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Gevers Patents

1. Aye ii R EE Line META Faa CH ve SE he LATE erf 10 15 20 25 30 5 ou un groupe alc nyi ne en Cup et dans lesquelles chacun des Ri Ra R3 Ry Rs Re et Ry repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en C1 6 Y repr sente un substituant carboxyie de A choisi parmi les groupes hydroxy amino alkylamino et alcoxy et dans lequel lorsque Az repr sente une liaison on peut changer A et Az En outre la pr sente invention comprend des surfactants pulmonaires synth tiques constitu s d un complexe d un polypeptide et de lipides dans lequel le polypeptide r pond la formule 2 suivante X Aj A2 Az Ay Y ou l un de ses isom res optiquement actifs ou l un de ses sels actifs du point de vue pharmaceutique dans lequel A repr sente une liaison ou Glu A2 repr sente Trp ou Glu A3 repr sente Aib Glu Gin Leu Ala ou Orn et A4 repr sente Lys X a pour formule Da ou Db R3 H By de Ra 0 Ee Se e wg Ry E y S YN OU Ry H Rs OH Da Db dans lesquelles B repr sente B C O B C O C O NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkyl ne en C1 16 ou un groupe alc nyl ne en C2 16 et dans lesquelles chacun des Ri R2 R3 Ry Rs Be et Ry repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en C1 6 Y repr sente un substituant carboxyle de Ay choisi parmi les groupes hydroxy amino alkylamino et alcoxy tez c a 6 d En outre les peptides de c
2. 35 36 DJ AUTRE INFORMATION note Xaa lysin 1 amide xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 1 Xaa Trp Xaa Xaa 1 2 INFORMATIONS POUR SEQ ID NO 2 i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE A LONGUEUR 4 acides amin s B TYPE acide amin D TOPOLOGIE lin aire 11 TYPE DE MOLECULE peptide ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 1 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide N alpha N 8 hydroxy di t butyl benzoyl amino octano quel glutamique HBB Aoc Glu ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 4 D AUTRE INFORMATION note Kaa lysin 1 amide xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 2 Xaa Trp Glu Kaa 1 2 INFORMATIONS POUR SEQ ID NO 3 i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE A LONGUEUR 5 acides amin s EE f mue ue tt pin dg tear Rte 5 E eu ee eet A A EA ce ee Te s is nl ne Sans ne nn Te Pi Stee Se Pie AA S ai TAL EEN et drain Me Ce ARIS CTE A AD set ARRE RAR 3 at Osch Le e EE Z AE D e TE GER Le SE A izi 10 N acide 15 20 25 30 37 B TYPE acide amin D FOPOLOGIE lin aire 11 TYPE DE MOLECULE peptide ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi 8 POSITION 1 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide N aipha 6 hydroxy 2 5 7 8 t tram thyl chroman 2 carboxylique amino octano que ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi
3. Y repr sente un substituant carboxyle de A4 choisi parmi les groupes hydroxy amino alkylamino et alcoxy et d un lipide ou d un m lange de lipides choisi dans l ensembie constitu de DPPC PC CL PG PS FA et TG 10 15 20 25 30 35 45 19 Complexe conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le DPPC constitue le composant principal du lipide 20 Complexe conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le lipide est un m lange de DPPC et de PG 21 Complexe conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le lipide est constitu d environ 85 100 de DPPC et d environ 0 15 de PG 22 Complexe conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le polypeptide est HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID NO 1 23 Complexe conforme a la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le polypeptide est HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NHz SEQ ID NO 2 24 Compiexe conforme ia revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le polypeptide est Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID NO 3 25 Complexe conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le polypeptide est HBB Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID NO 4 26 Complexe conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel le polypeptide est HBB Aoc Giu Trp Ala Lys NH gt SEQ ID NO 5 27 Utilisation d un c
4. du second acide amin On r p te ces tapes avec les autres r sidus aminoacides ce qui permet de former le peptide Lorsque le peptide de longueur d sir a t form on peut modifier ie peptide avec un fragment antioxydant coupl de fa on appropri e avant de le couper de la r sine de le d prot ger et de Visoler En variante on peut retirer de fa on s lective le peptide prot g de la r sine et coupler le fragment antioxydant au peptide avant de retirer les groupes protecteurs et de Visoler AEN teh hirda WAA ea BOM REG TS AAA 10 15 20 25 30 35 Le support de r sine employ peut tre toute r sine appropri e conventionnellement employ e dans le domaine de la pr paration en phase solide de polypeptides telle qu un polystyr ne ayant t r ticul avec 0 5 environ 3 de divinyibenz ne que l on a chlorom thyi ou hydroxym thyl pour fournir des sites de formation d esters avec l acide amin groupe a amino prot g initialement introduit D autres Supports de r sines appropri es sont les pMHBA Peptide International Louisville Ky RINK Calbiochem Lajolla CA et sasrin Biochem Philadelphie Pa La r sine Sasrin n cessite un cycle en ABI particulier pour charger le premier acide amino qui est d crit dans le manuel d utilisation du synth tiseur de peptide ABI On attache le premier acide amin dont le groupe a amino est prot g la r sine comme d crit
5. 0 2 mol dans du m thanol 10 ml Agiter pendant 10 minutes et s parer entre de l ther thylique et de la saumure S parer la phase organique et laver avec de la Wy tes See A2 ka ET W af e Ce KEE PES DE i AYA i hee e el 10 15 20 25 30 35 29 saumure jusqu obtenir la neutralit S cher Na S04 et vaporer le solvant sous vide pour obtenir de la 2 propyl 3 butyl 5 isopropyibenzoquinone Dissoudre de la Z propyl 3 t butyl 5 isopropyibenzoquinone 10 mmol du 1 1 3 3 t tram thyldisiloxane 1 79 mi 10 mmoi et de Piode 0 05 oi dans du chlorure de m thyl ne 30 ml Agiter au reflux pendant 30 minutes et extraire avec de hydroxyde de sodium IN 30 ml Acidifier la phase aqueuse avec de l acide chlorhydrique concentr et I extraire dans de l ac tate d thyle 4 x 10 mi s cher Nal et vaporer le solvant sous vide pour obtenir du 2 propyl 3 t butyl 4 hydroxy 5 isopropylph nol Dissoudre de la 2 propyl 3 t butyl 4 hydroxy S isopropylph nol 2 0 mol et de Potkoformate de trim thyle 0 3 1 dans du m thanol 1 2 D et d gazer Placer sous une atmosphere d azote et refroidir a 3 C et ajouter de Pacide sulfurique concentr 5 mi Ajouter par addition goutte goutte de la m thyivinylc tone 340 ml 4 0 mol et agiter sous refroidissement pendant 44 heures Verser dans une solution aqueuse d hydrog nocarbonate de sodium et extraire dans de l ther thylique S
6. 2 liaisons insatur es La composition lipidique pr f r e est ia suivante 85 100 de DPPC plus 0 15 de PG On pr f re encore davantage du DPCC pur Les composants lipidiques du surfactant pulmonaire synth tique se trouvent couramment dans le surfactant pulmonaire des mammif res et sont disponibles partir de sources industrielles avec une puret lev e On pr pare les Lie LA a ot haie YA D Y Ai ie d i ER qa a ie 2 MED Ze ts Sr Es EG Pe ER Red EN a Sa D zA FE Ze LE ta DH Ca Zei Ti ee d Or TRE wl et a w Bay ae eS 2 a i des pi NC it KE ba Wa GZ i Ei E N E me a At SS 1 fei E A an Ze d au 7 Ze Gi an A C et Es Ai ari En y CR SCH 10 15 20 25 30 35 18 composants polypeptidiques par synth se de peptides en phase solide par des proc d s connus des hommes de m tier Les m langes de lipides de l invention avec des prot ines isol es de lavage de poumons de mammif res se sont montr s efficaces dans le traitement de RDS n onatate Cependant des m langes de ces lipides avec des peptides synth tiques dans des pr parations de surfactant pulmonaire n ont t que r cemment d crits McLean et al On met des lipides en suspension sous forme de liposome par des proc d s connus des hommes de m tier c est dire que Pon m lange tout d abord les li
7. anhydre 1 1 Placer sous une atmosph re d azote et ajouter goutte goutte du phosphonoac tate de trim thyle 209 4 g 1 15 mol Agiter 25 minutes et ajouter une solution de 2 hydroxy 2 m thyl 7 t butyvi 5 isopropyi 8 propyl chroman 6 yl ac tate 0 5 mol dans du t trahydrofurane 1 D Agiter temp rature ambiante pendant 18 heures puis chauffer au reflux pendant 4 heures Refroidir vaporer le solvant sous vide et purifier par chromatographie pour obtenir le compos titre Les proc d s de test d efficacit des pr parations de surfactant synth tique sont bien connus dans le domaine Par exemple on peut tester des pr parations de surfactant synth tique de la pr sente invention de toute mani re appropri e par exemple dans un mod le de poumon de rat adulte Ikegami et aL 1979 Pediatr Res 13 777 780 Les caract ristiques pression volume des poumons de rat d pourvus de surfactant sont similaires a celles des poumons de nourrissons atteints de maladies membranes hyalines et le r tablissement des relations pression volume du poumon vers la normale est corr l e la quantit de surfactant instill de mani re dose d pendante Bermel M S et al Lavage excised rat lungs as a model of surfactant deficiency Lung 162 99 113 1984 ON aus PA AP Vo us ad E 1 A i Et 10 15 20 25 30 35 IMAGE QE ARO LA Ye ESC de Les protocoles ntaux de aration des
