Home

Validation AFNOR, selon le référentiel EN ISO 16140, du test

1. Concordance ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Echantillons ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM Palcam Palcam R sultat R sultat final Fraser 1 2 48H N Produit colonies colonies colonies colonies colonies Test Confimeation R sultat colonies Test Confimr tion R sutat suspectes suspectes suspectes suspectes suspects Accuprobe Gaa Rapid mono suspectes Accuprobe CA Rapid L mono 422 Epongette bac maturation S z 423 Epongette moulage table 424 Epongette cuve d cong lation 425 Epongette tapis Skater z f S S 493 Salaison Cu cong lation S 494 Sdalaison Table de pes e moulage 495 Salaison Malaxeur s 496 Salaison Trans palette 497 Salaison Coffret namites 498 Salaison Palonnier mamrite s S z 499 Salaison Charot produits frigo z s 500 Salaison Tapis conditionnement 529 P tisserie Tapis p trin 530 P tisserie Tapis z 8
2. ADRIA D veloppement 42 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux PRODUITS LAITIERS Concordance F1 2 48H ISO Palcam PD ND PD ISO Oxford PD PD ND ND R suitat final Fraser 1 2 48H Palcam Rapid mono Li Confinration _ R suitat Ok Pak A A colonies Test suspeces Accuprobe OAA R sutat Rapid MONO Li Confinration colonies Test suspedes Accuprobe OAA M thode ACCUPROBE L monocytogenes Fraser 1 2 24H Palcam R sultat Rapid mono Li Confinration Test suspeces Accuprobe OAA colonies itat Rapid Loo Coriirrration Test suspeces Accuprobe O colonies R sultat Fraser PALCAM ENISO 11290EN ISO 11290 1 Fraser 1 2 OAA PALCAM OAA colonies colonies colonies colonies suspedes suspectes suspectes suspectes Echantillons Produit Fromage au lait au Lat cru Lat cru Lat cru Lat cru Poudre de lait Poudre de lait Poudre de lait Poudre de lait Brie Fromage de ch vre au lait au Ch vre frais Fronage Livarot Radette Reblochon is Lait au Ca Lait ribot Lait cu Lait cu Lait ou Lat ille Mil Lait ou aulat
3. MEGETAUX ET DN ERS Concordance ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Echantillons ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM Palcam Palcam R sultat R sultat final Fraser 1 2 48H N Produit colonies colonies colonies colonies colonies Corfirration R sutat colonies Test Confirrration R sultat Test Accuprobe suspeces suspects suspectes suspectes suspectes OAA Rapid L mono suspects Accuprobe oaa Bail moo 416 Salade Bulgare 417 Salade Bretonne 418 Salade Franc cominise E E 419 Salade Strasbourgeoise gt 420 Persil s 5 Z 426 Salade Marco polo Ka gt S 429 Salade Bulgare gt ke e SS 446 Po l e m ridionale B S S 447 G teau au chocolat A dr 563 Salade de riz ni ois g 569 Riz la proven ale 8 z z 584 Salade Bulgare 661 Poivrons rouges col ES J S 923 Carottes r p es 924 Torrates la Grecque f 925 Mac doine r 5 Se Pain de l gumes
4. 2 ETUDE PRELIMINAIRE 2 1 Exactitude relative sp cificit relative et sensibilit relative 2 1 1 Nombre et nature des chantillons 346 chantillons ont t analys s au total La r partition par cat gorie est donn e dans le tableau ci apr s cata Types Positifs N gatifs Total 3 Jp nombre nombre nombre Produits carn s Viandes crues charcuteries plats traiteurs 34 39 13 Produits laitiers Laits crus fromages poudres de lait 34 34 68 Produits de la mer Poissons et coquillages crus poissons fum s plats traiteurs 38 38 16 V g taux et divers Surgel s 4e gamme salades produits traiteurs 31 34 65 ne de Environnement salaison p tisserie et transformation du 32 32 64 l environnement poisson TOTAL 169 177 346 Tous r sultats confondus m thode de r f rence m thode AccuP robe avec Palcam pour toutes cat gories et m thode AccuP robe avec Oxford pour la cat gorie Produits laitiers ADRIA D veloppement 6 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 Soci t BioMerieux Contamination artificielle des chantillons Des contaminations artificielles ont t r alis es par des inoculations ou des contaminations crois es 74 chantillons ont t contamin s artificiellement dont 56 ont donn un r sultat positif par l une ou lautre des m thodes Les chantillons naturellement contamin s repr sentent donc 66
5. 1522 Eau de process 1533 Paussi res 1524 Eau de process F 7 F 1525 Eau de process ADRIA D veloppement 51 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1
6. l SISINSIS l Cocktail de crevettes 1 H 1 Il Il Riz au thon Saurron fin Cubes de saumon fun 84 I SISIS l I I P t s inmp riaux k Il Il Nens aux crevettes et crabe H 1 Il Il Cocktail de fruits de mer 916 Loup de ner 917 Sauron fin Sauron fin Meru DOUD ft l f ft fe fs f rz Is ls ls Is AZi lzltl Meru 1 1 Il Il Cocktail de la mer 1 1 1 Il Il Filet de poisson au 1 sha SS SSS 1 rn ls lr le ls li lr lr Ur lr lr ls lr lr lr Ir Ir lr ls Ir Ir nn lr lr le lr li lr ls Ur lr lr ls lr lr lr lr lr lr Is Ir 1 Il Il Nuggets de poisson 1 1 H 1 Il Hoki pan 1 PD Il Meran pan 1 t Il Colles St acques ND Filet deJ ulienne Pan de colin OCDE D 44 I 937 Filet de sardine 1 H 1 Il Il 938 Boudin de meru ki Il Il 1080 Salade au surimi 1082 Saunon fum LU Il Il 1097 Saumon fun L Il Il 1105 Filet de lieu jaune 1 SSII EI 1 H 1117 Torti au surimi 1 HINININISISSNISNISNII ND 1125 Coktail de crevettes
7. H 436 Poulet Koma 437 CHERE EN douce Ae Escalope de veau hach A Escalope veau hach aas maoe veau hach 449 Steak H S 564 Brochettes CE port nature 565 Merguez 566 J anton Viande aue 567 Epaule ande aue 585 Steak hach 1 586 Pintade d 657 Chipolatas aux herbes H i 658 Saucisse Godiveau H H 659 Chorizo S 5 H H H 660 Brochette de porc 667 Saucisses E 668 Chipolatas a R s S S H H Hcol PD 669 Chipolatas 670 Chipolatas 671 Chipolatas 672 Escalopes de veau 891 Saucisse s che H H s S 82 Lardors nature 893 Lardons furr s S H x rd S 894 J anton lt o H H H H 895 J anon S H z ADRIA D veloppement 40 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Versio
8. A 841 Ernviromerrent salaison 1399 Chiffonnete atelier p tisserie F F ADRIA D veloppement 50 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux ECHANTILLONS DE L ENMRONNEMNENT Concordance ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Echantillons ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM Palcam Palm R sutat R sultat final Fraser 1 2 48H N Produit colonies colonies colonies colonies colonies Test Corfirrration R sultat colonies Test Confimr tion R sutat suspectes suspectes suspectes suspectes suspectes Accuprobe Gaa RapidL rono suspectes Accuprobe CA Rapid L mono 1400 Chiffonnette atelier p tisserie f 2 1401 Chiffonnete atelier patisserie F F 1402 Chiffonnete atelier patisserie F F 1472 Eau de lavage w s 1473 Eau de lavage 1477 Eau de lavage A 1516 Chiffonnetie vier 1518 Eau de process 1519 Eau de process H 1521 Eau de process
9. 1248 Cocktail de crevettes 1252 Salade Alaska 1256 Saunon l oseille 1257 Surni DEA DEA DEA DEA DEA DEA 4 R RSS RTS RS EEE EIRE EE RTE IS RSR RER ER RS RS EEE IE ER TEE IST DEA 444 SISINIS ll ll litt lit SISINNINS EN ISIN ETES DEA DEA ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 44 27 f vrier 2007 Soci t BioMerieux PRODUITS DE LA MER Echantillons NF ENISO 11290 1 M thocke ACCUPROBE Listeria monocytogenes Concordance ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H Nurr ro Produit OAA PALCAM OAA PALCAM Palcam Palcam colonies suspectes colonies suspects colonies suspects colonies suspectes Colonies suspectes Confimation Rapid L mono R sultat Colonies suspectes Confimation Rapid L mono R sultat R sultat final 1 2 24H 1 2 48H Saurron fur ki 1259 Coktail de qaevettes Roul de surimi 1261 Filet de colin Boudin de meru Brochet farci 444 l l l l 444 AZi lzlt l it Moules 1 ll PD Sauron fun H ET let let ND Coktail de fruits de mer 1 H 1 Salade de ga
10. Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H R sultat final OAA PALCAM OAA PALCAM Oxford Palcam Oxford Palcam IC 15o R sultat ration R sut Confirrreti t Mrt Confirrrati Geen deal rrreti N Produit calonies calories colonies colonies colonies Test Oger Dan onies Test ei colonies Test m calories Test Core Da oral Paicarr Accuprobe Acauprobe suspectes suspectes suspectes suspectes suspeces Accuprobe oaa Rapid suspectes Accuprobe oaa Rapid suspectes Accuprobe oaa Rapid suspeces Accuprobe oaa Rapid Oxford Palcam Loo Loo Loo Loo 421 Fromage a 4 e f PD PD p te cuite 427 Lait cru E H H H H H H H H 428 Laitau 5 H H H H H H H H Fromage 431 Mate D 7 433 Bleu H H F P Aa eege gt e E p te molle 438 Ts iki e S z H H H H 1 H Beure de 439 S H H baratte 440 Bleu a ZC H A 441 Bleu ES H L H H H H A 442 PO 2 d 4 p te molle 448 Bleu 5 H H H H H 1 H EE EE TT
11. chantillon isol Identification partir de bouillon de culture Le test peut tre pratiqu directement partir d un bouillon de culture appropri Selon des tudes r alis es sur diff rents milieux 1 7 seuls certains bouillons peuvent tre utilis s directement Des bouillons non s lectifs comme les bouillons c ur cervelle trypticase soja Listeria Enrichment Broth ou Todd Hewitt donnent de bons r sultats tandis que certains plus s lectifs L PALCAMY UVM Fraser diminuent la sensibilit du test pouvant donner des r sultats ADRIA D veloppement 31 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux faussement n gatifs L incubation doit tre poursuivie pendant 48 heures 30 C L utilisation de bouillons Fraser UVM L PALCAMY impose la r alisation d une subculture sur milieu solide Pr lever 50 ul du bouillon de culture bien homog n is et les mettre dans le tube de R actif Sonde suivant les instructions du paragraphe C du Mode Op ratoire PROTOCOLE VALIDE AFNOR N BIO 12 4 02 95 valide jusqu au 07 02 2011 POUR TOUS PRODUITS ALIMENTAIRES ET ECHANTILLONS D ENVIRONNEMENT JO 1 Homog n iser 25 g d chantillon dans 225 ml de bouillon Fraser dem puis incuber pendant 18 24 heures 30 1 C JO 24h 2 Apr s incubation ensemencer le bouillon d enrichissement l aide d un couvillon par la m thode en strie large sur une g lose Palcam
