D13S25/D13S1009 DNA-FISH Probe VC s wF
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1. Visualisation et interpr tation des signaux Le signal doit tre visualis l aide d un microscope pifluorescence qui p des filtres appropri s Remarque sur la proc dure Les signaux peuvent tre diff rents plans focaux c est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des sp ci mens afin de s assurer du comptage de tous les signaux Dans la m taphase diplo de normale et dans les noyaux en interphase la sonde DNAFISH D13S25 D13S1009 g n re deux signaux rouges et deux verts correspondant aux deux chromosomes 13 normaux Dans les cellules avec d l tion de la totalit d un chromosome 13 le nom bre de signaux rouges D13S25 et verts D13S1009 sera r duit Dans les cellules avec d l tion interstitielle du chromosome 13 dans lesquelles le locus D13S25 est d l t et le locus D13S1009 conserv on observera un signal rouge D13S25 et deux signaux verts D13S1009 Recommandations et limitations Ce produit a t optimis pour tre utilis sur des lames pr par es partir de sp cimens de sang p riph rique et de moelle osseuse conform ment aux m thodes cytog n tiques courantes Le fabricant garantit que ce produit r pond aux caract ristiques de performance analytique sensi bilit sp cificit reproductibilit et intervalle de validit tablies sur du sang p riph rique normal ou des tissus pr vus Chaque nouveau lot de sonde DNA FISH do2. verte tiquet e directement couvre le locus et sert de t moin Conservation l arriv e conserver le produit 20 C l abri de la lumi re jusqu la date de p remption Conservation des lames Conserver les lames hybrid es a 20 C l abri de la lumi re Remarque Ces conditions de conservation s appliquent la fois aux produits non ouverts et ouverts Le nombre de cycles de gel d gel ne doit pas d passer le nombre de tests recommand s par flacon Conserver dans le flacon d origine Les flacons conserv s dans d autres conditions peu vent ne pas offrir de performance optimale et par cons quent affecter les r sultats du test Manipulation Tous les r actifs doivent tre manipul s comme s ils taient capables de trans mettre des agents infectieux Apr s usage tout le mat riel doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur Manipuler tous les r actifs et lames contenant des fluorophores en clairage r duit afin d viter toute d t rioration du signal fluorescent Avertissements et mises en garde Lire le mode d emploi avant toute utilisation Tout transport ou conservation impropre peut d truire ou d t riorer la perfor mance du produit En cas de r ception d emballage ou de flacon endommag de d faillance du dispositif apr s utilisation conforme au mode d emploi ou de blessure de l utilisateur contacter le fabricant Tout flacon endommag doit
3. tre limin conform ment la loi nationale en vigueur et aucun essai ne doit tre r alis partir d un tel r actif Manipuler tous les r actifs avec soin et porter un quipement de protection in dividuelle appropri Le formamide la solution saline de citrate de sodium SSC Saline Sodium Citrate et le dod cyl sulfate de sodium SDS peuvent avoir des effets t ratog nes et mu tag nes viter toute inhalation ingestion ou contact avec la peau Le DAPI estun irritant Consulter le Material Safety Data Sheet MSDS du produit pour les informations concernant la s curit R actif fourni Sonde DNA FISH pr te l emploi 100 uL par flacon 10 tests Un test est d fini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm Sonde tiquet e au fluorophore pour le locus D13S25 rouge et au fluoro phore pour le locus D13S1009 vert pr m lang e avec de l ADN bloquant et un tampon d hybridation formamide sulfate de dextran SSC et SDS R actifs et mat riel n cessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microcentrifugeuse tanol 100 Lamelles couvre objets Microtube centrifuger 0 5 PBS 10X 22x22 e 25x25 mL HCI 1N Microscope pifluores Micropipettes 1 200 mL MgCl 1M cence pH m tre NaOH 1M Pinces Colle de caoutchouc SSC 20X Hotte aspirante Plateau pour lames Formaline 10 Gants Thermom tre calibr DAPI et Antifade Chambre humidifi e 37 C to 80 C Eau dis