8. fe Heffner et al Am Rev Respir Dis 104 531 554 1989 a Halliwell FASEB J 1 358 364 1987 On a d crit un surfactant pulmonaire synth tique form de polypeptides plus grands ayant des fragments antioxydants 30 dans de demande de brevet en s rie no 07 789 918 publi e le 4 novembre 1991 incorpor e ici en r f rence Cependant la de pr sente invention fournit un surfactant pulmonaire de synth tique efficace ayant des propri t s antioxydantes qui ae sont des peptides raccourcis de 3 4 acides amin s ayant la E 35 capacit d inhiber l oxydation de compos s sensibles en a eR kime vw e RH 10 15 20 25 30 35 de oxydants Les surfactants pulmonaires raccourcis permettent de produire des agents th rapeutiques de facon plus efficace et plus conomique L originalit de l invention se situe dans sa capacit r duire de fa on efficace le peptide 3 4 acides amin s tout en conservant les propri t s de surfactant et d administrer de fa on efficace le peptide fix un antioxydant li par covalence On a ajout des agents th rapeutiques tels que la vitamine E des pr parations de surfactants pulmonaires synth tiques sous forme de composant s par Brevet U S No 4 765 987 Publication PCT No WO 90 11768 Publication PCT No WO 90 07469 Cependant dans la pr sente invention les antioxydants ne constituent pas un composant s par mais sont r ellement in
9. re les propri t s antioxydantes au polypeptide Cependant il est noter que X peut comprendre des lieurs pour le lier au polypeptide tels que lorsque les fragments antioxydarit attach s au polypeptide sont d crits iis comprennent galement les lieurs appropri s par exemple B C Q B C O C O NH B C O etc Il existe de nombreuses mani res de former X Par exemple on peut acyler des d riv s d acide amin par un agent acylant form partir de compos s antioxydant Pour tre un agent acylant les compos s antioxydants peuvent par exemple former un anhydride sym trique ou un ester actif par exemple lester de N hydroxybenzotriazole ester d HOBt On expose ensuite agent acylant un agent nuci ophile fonctionne non prot g pour que la r action se produise On effectue ceci de pr f rence dans une synth se de peptide en phase solide alors que lacide amin destin recevoir le fragment antioxydant fait partie du peptide attach la r sine On peut galement modifier des acides amin s individuels avant ieur incorporation dans le peptide par exempie par est rification alkylation r ductrice etc D autres modifications des acides amin s et des d riv s d acide amin s contenant des groupes fonctionnels sont bien connues des hommes de m tier Les exemples pr f r s de compos s antioxydants qui se sont r v l s utiles dans des r actions avec des acides amin s ou des d riv s d acide
10. s comprennent les acides mono di et tricarboxyliques Des exemples de ces acides sont par exemple les acides ac tique glycolique lactique pyruvique malonique succinique glutarique fumarigue malique tartrigue citrique ascorbique maj ique hydroxymal ique benzoique bydroxybenzoique ph nylac tique cinnamique salicylique 2 ph noxybenzolque et les acides sulfoniques tels que Pacide m thanesulfonique et Pacide 2 hydroxy thanesulfonique Des sels du fragment aminoacide carboxy terminal comprennent les sels d acide carboxylique non toxiques form s avec toute base min rale ou organique appropri e par exemple ces sels comprennent les sels de m taux alcalins tels que par exemple le sodium et le potassium de m taux alcalino terreux tels que le calcium et le magn sium de m taux i gers du groupe IHA en particulier aluminium et les amines primaires secondaires tertiaires telles que par exemple les trialkylamines en particulier le tri thylamine la procaine la dibenzylamine la 1 th namine la N N dibenzyl thyl n diamine la dihydroabi tylamine la N alkyle inf rieur pip ridine et tout autre amine appropri e Les phospholipides des complexes prot ine phospholipide de cette invention peuvent tre des phospholipides quelconques et ce terme utilis ici comprend les phosphoglyc rides et les sphingolipides Les phosphoglyc rides sont les esters d acide di gras de glyc rol dans lesquels le
11. sente une liaison ou Glu repr sente Trp ou Glu A3 repr sente Aib Glu Gln Leu Ala ou Orn et As repr sente Lys X a pour formule Da ou Db a AA ARENA AI RU Ge e AT PE NE e T E O Kaa E 7 QA a nee I Bi B Aa Z ou 5 R Ry R OH 10 15 20 25 30 LAS LIEN Da Ob dans lesquelles B repr sente B C O B C O C O NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkyl ne en Cire ou un groupe alc nyl ne en C2 16 et dans lesquelles chacun des Ri Ra R3 Ra Rs Be et Ry repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en Ci 6 et Y repr sente un substituant carboxyle de As choisi parmi les groupes hydroxy amino alkylamino et alcoxy 4 Polypeptide conforme l une des revendications I 3 dans lequel A repr sente Glu 5 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 dans lequel Az repr sente Trp 6 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 dans lequel A3 epr sente Aib 7 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 dans lequel A3 repr sente Ala 8 Polypeptide conforme la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel A4 repr sente Lys 9 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 dans lequel X repr sente Da 10 Polypeptide conforme la revendication 17 ou la revendication 18 dans lequel R et R2 repr sentent chacun un groupe tertio butyle 11 Polypeptide conforme l une des r
12. soussign s 2110 East Galbraith Road The undersigned Ctactanati Die 45215 United States of America G signe nt comme mandataires ies personnes suivantes appoints appoint the following persons as agen Callewaert Jean Claeys Pierie Gevers Florent Gevers Jacoves Pieraerts Jacques Quintelize Claude Schmitz Yvon Van der Stock Guy Van Reet Joseph ou Vosswinke Philippe c o GEVERS Patents S A Holidaystraat 5 183 Diegem pour la le s repr senter aupr s de l Office beige de la Propridi Industrielle concernant to represent the undersigned before the Office belge de la Propri t Industrielle in connecrion wit toute demande de brevet beige ou tout brevet belge any and all Belgian patenis or patent applicerions tout brevet curopden ayant effet en Belgique any and all European patent being effective in Belgium et pour faire ou recevoir tout paiement en son leur nam and to make or receive any and all payments on behalf of the undersigned Signature s Mans E Nom du signataire GARY D STREET Name of the person signing Fonction du signataire General Patent Counsel and Assistant Secretary Capacity in which the person signs Dae L December 19195 10 15 20 25 30 35 V 816 758 a d TRADUCTION DE BREVET EUROPEEN 11 Num ro de publication europ en 0 652 594 21 Num ro de d p t de la demande 93 316 889 4 45 Mention de la d livrance Bulletin europ en n 97 36 du 0
13. 1 pH 2 avec un contr le 214 nm Ona recueilli le pic principal et on Fa lyophilis On a confirm la puret gt 97 et l identit des peptides synth tiques par l obtention d un pic unique en chromatographie liquide haute performance CLHP analytique lectrophor se de zone capillaire spectroscopie de masse par bombardement atomique rapide SM FAB sur un VG Analytical ZAB2 SE qui a donn des ions mol culaires uniques correspon lant aux s quences correctes et les analyses d acides amin s qui taient dans les 10 des valeurs pr dites pour chacun des r sultats La L a diplamitoylphosphatidyicholine DPPC puret gt 99 provenait d Avanti Polar Lipids Birmingham AL En utilisant ces protocoles on a synth tis les peptides suivants leurs propri t s analytiques sont pr sent es dans le tableau I H z E D a d SS Ee W Was EI E A Te Ka pS SV KE Msn LL si A O EE anne Se SN za QE Se ES d AE E g 2 AO E eg S E Gel z a A PL AR SCT FE St S EE En d EN ER ee Ge d ege SHE BON euen A OM SS wA En PI AN kaaa tones P se is d Ble Teen D s A ce A d a aa AN ts LS n 10 15 20 25 30 593 1 4 PREPARATION DU POLYPEPTIDE HBB Aoc Giu Trp Aib Lys NH SEQ ID NO 1 HBB Acc N hydroxy di t butyl benzoyl aminooctanoyl On a tout d abord pr par Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2CIZ pMBHA en utilisant une r sine Lvs N 2CIZ pMBHA plac e dans un synth tiseur de
14. B POSITION 1 D AUTRE INFORMATION note suite glutamique Fri Aoc Glu ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 4 D AUTRE INFORMATION note acide 2 amino isoburyrique Aib ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 5 D AUTRE INFORMATION note Xaarlysin 1 amide xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 3 Xaa Glu Trp Xaa Xaa 1 5 38 2 INFORMATIONS POUR SEQ ID NO 4 i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE A LONGUEUR 4 acides amin s B TYPE acide amin D TOPOLOGIE lin aire 5 tii TYPE DE MOLECULE peptide 10 ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 1 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide N alpha N 8 hydroxy di t butyl benzoyl glutamique HBB G 15 ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 3 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide 2 amino 20 isobutyrique A b val a ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi E B POSITION 4 s 25 D AUTRE INFORMATION note Xaa lysin 1 amide S xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 4 Xaa Trp Xaa Xaa 30 2 INFORMATIONS POUR SEQ ID NO 5 S WA i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE A LONGUEUR 4 acides amin s 35 B TYPE acide amin mepri i toit en ta e AAA er A 0 Le note RES Hier Ee dre D Une E Ta Pr IA TN e ll eee S 2 als 3 D TOPOL