12. par la technicienne du poste Pes e qui une fois l chantillon stomach sans l intervention d un autre mat riel et pr s du bec Bunsen fait glisser la solution m re vers le pot st rile en inclinant le sac au dessus de l ouverture du pot Le couvercle est ensuite reviss sur le pot qui est incub ADRIA D veloppement 23 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 3 4 3 4 1 Soci t BioMerieux Compte tenu des risques de contamination engendr s par cette technique le laboratoire A n a pas t retenu le laboratoire H a obtenu deux r sultats positifs sur des t moins par la m thode alternative 48 h Ce laboratoire a signal qu il avait coup les sacs au scalpel apr s la premi re incubation ce qui aurait pu entra ner des intercontaminations Les souches isol es pour ces deux chantillons ont t transmises au laboratoire expert et ont t caract ris es par PFGE comme tant la souche inocul e Le laboratoire H n a pas t retenu un laboratoire a eu un sac perc au cours de l incubation chantillon t moin Ce laboratoire a t maintenu L interpr tation a donc t r alis e avec les laboratoires B C D F G J K Let M Calculs Calcul des pourcentages de sp cificit SP et de sensibilit SE pour les deux m thodes Le pourcentage de sp cificit pour le niveau LO et pour chaque m thode est calcul l aide de
13. H y z 914 Saucisse pistach e e f 1079 Chorizo H H 1089 Pintade 1090 Chipolatas 1091 Saucisse godiveau 1092 Collier 1093 Steak hach 1094 J ambon H S 1095 Epade s s a x H El H H 10 Chipolatas z 1098 Merguez H 1099 Lardons furr s 1100 Merguez 1101 Merguez 2 1102 Chipo aux herbes 1108 __ P t canpagre e 1109 Rillettes H 8 H 1110 Chipolatas 1111 Errinc s de poulet 8 1112 Saucisse 1113 Gras de boa f H o H H ADRIA D veloppement 41 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux En gras chantillons artificiellement contamin s n et produit PRODUITS LAITIERS A ENISO 11290EN ISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Lmonocytogenes Echantillons Concordance F1 2 48H
14. PD chantillons 421 968 969 ND chantillons 571 1369 1374 ADRIA D veloppement 8 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 PA Accord positif R A Soci t BioMerieux Tableau 4 Produits de la mer R ponses M thode de r f rence positive R M thode de r f rence n gative R M thode alternative positive Accord positif A AR D viation positive R A A PA 36 PD 2 M thode alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 0 NA 38 PD chantillons 932 1359 Tableau 5 V g taux et divers R ponses M thode de r f rence positive R M thode de r f rence n gative R M thode alternative positive Accord positif A AR D viation positive R A A PA 30 PD 0 M thode alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 1 NA 34 ND chantillons 1377 Tableau 6 Echantillons de l environnement R ponses M thode de r f rence positive R M thode de r f rence n gative R M thode alternative positive A M thode alternative n gative A Accord positif A R PA 30 D viation n gative A R ND 0 D viation positive R A DD 2 Accord n gatif A R NA 32 PD chantillons 533 648 Tableau 7 Calcul de l exactitude relative AC d
15. S 531 P tisserie Tapis S z 532 P tisserie Tapis 533 P tisserie Tapis PD 534 P tisserie Doseur levure 535 P tisserie Caisson dimatiseur z S Z 2 536 P tisserie Tapis Ai 537 P tisserie Tapis 538 P tisserie Tapis 5 539 P tisserie Tapis ligne croissant F F 643 Salaison Chiffonnette table E S z ADRIA D veloppement 49 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux ECHANTILLONS DE L ENMRONNEMNENT Concordance ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Echantillons ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM Palcam Palm R sultat R sultat final Fraser 1 2 48H N Produit colonies colonies colonies colonies colonies Test Corfirrration R sultat colonies Test Confimr tion R sutat suspectes suspectes suspectes suspectes suspects Accuprobe Gaa Rapid L mono suspectes Accuprobe CA Rapid L mono 644 Salaison Pupitre salle pr paration f
16. actif Sonde S1 le test est pratiqu sur des souches isol es partir de bouillon de culture ne pas ajouter de R actif 1 dans les tubes de R actif Sonde 4 Transf rer l chantillon provenant du milieu solide ou 50 ul du bouillon de culture correctement homog n is dans les tubes de R actif Sonde suivant les instructions du chapitre PREPARATION DE L ECHANTILLON Si le test est r alis partir d un milieu solide agiter l oese ou l aiguille dans le R actif 1 pour remettre les microorganismes en suspension 5 Reboucher les tubes de R actif Sonde et les incuber 37 1 C pendant 5 minutes dans un bain marie ou pendant 10 minutes dans un incubateur D HYBRIDATION 1 Retirer les tubes de R actif Sonde du bain marie ou de l incubateur Oter et conserver les bouchons Distribuer 50 ul de R actif 2 Tampon d Hybridation dans chaque tube de R actif Sonde 2 Reboucher les tubes de R actif Sonde et les incuber pendant 15 minutes dans le bain marie ou le bloc chauffant 60 1 C E SELECTION 1 Retirer les tubes de R actif Sonde du bain marie ou de l incubateur Oter et conserver les bouchons Distribuer 300 ul de R actif 3 R actif de S lection dans chaque tube Refermer les tubes et les agiter l aide d un vortex jusqu l obtention d un m lange homog ne 2 Incuber les tubes de R actif Sonde pendant 5 min dans le bain marie ou le bloc chauffant 60 1 C 3 Retirer
17. f 39300 Gen Probe Cat No 1791 MODE OPERATOIRE A PREPARATION DU MATERIEL 1 R gler l incubateur ou le bain marie 37 1 C 2 R gler le bain marie ou le bloc chauffant 60 1 C 3 Pr parer le luminom tre GEN PROBE S assurer que la quantit de R actifs de D tection I et IT est suffisante pour pratiquer les tests B CONTROLES Des souches de contr le positif et n gatif doivent tre test es en routine dans chaque laboratoire selon la r glementation en vigueur Une culture de L monocytogenes American Type Culture Collection ATCC 35152 peut tre utilis e comme contr le positif et une culture de Listeria grayi ATCC 19120 peut tre utilis e comme contr le n gatif C PREPARATION DES ECHANTILLONS POUR HYBRIDATION 1 D couper horizontalement la partie sup rieure des sachets en aluminium Retirer le nombre n cessaire de tubes de R actif Sonde pour tester les chantillons et ou les souches de contr le Refermer le sachet herm tiquement en rabattant plusieurs fois ADRIA D veloppement 33 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux son extr mit et en la fixant par un ruban adh sif ou une pince Ne pas retirer le sachet dessiccant Identifier un nombre suffisant de tubes de R actif Sonde pour tester les chantillons et les souches de contr le Oter et conserver les bouchons 3 Distribuer 50 ul du R actif 1 R actif de Lyse dans chaque tube de R
18. monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux y Justesse Etude de 1994 1996 comparaison des performances de la m thode alternative par rapport la m thode NF V 08 055 En 1994 et 1996 des essais ont t effectu s sur 272 chantillons produits divers dont 92 naturellement contamin s Tous les chantillons ont t analys s en double par la m thode alternative et en double par la m thode AFNOR V 08 055 Les r sultats sont les suivants Concordants 256 Faux n gatifs ou d viations n gatives de la m thode alternative 4 Positifs suppl mentaires ou d viations positives de la m thode alternative 12 faux n gatifs de la m thode de r f rence Conclusion La concordance entre les 2 m thodes est satisfaisante Etude de 2003 extension de la m thode la confirmation des r sultats positifs par isolement sur une g lose chromog ne Les 4 milieux suivants ont t test s ALOA RAPID L Mono Chromagar Listeria et Compass L mono Agar Des essais ont t effectu s en 2003 sur 80 chantillons produits carn s produits laitiers produits de la p che produits v g taux et divers dont 40 chantillons naturellement contamin s et 40 chantillons artificiellement contamin s Les chantillons positifs du test AccuProbe ont t confirm s par isolement partir de la g lose Palcam ou Oxford sur 4 g loses chromog nes ALOA RAPID L mono Chromagar Listeria et Compas
19. une des trois options suivantes l 2 par la mise en uvre des tests classiques d crits dans les m thodes normalis es par le CEN l ISO ou l AFNOR en incluant l tape de purification par l utilisation d un milieu chromog ne utilis dans une m thode ayant fait l objet d une validation AFNOR A l aide d une oese de lul pr lever au point d inoculation sur la boite PALCAM ayant donn un r sultat Accuprobe positif et proc der un isolement sur milieu chromog ne Incuber les boites dans les conditions de dur e et de temp rature indiqu es dans les notices des fabricants La pr sence de colonies caract ristiques isol es confirme le r sultat positif du test Accuprobe Les milieux chromog nes suivants ont t test s dans le cadre de la validation AFNOR de 2003 Compass L Mono Agar Chromagar Listeria ALOA et Rapid L Mono par l utilisation de toute autre m thode valid e AFNOR de principe diff rents de celui de la m thode Accuprobe Le protocole valid de la seconde m thode devra tre respect dans son ensemble En cas de r sultats discordants positif par la m thode alternative non confirm par les tests d crits dans les m thodes normalis es par le CEN l ISO ou l AFNOR ou apr s isolement sur ADRIA D veloppement 32 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux milieu chromog ne ou par une autre m thode valid e AFNOR le laboratoire devra mett