4. Am J Clin Pathol 2007 128 2 323 32 Chen L et al Exp Oncol 2007 29 2 116 20 Terpos E et al Leuk Lymphoma Review 2006 47 5 803 14 Dierlamm J et al Cancer Genet Cytogenet 2000 120 1 1 5 Ma E S K et al www AtlasGeneticsOncology org Reddy K S Br J Haematol 2006 132 6 705 22 Ow U GR A Cancer Genetics Italia S r l Viale Luigi Majno 17 20122 Milano Italia www cancergeneticsitalia com support cancergeneticsitalia com DNA FISH Probe fabriqu e dans la communant europ enne par Cancer Genetics ltalia S r l 2012 Cancer Genetics Italia S r l Version 05 17 12
5. A MgCl 100X Chlorure de magnesium dans PBS 1X Ajouter 50 uL de MgCI2 1M a 450 uL de PBS 1X Proc dure Standard for FISH Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul e un e technologiste m dical e familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis est du sang p riph rique et la moelle osseuse Les lames doi vent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Toutes les lames fra chement pr par es doivent tre vieillies pendant 1 heure et demie 45 50 C avant l hybridation Si l hybridation n a pas lieu le m me jour que la pr paration conserver les lames 4 C ou 20 C Les lames avec des cellules cytoplasme visible peuvent n cessiter un pr trai tement l aide d un enzyme prot olytique du type pepsine voir pr traite ment facultatif la pepsine Pr traitement facultatif des lames la pepsine 1 Pr chauffer 50 mL de HCI 0 01N 37 C 2 Ajouter 10 15 ul de solution m re de pepsine 0 4 aux 50 mL de HCI 0 01N pr chauff s et incuber la lame pendant 5 10 min 37 C dans la pepsine Remarque sur la proc dure Certains sp cimens peuvent n cessiter des temps d
6. D13 S25 D13 S1009 DNA FISH Probe Sonde d num ration bicolore 14 009 Ce EX Mode d emploi L Usage pr vu La sonde DNA FISH D13S25 D13S1009 de Cancer Genetics Italia est concue pour d tecter la perte du g ne D13S25 sur le chromosome 13q14 par rap port au marqueur t moin D13S1009 sur le chromosome 13q34 par hybrid ization in situ en fluorescence FISH Fluorescence in situ hybridization La perte de D13S25 un locus distal du g ne RB1 a t d tect dans 65 des cas des leuc mies chroniques cellules B lymphocytaire LLC B dans 30 50 du my lome multiple MM as rarement dans une vari t de lymphome non hodgkinien de LNH F et dans plusieurs pathologies my lo des F La perte de 13q14 a une forte valeur pronostique en corr lation avec la progression lente de la maladie et un meilleur pronostic chez les patients LLC BF alors qu elle est associ e un stade sup rieur de la maladie et une survie plus courte chez les patients avec un myeloma multiple ITALIA D13S25 centrom re Ba D13S25 13414 13q centromere __ ____ BE 186kb D13S1009 t lom re 321kb D13S1009 13434 13 Repr sentation sch matique de la sonde DNA FISH D13S25 D13 1009 Les barres horizontales rouges et vertes indiquent les zones couvertes par les sondes approximativement l chelle NCBI 36 1 HG18 2006 La sonde D13S25 rouge tiquet e directement couvre la totalit du locus La sonde D13S1009
7. e digestion plus longs dans la pepsine 3 Laver deux fois la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X tem p rature ambiante TA 4 Incuber la lame pendant 5 min dans du formald hyde 1 TA 5 Laver la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X TA 6 D shydrater la lame dans de l thanol 70 85 et 100 TA pendant 1 min chacun 7 Laisser s cher la lame l air libre Remarque sur la proc dure V rifier la morphologie de l chantillon l aide d un microscope contraste de phase avant l hybridation Ne pas hybrider en cas de compromission de la morphologie nucl aire Suite la page suirante Proc dure Standard for FISH D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer bri vement la sonde DNA FISH et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse pendant 30 secondes 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH sur la zone cible sur la lame et la recouvrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 3 min 80 C sur une plaque chauffante temp rature control e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une c
8. hambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Eviter de faire s cher la lame avant que le lavage soit fini 1 Pr chauffer les solutions de SSC 2X Tween 20 0 1 et de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C 2 Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 3 Tremper bri vement la lame dans la solution de SSC 2X TA Retirer la lamelle couvre objet 4 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C 5 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C 6 Rincer bri vement la lame dans de l eau distill e Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe 8 Appliquer 20 uL de DAPI Antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm N Accessoires pour microscope Objectifs Un objectif 10X est adapt au balayage de la zone cible Un grossissement sup rieur s av re n cessaire pour l analyse des signaux et doit avoir lieu avec un objectif immersion huile 63X ou 100X Huile d immersion L huile d immersion doit tre adapt e la microscopie en fluorescence Lampe Une lampe mercure de 100 watts avec une dur e de vie maximale de 200 heures est recommand e Remplacer la lampe avant qu elle ne d passe les 200 heures Filtres recommand s Fluorophore Excitation Emission a
9. it tre test pour la sp cificit du locus sur un sp cimen de sang p riph rique normal et sur le tissu pr vu pour v rifier la bonne performance du r actif Il incombe au labo ratoire d tablir les intervalles de validit l aide de sp cimens de controle positifs et n gatifs du tissu pr vu L utilisation de filtres aux caract ristiques spectrales autres que celles sp cifi es peut affecter n gativement la force du signal Par exemple le fluorophore rouge est visible travers un filtre orange mais les signaux apparaissent faibles La technique FISH sur m taphase est recommand e pour caract riser les variantes et les patrons de signaux anormaux atypiques Le test FISH est consid r comme une adjonction la cytog n tique classique caryotype Les r sultats de ces tests doivent tre interpr t s dans la totalit du contexte des ant c dents cliniques du patient Aucune d cision m dicale ne peut tre prise en se fondant uniquement sur les r sultats du test FISH Glossaire des symboles Num ro de lot Dispositif m dical de diagnostic in f f vitro amp Risques biologiques _ 4N Conserver l abri de la lumi re du Num ro de catalogue soleil A Attention consulter la documenta Fabricant tion d accompagnement CE e Limite sup rieure de temp rature Marquage CE de conformit KSE N7 Utiliser avant le Contient suffisamment pour 10 tests Bibliographie 1 Nelson B P et al
10. till e Huile d immersion Plaque chauffante Pepsine Incubateur Bain marie Tween 20 Lampe mercure 100 watts Pr paration des r actifs Remarque Utiliser de l eau distill e pour la pr paration de toutes les solutions m res et de toutes les solutions de travail S rie d thanol 70 85 et 100 Pr parer des dilutions vol vol d thanol 100 et d eau distill e Conserver TA HCI 0 01N acide chlorhydrique Ajouter 0 5 mL de HCI 1N 49 5 mL d eau distill e Conserver TA Pr chauffer la solution 37 C dans un bain marie avant usage Solution m re de pepsine 0 4 4 mg mL Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL O 2N Conserver des aliquots de 500 uL 20 C Formald hyde 1 Ajouter 12 5 mL de formaline 10 4 formaldehye 37 mL de PBS 1X Ajouter 500 uL de MgCl 100X Conserver 4 C jusqu une semaine SSC 0 5X Citrate de sodium salin Tween 20 0 1 Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 974 mL d eau distill e Bien m langer en tour noyant Conserver TA PBS 1X solution saline dans un tampon phosphate M langer 100 mL de PBS 10X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver TA SSC 2X M langer 100 mL de SSC 20X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver temp rature ambiante TA SSC 2X Tween 20 0 1 Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 899 mL d eau distill e Bien m langer en tournoyant Conserver T
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