15. D EXPLOITATION PC DOS MS DOS 25 D LOGICIEL Patent In Release 1 0 Version 1 25 S vi DONNEES SUR LA DEMANDE EN COURS A NUMERO DE LA DEMANDE US B DATE DE DEPOT 30 C CLASSIFICATION vii DONNEES SUR LA DEMANDE PRECEDENTE S A NUMERO DE LA DEMANDE US 07 923 092 B DATE DE DEPOT 31 JUILLET 1992 35 ET CARE Zem me ee aa IN A e keshi PE Ga Res e aS IT Lente ae SE EE DEA E Mia ART eta o TT e SEA ADA Aa KIA Z pM me SE An 35 viii INFORMATION SUR LE MANDATAIRE AGENT A NOM Collier Kenneth J B NUMERO DE DEPOT 34 982 C NUMERO DE REFERENCE REGISTRE M01598 US 5 10 15 20 25 30 ix INFORMATIONS SUR LES TELECOMMUNICATIONS A TELEPHONE 513 948 7834 B TELECOPIE 513 948 7961 TELEX 214320 2 INFORMATIONS POUR SEQ ID NO 1 i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE A LONGUEUR 4 acides amin s B TYPE acide amin D TOPOLOGEE lin aire ii TYPE DE MOLECULE peptide ix CARAC ERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 1 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide N alpha N 8 hydroxy di t butyl benzoyl amino octanoique glutamique HBB Aoc Glu ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 3 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide 2 amino isobutyrique Aib 35 ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION A 10 15 20 25 30
16. animaux d enregistrement de la courbe pression volume et de lavage de poumon sont adapt s de ceux d crits par Ikegami et al Pediatr Res 11 178 182 1977 et Pediatr Res 13 777 780 1979 et Bermel et al Lung 162 99 113 1984 On anesth sie des rats Sprague Dawley m les 200 250 g avec du pentobarbital de sodium et on les exsanguine On canule la trach e et on retire les organes thoraciques en bloc Apr s limination des tissus adventifs on met la trach e et les poumons environ 2 g en suspension dans une solution saline 0 9 96 on les place dans une chambre vide et on les d gaze selon le protocole de Stengel et al On met en suspension les poumons d gaz s dans une solution saline dans un r servoir chemise 37 C et on connecte la canule trach ale un manom tre eau et une seringue en verre par un tube en T On place la seringue en verre dans une pompe injection pr levement On gonfle rapidement les poumons avec de Pair une pression de 30 cm de H 0 la vitesse de 10 mi min pour r duire le pi geage de Pair et on les niaindent cette pression pendant 10 min en ajoutant par intermittence de Pair aux poumons On enregistre le volume total d air inject comme capacit pulmonaire totale CPT qui est g n ralement de 14 15 mi On d gonfle ensuite les poumons une vitesse de 2 5 ml min jusqu atteindre la pression 0 Pendant le d gonflement on rel ve la pression sur le manom tre
17. autres groupes protecteurs Parmi les cat gories de groupes protecteurs de groupe a amino consid r s pour une utilisation avec ia pr sente invention On trouve 1 les groupes protecteurs de type acyle tel que les groupes formyle trifluoroac tyle phtalyle toluenesulfonyle tosyle benz nesulfonyle nitroph nylsuif nyle tritylsulf nyle o nitroph noxyac tyle et y chlorobutyryle 2 les groupes protecteurs de type ur thane aromatique tels que les groupes benzyloxycarbonyles et benzyloxycarbonyles substitu s tels que les groupes p chlorobenzyloxycarbonyle p nitrobenzyloxycarbonyle p bromobenzyloxycarbonyle p m thoxybenzyloxycarbonyle 1 p biph nyle 1 m thyl thoxycarbonyle aa dimethyi 3 5 dim thoxybenzyloxycarbonyle et benzylhydryloxycarbonyle 3 les groupes protecteurs de type ur thane aliphatique tels que les groupes tert butyloxycarbonyle Boc diiscpropylm thoxycarbonyle isopropyloxycarbonyle thoxycarbonyle et allyloxycarbonyle 4 les groupes protecteurs de type ur thane cycloalkylique tels que les groupes cyclopentyloxycarbonyle ou 9 fluor nylm thoxycarbonyle Fmoc 6 les groupes protecteurs de type alkyle tels que les groupes triph nyim thyle trityle et benzyle 7 les groupes trialkylsilane tels que le groupe trim thyisilane Le choix du groupe protecteur du groupe a amino d pend cependant de la r sine utilis e du groupe fonctionnel du site cible des autres groupes fonction
18. cher MgSO et vaporer le solvant sous vide pour obtenir du 2 m thoxy 2 m thyl 7 t butyl 5 isopropyl 8 propyl chroman 6 ol Dissoudre du 2 m thoxy 2 m thyl 7 t butyl 5 isopropyl 8 propyl chroman 6 ol 2 mol dans de la pyridine 600 ml et ajouter de Panhydride ac tique 900 ml D gazer et agiter sous une atmosph re d azote pendant 18 heures Verser dans de la elace eau et agiter pendant 3 heures Extraire dans de V ther thylique s cher MgSOy vaporer le solvant sous vide et purifier par chromatographie pour obtenir du 2 m thoxy 2 m thy 7 t buty 5 isopropyl 8 prupyi chroman 6 yl ac tate Dissoudre du 2 m thoxy 2 m thyl 7 t buty 5 isopropyl 8 propyl chroman 6 yl ac tate 2 mol dans de l ac tone 2 5 1 et ajouter de l eau 2 1 puis de Pacide chlorhydrique concentr erp LE ert Abr te fale ene ng ESR aH E JH rer Se rege BRE DEE arepa AT 10 20 30 35 30 16 6 mi Eliminer le soivant par distillation du m lange agit jusqu ce que la temp rature atteigne 90 C Refroidir la suspension la diluer avec de l ther thylique et la laver avec une solution aqueuse d hydrog nocarbonate de sodium S cher MgSO4 vaporer le solvant sous vide et purifier par chromatographie pour obtenir du 2 bydroxy 2 m thyl 7 t butyi S isopropy 8 propyi chroman 6 yi ac tate Mettre en suspension de l hydrure de sodium 47 2 g 56 dans de Phuile min rale 1 10 mol dans du t trahydrofurane
19. couplage tel qu un milieu dim thyiformamide chlorure de m thyl ne 1 1 ou dans du dim thylformamide seul ou dans du chlorure de m thyl ne seul Lorsque le couplage est incomplet on r p te le protocole de couplage avant de retirer les groupes protecteurs de groupe a amino avant le couplage de l acide amin suivant dans le r acteur en phase solide La r ussite de la r action de couplage chacune des tapes de la synth se est contr l e par la r action la ninhydrine d crite par E Kaiser et al Analyt Biochem 34 595 1970 Apr s obtention de ia s quence d acides amin s d sir e on retire le peptide de la r sine en utilisant tout r actif appropri qui ne nuira pas au polypeptide Par exemple on peut utiliser du HF anhydre contenant 5 d anisole et 5 d ac tonitrile dans de l acide trifluoroac tique 0 1 pour couper le peptide d une r sine DMBHA Les polypeptides de formule 1 peuvent former des sels acceptables du point de vue pharmaceutique avec tout acide non toxique organique ou min ral Des exemples d acides min raux qui forment des sels appropri s comprennent les NEEDS z ARA sa ADA A IS ME RP DU a PERS AS de 10 15 20 25 30 35 15 acides chiorhydrique brombydrique sulfurique et phosphorique et les sels de m taux acides teis que le monohydrog noorthophosphate de sodium et l hydrog nosulfate de potassium Des exemples d acides organiques qui forment des sels appropri
20. dans le manuel de Putilisateur du synth tiseur de peptide Applied Biosystems Modei 430A incorpor ici dans sa totalit Les proc d s pr f r s d activation de chacun des acides amin s a la chaine peptidique li comprennent la formation d un anhydride sym trique ou d un ester actif de chacun des groupes oam po ajout s ayant t prot g s de fa on appropri e Par exemple on peut faire r agir un acide amin a groupe a amino prot g avec du dicyclohexylcarbodiimide DOC en pr sence de dichlorom thane DCM pour former l anhydride sym trique En variante on peut former l ester actif d HOBt en dissolvant Pacide amin BOC acide amin tert butyloxycarbonyle et du HOBt dans du DCC et en refroidissant en ajoutant un suppl ment de DCC et en r chauffant la solution temp rature ambiante On ajoute ensuite cette solution la r sine li e l acide amin Ce proc d d activation permettant de former des agents d acylation peut galement tre utilis pour les compos s antioxydants Si d autres groupes fonctionnels sont pr sents en plus du groupe a amino il faudra g n ralement prot ger ces groupes G n ralement on peut prot ger le groupe a amino et chacun des groupes fonctionnels de chaine lat rale par des groupes mn d Seit 2 NO EA TERNA Kb E 10 15 20 25 30 35 13 protecteurs diff rents de telle sorte qu un groupe protecteur soit retir sans retrait des
21. eau intervalles de 1 cm et on l enregistre On utilise ces donn es pour construire une courbe pression volume P V ou une courbe de compliance quasi statique apr s correction tenant compte de la courbe P V de l appareil Apr s d gazage et quilibration on rend les poumons d ficients en surfactant par des lavages r p t s avec 5 mi g de tampon de lavage NaCl 0 9 HEPES 10 mM Ph 7 4 On r p te les protocoles de d gazage d quilibration et de lavage 15 20 fois jusqu a ce que la courbe pression volume prenne une forme x A Sg E ru ta Wi tay Kei RS w i Zi H y Pe he ie vi ke ge e 2 4 Gi Si i e Ea 10 15 20 25 30 32 nettement sigmoidale et que le volume d air restant dans les poumons une pression de 5 cm de H O soit inf rieure ou gale 3 mi A ce point on considere les poumons comme d ficient en surfactant Pour le test on ajoute 2 mi de NaCl 0 9 tampon HEPES 10 mm pH 7 4 au surfactant pulmonaire sec 25 mg de phospholipide 100 125 mg kg et on vortexe le m lange on le purge avec de l azote et on lincube 45 C pendant 1 h On vortexe ensuite nouveau le m lange on le d gaze sil est mousseux et on introduit 2 mi du m lange tester dedans et on le retire des poumons quatre fois par la seringue Lorsqu on r introduit le m lange tester dans les poumons pour la cinqui me fois on l y laisse On a adopt ce protocole pour favoriser un