20. z 645 Salaison Conmande mamite ES F 646 Salaison Tirete porte z 5 647 salaison Poign e porte 648 Salaison Mortant porte PD 649 Salaison Porte et poign e 650 Salaison Tapis conditionnement z gt 651 Salaison Table color 652 Salaison Cartonneuse S 653 Charcuterie poisson Cutter Ai 654 Charcuterie poisson Poussoir E 655 Charcuterie poisson Bennesr d 5 656 Charcuterie poisson Cloche tranchage gt s 814 Ermvironnenernt salaison s e 815 Environnenert salaison E A 816 Environnenert salaison 817 Environnenert salaison 818 Environnenert salaison 819 Ernviromerrent salaison z 820 Ermvironnenent salaison S z 821 Environnenert salaison 838 Environnenert salaison ES f F 839 Environnenert salaison ES F 340 Environnenert salaison ES
21. 7 99 8 La seule souche AccuProbe positive Culture n gative du site 2 a t re test e avec le test AccuProbe LISTERIA MONOCYTOGENES et a donn un r sultat n gatif PERFORMANCE DU TEST A PR CISION INTRA ESSAI La pr cision intra essai du TEST AccuProbe Listeria monocytogenes a t calcul e en testant trois concentrations diff rentes d ARN ribosomal de L monocytogenes Chaque chantillon a t test 10 fois dans une m me s rie Echantillon A B C Nombre d essais 10 10 10 R ponse moyenne RLU 132 370 72 720 41 074 Ecart type 9 981 3 126 3 837 Coefficient de variation 7 5 4 3 9 3 B PR CISION INTER ESSAI La pr cision inter essai a t calcul e en analysant en simple les m mes trois concentrations d ARN ribosomal de L monocytogenes au cours de 12 s ries distinctes Echantillon A B C Nombre d essais 12 12 12 R ponse moyenne RLU 146 469 77 240 41 074 Ecart type 19 793 8 634 4 343 Coefficient de variation 13 5 11 2 10 8 C SPECIFICITE Un total de 97 souches ATCC a t test avec le TEST D IDENTIFICATION AccuProbe Listeria monocytogenes Ces souches repr sentaient au total 87 esp ces issues de 53 genres diff rents Un panel de 15 souches de 7 esp ces de Listeria a t test L grayi L innocua L ivanovii L monocytogenes L murrayi L seeligeri L welshimeri Seules les souches de L monocytogenes ont donn des r sultats positifs avec le TEST D IDENTIFICATION AccuProbe L
22. 9 des chantillons positifs Protocoles de confirmation Lorsqu un test AccuProbe positif est obtenu des colonies issues de g lose Oxford ou Palcam sont isol es sur deux g loses chromog nes OAA et RAPID L mono R sultats des essais Les r sultats bruts sont donn s en annexe 5 A positifs confirm s A n gatifs imm diats et n gatifs apr s confirmation quand pr somptifs positifs Tableau 1 Couples de r sultats des m thodes de r f rence et alternative v R sultats obtenus partir de la g lose Palcam M thode de r f rence M thode de r f rence R ponses positive R n gative R M thode alternative positive Accord positif A R D viation positive R A A PA 157 PD 8 M thode alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 3 NA 178 dont 3 Positifs AccuProbe non confirm s un second test AccuProbe r alis sur les colonies a donn un r sultat n gatif Echantillons 570 661 663 ADRIA D veloppement 7 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux v R sultats obtenus avec la g lose Oxford pour les produits laitiers et avec la g lose Palcam pour les autres produits Rae M thode de r f rence M thode de r f rence P positive R n gative R M thode alternative positive Accord positif A AR D viation positive R A A PA 156 PD 8 M tho
23. Sonde en suivant les instructions du paragraphe MODE OPERATOIRE CONTROLE MICROBIOLOGIQUE Le protocole d crit au paragraphe C de ce chapitre est valid par L AFNOR Association Fran aise de Normalisation A Identification ou d tection partir de culture sur milieu solide Le test peut tre pratiqu sur des colonies isol es sur un milieu solide appropri g lose 5 de sang de mouton g loses PALCAM Oxford ou McBride La culture doit avoir moins de 72 heures et peut tre test e d s que les colonies sont visibles 1 L chantillon peut tre pr lev l aide d une oese en plastique jetable de 1 ul d une oese m tallique d une aiguille en plastique jetable d une pipette Pasteur boutonn e ou d un b tonnet applicateur Ne pas utiliser d couvillon en raison du faible volume de liquide dans lequel les bact ries vont tre remises en suspension 2 Il est possible de tester soit plusieurs petites colonies 3 ou 4 soit une seule colonie d un diam tre d au moins 1 mm 1 colonie contient de 1011 1012 bact ries soit de pr lever au point d inoculation oese de 1 ul 3 Eviter de pr lever du milieu de culture avec les bact ries 4 Pr lever selon la richesse de la culture soit l ensemble des colonies pr sentes soit celles pr sentes dans la zone d inoculation 5 L op rateur peut d cider d ensemencer une autre bo te de P tri pour confirmer la puret de l
24. a a 5 S 227 Pommes de tre gt Poireaux San Hricots verts z z 20 Epinards hach s S S 1078 Roui s v g tariens E 1081 Oignors pr frits ADRIA D veloppement 46 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux MEGETAUX ET DN ERS Concordance ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Echantillons ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM Palcam Palcam R sultat R sultat final Fraser 1 2 48H N Produit colonies colonies colonies colonies colonies Corfirration R sutat colonies Test Corfirration R sultat Test Accuprobe suspeces suspects suspectes suspectes suspects OAA RapidL mono suspects Accuprobe oaa Bail moo 1103 Poivrons rouges D 1104 Echalotes e S 2 1106 Ail pupe z z E a S H 1107 Echalotes S a 1114 Tabou H lt Z 1115 Salade bretonne 1116 Salade gauloise DN 1118
25. avant ensemencement taux obtenus apr s contamination artificielle et stabilit des chantillons Avant ensemencement La recherche de Listeria monocytogenes a t effectu e sur six pr l vements de 25 ml de lait par la m thode ISO 11290 1 A1 2004 avant ensemencement Toutes les analyses se sont r v l es n gatives 3 1 2 2 Taux de contamination obtenus Les taux de contamination obtenus dans la matrice et les estimations de pr cision sont donn s dans le tableau suivant Taux Estimation de Estimation de th orique EE la limite inf rieure de la la limite sup rieure de la Niveau Echantillons q b 25 ml SE P SH cibl d chantilon contamination contamination b 25 ml par 25 ml d chantillon par 25 ml d chantillon 2 3 5 7 9 15 Niveau 0 18 23 0 0 I I 4 8 11 13 17 Niveau bas 20 21 24 5 7 6 8 1 6 12 14 16 Niveau haut 19 22 25 28 25 33 ADRIA D veloppement 21 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux 3 1 2 3 Stabilit des chantillons Le d nombrement a t r alis sur 5 ml de lait Les r sultats sont report s dans le tableau suivant Jour M thode de r f rence M thode alternative UFC 25 ml XLD J0 Pr sence Pr sence 35 35 Il Pr sence Pr sence 25 30 Aucune volution n est noter 3 2 2 Temp rature relev e au cours du transport temp rature r ception et
26. culture g los appropri et le mettre incuber V rifier l aspect des colonies R SULTATS A INTERPR TATION DES R SULTATS Les r sultats du TEST AccuProbe Listeria monocytogenes sont interpr t s en fonction d une valeur seuil Les chantillons produisant un signal lumineux de valeur sup rieure ou gale ce seuil sont consid r s comme positifs Les signaux lumineux inf rieurs ce seuil sont consid r s comme n gatifs Lorsque le r sultat est situ dans la zone d incertitude le test doit tre r p t Si la seconde analyse donne toujours des r sultats quivoques il faut repiquer la souche afin de v rifier sa puret AccuLDR LEADER anciennement PAL Valeur seuil 1 500 PLU 50 000 RLU Zone d incertitude 1 200 1 499 PLU 40 000 49 999 RLU B CONTR LE DE QUALIT ET ACCEPTABILIT DES RESULTATS Les contr les n gatifs par ex Listeria grayi ATCC 19120 et positifs par ex Listeria monocytogenes ATCC 35152 doivent satisfaire aux valeurs suivantes AccuLDR LEADER anciennement PAL Contr le n gatif lt 600 PLU lt 20 000 RLU Contr le positif gt 1 500 PLU gt 50 000 RLU S1 les contr les se trouvent en dehors de ces zones les r sultats du test ne doivent pas tre pris en consid ration LIMITES DU TEST Cette m thode a t test e sur des cultures fra ches r alis es sur les milieux solides et sur les types de bouillons de culture cit s dans le paragraphe PR PARATION DE L CHAN
27. h molyse sur g lose au sang et fermentation des sucres 8 Le TEST AccuProbe Listeria monocytogenes permet la mise en vidence de Listeria monocytogenes en 35 minutes apr s pr paration de l chantillon PRINCIPE Les tests par hybridation d acides nucl iques sont bas s sur la capacit de brins compl mentaires d acides nucl iques s apparier de mani re sp cifique pour former des complexes bicat naires stables 6 La m thode AccuProbe utilise une sonde ADN monocat naire conjugu e un marqueur chimiluminescent compl mentaire de l ARN ribosomal ARNr de l organisme cible Lorsque l ARNr de l organisme cible est lib r la sonde s hybride avec celui ci pour former un complexe ADN ARN stable Le R actif de S lection permet de diff rencier les sondes hybrid es des sondes non hybrid es Le luminom tre GEN PROBE permet de mesurer le signal lumineux mis par les hybrides ADN ARN Le r sultat est positif si le luminom tre indique une valeur sup rieure ou gale la valeur seuil le r sultat est n gatif s il indique une valeur inf rieure R ACTIFS Les r actifs utilis s pour le TEST AccuProbe Listeria monocytogenes sont fournis dans trois coffrets distincts COFFRET ACCUPROBE LISTERIA MONOCYTOGENES bioM rieux ref 39500 Gen Probe Cat No 2920 R actif Sonde P 4 x 5 tubes Listeria monocytogenes ADRIA D veloppement 29 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Ve
28. obtenus varient entre 39 000 et 560 000 UFC ml R sultats obtenus par le laboratoire expert Tous les chantillons inocul s ont t trouv s positifs par les deux m thodes La concordance entre les deux m thodes est de 100 R sultats obtenus par les laboratoires collaborateurs Sur les 13 laboratoires ayant particip l tude un laboratoire n a pas respect le protocole il s agit du laboratoire E qui na pas r alis les analyses par la m thode alternative apr s 48 h d incubation du Fraser 1 2 Les r sultats de ce laboratoire n ont donc pas t pris en compte deux laboratoires ont obtenu des r sultats positifs par la m thode alternative apr s 48 h d enrichissement du Fraser 1 2 pour des chantillons non inocul s le laboratoire A 5 chantillons non inocul s ont t trouv s positifs par la m thode alternative Il a t demand ce laboratoire le lundi 27 novembre 2006 d exp dier au laboratoire expert les souches isol es afin de v rifier qu il s agissait bien de la souche inocul e Les bo tes ont t jet es le 29 novembre 2006 sans avoir t exp di es le laboratoire expert n a donc pas pu proc der la v rification Il a alors t demand ce laboratoire de donner des pr cisions sur son protocole pour expliquer les intercontami nations la r ponse du laboratoire est la suivante Les pr parations sont r alis es sous hotte Un transfert sac pot est r alis
