans un laboratoire clinique l exp rience devrait tre reprise Si cette erreur intervient dans cette activit prenez le r sultat des deux puits qui coincident car il est sans doute correct 17 Quels tests base d anticorps pouvez vous acheter dans votre pharmacie locale 2 Les kits de test qui s appuient sur le m me principe qu ELISA comportent les tests de d tection de grossesse ou d ovulation domicile et les tests pour d tecter la pr sence de drogues ill gales telles que la marijuana et la cocaine 18 Si le r sultat de votre test est positif pour une exposition la maladie avez vous eu un contact direct avec l un des l ves contamin s de d part Dans le cas contraire quelles conclusions pouvez vous aboutir propos de la transmissibilit de la maladie dans une population Avoir un contact intime avec une autre personne signifie que vous tes expos non seulement cette personne mais galement tous le
76. uyant sur une enqu te pour d terminer comment la maladie s est propag e au sein de la population Les l ves tant directement impliqu s dans les r sultats cette activit tend captiver leur imagination et est particuli rement pertinente la lumi re de la maladie contagieuse qui est apparue il n y a pas si longtemps le SRAS De nombreuses autres maladies fonctionnent galement avec ce protocole y compris le virus West Nile le VIH les rhumes banaux la grippe et les MST pour n en nommer que quelques uns Une approche simple peut tre de ne pas sp cifier la maladie r elle pour une le on g n rique Remarque ce protocole a t tabli pour d montrer comment la d tection des antig nes avec ELISA peut tre utilis e pour d tecter une pid mie Le protocole peut facilement tre adapt pour simuler comment une maladie peut tre d pist e en utilisant les tests d anticorps ELISA pour d tecter les anticorps d une maladie particuli re dans le sang Mise en uvre d lai Le on 1 Pr paration du TP Cours et discussion Le on 2 Partage des liquides organiques TP ELISA simul s Le on 3 Analyse des r sultats ELISA Exercice de d pistage Bulletin n 4110175FR 15 Pr sentation g n rale du TP tape 1 les l ves partagent leurs liquides organiques en m langeant leur chantillon avec celui des autres l ves Pour chaque paire d l ves qui effectue le partage chacun d entre eux remporte la mo
77. vous recommandons d utiliser une prouvette gradu e de 1 litre et une de 100 ml pour pr parer les solutions tampon Vous aurez galement besoin d 1 litre d eau distill e a Pr parer 100 ml de PBS 1x Dans l prouvette de 100ml verser 10 ml de PBS 10x compl tez 100mL avec 90 ml d eau distill e et m langer Etiqueter le conteneur PBS 1x Le PBS est utilis pour r hydrater les trois composants lyophilis s en tape 2 et pour diluer ANTIGENE en tape 3 b Pr parer 900 mli de solution tampon de lavage Dans l prouvette de 1L verser 90 ml de PBS 10x et 4 5 ml de Tween 20 10 compl ter 900mL avec de l eau distil e et m langer Etiqueter le conteneur solution tampon de lavage La solution tampon de lavage est utilis e pour diluer les ANTICORPS PRIMAIRES ET SECONDAIRES en tape 3 tape 2 R hydrater l antig ne l anticorps primaire et l anticorps secondaire lyophilis s b R hydrater les antig nes et les anticorps dans du PBS 1x Retirer d licatement les bouchons des trois r actifs lyophilis s et utiliser une pipette pour ajouter 0 5 ml de PBS 1x chacun Utiliser une nouvelle pipette pour chacun Fermer les flacons et agiter pour m langer Ces solutions sont concentr es 50x Remarque ce stade vous ne devez pas utiliser la solution tampon de lavage tape 3 Diluer les r actifs a Diluer l antig ne Etiqueter une bouteille de 30 ml antig ne 1x et ajouter 24 5 ml de P

manuel 166-2400 - Bio-Rad

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