22. groupe hydroxy restant un groupe hydroxy terminal du fragment glyc rol forme un ester avec l acide phosphorique G n ralement dle fragment acide phosphorique des phosphoglyc rides forme un second ester avec un alcool par exemple thanolamine s rine choline ou glyc rol Les sphingolipides sont les esters d acides gras et digras de Ko Ar a AE RE N WA zi AS aa 10 13 20 25 39 i6 sphingosine ou dihydrosphingosine dans lesquels le groupe hydroxy en position 1 forme un ester avec l ester de choline de l acide phosphorique Les lipides pr f r s des complexes prot ine phospholipide de cette invention comprennent ia dipalmitoyiphosphatidyicholine DPPC les mol cules de phosphatidyicholine contenant des chaines acyliques de longueurs diff rentes er de degr s de saturation diff rents PC la cardiolipine CL les phosphatidyiglyc rols PG les phosphatidyls rines PS les acides gras AG et les triacyiglyc rols TG Le DPPC constitue le composant majeur du m lange surfactant pulmonaire tandis que les PC CL PG PS AG et TG constituent les composants mineurs Des acides gras appropri s une utilisation dans les phospholipides de cette invention sont les acides carboxyliques longue chaine comportant g n ralement huit atomes de carbones ou plus g n ralement non ramifi s Les acides gras peuvent tre satur s Ou insatur s Des exemples d acides gras sont les acides laurique my
23. peptide ABI430A et on Ta synth ns en utilisant la chimie t Boc standard Pour synth tiser le peptide 1A on a combin Vacide N hydroxy di t butyl benzoique HBB 501 mg du dim thylformamide 4 mi et du chlorure de m thyl ne 4 mi et on a ajout une solution de dicycloh xylcarbodiimide 8 mi d une solution 0 5 M dans du chlorure de m thyl ne et on a agit pendant 5 minutes pour obtenir Panhydride sym trique de HBB que Yon a ensuite coupl a Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2ClzZ pMBHA en un exc s de 10 fois pour chacun des deux couplages On a coup le peptide prot g HBB Aoc Giu OBzl Trp Aib Lys N 2CIZ pMBHA de la r sine et on a retir les groupes protecteurs de chaine lat rale en traitant le HBB peptide r sine dans du HF anhydre contenant 5 d anisole et 5 de sulfure de dim thyie a 5 C pendant 1 heure On a ensuite extrait le peptide de la r sine avec de Pac tonitrile a 50 dans de Vacide trifluoroac tique a 0 1 on Pa congel et on Pa lyophilise On a ensuite purifi le peptide par CLHP en phase inverse pour obtenir le compos titre 1 B PREPARATION DE COMPLEXE DECRIT DANS L EXEMPLE LA On pr pare le peptide IJA comme d crit ci dessus On s che du DPCC 25 mg dans 1 mi de chloroforme sous un flux d azote et on le s che sous vide pour liminer les traces de solvant organique On ajoute au m lange lipidique sec 3 mi d eau On incube la pr paration pendant heure a 45 C Ensuite on ajou
24. peptide n ayant pas r agi de Passociation lipide peptide par ultracentrifugation filtration ou chromatographie On peut ensuite lvophiliser ou a rosoliser le m lange Lorsqu on utilise les complexes polypeptide phospholipide de cette invention dans le traitement de syndrome de d tresse respiratoire du nouveau n un tat physiologique qui r sulte de l incapacit des poumons des nourrissons pr matur s produire un surfactant pulmonaire les complexes agissent comme un antioxydant et des surfactants pulmonaires synth tiques et remplacent le surfactant naturel manquant ou bien pallient la d faillance du surfactant naturel On poursuit Be y E ve CUS i mi Ne AA Brae rar wet Sp SRS STE et een Een E Rs O ae Baran 7 REIS DEIA 0e S RO RCE EE DE a SS Sai dd EE RAZA SE 3 10 15 20 25 30 20 le traitement jusqu ce que les poumons du nourrisson produisent une quantit suffisante de surfactant pulmonaire naturel telle que le traitement devienne inutile Les pr parations conviennent de pr f rence une administration endotrach ale c est dire sous forme de suspension liquide de poudre s che ou d a rosol Pour une suspension liquide on m lange le m lange sec ou le m lange en suspension aqueuse avec des agents appropri s tels que l eau des solutions salines du dextrose et du glyc rol pour produire une composition efficace du point de vue pharmaceutique Les suspensi
25. pour Respiratory Distress Syndrome Le syndrome de d tresse respiratoire du nourrisson est une Cause majeure de d c s dans les 28 premiers jours de la 5 vie Le RDS du nourrisson frappe un b b sur 100 dans le monde et environ 10 pour cent d entre eux meurent Le syndrome est relativement rare en terme de nourrissons mais est g n ralement associ avec Pimmaturit et le faible poids la naissance moins de 2 kg La RDS de l adulte montre des 10 caract ristiques cliniques et une pathophysiologique similaires e celles de la maladie infantile et est g n ralement prise en Ja charge dans une unit de soins intensifs La maladie adulte a a diverses thiologies et peut r sulter d agressions pulmonaires tels que des infections diffuses l aspiration du contenu de 15 l estomac l inhalation de produits irritants et de toxines et un oed me pulmonaire ayant pour origine par exemple une overdose de narcotiques La RDS est corr l e l absence ou au dysfonctionnement du surfactant pulmonaire qui recouvre les alv oles des poumons 20 o se produisent les changes gazeux et on Pa associ e aux radicaux libre centre oxyg ne dans le poumon ou la cavit pe pulmonaire que Pon appelle les oxydants tels que les radicaux E superoxyde les radicaux hydroxyle le peroxyde d hydrog ne E qui peut produire des radicaux hydroxyie et les peroxydes a 25 lipidiques qui sont impliqu s dans les l sions cellulaires
26. r cisom res ainsi que le st r oisom re isol Comme d habitude par crit la structure des peptides est ici telle que l extr mit amino terminale se ECG 1 7 3 8 10 15 20 30 35 8 trouve sur je c t gauche de la chaine et l extr mit carboxy terminale se trouve sur le c t droit de la chaine Lorsque deux acides amin s se combinent pour former un peptide par l interm diaire d une liaison amide typique une mol cule d eau est lib r e et on appelle ce qui reste de chacun des acides amin s un r sidu La laison amide peut galement se faire lorsque X est li l acide amin suivant ou A un isost re de liaison amide Un r sidu est par cons quent un acide amin auquel manque un atome d hydrog ne du groupe amino terminal et auquel manque le groupe hydroxyle du groupe carboxyi terminal En utilisant la terminologie accept e un tiret devant indiquant une perte d eau le code trois lettres d un acide amin ou d un d riv d acide amin indique la liaison amine d un r sidu Groupe alkyle utilis ici indique un radical hydrocarbon chaine lin aire ou ramifi e tel que les groupes m thyle thyle propyle butyle isopropyle tertio butyle sec butyle isopentyle l m thyibutyle etc en fonction du nombre d atomes de carbone sp cifi s Groupe acyle utilis ici indique un radical form partir d un acide organique par P limination d un groupe
27. 3 09 1997 73 Titulaire MERRELL PHARMACEUTICALS INC 54 Titre Tensicactifs pulmonaires synth tiques 3 peptides poss dant des entioxydants li s de mani re covalente Cette invention se rapporte la synth se d une s rie de polypeptides contenant 3 4 acides amin s avec des antioxydants li s par covalence au peptide soit directement soit par Vinterm diaire d une r gion lieuse Ces peptides modifi s peuvent tre utilis s comme surfactants pulmonaires synth tiques comportant des antioxydants utiles faisant partie de la structure du peptide On d crit galement la pr paration de m lange de ces polypeptides avec des lipides leur proc d de production et des compositions pharmaceutiques efficaces pour traiter les syndromes de d tresse respiratoire aigu des mammif res ARRI RE PLAN DE L INVENTION Les poumons d pendent d un quilibre d licat entre les oxydants toxiques et les activit s protectrices des syst mes de d fense antioxydants Un d s quilibre de ce syst me d l augmentation de ja quantit d oxydants ou au dysfonctionnement des syst mes de d fense antioxydants protecteurs peut produire des v nements pathophysiologiques dans le poumon provoquant un dysfonctionnement du poumon Un type de dysfoncuonnemen pulmonaire auquel peut contribuer une augmentation de la quantit d oxydants est le e UE EC EC ann de vitae ay syndrome de d tresse respiratoire aigu RDS
28. ALYTIQUES DES PEPTIDES SYNTHETISEES ANALYSE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE FABS DES PEPTIDES 1 7 E HBB Aoc Glu Alb Lys NH 4 Hi 9206 PREPARATION DES FRAGMENTS ANTIOXYDANTS On peut utiliser les mat riaux de d part antioxydants suivants comme d crit dans les exemples pr c dents Remplir un r cipient de r action d une suspension d hydrure de sodium 4 74 g 0 198 moi dans de l ther dim thylique d thyl neglycol anhydre 150 ml Ajouter goutte goutte une solution de 2 t butyl 6 m thylph nol 0 1 mol dans de l ther dim thylique d thyl neglycol 150 mi Chauffer 50 60 C pendant 1 5 heure puis introduire du dioxyde de carbone l aide d un tube d arriv e de gaz plac sous la surface du m lange r actionnel pendant 20 heures Refroidir 5 C et d truire soigneusement l hydrure de sodium en exces avec de l alcool m thylique 30 mi Apr s arr t du d gagement d hydrog ne ajuster le pH du m lange r actionnel 2 avec de l acide chlorhydrique 1N Diluer avec de l eau 1 6 1 et recueillir le compos titre par filtration A N srar aa AA a AA 5 15 20 25 30 35 28 Exemple 7 PREPARATION DE COMPOSE ANTIOXYDANT MATERIAU DE DEPART acide 6 hydroxy 7 1 burS isopropyl 8 M langer des copeaux de magn sium 45 mg 1 85 minal et du 1 chloro 2 2 dim thylpropane 74 6 mg 0 7 mmol dans de l ther anhydre 9 mi Chauffer et agiter vigoureusement puis ajo