29. 00 L1 DA 100 DA 100 L2 DA 100 DA 100 3 5 3 Concordance Les pourcentages de concordance pour la m thode de r f rence et la m thode alternative chaque niveau sont repris dans le tableau ci apr s Niveau M thode de r f rence M thode alternative LO Concordance 98 8 Concordance 98 8 L1 Concordance 100 Concordance 100 L2 Concordance 100 Concordance 100 Le pourcentage de concordance est li au fait que le laboratoire D a analys uniquement sept chantillons pour ce niveau ADRIA D veloppement 26 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux 3 5 4 Odds Ratio COR ll est calcul selon la formule suivante _ degr d accord x 100 concordance COR A concordance x 100 degr d accord Les Odds ratio pour la m thode de r f rence et la m thode alternative sont ci apr s Niveau M thode de r f rence M thode alternative LO COR 1 01 COR 1 01 L1 COR 1 00 COR 1 00 L2 COR 1 00 COR 1 00 4 CONCLUSION Les conclusions de l tude pr liminaire sont les suivantes v Exactitude sp cificit et sensibilit relative la m thode AccuProbe montre des r sultats comparables voire sup rieurs ceux de la m thode de r f rence v Niveau de d tection relatif les niveaux de d tection relatifs de la m thode AccuProbe sont identiques ceux de la m thode de r f rence y Inclusivi
30. 01 0 280 5 162 Eau de process Listeria monocytogenes 877 113 0 457 0 178 1 169 0 457 0 178 1 169 Tableau 9 Valeurs des niveaux de d tection relatifs Niveau de d tection relatif UFC 25 g ou 25 ml selon le test de Spearman K rber Couples souche matrice M thode de r f rence M thode alternative Rillettes Listeria monocytogenes 1 2 V2 124 0 5 0 3 0 7 0 5 0 3 0 7 Saumon fum Listeria monocytogenes 1 2a BR32 0 2 0 1 0 5 0 2 0 1 0 5 J ardini re de l gumes Listeria monocytogenes 1 2 10 11 1410 0 3 0 1 0 6 0 3 0 1 0 6 Lait cru Listeria monocytogenes 4b 153 1 2 0 3 5 2 1 2 0 3 5 2 Eau de process Listeria monocytogenes 877 113 0 5 0 2 1 2 0 5 0 2 1 2 Le niveau de d tection relatif est compris entre 0 3 et 5 2 pour la m thode de r f rence et la m thode alternative Le niveau de d tection de la m thode alternative est identique celui de la m thode de r f rence 2 3 Inclusivit exclusivit L objectif de l tude d inclusivit exclusivit est de v rifier que toutes les souches Listeria monocytogenes sont d tect es par la m thode AccuProbe Listeria monocytogenes et qu il ny a pas de r action crois e avec des souches autres que Listeria monocytogenes 1 Hitchins A Proposed Use of a 50 Limit of Detection Value in Defining Uncertainty Limits in the Validation of Presence Absence Microbial Detection
31. 1 100 0 36 95 0 96 8 34 100 0 100 0 34 94 1 97 5 186 95 7 OTAL 2 1 5 Calcul de l exactitude relative AC de la sensibilit relative SE et de la sp cificit relative SP Les valeurs en pourcentage calcul es pour la m thode alternative sont les suivantes Utilisation du milieu Palcam pour toutes les matrices Utilisation du milieu Oxford pour les produits laitiers et du milieu Palcam pour les autres matrices Exactitude relative AC 96 8 AC 96 5 Sp cificit relative SP 95 7 SP 95 7 Sensibilit relative SE 98 1 SE 97 5 Utilisation du milieu Palcam Utilisation pour toutes les matrices du milieu Oxford pour les produits laitiers et du milieu Palcam pour les autres matrices M thode alternative PA PD PA PD ND 98 2 97 6 M thode de r f rence PA ND PA PD ND 95 2 95 2 10 27 f vrier 2007 ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 2 1 6 Soci t BioMerieux Analyse des discordants Les 12 chantillons discordants sont r partis comme suit 4 DEVIATIONS NEGATIVES Produits laitiers 3 Echantillon n 571 Fromage non affin D viation n gative pour le milieu Oxford uniquement dans la m thode Accuprobe Des colonies suspectes ont t observ es la fois sur g loses Oxford et Palcam pour la m thode AccuProbe mais seul le test AccuP robe r alis sur g lose Pa
32. ETUDE PRELIMINAIRE 2 1 Exactitude relative sp cificit relative et sensibilit relative 2 2 Niveau de d tection relatif 2 3 Inclusivit exclusivit 2 4 Praticabilit 3 ETUDE INTERLABORATOIRES 3 1 Organisation de l tude 3 2 Contr le des param tres exp rimentaux 3 3 R sultats des analyses 3 4 Calculs 3 5 Interpr tation 4 CONCLUSION CT Annexe 1 M thode AccuProbe Listeria monocytogenes Ref 39500 CT Annexe 2 M thode de r f rence EN ISO 11290 1 A1 m thode de recherche de Listeria monocytogenes O Annexe 3 Exactitude relative r sultats bruts ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 BB OO OO OO N N N 14 15 17 19 19 21 23 24 26 27 28 39 40 27 f vrier 2007 Soci t BioMerieux Avant Propos L accr ditation du COFRAC atteste de la comp tence des laboratoires pour les seuls essais couverts par l accr ditation qui sont identifi s par le symbole L ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des analyses est tenu la disposition de la Soci t BioMerieux Les r sultats sont synth tis s au sein de tableaux et interpr t s selon la norme EN ISO 16140 o Fabricant Soci t BIOMERIEUX Chemin de l Orme 69280 MARCY L ETOILE o Laboratoire expert ADRIA D veloppement ZA Creac h Gwen 29196 QUIMPER Cedex o M thode valider Test AccuProbe Listeria monocytogenes o R f rentiel de valid
33. IA MONOCYTOGENES ISOL E PAR CULTURE bioM rieux r f 39500 Gen Probe Cat No 2920 UTILISATION Le TEST AccuProbe Listeria monocytogenes est un test rapide d identification de Listeria monocytogenes par sonde ADN partir de culture ou de pr enrichissement Ce test utilise la technique d hybridation des acides nucl iques Un protocole de d tection est galement propos et a t valid par l AFNOR sous la r f rence N BIO 12 4 02 95 voir paragraphe CONTROLE MICROBIOLOGIQUE paragraph C INTRODUCTION Listeria monocytogenes est un microorganisme d origine tellurique qui a t dispers dans l environnement On le trouve dans l eau les produits agricoles et chez les animaux Microorganisme pathog ne de l homme connu depuis plus de 50 ans L monocytogenes est l agent tiologique de la list riose laquelle provoque m ningites enc phalites septic mies endocardites avortements abc s et l sions locales purulentes chez l homme 2 4 Au cours de la derni re d cennie plusieurs pid mies de list riose ont t rattach es la consommation de nourriture contamin e Les femmes enceintes les nouveau n s les patients immuno d ficients et les personnes g es sont les plus expos s au risque de contracter une list riose S En routine l identification de L monocytogenes repose sur des m thodes physiologiques et biochimiques morphologie coloration de Gram catalase mobilit b ta
34. ISTERIA MONOCYTOGENES D TEST DE SURCHARGE 5 s ries de dilutions de L monocytogenes de 0 30 millions de microorganismes ont t test es en pr sence de 30 millions de microorganismes d esp ces autres que L ADRIA D veloppement 36 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux monocytogenes L grayi L ivanov Erysipelothrix rhusiopathiae Brochothryx thermophacta Aucune interf rence ni r action crois e n a t observ e E PERFORMANCES SPECIFIQUES Lors de la validation AFNOR l tude pr liminaire a abouti aux r sultats suivants Inclusivit exclusivit 50 souches de Listeria monocytogenes ont t d tect es sur 50 test es L tude de 18 souches de Listeria non monocytogenes et 12 souches n appartenant pas au genre Listeria n a pas mis en vidence de r actions crois es Niveau de d tection relatif la limite de d tection 50 est identique pour la m thode Accuprobe et la m thode EN ISO 11290 1 et est comprise entre 0 3 et 5 2 UFC 25 g Etude comparative sur 346 chantillons test s simultan ment avec la m thode Accuprobe g lose Palcam et la m thode de EN ISO 11290 1 les r sultats suivants ont t obtenus Faux n gatifs Accuprobe 3 Positifs suppl mentaires Accuprobe 8 R sultats concordants 335 Le param tre AccuProbe Listeria monocytogenes est valid par AFAQ AFNOR Certification en tant que m thode alternat
35. Methods Draft 10th December 2003 ADRIA D veloppement 15 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux 2 3 1 Protocoles d essai v Protocole pour l inclusivit Cinquante souches de Listeria monocytogenes ont t d congel es et mises en culture en bouillon BHI 37 C Les souches ont t inocul es un taux compris entre 10 et 100 cellules pour 225 ml en bouillon Fraser 1 2 Le protocole complet de la m thode AccuProbe a ensuite t appliqu v Protocole pour l exclusivit Trente souches n gatives ont t d congel es et mises en culture en bouillon BHI 37 C Les souches ont ensuite t inocul es un taux de 10 225 ml en bouillon nutritif Le protocole complet de la m thode alternative a ensuite t appliqu 2 3 2 R sultats y Inclusivit Toutes les souches de Listeria monocytogenes test es ont donn un Test AccuProbe positif et des colonies caract ristiques en protocole de confirmation g loses OAA et RAPID L mono v Exclusivit Sur les trente souches n gatives test es aucune souche n a donn un test AccuProbe positif ADRIA D veloppement 16 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 2 4 Praticabilit v Temps r el de manipulation Soci t BioMerieux Oxford F1 2 24 h Lecture des g loses OAA et Palcam Etapes M thode ISO 112901 A1 M thode AccuP robe 6 chantillons 12 chant
36. Salade Marco Polo KR H 1119 Salade serpentine D 1120 Piemontaise au janbon S S H 1121 Salade Alaska Ai 1122 Salade Alaska Dr 1123 Errinc de chou blanc 1124 Duo de l gurres g e 1246 Salade bulgare 1247 Salade de choux rouge dp 1249 Eminc s de chou blanc 1250 Duo de l gurres 1251 Salade ni oise Do 1253 Mac doine de l gurres 1254 Salade de fruits de rer D 1255 Carottes r p es 1264 Courgettes rondelles 1265 J Uienne de l gun s 1266 Haricots verts e 1267 L gurres verts T ADRIA D veloppement 47 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux MEGETAUX ET DIVERS Concordance ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Echantillons ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H F
37. T TT TT EE EENE EE F 571 Ms We S a ND affin au lait au 572 Fones Ve ri H D ES affin au lait au Fromage SA she s S S j F Ser S s E S E S affin au lait au 575 Fons 2 H H affin au lait cru 57e T a S z s z S S z affin au lait au 577 Tore aulaitau Fi H D 578 Tone aulaitau a H 8 S L 5 H S H a 579 _Lait de brebis Fi 1 7 D 580 FEU oa 2 Sp A lait RAEMA SS SS 581 FORGES d 2 lait RAEMA z z 582 Boren lait RAEMA SS 583 FER f D lait RAEMA F e US z E S E g z S S au lait cu F Ss Deg g R 3 EES S 4 S i S i 4 S T au lait au Fi ca ete E e a a au lait au Fromage 665 au lait au D H Fi r
38. TILLON Les performances de ce test n ont pas t valu es quand il est r alis directement sur des chantillons cliniques liquide c phalo rachidien ou sang par exemple Les r sultats du TEST D IDENTIFICATION AccuProbe LISTERIA MONOCYTOGENES doivent tre interpr t s en fonction des autres donn es du laboratoire et corr l s avec les donn es cliniques ADRIA D veloppement 35 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux VALEURS ATTENDUES Le TEST AccuProbe Listeria monocytogenes a t compar des m thodes traditionnelles d identification biochimique de culture sur 175 souches de L monocytogenes et 102 autres souches appartenant 21 genres diff rents Une seconde valuation a port sur 296 souches isol es partir de nourriture suspect e d tre contamin e Les chantillons ont t d clar s soit positifs gt 50 000 RLU soit n gatifs lt 40 000 RLU Les r sultats observ s allaient de 520 27 990 RLU pour les cultures n gatives et de 77 088 1 283 789 RLU pour les cultures positives La comparaison de ces r sultats avec les m thodes d identification traditionnelles figure dans les tableaux ci dessous AccuProbe IDENTIFICATION DE CULTURE AccuProbe Pos Pos N g N g Sensibilit Taux de Culture Pos N g Pos N g Sp cificit Concordance Site 1 175 0 0 102 100 100 100 Site 2 81 1 0 214 100 99 5 99 7 Total 256 1 0 316 100 99
39. anca deroeneg CHa CoN SEGU AS Ou tat Sur la gosa Pr s ercg da CONCMES IC ANSE AS O ro Sura O OSa TEST ACCUPROBE hole m nt ur ung gsloss chromoge ne ENEE V TEST POSITIF p l de oengog d A nt 1 Prelswr avec 1 i de 14 12 Dani 1 ube Acuprobs 5 Lecture rur Luminom t coloniss liol s ou culture au Aputers pl Reactif Ri point d Inocuaton In ub ers min a 37 Zu R actif R2 Neuber 15 min a 60 C a mu Reacit F3 Vorte Im Uber 5 min a 60 C ADRIA D veloppement 38 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux Annexe 2 M thode de r f rence EN ISO 11290 1 A1 m thode de recherche de Listeria monocytogenes Prise d essai x g ou ml de produit Dilution au 1 10 en bouillon d enrichissement primaire Fraser 72 y Incubation 30 C 1 C pendant 24h 2h 0 1 ml de l enrichissement primaire dans 10 ml de bouillon d enrichissement secondaire Fraser Isolement sur Palcam et OAA Incubation 37 C 1 C pendant 48 2h Isolement sur Palcam Incubation 37 C 1 C pendant 24h 2h et OAA ae Pr sence de colonies caract ristiques Oui Non Test de confirmation Incubation 18 24h suppl mentaires 37 C 1 C Pr sence de colonies caract ristiques L monocytogenes Autre que Oui Non L monocytogenes y Test de confirmation Pr sence de Absence de L monocytogenes Autre que Absence de L monocytogen
40. ation Norme EN ISO 16140 octobre 2003 protocole pour la validation des m thodes alternatives o M thode de r f rence Norme EN ISO 11290 1 A1 2004 M thode horizontale pour la recherche et le d nombrement de Listeria monocytogenes Partie 1 m thode de recherche o Etendue de la validation Produits d alimentation humaine Extension aux chantillons d environnement EN ISO 11290 1 A1 2004 essai effectu sous le couvert de l accr ditation par le laboratoire expert ADRIA D veloppement 1 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 1 1 1 2 1 2 1 1 2 2 Soci t BioMerieux INTRODUCTION R f rentiel de validation Le r f rentiel de validation utilis est la norme EN ISO 16140 octobre 2003 protocole pour la validation des m thodes alternatives Protocole et principe de la m thode alternative Le protocole et la notice technique sont donn s en annexe 1 Protocole d utilisation Le protocole valid est le suivant enrichissement en Fraser 1 2 pendant 24 h et 48 h 30 C couvillonnage sur Oxford ou Palcam pour les produits laitiers et sur Palcam pour les autres cat gories avec une incubation de 18 24h 37 C test AccuProbe Listeria monocytogenes confirmation par isolement sur milieux chromog nes Les milieux suivants ont t test s durant les validation de 2003 et de 2007 OAA RAPID L mono ALOA CHROMagar Listeria et Compass L mon
41. cofrac Ze S e j DEVELOPPEMENT ESSAIS ACCREDITATION n 1 0144 PORTEE COMMUNIQUEE SUR DEMANDE SOCIETE BIOMERIEUX Chemin de l Orme 69280 MARCY L ETOILE Validation AFNOR des m thodes alternatives d analyse Application la microbiologie alimentaire Rapport de synth se Etudes pr liminaire et collaborative conduites selon la norme EN ISO 16140 Validation AFNOR selon le r f rentiel EN ISO 16140 du test AccuProbe Listeria monocytogenes r f 39500 pour la recherche de Listeria monocytogenes dans les aliments R f rence du protocole BIO 12 4 02 95 M thodes qualitatives Ce rapport comprend 53 pages dont 3 annexes La reproduction de ce rapport n est autoris e que sous sa forme int grale SYNTHESE AccuProbe L monocytogenes Version 1 27 f vrier 2007 ADRIA DEVELOPPEMENT Creac h Gwen F 29196 QUIMPER Cedex T l 33 02 98 10 18 18 Fax 33 02 98 10 18 08 E mail adria developpement adria tm fr Site web http www adria tm fr Site r serv adh rents http www clubiaa net ASSOCIATION LOI DE 1901 N SIRET 306 964 271 00036 N EXISTENCE 532900006329 N TVA FR4530696427100036 Soci t BioMerieux Sommaire 1 INTRODUCTION 1 1 R f rentiel de validation 1 2 Protocole et principe de la m thode alternative 1 3 Domaine d application demand 1 4 M thode de r f rence 1 5 Historique de la validation 1 6 Principaux r sultats obtenus lors de la validation initiale 2
42. cru aulatcru aulatcru Fromage au lait au N 967 968 969 970 971 974 1126 Lait de brebis 1127 Flan noix de coco 1128 1129 1130 Leerdarrer 1131 1132 1133 1154 Lait femrent 1135 1136 1372 Glace vanille 1374 198 Bleu au laitcru 27 f vrier 2007 43 ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 En gras chantillons artificiellement contamin s n et produit Soci t BioMerieux PRODUITS DE LA MER Echantillons NF ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes Concordance ISO Accuprobe Fraser 1 2 Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H Nurr ro Produit PALCAM PALCAM Palcam Palcam R sultat colonies suspectes colonies suspects colonies suspectes colonies suspectes R sultat Colonies suspeces i Confimation Rapid L mono R sultat Colonies suspeces Confimation Rapid L mono R sultat final 1 2 24H 1 2 48H Pa lla l 410 Saurron fun 1 1 Il Il 411 Cocktail de fruits de mer 1 H k Il Il 412 Cocktail de fruits de mer 413 Moules surgel es 414 Moules surgel es Gr au saunon l
43. d lais de r ception Les temp ratures au cours du transport et mesur es r ception ainsi que le d lai de r ception des chantillons sont donn es ci apr s Temp rature des chantillons r ception Laboratoires Temp rature relev e par Temp rature mesur e D lai de r ception le thermobouton C r ception C des chantillons A 0 00 4 7 B 0 50 2 7 C 0 00 1 0 D 0 0 3 5 E 0 50 2 6 F 0 00 2 1 G 0 00 5 5 J1 H 0 00 3 1 l 0 50 2 5 J 0 50 4 3 K 0 00 10 8 L 0 00 2 5 M 0 50 5 6 Aucune anomalie n a t observ e pendant le transport la temp rature mesur e pendant le transport tait comprise entre 0 et 1 C Le laboratoire K a not une temp rature r ception de 10 8C la temp rature enregistr e par le thermobouton tait de 0 C Les r sultats de ce laboratoire ont t conserv s dans les interpr tations 3 2 3 Conclusion Aucun probl me n a t rencontr au cours du transport ni la r ception des chantillons ADRIA D veloppement 22 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 3 3 3 3 1 3 3 2 3 3 3 Soci t BioMerieux R sultats des analyses D nombrement de la flore a robie m sophile Un chantillon non cod a t fourni aux laboratoires collaborateurs afin qu ils r alisent le d nombrement de la flore a robie m sophile du lait par la m thode ISO 4833 Les d nombrements
44. de alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 4 NA 178 ka dont 3 Positifs AccuProbe non confirm s un second test AccuProbe r alis sur les colonies a donn un r sultat n gatif Echantillons 570 661 663 Tableau 2 Produits carn s ee M thode de r f rence M thode de r f rence P positive R n gative R M thode alternative positive Accord positif A AR D viation positive R A A PA 33 PD 1 M thode alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 0 NA 39 PD chantillon 668 Tableau 3 Produits laitiers v R sultats obtenus partir de la g lose Palcam R ponses M thode de r f rence M thode de r f rence positive R n gative R M thode alternative positive Accord positif A R D viation positive R A A PA 28 PD 3 M thode alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 2 NA 35 PD chantillons 421 969 1373 ND chantillons 1369 1374 v R sultats obtenus avec la g lose Oxford B bee M thode de r f rence M thode de r f rence P positive R n gative R M thode alternative positive Accord positif A AR D viation positive R A A PA 27 PD 3 M thode alternative n gative D viation n gative A R Accord n gatif A R A ND 3 NA 35