29. CONSEILS EN BREVETS BELGES ET EUROPEENS Gevers Patents BELOS na Srucsats Aleport j Business Park ME 200001 Diegem le 1 septembre 1997 GEVERS Patents Hohdlaystital 5 B 1831 Oregon TEL 432 2 715 39 00 FAX 432 720 50 70 Antwerpen GEVERS Psienis Fronkrikie 53 55 bus 5 8 2000 Antwerpen TEL 32 3 206 99 88 FAX 432 3 206 98 51 MIN DES AFFAIRES ECONOMIQUES ra ae Off de la Prop Industridie Te noyt boulevard Emile Jacqmain 154 1000 BRUXELLES N Ref EPBE 816758 302462 Messteurs D p t d une traduction d un brevet europ en Nous vous remettons en annexe un exemplaire de la traduction du texte du brevet europ en dont les donn es sont reprises ci dessous Date de d p t 30 juin 1993 Date de d livrance 3 septembre 1997 Num ro de publication 0652894 Titulaire s MERRELL PHARMACEUTICALS INC Nous joignons galement une photocopie du pouvoir g n ral Nous vous serions cblig s de bien vouloir accuser r ception de la pr sente en nous retournant la copie ci jcinte munie de votre cachet Nous vous prions d agr er Messieurs nos salutations distingu es Annexes GR 316758 Ph VOSSWINKEL NV GEVERS Patents SA BBL 310 1012647 53 TVA BTW VAT BE 451 659 126 RC HA BR 576 237 aon rl TA COPIES Lai gt 1 289 158 POUVOIR GENERAL GENERAL POWER OF ATTORNEY Demandes de brevet Patent Applications Brevets Patients La soussign e FERRELL PHAMOLEUTICALS IRC Le s
30. LAA EE AT TT I e oi zi TE AA A e et Pig St l S P WEN SECH ae 10 15 20 25 30 35 21 Les exemples suivants pr sentent certains proc d s de pr paration du polypeptide du complexe polypeptide liquide et des mat riaux de d part de la pr sente invention La pr sente invention ne se limite pas aux exemples suivants ni ces proc d s de pr paration Les abr viations non pr alablement d finies utilis es dans les exemples sont les suivantes TBDMS t trabutyldim thyisilyle SEt thyithio Suc Succinyle TEA Acide trifluoroac tique Bal Benzyle Ot Bu Ether t butylique qui accompagnent la chimie Boc standard et la chimie Fmoc standard les r actions chimiques utilis es avec le synth tiseur de peptide ABI respectivement pour les cycles Boc et les cycles Fmoc PROTOCOLES CHIMIQUES EXPERIMENTAUX Exemple 1 Synth se de peptides et autres produits chimiques On synth tise les peptides l chelle de 0 5 mmol par des proc d s en phase solide sur un synth tiseur de peptides Applied Biosystems Inc Foster City CA mod le 430 A On a utilis une r sine p m thylbenzoxyhydrylamine pMBHA pour obtenir des extr mit s C terminal amides apr s coupure On a effectu un double couplage des acides Na t Boc t butyloxycarbonyl amin s avec une protection de chaine lat rale de Cys thylthio Glu benzyle et Lys 2 chlorobenzyloxycarbonyle d apr s Peptides International par l
31. Lys N 2CIZ bMBHA en un exc s de 10 X pour chacun des deux couplages Pour couper le peptide prot g Tri Aoc Glu OBz1 Trp Aib Lys N 2CIZ pMBHA de la r sine et retirer les groupes protecteurs de cha ne lat rale on a trait le peptide avec du HF anhydre contenant 5 d anisole et 5 de sulfure de dim thyle 5 C pendant 1 heure On a ensuite extrait le Trl peptide de la r sine avec de Pac tonitrie 50 dans de l acide trifluoroac tique 0 1 on l a congel et on Pa lyophilis On a ensuite purifi le peptide par CLHP en phase inverse pour obtenir le compos titre im Es ot geg A EE o IN pS g On a pr par le peptide 3 A avec du DPPC pratiquement comme d crit dans l exemple 1 B 4 A PREPARATION DU POLYPEPTIDE HBB Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID NO 4 HEB Na hydroxy di t buty benzoyle On pr pare le peptide 4 A d une mani re pratiquement 10 analogue la pr paration du peptide 1 A On wani le Pepe 4 A avec du DPPC pratiquement 15 comme d crit dans exemple 1 PREPS PO E HBB Aoc Giu Trp Ala Lys NH SEQ 7 NO 5 HBB Aoc No hydroxy di t butyl 20 benzoyl aminooctanoy On prepare le peptide 5 A d une mani re pratiquement analogue a la pr paration du peptide 1 A 25 On es le DER r S A avec du DPPC pratiquement comme d crit dans l exemple 1 bo dj zept HE Nah En o AA ect GE RE D n M as DEA 10 15 25 TABLEAU 1 PROPRIETES AN
32. NH2 SEQ ID NO 4 36 Utilisation conforme a la revendication 27 ou a la revendication 28 dans laquelle ledit polypeptide est HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NH2 SEQ ID NO 5 37 Proc d de pr paration d un polypeptide conforme la revendication 1 comprenant les tapes consistant 1 synth tiser un polypeptide convenablement prot g r pondant la formule A Az Az3 AyY puis 2 faire r agir une extr mit alpha amino terminale de Aj A2 A3 Ay Y convenablement pr par e pour l acylation en la faisant r agir avec un groupe carbonyle de B de formule X pour former un polypeptide de formule X A A2 A3 Ay Y 38 Proc d conforme a la revendication 37 dans lequel ledit polypeptide est conforme l une des revendications 12 16 Tee se Ne DUAL EEN AE A ES SE A aa ES 111 rad Gure 1 succinyi i Tp Ley Y Kei a AA aman 7 Z Glu o Bet SUCcinyI Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Trp Leu Lys NH2 Fiqure 2 Trp2 DS ye Giu ee de Gren 7 HBB Aoc Lys4 amide HB B Aoc Glu Trp Aja Lys NH 5
33. OGIE lin aire ii TYPE DE MOLECULE peptide 5 ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSTTION 1 D AUTRE INFORMATION note Xaa acide N alpha N 8 Hydroxy di t butyl benzoyljamino octanoiquel glutamique 10 HBB Aoc Glu ix CARACTERISATION A NOM CLE Site modifi B POSITION 4 15 D AUTRE INFORMATION note Xaa jysin 1 amide xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO 5 Xaa Trp Ala Xaa 1 93 916 889 4 lt a REVENDICATIONS i Polypeptide de formule X A1 Az Az Agr Y ou l un de ses isom res optiquement actifs ou l un de ses sels 5 actifs du point de vue pharmaceutique dans lequel A repr sente une liaison ou un acide amin de charge n gative choisi parmi Glu et Asp A2 repr sente un acide amin hydrophobe choisi parmi Trp Tyr Phe His Val Leu ou He 10 A repr sente Aib Glu Gin Leu Ala Orn ou une liaison et A4 repr sente un acide amin de charge positive choisi parmi Lys Arg ou His X a pour formule Da ou Db R3 15 d Hat Ra A E AA SA Kg E se ZS ou Ri R Rs OH 20 Da Nb dans lesquelles B repr sente B C O B C O C O NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkyl ne en 1 16 ou un groupe alc nyl ne en C2 16 et dans lesquelles chacun des 25 Ri Rz Ba Ra Rs Ro et Ry repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en C Y repr sente un substituant carboxyle de A choisi parmi les groupes hydroxy am
34. T Free PANA 10 15 20 25 30 35 19 On peut ventuellement m langer des lipides avec un d tergent appropri tel que octyiglucosyle ou le d soxycholate de sodium selon un rapport molaire compris entre 1 et 20 parties de d tergent par partie de DPPC dans de l eau un tampon aqueux ou une solution saline des concentrations comprises entre 1 et 100 mg de DPPC ml Ensuite on ajoute le peptide sous forme d une poudre s che ou en suspension en solution aqueuse avec ou sans solvant organique agent d naturant ou d tergent On dialyse ensuite le m lange on le filtre on le centrifuge ou on le soumet une chromatographie pour liminer le d tergent On m lange de pr f rence les lipides et les peptides dans un solvant organique volatile avec ou sans une petite quantit d eau On vapore le solvant volatile sous un flux d azote ou d argon dans un four vide ou par vaporation rotative avant ou apr s l addition d un solvant aqueux On incube le m lange de lipides et de peptides pr par s par un des proc d s ci dessus pendant une dur e allant jusqu 2 heures de pr f rence 35 50 C avec irradiation sonique On peut ensuite dialvser le m lange le filtrer ou le soumettre une chromatographie pour remplacer je milieu aqueux par un milieu acceptable du point de vue pharmaceutique bien que cela ne soit pas n cessaire Dans certains cas on am liore l efficacit en s parant le lipide ou le
35. a r sine et on a retir les groupes protecteurs de chaine lat rale en traitant le HBB peptide r sine dans du HF anhydre contenant 5 d anisole et 5 de sulfure de dim thyie 5 C pendant 1 heure On a ensuite extrait le peptide de la r sine avec de l ac tonitrile 50 dans de Pacide trifluoroac tique 0 1 on l a congel et on l a lyophilis On a ensuite purifi le peptide par CLHP en phase inverse pour obtenir le compos titre A por pty Sted e A ETA AA E ar Mech e 15 20 25 23 2 B PREPARATION DE COMPLEXE DPPC AVEC LE POLYPEPTIDE On a m lang le peptide 2 A avec du DPPC pratiquement comme d crit dans l exemple 1 EXEMPLE 3 3 A PREPARATION DU POLYPEPTIDE Tri Aoc Glu Trp Aib Lys NH Tri Aoc e Na hydroxy di t butyi benzoyl aminooctanoyl SEQ ID NO 3 On a pr par Aoc Glu OBzt Aib Lys N 2CIZ bMBHA en utilisant une r sine Lys N 2CIZ bMBHA plac e dans un synth tiseur de peptide ABI43GA et on l a synth tis en utilisant la chimie t Boc standard Pour synth tiser le peptide 3A on a combin l acide 6 hydroxyt tram thyichroman 2 carboxylique Trolox 501 mg du dim thylformamide 4 mi et du chlorure de m thyl ne 2 5 m et on a ajout une solution de dicycloh xylcarbodiimide 8 mi d une solution 0 5 M dans du chlorure de m thyl ne et on a agit pendant 5 minutes pour obtenir Panhydride sym trique de HBB que Pon a ensuite coupl Aoc Glu OBz Trp Aib