45. e la sensibilit relative SE et de la sp cificit relative SP NA Accord n gatif R A PD d viation positive R A v R sultats obtenus avec la g lose Palcam ND d viation n gative A R Matrices PA NA Produits can s 33 39 Produits laitiers 28 35 Produits de la mer 36 38 g taux et divers 30 34 Environnement 30 32 OTAL 157 178 ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 ND w jejo In le PD jN N Exactitude relative N Sensibilit relative AC PA AND SE 100x P A NA N 100xPAYN 98 6 33 100 0 92 6 30 93 3 97 4 36 100 0 98 5 31 96 8 96 9 30 100 0 96 8 160 98 1 9 N Sp cificit relative SP TT Hogan 40 97 5 38 92 1 36 95 0 34 100 0 34 94 1 186 95 7 27 f vrier 2007 Soci t BioMerieux v R sultats obtenus avec la g lose Oxford pour les produits laitiers et avec la g lose Palcam pour les autres produits Exactitude relative Matrices PA NA ND PD N AC 100x P A NA N Produits can s 33 39 0 1 KE 98 6 Produits laitiers 27 35 3 3 68 91 2 Produits de la mer 36 38 0 2 66 97 4 g taux et divers 30 34 1 0 65 98 5 Environnement 30 32 0 2 64 96 9 1561178 4 8 346 96 5 N PA ND Sensibilit relative N Sp cificit relative SE SP Zeen e dE Zeie 100 0 40 97 5 90 0 38 92
46. ert en flacons st riles raison de 25 ml par flacon avant d tre contamin s v Pr paration des suspensions contaminantes Deux suspensions 125 cellules ml et 25 cellules ml ont t pr par es partir d une culture d une nuit en bouillon BHI 37 C selon le protocole d crit dans les exigences relatives aux tudes pr liminaires et collaboratives des r gles techniques de l AFNOR v Protocole de contamination des chantillons L inoculation au taux faible a t r alis e l aide de 200 ul de la suspension 25 cellules ml et l inoculation taux fort a t effectu e par 200 ul de la suspension 125 cellules ml Apr s inoculation les chantillons ont t homog n is s et ferm s herm tiquement par un parafilm puis stock s au froid avant exp dition ADRIA D veloppement 19 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 3 1 3 Soci t BioMerieux Les taux d inoculation vis s taient les suivants 0 UFC 25 ml 1 10 UFC 25 mi 5 50 UFC 25 ml Modalit s d exp dition date moyens mis en uvre pour le contr le des temp ratures pendant le transport et r ception Les chantillons ont t trait s semaine 46 Ils ont t exp di s le lundi 13 novembre 2006 la r ception et la r alisation des analyses tant pr vues dans les laboratoires le mardi 14 novembre 2006 Les chantillons cod s code connu uniquement du laboratoire expert ont t plac s da
47. es L monocytogenes L monocytogenes L monocytogenes x g ou ml x g ou ml x g ou ml Pr sence de Absence de L monocytogenes L monocytogenes x g ou ml xg ou ml Test de confirmation Gram Catalase H molyse Camp Test Galerie API Listeria ADRIA D veloppement 39 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Annexe 3 Exactitude relative r sultats bruts Soci t BioMerieux PRODUITS CARNES Concordance Eddie ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes 150 Accuprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM R sultat Palcam Palcam Eraser 1 2 48H i geen colonies suspectes colonies suspectes colonies suspectes colonies suspectes colonies suspectes Test Accuprobe EE Ge colonies suspectes Test Ac Gre EE Ruta OAA Rapid mono OAA Rapid L mono 402 Escalope de veau e f H H 3 403 Merguez 404 Merguez 405 Steak hach de veau 406 Poulet la mexicaine 407 Chipolatas Se f H a Gi 408 Chipolatas d D e e 432 Escalope Ka Luc D E hach 435 Poulet Koma
48. g taux et divers 1 Echantillon n 1377 Courgettes en rondelle Il s agit d un chantillon naturellement contamin Pour la m thode AccuProbe des colonies suspectes ont t obtenues sur g loses Oxford et Palcam d s 24 h d incubation du Fraser 1 2 mais un test AccuP robe appara t n gatif Pour la m thode de r f rence des colonies de Listeria monocytogenes ont t obtenues sur g lose Palcam partir du Fraser 1 2 ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 11 27 f vrier 2007 Soci t BioMerieux 8 DEVIATIONS POSITIVES Produits carn s 1 Echantillon n 668 Chipolatas Cet chantillon a t d tect par la m thode AccuProbe uniquement partir de g lose Palcam issue d un Fraser 1 2 incub 48 h H s agit probablement d un chantillon tr s faiblement contamin Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Produits laitiers 4 Echantillon n 421 Fromage p te cuite Quel que soit le milieu d couvillonnage de la m thode AccuProbe Oxford ou Palcam La m thode AccuP robe a donn un r sultat positif partir des g loses Oxford et Palcam issues du Fraser 1 2 incub 48 h Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon faiblement contamin Echantillon n 968 Poudre de lait D viation positive pour le milieu Oxford uniquement dans la
49. genes 1 2 10 11 1410 lait cru inocul par Listeria monocytogenes 4b 153 eau de process inocul e par Listeria monocytogenes 877 113 isol e d environnement 2 2 2 Protocole de contamination Six sachets de 25 g ont t pr par s par matrice et par taux Les sachets ont t inocul s individuellement par une suspension bact rienne Les analyses ont t effectu es la fois par la m thode de r f rence et la m thode alternative Les matrices utilis es ont t analys es avant inoculation par la m thode EN ISO 11290 1 A1 2004 afin de s assurer de l absence d une contamination par Listeria monocytogenes des chantillons Un d nombrement de la flore totale a galement t r alis sur chaque matrice ADRIA D veloppement 14 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux 2 2 3 R sultats Tableau 8 R sultats des niveaux de d tection relatifs Niveau de d tection relatif UFC 25 g ou 25 ml selon le test de Spearman K rbert Couples souche matrice M thode de r f rence M thode alternative Rillettes Listeria monocytogenes 1 2 V2 124 0 487 0 334 0 709 0 487 0 334 0 709 Saumon fum Listeria monocytogenes 1 2a BR32 0 235 0 106 0 522 0 235 0 106 0 522 Jardini re de l gumes Listeria monocytogenes 1 2 10 11 1410 0 262 0 112 0 611 0 262 0 112 0 611 Lait cru Listeria monocytogenes 4b 153 1 201 0 280 5 162 1 2
50. illons 6 chantillons 12 chantillons Ajout du diluant broyage 35 60 35 60 Repiquage en Fraser 1 5 10 Isolement sur OAA et Palcam E cd 11 19 01 P1 Ecouvillonnage sur Palcam ou 6 10 EE Ln KA N Lectures des g loses Oxford ou Palcam CO UT Ecouvillonnage F 1 2 48 h sur Oxford ou Palcam ex KA Isolement du Fraser 1 sur OAA et Palcam 02 P 2 1 D eaa Lecture de g lose Oxford ou 3 5 Palcam Total chantillons n gatifs 72 132 52 90 Total chantillon n gatif 12 11 8 8 7 5 Etapes M thode ISO 112901 A1 M thode AccuP robe 6 chantillons 12 chantillons 6 chantillons 12 chantillons Isolement sur TSAYE 20 26 Test AccuP robe Isolement sur g lose Chromagar Lecture des g loses chromog nes Tests de confirmation Total pour des chantillons positifs ou pr sentant des Total chantillon positif ou pr sentant des colonies suspectes 130 244 colonies suspectes 21 7 20 3 77 127 12 8 10 6 ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 27 f vrier 2007 wv D lais d obtention des r sultats Soci t BioMerieux Pour des chantillons n gatifs les d lais d obtention des r sultats sont les suivants Etape M thode ISO 11290 1 A1 M thode AccuP robe D but de l analyse JO J0 Isolements J10 3 J10J2 Lectures OAA et Palcam J2 J5 Lec
51. itif partir de la g lose Palcam issue du Fraser 1 2 incub 48 h Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon faiblement contamin ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 12 27 f vrier 2007 Soci t BioMerieux Echantillons de l environnement 2 Echantillon n 533 La m thode AccuProbe a donn un r sultat positif Tapis environnement uniquement partir du Fraser 1 2 incub 48 h Aucune p tisseries colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon faiblement contamin Echantillon n 648 La m thode AccuProbe a donn un r sultat positif Montants de portes uniquement partir du Fraser 1 2 incub 48 h Aucune Environnement salaison colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon faiblement contamin Le nombre de discordants entre la m thode de r f rence et la m thode alternative est de v Utilisation du milieu Palcam pour toutes les cat gories Y ND PD 8 3 11 y lt 22 m 3 M 1 m gt M les deux m thodes ne sont pas diff rentes v Utilisation du milieu Oxford pour la cat gorie Produits laitiers et du milieu Palcam pour les autres cat gories Y ND PD 8 4 12 y lt 22 m 4 M 2 m gt M les deux m thodes ne sont pas diff rentes L exactitude de la m thode alternative est satisfaisante 2 1 7 Confirmations Les
52. ive d analyse pour tous produits alimentaires et chantillons d environnement par rapport la m thode de r f rence d crite dans la norme internationale EN ISO 11290 1 A1 et selon le r f rentiel EN ISO 16140 L attestation BIO 12 4 02 95 est valide jusqu au 07 f vrier 2011 et peut tre obtenue aupr s de notre service Assistance Technique AFNOR Validation BIO 12 4 02 95 METHODES ALTERNATIVES D ANALYSE POUR L AGROALIMENTAIRE Certifi par AFAQ AFNOR Certification www afnor org ADRIA D veloppement 37 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux ANNEXE PROTOCOLE DE LA METHODE RAPIDE DE DET ECT ION DE LISTERIA MONOCYTOGENES zs VALIDATION AFNOR N BIO 12 74 02 95 aide jusqu au 7 F vrier 2007 25 g Ehantllon 225 miboulllon Fraser Cemi Homogenslsaton st Incubation 15 2413 30 Ent m n r Une g lon ele cHie Palcam O ford Gelote Hei JO 24h Hetfodet de strie large aawe UN eco ul Im ubation Pour we l Incubation 18 2413 57 C 18 24h a 30 C ADS arc 8 da CONS sur IS glose g lor tolog 1 w TEST ACCUPROBE Palcam O brd Metoder d trie slarga i Pour wie w ZS avec un cou4ilon Dm ubaton Gelore Wei 24h a 57 C TEST NEGATIF TEST POSITIF Abente de L mi toe progas Incubation 18 2413 ne JO 72h As arcs de Caw as Sur ia g losa dbisn s d L m wto progatas TEST NEGATIF Abtence d L m toe progatas Pr s