36. corpor s dans un poiypeptide Un avantage de lincorporation de l antioxydant dans le polypeptide est qu au lieu d avoir un m lange trois composants lipide polypeptide et antioxydant on dispose d un m lange deux composants Ceci peut pr senter un avantage significatif lors des tests de l efficacit d un produit pharmaceutique comunercialisable lorsqu on doit tester divers dosages et formulations pour chacun des composants En outre une formulation deux composants est plus facile pr parer On peut utiliser ies polypeptides de la pr sente invention simplement en m lange avec un lipide ou en combinaison dans des m langes de lipides dans lesquels le polypeptide constitue un composant mineur du m lange surfactant On peut pr parer la composition de la pr sente invention avec une puret lev e et par un proc d standardis car il s agit d un m lange d fini de composants synth tiques En outre les composants ne proviennent pas de sources animales ce qui r duit le risque de contamination par des virus et des bact ries On utilise une representation en roue h licoidale d un peptide a h licoidal amphipatbique dix r sidus pour une description du peptide a h licoidal amphipathique voir McLean L R et al Biochem 1991 30 31 pour mettre au point Jim D de ra e a fa tar oe E D KENE i E 10 15 20 25 30 35 4 un mod le de peptide trois et
37. e distribution uniforme du mat riau dans le poumon On d gaze les poumons on les laisse s quilibrer 37 C pendant 7 min et on effectue une mesure de P V On tudie les poumons dans une solution saline 37 C plut t qu temp rature ambiante car les caract ristiques physiques des surfactants peuvent d pendre de la temp rature On administre du surfactant pulmonaire canin d une mani re similaire sauf que Von ne chauffe le surfactant que pendant 5 min Les donn es sont pr sent es en terme de CPT Les parties correspondant au d gonflement des courbes pression volume P V pour des poumons de rat adulte sont analys es en calculant les capacit s pulmonaires totales 9 CPT des pressions de 5 et 10 cm de H20 PCs et PC 10 Les comparaisons s effectuent par rapport au pourcentage de r tablissement PCs surfisant PCs test x 100 PCs suffisant ii DC d ficient et sont effectu es par analyse de variance une voie en utilisant le protocole g n ral des mod les lin aires avec des contrastes sp cifiques des moyennes SAS Institute Inc Cary NC Le lavage et le traitement par des m langes a tester n a pas produit de variation sup rieure 6 du CPT absolu 7 RH Ki x H a ei Y EI e 4 H H Le schei E CN Te BS e BE ZE eier rate 10 15 HBB Aoc Glu Trp Aib I SEQ ID No 2 HBB Aoc Glu Trp Glu SEQ ID No 3 213 R sultats Les pr pa
38. e en C2 164 et dans lesquelles chacun des Ri Rz Ra Ry Rs Re et Ry repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en C 6 Y repr sente un substituant carboxyle de A choisi parmi les groupes hydroxy amino alkylamino et alcoxy et ai raed syp hH Yat Se Sch LEE EAN sn NS A BF z J ku van L pa RAR MT ESS 10 15 20 25 30 44 dans lequel lorsque A3 repr sente une liaison on peut changer A et Az et d un lipide ou d un m lange de lipides choisi dans l ensemble constitu de DPPC PC CL PG PS FA et TG 18 Complexe d un polypeptide de formule X A1 2 A3 As Y ou d un de ses isom res optiquement actifs ou d un de ses sels actifs du point de vue pharmaceutique dans lequei A repr sente une liaison ou un acide amin de charge n choisi parmi Glu et Asp Az repr sente un acide amin hydrophobe choisi parmi Trp Tyr Phe His Val Leu ou He A3 repr sente Atb Glu Gin Leu Ala Orn ou une liaison et Ag repr sente un acide amin de charge positive choisi parmi Lys Arg ou His X a pour formule Da ou Db alive gai amp R3 Hat B H E OLA 7 4 OF a Sox SE ou a Ry R 5 OH Da Db dans lesquelles B repr sente B C O B C O C Q NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkyl ne en C1 16 ou un groupe alc nyl ne en C2 16 et dans lesquelles chacun des Ri Ra Ra Ra Rs Re et R repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en Cie
39. eptides synth tis s Le tableau II pr sente les r sultats d exp rience pression volume d montrant l efficacit des compos s dans le mod le de poumons de rats adultes 30 r Po 7 Wi EE e si d Ad E AA Be WA De e E Ce AAN A weg ee RS ARN PRE Yer NA Weet H ts KA E CS H ka LS DR Ae UA EIA UA GE E OE Her SE DECH Lef zA E EE GE S 10 15 20 25 30 DEEE V LAILLEE LU NTIC On a utilis jes abr viations courantes suivantes des acides amin s naturels dans toute cette description Ala ou A alanine Val ou V valine Leu ou L leucine Re ou isoleucine Phe ou F ph nylalanine Trp ou W tryptophane Met ou M m thionine Ser ou serine Tyr ou Y tyrosine Asp ou D acide aspartique Glu ou E acide glutamique Gin ou Q glutamine Thr ou T thr onine Gly ou G glycine Lys ou K lysine Arg ou R arginine Asn ou N asparagine Nie norleu zine Orn ornithine hArg homoarginine Nva norvaline Aib acide amino isobutyrique Les acides amin s naturels lexception de la glycine contiennent un atome de carbone chiral En l absence d indications contraires les acides amin s optiquement actifs num r s ici ont la configuration L Une fois que l on a ajout le fragment antioxydant de la pr sente invention au peptide des st r oisom res peuvent se former La pr sente invention comprend des m langes de ces st
40. er comme d crit ci dessus Tri Glu indique une mol cule avec une liaison peptidique form e entre le trolox et le r sidu glutamyle dans lequel le trolox est attach au groupe a amino du r sidu acide glutamique comme pr sent ci dessous 22 414 3 5 di t butyi 4 LA 10 15 25 35 STEE IY ens CH C Hai COOH Comme le montre Pexemple Tri Glu le fragment antioxydant dans ce cas lorsque X Db et B une liaison avec un groupe carbonyle C O peut tre attach Pextr mit a amino terminale du polypeptide pour former Db C O A A Az AsY On peut pr parer les polvpeptides de cette invention par divers protocoles ais ment disponibles pour les hommes de m tier tels qu un proc d chimique en phase liquide On pr f re le proc d consistant suivre un protocole s quentiel en phase solide qui peut employer des appareils automatiques tels que le synth tiseur de peptides ABI Dans le protocole s quentiel en phase solide on suit les tapes suivantes 1 on lie un premier acide amin dont le groupe a amino est prot g un support de r sine 2 on active le groupe carboxylique d un second acide amin dont le groupe a amino est prot g 3 on d prot ge le premier acide amin avec un r actif qui permet au premier acide amin de rester artach ala r sine et 4 on effectue le couplage entre le groupe a amino du premier acide amin et le groupe carboxylique activ
41. ette invention peuvent tre associ s avec un lipide constitu d un ou plusieurs de ceux du ii type associ avec un surfactant pulmonaire naturel Ces complexes polypeptide lipides et leurs compositions 5 pharmaceutiques peuvent tre utilis s dans le traitement du syndrome de d tresse respiratoire aigu de mammif re RENE DESCRIPTION DES SCHEMA La figure 1 est une repr sentation sous forme de roue 10 h licoidale d un surfactant peptdique dix r sidus utilis s pour mettre au point un mod le pour les peptides courts La vue est orient e vers le bas du corps de l h lice et les cha nes lat rales des r sidus sont indiqu es dans leur position par rapport l axe de l h lice La phase hydrophobe comprend les r sidus vers la 15 droite dans le dessin Trp Leu Leu Leu Leu et Lef La face hydrophile comprend les r sidus charg s Lys Glu Glu et Lys La figure 2 est un exemple d un antioxydant t trapeptidique con u partir d une seule r volution de la 20 projection en rcue h licoidale du peptide a dix r sidus e presentee dans la figure 1 La face hydrophobe du peptide de la EN figure 1 a t remplac e par Trp Ala HBB Aoc qui pr sentent g une face hydrophobe suffisante pour ancrer le peptide au lipide La face charg e hydrophile a t remplac e par Glu et 25 Lys BREVE DESCRIPTION DES TABLEAUX E Le tableau I pr sente les r sultats de l analyse des acides amin s des p
42. evendications i 10 dans lequel Y repr sente un groupe amino 12 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 qui est HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID NO 1 Pr gr ye L RME ES DS Le AE E ee x 10 15 20 25 30 35 13 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 qui est HBB Aoc Glu Trp Giu Lys NH2 SEQ ID NO 23 14 Polypeptide conforme 4 l une des revendications 1 3 qui est Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID NO 3 15 Polypeptide conforme l une des revendications 1 3 qui est HBB Glu Trp Aib Lys NH2 SBQID NO 4 16 Polypeptide conforme a l une des revendications I 3 qui est HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NHz SEQ ID NO 5 17 Complexe d un polypeptide de formule X Ar A2 A3 Ay Y ou d un de ses isom res optiquement actifs ou d un de ses seis actifs du point de vue pharmaceutique dans lequel A1 repr sente une liaison ou un acide amin de charge n gative choisi parmi Glu et Asp Az repr sente un acide amin hydrophobe choisi parmi Trp Tyr Phe His Val Leu ou lle A3 repr sente Aib Glu Gin Leu Ala Orn ou une liaison et A4 repr sente un acide amin de charge positive choisi parmi Lys Arg ou His X a pour formule Da ou Db R3 ch Hat a we Ra B A wA SU S OH E ou Da Ob dans lesquelles B repr sente B C O B C Q C O NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkylene en Ci 16 ou un groupe alr nylen