53. l quation suivante SP Kat 1 00 N avec N nombre total de tous les essais LO FP nombre de faux positifs Le pourcentage de sensibilit pour chaque niveau de contamination positif et pour chaque m thode est calcul l aide de l quation suivante sE TP x100 N avec N nombre total de tous les essais L1 ou L2 FP nombre de vrais positifs ADRIA D veloppement 24 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Les r sultats sont report s dans le tableau suivant Soci t BioMerieux Niveau M thode de r f rence M thode alternative SP SE LCL SP SE LCL LO SP 100 98 SP 100 98 L1 SE 100 98 SE 10 98 L2 SE 100 98 SE 100 98 L1 L2 SE 100 98 SE 100 98 3 4 2 Calcul de l exactitude relative AC Les r sultats pour tous niveaux confondus sont donn s ci apr s Tableau 10 Couples de r sultats de la m thode alternative et de la m thode de r f rence M thode alternative M thode de r f rence Total a PA 160 PD 0 160 ND 0 NA 79 19 Total N 160 N 79 N 39 Un chantillon t moin n a pas pu tre analys par le laboratoire D L exactitude relative AC exprim e en pourcentage est calcul e l aide de l quation suivante AC E 100 N nombre d chantillons soumis essai PA nombre d accords positifs NA nombre d accords n gatif
54. lcam s est r v l positif Une forte contamination en Listeria autre que Listeria monocytogenes pourrait expliquer ce r sultat Par la m thode de r f rence des colonies de L monocytogenes sont obtenues sur g lose OAA partir du Fraser 1 2 Echantillon n 1369 Lait cru Quel que soit le milieu d couvillonnage de la m thode AccuProbe Oxford ou Palcam Des colonies suspectes ont t observ es sur g loses Oxford et Palcam mais le test AccuP robe s est r v l n gatif P our la m thode de r f rence des colonies de Listeria monocytogenes ont t observ es sur g lose OAA et Palcam apr s Fraser 1 uniquement Il est probable que l chantillon tait faiblement contamin en L monocytogenes Echantillon n 1374 Mille feuilles Quel que soit le milieu d couvillonnage de la m thode AccuProbe Oxford ou Palcam Il s agit d un chantillon positif obtenu par contamination crois e avec du lait cru Des colonies suspectes sont observ es sur g loses Oxford et Palcam partir du Fraser 1 2 incub 48 h mais les tests AccuP robe se sont r v l s n gatifs Pour la m thode de r f rence des colonies suspectes ont t obtenues sur g lose Palcam partir du Fraser 1 2 mais il s agit de Listeria autre que Listeria monocytogenes qui n a t retrouv e qu partir du Fraser 1 avec une colonie sur g lose OAA uniquement Il s agit donc d un chantillon tr s faiblement contamin V
55. les tubes du bain marie ou du bloc chauffant et les laisser revenir temp rature ambiante pendant au moins 5 minutes Oter et jeter les bouchons Lire les r sultats l aide du luminom tre dans l heure qui suit F DETECTION 1 S lectionner le protocole appropri sur le luminom tre 2 Afin de retirer tout r sidu de la surface des tubes les essuyer l aide de papier absorbant humide Placer ensuite les tubes dans le luminom tre et suivre les instructions du manuel d utilisation 3 Lorsque l analyse est termin e retirer les tubes du luminom tre REMARQUES A REACTIFS le R actif 2 Tampon d Hybridation peut pr cipiter Le chauffer et l agiter 35 60 C pour dissoudre le pr cipit B TEMPERATURE l hybridation et la s lection sont des r actions thermo d pendantes Par cons quent il est imp ratif de maintenir le bain marie l incubateur ou le bloc chauffant la temp rature pr conis e C DUREE DES OPERATIONS 1 La r action d hybridation doit tre initi e dans l heure qui suit l introduction de l chantillon et du R actif 1 dans les tubes de R actif Sonde 2 Les r actions d hybridation et de s lection sont d pendantes du temps L hybridation doit durer au moins 15 minutes mais pas plus de 20 minutes Pendant l tape de SELECTION incuber les tubes de R actif Sonde pendant au moins 5 minutes mais pas plus de 6 minutes ADRIA D veloppement 34 27 f vrier 2007 S
56. m thode AccuP robe Cet chantillon a t d tect par la m thode AccuProbe uniquement partir de g lose Oxford issue d un Fraser 1 2 incub 48 h Il s agit probablement d un chantillon tr s faiblement contamin Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon n 969 Poudre de lait Quel que soit le milieu d couvillonnage de la m thode AccuProbe Oxford ou Palcam Echantillon d tect par la m thode AccuProbe sur g loses Oxford et Palcam partir du Fraser 1 2 incub 48 h Il s agit galement d un chantillon faiblement contamin Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon n 1373 Lait ferment D viation positive pour le milieu Palcam uniquement dans la m thode AccuP robe La m thode AccuProbe a donn un r sultat positif uniquement partir de la g lose Palcam ceci d s 24 h d incubation du Fraser 1 2 Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon faiblement contamin Produits de la mer 1 Echantillon n 932 Hoki pan La m thode AccuP robe a donn un r sultat positif partir des g loses Oxford et Palcam issues du Fraser 1 2 incub 48 h Aucune colonie suspecte n a t observ e par la m thode de r f rence Echantillon faiblement contamin Echantillon N 1359 Moule La m thode AccuP robe a donn un r sultat pos
57. n 1 Soci t BioMerieux PRODUITS CARNES Concordance Edas ENISO 11290 1 M thode ACCUPROBE Listeria monocytogenes ISO Acouprobe Fraser 1 2 Fraser Fraser 1 2 24H Fraser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM ease Palcam Palcam Eraser 1 2 48H D Fe colonies suspectes colonies suspectes colonies suspectes colonies suspectes colonies suspectes Test Accuprobe Conirretion RUES colonies suspectes Test Ac Gre Corirretion RUES OAA Rapid mono OAA Rapid L mono EE Pancetta H H H S 897 Chorizo be d H 898 Mortadelle H S 899 Saucisse s che H H H 200 Travers de porc S H H H 901 3 se SE S S S S z 902 Lardons mature 903 Lard furr H H 904 Chorizo S S S S H H 905 Saucisse de Morteau 8 H 906 Andouille de Gu rr n fal H SS H 907 Saucisse de jambon e H S 2 H f 2 Gi 908 Beignets de crevettes H f H 911 Coppa H H H z e Foie gras Ke canard L RB 8 L d D D D S erter 913 Lardons nature S H S gt
58. ns des caisses isothermes contenant des blocs r frig rants et exp di s aux diff rents laboratoires l aide d un transport express Un flacon t moin temp rature contenant un enregistreur de temp rature a t joint au colis afin de suivre la temp rature au cours du transport et de la mesurer r ception Chaque laboratoire identifi par une lettre a re u 24 chantillons contamin s num rot s de 1 24 1 chantillon non cod pour le d nombrement de la flore a robie m sophile du lait par la m thode ISO 4833 1 flacon d eau contenant un thermobouton destin enregistrer la temp rature au cours de l acheminement du colis vers le laboratoire et permettant de contr ler la temp rature r ception un accus de r ception un tableau de r sultats compl ter et renvoyer au laboratoire expert ADRIA D veloppement 20 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 3 1 4 3 2 3 2 1 3 1 2 1 Soci t BioMerieux El ments n cessaires la r alisation des essais par les laboratoires collaborateurs v R actifs utilis s L ensemble des r actifs n cessaires la mise en uvre de la m thode alternative et de la m thode de r f rence a t fourni par la Soci t BioMerieux v Instructions Les instructions d taill es ont t transmises aux laboratoires par le laboratoire expert Contr le des param tres exp rimentaux Taux de contamination
59. ntas H Saunon fum Bar ND Filet de dorade Filet de haddock Salade marco polo Taboul aux crevettes Salade du p cheur DEA Poissonretie de colin OCDE Filet de cabillaud Salade crevettes surimi Salade aux fruits de mer Calarars l am ricaine Crevettes sauce Tha Brandade de mone Pav de saumon sauce noussaine Terrine de saunon furr la ar ne Parmentier de poisson D s de saunon fun Chutes de saunon fum D s de saunon fun Saunon fum Saumon fun de Nor ge Saumon fun de Non ge Saumon fun Saumon fur de l Atantique Sauron fun Saunon fun d Idande dehe R e h i LlrlrltikilitklllliiilklllltkiriikillllllikikikIEIEIA LlrlrlizikillkilrlliiilkllllklrizikilrlllllzikikItEIEIt Akku RES ER EL ES He Eer kl k kill kk kl kee H ec Me ec ec ec ec ec bati ec ec ec ec ISIN IS IS INIST bell kill kl kk cl kee Mc H ke ec H ec ec ec H ec bai ec ec ec ec H CHE CH CH E AE DM ke HM ec ec ech e ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 45 27 f vrier 2007 En gras produits artificiellement contamin s n et produit Soci t BioMerieux
60. o agar Principe Apr s une phase d enrichissement en bouillon Fraser 1 2 suivie d un isolement sur g lose Palcam ou Oxford le test AccuProbe permet la d tection de Listeria monocytogenes par un test d hybridation mol culaire La d tection des complexes ARN ADN form s et marqu s se fait par mission de photons d tect s l aide d un luminom tre Les r sultats sont exprim s comme suit Leader Valeur seuil 50 000 RLU Zone d incertitude 40 000 49 999 RLU Contr le lt 20 000 RLU Contr le gt 50 000 RLU RLU Relative Light Units ADRIA D veloppement 2 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux Dans le cadre de la validation AFNOR tous les chantillons positifs l issue du test AccuProbe ont t confirm s la confirmation tant r alis e partir du milieu d isolement g lose Oxford ou Palcam par isolement sur milieu chromog ne La pr sence de colonies caract ristiques isol es confirme le r sultat positif du test AccuProbe 1 3 Domaine d application demand Produits d alimentation humaine Extension aux chantillons d environnement 1 4 M thode de r f rence La m thode de r f rence est la norme EN ISO 11290 1 A1 2004 m thode horizontale pour la recherche et le d nombrement de Listeria monocytogenes Partie 1 m thode de recherche Le protocole est sch matis en annexe 2 1 5 Histori