43. hydroxyle la formule g n rale est RCO dans laquelle R peut repr senter un hydrocarbure aliphatigue alicyclique aromatique ou un atome d hydrog ne groupe formyle Le groupe R peut porter un substituant Un exemple d un groupe acyle est le groupe succinyle Utilis ici le terme acide amin hydrophobe indique un r sidu non polaire avec une chaine lat rale hydrocarbon e aliphatique tel que Val Leu ou Ile ou un r sidu non polaire avec un groupe aromatique tel que Phe Tyr Trp ou His Utilis ici le terme acide amin charge n gative indique un r sidu polaire avec une chaine lat rale hydrophile acide telle que Giu ou Asp Utilis ici le terme acide amin charge positive indique un r sidu polaire avec une chaine lat rale hydrophile basique telle que Lys Arg ou His 10 15 20 25 30 35 9 On peut synth tiser les peptides dans lesqueis X n a pas t modifi du point de vue fonctionnel par l antioxydant d sign par tout proc d appropri tel qu un protocole s quentiel en phase solide d crit ci apr s Les groupes Markush pr f r s sont tels que Ri Rz Re et Ro repr sentent chacun un groupe tertio butyle et R3 Ry et Rs repr sente chacun un groupe m thyle On pr f re Da Db et B repr sente de pr f rence C O NH B C O dans iequel B repr sente un aicane en Cg On appelle X un fragment antioxydant car on pense que X est la portion qui conf
44. ino alkylamino et alcoxy et dans lequel lorsque A repr sente une liaison on peut 30 changer A et Ap Ge 2 Polypeptide de formule gs X A Ar Az Ay Y ES ou l un de ses isom res optiquement actifs ou l un de ses sels actifs du point de vue pharmaceutique dans lequel a 4 o One Se d A PLT AA E A EN RE WAA A taar YR o TORR I tn D To T AS A GES tech Ee ESE may f naai A E ETS De Me SEE EE AE A LEA Ee EE g E a ree 10 15 20 25 30 41 A repr sente une liaison ou un acide amin de charge n gative choisi parmi Glu et Asp A2 repr sente un acide amin hydrophobe choisi parmi Trp Tyr Phe His Val Leu ou lie A3 repr sente Aib Glu Gin Leu Ala Orn ou une Liaison et A4 repr sente un acide amin de charge positive choisi parmi Lys Arg ou His Ka pour formule Da ou Db j B ex Ra i SA oy Ri R 5 OH Us Db dans lesquelles Bj repr sente B C O B C O C O NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkyl ne en Ci tie ou un groupe alc nyl ne en C2 16 et dans lesquelles chacun des Ri Ra Ra Ra Rs Re et Ry repr sentent ind pendamment un groupe alkyle en C1 6 Y repr sente un substituant carboxyle de A choisi parmi les groupes hydroxy amino alkylamino et alcoxy 3 Polypeptide de formule X Ar Az Az Ay Y ou l un de ses isom res optiquement actifs ou l un de ses sels actifs du point de vue pharmaceutique dans lequel A1 repr
45. interm diaire de leurs anhydrides sym triques pr form s On a couple le groupe antioxydant par activation de l acide de Vantioxydant pour former l anhydride sym trique On a plac des antioxydants tels que HBB acide 3 5 di tert butyl 4 hydroxybenzoique l extr mit amino terminale du peptide en pr activant l acide Bei i h 19 15 20 25 30 22 HBB pour former anhydride sym trique correspondant G n ralement on a coupl l antioxydant en double ou en triple pour assurer la r action compl te Par exemple HBB n cessite trois couplages pour obtenir une incorporation compitte On a effectu des couplages suppl mentaires en fonction des r sultats de tests la nihydrine On a retir les groupes Na t Boc avec de Pacide trifluorac tique TFA 50 dans du chlorure de m thyl ne et on les a neutra is s par de la diisopropyl thylamine DEA 10 dans du dim thyiformamide On a coup les peptides de la r sine et on les d prot g s dans du HF anhydre contenant 5 d anisol et 5 de sulfure de dim thyle 5 C pendant 45 min On a limin le HE sous vide et on a extrait le peptide de la r sine avec une solution aqueuse d ac tonitrile 50 On a congel les extraits combin s et on les a lyophilis s puis purifi s par CLHP pr parative en phase inverse sur une colonne Rainin Dynamax 21 4 x 250 mm Cie 40 mi min avec un gradient d ac tonitrile dans une solution aqueuse de TFA 0
46. nels pr sents dans le polypeptide et de la capacit du X d riv d un acide amin de supporter la coupure de la r sine par le r actif de coupure Par exemple pour pr parer HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID NO 1 on utilise une r sine pMBHA qui produit un groupe amino C terminal et on construit le peptide en utilisant une chimie du t Boc standard sur un synth tiseur de peptide ABI4304 On peut introduire le fragment HBB sous forme d un e RAP AS Ar ue af Ae AE COG a Er Se Ge Re P Ke EE gt EE Cl De ZE CCGK GN A cue eng TEE TE EEES DEI O BR 10 15 20 25 30 35 14 ester actif d HOBT afin d atracher HBB sur le groupe N a amino du site cible de l acide glutamique On peut utiliser de l acide fluorhydrique HF anhydre pour couper simultan ment le peptide de la r sine et pour retirer les groupes protecteurs restants Le choix de la combinaison appropri e de groupes protecteurs et de r actifs permettant d liminer s lectivement les groupes protecteurs est bien connu dans le domaine Par exemple voir M Bodanszky PEPTIDE CHEMISTRY A PRACTICAL TEXTBOOK Sringer Veriag 1988 J Stewart et al SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS 2nd ed Pierce Chemical Co 1984 On introduit chacun des acides amin s prot g s ou s quences d acides amin s prot g es dans le r acteur en phase solide en un exc s d environ quatre fois et on effectue le couplage en pr sence d un agent de
47. omplexe conforme la revendication 17 pour la pr paration d un m dicament destin au traitement du syndrome de d tresse respiratoire aigu chez un sujet le n cessitant 28 Utilisation d un complexe conforme la revendication 18 pour la pr paration d un m dicament destin au traitement du syndrome de d tresse respiratoire aigu chez un sujet le n cessitant 29 Utilisation conforme la revendication 27 ou la revendication 28 dans laquelle le DPPC constitue le composant principal du lipide Rua 10 15 20 25 30 30 Utilisation conforme la revendication 27 ou la revendication 28 dans laquelle ledit lipide est un m lange de DPPC et de PG 31 Utilisation conforme la revendication 27 ou la revendication 28 dans laquelle iedit lipide est constitu d environ 85 100 de DPPC et d environ 0 15 de PG 32 Utilisation conforme la revendication 27 ou la revendication 28 dans laquelle ledit polypeptide est HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID NO 1 33 Utilisation conforme 4 la revendication 27 ou la revendication 28 dans laquelle ledit polypeptide est HRB Aoc Glu Trp Glu Lys NHz SEC ID NO 2 34 Utilisation conforme a ia revendication 27 ou a la revendication 28 dans laquelle ledit polypeptide est Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NHz2 SEQ ID NO 3 35 Utilisation conforme a la revendication 27 ou a la revendication 28 dans laquelle ledit polypeptide est HBB Glu Trp Aib Lys
48. ons liquides pr f r es contiendront entre 0 8 et 1 0 pour cent en poids de chlorure de sodium et contiendront 1 20 mM d ions calcium On filtre ensuite la pr paration pour la st riliser En g n ral la pr paration comprend 1 100 mg de DPPC par ml et est administr e une dose de 0 2 5 ml kg Pour pr parer un m lange sec on lyophilise la suspension aqueuse On prepare l a rosol partir d une poudre s che finement divis e mise en suspension dans un pulseur tel que des alcanes et des alcanes fluor s inf rieurs tels que le fr on On stocke lP a rosol dans un r cipient pressuris Par exemple on administre le surfactant polypeptide de la pr sente invention et complexe lipidique d une mani re appropri e la forme posologique par sonde endotrach ale par administration par a rosoi ou par n bulisation de la suspension ou du m lange sec dans le gaz inspir On administre le surfactant en une ou plusieurs doses de 10 200 mg kg Le proc d pr f r d administration se fait sous forme d une suspension du lipide et du peptide dans une solution saline physiologique une concentration de 5 10 mg de surfactant par mi l aide d une sonde endotrach ale en administrant une dose de 5 100 mg kg On administre le polypeptide de la pr sente invention pour traiter un sujet Sujet indigue un mammif re par exemple sans s y limiter un tre humain cor he SAR a ire WA Led d DEEN EE LA e RL
49. pides dans un solvant organique ou un m lange de solvants organiques volatiles tel que des m langes de chloroforme et de m thanol ou de trifluoro thanol On limine le solvant organique par vaporation sous azote Ou argon ou sous vide On ajoute une solution aqueuse qui peut contenir des acides des bases et des sels organiques et min raux et des saccharides tels que le dextrose au m lange de lipides sec pour obtenir une concentration finale de 0 1 100 mg de DPPC par mi En g n ral il est pr f rable mais pas indispensable de r chauffer le m lange 3 50 C de Pagiter vigoureusement et de Vincuber jusqu 2 heures 25 50 C Ensuite on ajoute le peptide ou un m lange de peptide sous forine de poudre s che ou en suspension dans une solution aqueuse contenant dans certains cas un solvant organique appropri tel que ethanol ou du trifluoro thanol ou un agent d naturant tel que le chlorhydrate de guanidinium ou Pur e qui am liorent la solubilit du peptide dans la suspension aqueuse On peut favoriser Passociation du peptide et du lipide un pH particulier et le pH de la solution aqueuse peut donc varier entre 2 et 10 Le proc d pr f r de m lange du peptide et du lipide est d ajouter le peptide sec au lipide dans de Peau 45 50 C et de m langer par ultrasonication en bain 45 50 C pendant 30 96 minutes puis de cryodess cher et de stocker 20 C hu dr we E RR TEES RE tegen A SEE
50. quatre r sidus Lorsqu on regarde le corps de l a h lice vers le bas les chaines lat rales des r sidus pr sentent une face hydrophobe et une face hydrophile sur Ph lice Un peptide quatre r sidus correspond une seule r volution de cet a h lice avec les faces hydrophobe et hydrophile requises pr sentes Un peptide trois r sidus correspond une r volution resserr e de l a h lice les faces hydrophobe et hydrophile tant toujours pr sentes LA H La pr sente invention comprend des surfactants pulmonaires synth tiques constitu s d un complexe d un polypeptide et de lipides le polypeptide correspondant la formule 1 suivante X Aj Az A3 Ag Y ou l un de ses isom res optiquement actifs ou l un de ses sels actifs du point de vue pharmaceutique dans lequel Ai repr sente une liaison ou un acide amin de charge n gative choisi parmi Glu et Asp A2 repr sente un acide amin hydrophobe choisi parmi Trp Tyr Phe His Val Leu ou lle A3 repr sente Aib Glu Gin Leu Ala Orn ou une liaison et A4 repr sente un acide amin de charge positive choisi parmi Lys Arg ou His Ka pour formule Da ou Db R3 H3C d ei _ Ra WA By e Be ne NOH gt ou R Ry R gt OH Da Db dans lesquelles B repr sente B C O B C Q C O NH B C O et B repr sente une liaison un groupe alkyl ne en C 1e Zei ve van Lie 2 Fe Te A UE aL PRETE 5 A PA ee A 7 de FRA E Stes roe
51. rations adsninistr es au rat avaient une apparence transiucide La partie correspondant au d gonflement de la courbe pression volume P V dans les poumons de rat adulte t analys e par calcul du pourcentage de la capacit pulmonaire totale CPT une pression de 5 cm H20 PCs et de la CPT 10 cm de H O PC 0 Le r tablissement par rapport aux valeurs PCs a t utilis pour comparer les m langes tester Le DPPC seul n a pas eu d effet significatif sur les courbes pression volume P V du poumon lav Les activit s des m langes peptide DPPC sont indiqu es dans le tableau 2 E aa so 68 1 50 17 1 4541 EE SEQ ID No 1 7323 Lys NH 75 2 Lys NH Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID No 5 HBB Aoc Glu Trp Ala 3 5544 772 Lys NH 213312 5942 4316 34 LISTING DE SEQUENCE 1 INFORMATIONS GENERALES 5 1 DEMANDEURS McLean Larry R Edwards Judson V ii TITRE DE L INVENTION Surfactants pulmonaires peptide synth tique poss dant des antioxydants li s par 10 covalence ili NOMBRE DE SEQUENCES 5 iv ADRESSE DE CORRESPONDANCE A NOM Marion Merrell Dow Inc 8 RUE 2110 East Galbraith Rd C VILLE Cincinnati P O Box 156300 D ETAT Ohio E PAYS USA F CODE POSTAL ZIP 45215 6300 15 20 v FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR A TYPE DE SUPPORT disque souple B ORDINATEUR compatible IBM PC C SYSTEME
52. ristique palmitique et ol ique On peut pr parer des pr parations pharmaceutiques du polypeptide ou des compiexes prot ine phospholipide de cette invention sous forme de m lange sec ou en suspension aqueuse contenant dans certains cas de petites quantit s de solvants organiques tels que par exemple l thanol ou le trifluoro thanol de d tergents par exempie le dod cyisulfate de sodium ou le d soxycholate de sodium de sels tels que le chlorure de calcium ou le chlorure de sodium des glucides tels que le glucose le dextrose ou le mannitol et des acides amin s teis que la glycine et l alanine Lorsque la composition pharmaceutique est pr par e sous forme liquide on peut ajouter au liquide des agents stabilisants des conservateurs des r gulateurs de la pression osmotique des agents tampon et des agents de suspension Si souhait on peut galement ajouter des germicides appropri s Le pH de la suspension aqueuse peut varier entre 2 et 10 et on peut l aiuster avec des acides et des bases tels que par exemple l acide chlorhydrique a Pt Dee CRE ki ais AA ae Zeg KAA de EEE AE ERS SERRE Sele en FEE cr At ee ES SE Ce YA AN 2 Ka nu DH 10 15 20 25 30 35 le phosphate de sodium ou lhydroxyde de sodium On peut reconstituer le m lange sec en solution aqueuse contenant des sels acceptables du point de vue pharmaceutique des solvants organiques et des d tergents On peut dialy
53. s amin s dans la pr sente invention sont les suivants AA tte am Ka GE ver e LE AE sagan a A WA A WA 5 PI N Ss A RS p 5 10 15 20 25 30 10 1 HBB acide 3 5 di t butyl 4 hydroxybenzo que 2 HEP acide 3 3 5 di tert butyl 4 hydroxyph nyt propionique 3 HEC acide 3 5 di tert butyl 4 hydroxycinnamique 4 HBA acide 2 3 5 di t butyl 4 hydroxyph nyl ac tique 53 di HBA acide hydroxyph ny ac tique 6 Tri acide 6 hydroxy 2 5 7 8 t tram thyichroman 2 carboxylique galement appel Trolox On utilise de pr f rence HBB HBP HBC HBA di HBA et Trl lorsque le groupe fonctionnel est un groupe alcool ou un groupe amino Dans l ensemble des surfactants li s on peut choisir un groupement pr f r pour former un groupe que Pon pr f re davantage tel que HBB et Tri Les compos s antioxydant pr c dents sont disponibles dans le commerce ou leur synth se est cormue dans le domaine par exemple Pacide 3 5 di t butyi 4 hydroxyph nylac tique est d crit dans Izv Akad Nauk SSSR Ser Khim 358 1965 et le 3 5 di t butyl d nydroxy benzald hyde est d crit dans J Org Chel 22 1333 1957 G n ralement on peut utiliser tout compos antioxydant dans la pr sente invention si celui ci 1 peut tre attach au polypeptide de la pr sente invention 2 pr sente une activit antioxydante lorsqu il est attach au polypeptide et 3 permet au polypeptide de se comport
54. ser la pr paration aqueuse la filtrer ou la chromatographier pour changer le milieu de suspension avec un milieu acceptable du point de vue pharmaceutique avant utilisation On peut administrer la pr paration sous forme de poudre s che de suspension aqueuse ou d un a rosol directement dans les poumons du sujet souffrant On peut placer la composition pharmaceutique de la pr sente invention dans des r cipients herm tiquement ferm s tels que des flacons et des ampoules et les conserver de fa on st rile On peut stocker la composition dans un flacon ou une ampoule s par ment d un flacon ou d une ampoule contenant le tampon de suspension et on peut m langer la composition s che ou hydrat e avec le tampon de suspension avant utilisation Les lipides constituent entre 50 et 99 9 de la pr paration de surfactant Des lipides appropri s comprennent les DPPC PC CL PG PS AG et TG Le DPPC constitue l esp ce lipidique majeure et est present en concentration comprise entre 60 et 100 du poids total de lipides Les lipides restants sont pr sents en concentrations mineures Les PC CE PG et PS peuvent constituer jusqu 30 des lipides et les AG et TG peuvent constituer jusqu 10 du poids de lipides Les chaines acyliques grasses des composants lipides mineurs peuvent tre satur es ou insatur es et leur longueur est quelconque On pr f re que les cha nes soient longues de 12 16 atomes de carbone et qu il y ait jusqu
55. te 0 5 mg du peptide 1 A la pr paration aqueuse On sonique la pr paration dans un ultrasonicateur en bain 45 C MUA WEZA EUR pp BESET Ya RTE G CO en er ENT 10 15 20 25 30 24 pendant 2 heures On lyophilise le m lange lipide peptide r sultant et on le stocke 4 C pendant une dur e allant jusqu un mois Avant le test on ajoute 9 mi de NaCl 0 9 tampon HEPES 20 mm pH 7 40 On incube la pr paration pendant une heure 45 C avec agitation p riodique EXEMPLE 2 2 A PREPARATION DU POLYPEPTIDE HBB Aoc Giu Trp Glu Lys NH SEQ ID NO 2 HBB Aoc N hydroxy di t butyl benzoyl aminooctanoyl On a pr par Aoc Giu OBzl Trp Glu OBzi Lys N 2CIZ PMBHA en utilisant une r sine Lys N 2CIZ bMBHA plac e dans un synth tiseur de peptide ABI430A et on l a synth tis en utilisant la chimie t Boc standard Pour synth tiser le peptide ZA on a combin lacide N hydroxy di t butyl benzo que HBB 501 mg du dim thylformamide 4 mi et du chiorure de m thyi ne 4 mi et on a ajout une solution de dicycloh xylcarbodiimide 8 mi d une solution 0 5 M dans du chlorure de m thyl ne et on a agit pendant 5 minutes pour obtenir l anhycride sym trique de HBB que l on a ensuite coupl Aoc Glu OBzi Trp Glu OBzl Lys N 2CIZ bMBHA en un exc s de 4 X pour chacun des deux couplages On a coup le peptide prot g HBB Aoc Glu OBzl Trp Glu OBzl Lys N 2CIZ pMBHA de l
56. uter goutte goutte le 1 2 dibromo thane 156 mg 0 839 mmol dans de Pether anhydre 1 5 mi Chauffer au reflux pendant 12 heures placer sous une atmosph re d argan et refroidir 0 5 C Ajouter goutte goutte une solution de chlorure d isobutyryle 0 533 mmol dans de l ther di thylique anhydre 1 5 mi Agiter 0 5 C pendant 5 heures verser dans un m lange de glace et d acide chlorhydrique concentr 0 15 mi et s parer la phase organique Laver avec de l ac tate d thyle une solution aqueuse de carbonate de sodium 5 et de la saumure S cher MgSO et vaporer le solvant sous vide pour obtenir de la 2 2 6 trim thyi 4 heptanone Dissoudre du chlorure de vinylmagn sium 0 7 mmol dans de l ther di thylique anhydre 1 mi piacer sous une atmosph re d argon et refroidir 1 5 C Ajouter goutte goutte une solution de chlorure de butyryle 0 533 mmol dans de P ther di thylique anhydre 1 5 mi Agiter 0 5 C pendant 1 5 heure verser dans un m lange de glace et d acide chlorhydrique concentr 0 15 mi et s parer la phase organique Laver avec de l eau une solution aqueuse de carbonate de sodium 5 et de la saumure S cher MgSO et vaporer le solvant sous vide pour obtenir de la propylvinylc tone Dissoudre de ja 2 2 6 trim thyl 4 heptanone 0 4 mol dans du m thano 10 ml et ajouter du 4 butoxyde de potassium 12 g 0 1 mol Ajouter goutte goutte une solution de propyivinylc tone

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