61. on une infusion coeur cervelle ou une g lose chocolat Des milieux s lectifs comme la g lose McBride et la g lose LPM Remel peuvent galement tre utilis s L chantillon peut tre test d s que les colonies sont visibles et au cours des 72 heures suivantes 1 L chantillon peut tre pr lev l aide d une oese en plastique jetable de 1 ul d une oese m tallique d une aiguille en plastique jetable ou d un b tonnet applicateur Ne pas utiliser d couvillon en raison du faible volume de liquide dans lequel les bact ries vont tre remises en suspension 2 Il est possible de tester soit plusieurs petites colonies 3 ou 4 soit le contenu d une oese de 1 ul soit une seule colonie d un diam tre d au moins 1 mm 3 Eviter de pr lever du milieu de culture en m me temps que les bact ries 4 Le manipulateur peut d cider d ensemencer une autre bo te de P tri pour confirmer la puret de l chantillon isol H Identification partir de bouillon de culture Le test peut tre pratiqu partir de bouillons de culture appropri s comme le bouillon trypticase soja le bouillon coeur cervelle ou le bouillon d enrichissement pour Listeria LEB Listeria Enrichment Broth dont la turbidit doit tre sup rieure ou gale 1 unit McFarland Pr lever la pipette un chantillon de 50 ul de la suspension du bouillon parfaitement homog n is et le distribuer dans le tube de R actif
62. ontact rincer l eau Si ces r actifs sont renvers s les diluer avec de l eau avant d essuyer G Pour obtenir des performances optimales il est recommand avant de commencer le test de regarder si le produit s est d plac Si c est le cas taper le tube par le haut pour faire descendre le contenu au fond du tube CONSERVATION Set Les tubes de R actif Sonde doivent tre conserv s dans leur sachet en aluminium 2 8 C Ils sont stables avant ouverture jusqu la date de p remption Apr s ouverture le sachet doit tre referm herm tiquement et les tubes restants utilis s dans un d lai de deux mois dans la limite de la date de p remption Les autres r actifs du TEST AccuProbe Listeria monocytogenes peuvent tre conserv s entre 2 et 25 C et sont stables jusqu la date de p remption NE PAS CONGELER LES REACTIFS PREPARATION DE L ECHANTILLON Le TEST AccuProbe Listeria monocytogenes est con u pour identifier L monocytogenes isol e partir d une culture La d tection de L monocytogenes dans les aliments se fait apr s une phase de pr enrichissement ADRIA D veloppement 30 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux DIAGNOSTIC IN VITRO A H Identification partir de culture sur milieu solide Le test peut tre pratiqu sur des cultures r alis es sur un milieu solide appropri comme une g lose 5 de sang de mout
63. que de la validation Le test AccuProbe Listeria monocytogenes a t valid le 7 f vrier 1995 pour les produits laitiers n attestation EUR 15 1 02 95 avec une extension tous les produits d alimentation humaine le 13 novembre 1996 n attestation BIO 12 4 02 95 La premi re reconduction a eu lieu le 18 janvier 1999 et la seconde le 6 f vrier 2008 M thodes de r f rence laquelle la m thode alternative a t compar e v Etude de 1995 la validation a t obtenue par rapport la m thode NF VO08 055 Microbiologie des aliments Recherche de Listeria monocytogenes M thode de routine v Etudes de 1998 et 2003 la validation a t obtenue par rapport la m thode EN ISO 11290 1 1997 Microbiologie des aliments M thode horizontale pour la recherche et le d nombrement de Listeria monocytogenes Partie 1 m thode de recherche ADRIA D veloppement 3 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 1 6 Soci t BioMerieux Principaux r sultats obtenus lors de la validation initiale v Praticabilit Les r sultats n gatifs sont obtenus en 3 jours avec le test AccuProbe contre 5 7 jours avec la m thode de r f rence EN ISO 11290 1 Les r sultats positifs sont obtenus en 3 4 jours avec le test AccuProbe et confirmation sur g lose chromog ne contre 4 7 jours par la m thode de r f rence EN ISO 11290 1 La m thode alternative est flexible elle pe
64. raser 1 2 48H OAA PALCAM OAA PALCAM Palm Palcam R sultat R sultat final Fraser 1 2 48H N Produit colonies colonies colonies colonies colonies Corfiretion R sutat colonies Test Corfinration R suitat Test Accuprobe suspeces suspects suspectes suspectes suspects OAA RapidL mono suspects Accuprobe oaa Bail moo 1268 Salade poireaux poulet f 1269 Salade alaska F 1376 Chou blanc 5 1377 Courgettes rondelles P ND 1378 Mac doine a z 1379 Trio de choux S z S S Pur e de p ches 148 E blanches 1429 Coulis de nangue F T 1430 Pur e de m res H H H 1431 Pur e d artichauts Ga 1432 Pur e de brocolis i f 1433 Tare aux poireaux 7 1434 Pur e d artichauts na 1435 Chou rouge E 1456 Poivons f 1437 Po l e champ tre A E ADRIA D veloppement 48 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 En gras produits artificiellement contamin s n et produit Soci t BioMerieux ECHANTILLONS DE L ENMRONNEMNENT
65. re en uvre les moyens suffisants pour s assurer de la validit du r sultat attendu Dans le cas de l utilisation d un milieu chromog ne nous conseillons de prolonger l incubation de 24H suppl mentaires ou de proc der un second isolement ventuellement sur un milieu chromog ne diff rent en repartant du milieu Palcam MAT RIEL FOURNI TEST AccuProbe Listeria monocytogenes bioM rieux r f 39500 Gen Probe Cat No 2920 20 Tests R actif Sonde P 4 x 5 tubes MAT RIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI Oeses de 1 ul en plastique st riles oeses m talliques aiguilles en plastique pipettes Pasteur boutonn es ou b tonnets applicateurs pour pr lever les colonies Souches de contr le Incubateur ou bain marie 37 1 C Bain marie ou bloc chauffant 60 1 C Micropipettes 50 ul 300 ul Pipettes r p titives 50 ul 300 ul Vortex Les emplacements l int rieur du bloc chauffant doivent tre adapt s des tubes de 12 X 75 mm L utilisation des blocs chauffants GEN PROBE est recommand e MATERIEL SUPPLEMENTAIRE DISPONIBLE CHEZ VOTRE DISTRIBUTEUR GEN PROBE Luminom tre GEN PROBE LEADER 50i bioM rieux r f 39400 Gen Probe Cat No 3100i Bloc chauffant GEN PROBE 60 1 C bioM rieux r f 39406 Gen Probe Cat No 3397 COFFRET DE R ACTIFS POUR IDENTIFICATION DE CULTURES AccuProbe bioM rieux r f 39305 Gen Probe Cat No 2800 COFFRET DE REACTIFS DE DETECTION GEN PROBE bioM rieux r
66. rmet de r aliser des tests sur des petites s ries aussi bien que sur des grandes s ries la phase solide du test tant constitu e de tubes sonde individuels v Sp cificit tude de 1994 57 souches de Listeria monocytogenes ont t d tect es sur 57 test es L tude de 37 souches n appartenant pas l esp ce Listeria monocytogenes 17 souches du genre Listeria et 20 souches de genres bact riens proches n a pas mis en vidence la pr sence de r actions crois es v Limite de d tection intrins que tudes de 1994 et 1996 Nombre de Listeria monocytogenes introduire pour obtenir une r action positive du test 10 10 bact ries ml r sultats obtenus sur des souches pures de Listeria monocytogenes v Limite de d tection en matrice tudes de 1994 et 1996 Des essais ont t effectu s en 1994 et 1996 sur 4 aliments lait rillettes filet de poisson salade 4 me gamme contamin s artificiellement chacun par 4 souches Listeria monocytogenes 5 niveaux de contamination O 1 10 2 20 5 50 10 100 bact ries par 25 g Les r sultats sont les suivants Niveau de contamination M thode alternative M thode de r f rence bact ries 25 g NF VO08 055 1 10 88 86 2 20 94 94 5 50 97 97 10 100 97 97 Les limites de d tection des 2 m thodes sont quivalentes ADRIA D veloppement 4 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L
67. rsion 1 Soci t BioMerieux COFFRET DE R ACTIFS POUR IDENTIFICATION DE CULTURES ACCUPROBE bioM rieux r f 39305 Gen Probe Cat No 2800 R actif 1 R actif de Lyse 1 1x 10 ml Solution tamponn e contenant 0 04 d azide de sodium R actif 2 Tampon d Hybridation 2 1x 10 ml Solution tamponn e R actif 3 R actif de S lection 3 1 x 60 ml Solution tamponn e COFFRET DE R ACTIFS DE D TECTION GEN PROBE bioM rieux r f 39300 Gen Probe Cat No 1791 R actif de D tection I RD 1 x 240 ml 0 1 d eau oxyg n e dans de l acide nitrique 0 001 N R actif de D tection II RIT 1 x 240 ml Hydroxyde de sodium 1 N PR CAUTIONS D UTILISATION Pour diagnostic in vitro ou pour la microbiologie industrielle Observer les pr cautions habituelles lors de la r alisation de ce test 3 A utiliser uniquement pour l identification de L monocytogenes partir d une culture Utiliser uniquement le mat riel fourni ou du mat riel usage unique Certains r actifs utilis s dans ce test contiennent de l azide de sodium susceptible de former par r action avec le plomb ou le cuivre des canalisations des azides m talliques explosifs Lors de l limination de ces r actifs prendre soin de toujours rincer abondamment l eau pour pr venir la formation d azide dans la plomberie F Eviter le contact des R actifs de D tection I et II avec la peau les yeux et les muqueuses En cas de c
68. s avec Les valeurs d exactitude de la m thode alternative par rapport la m thode de r f rence ont t calcul es pour chacun des niveaux et figurent dans les tableaux ci apr s Tableau 11 Niveau AC LCL LO 100 98 L1 100 98 L2 100 98 L1 L2 100 98 Total 100 98 3 4 3 Etude des r sultats discordants Aucune discordance n ayant t observ e le test statistique n a pas t mis en uvre ADRIA D veloppement 25 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux 3 5 Interpr tation 3 5 1 Comparaison des valeurs d exactitude relative de sp cificit et de sensibilit Les valeurs obtenues dans les deux parties de l tude de validation tude comparative des m thodes et tude interlaboratoire sont report es dans le tableau 12 Tableau 12 Comparaison des valeurs obtenues lors de l tude interlaboratoire avec celles obtenues dans le cadre de l tude pr liminaire pour la m thode alternative Etude collaborative Etude pr liminaire Exactitude relative AC 100 96 8 Sensibilit SE 100 98 1 Sp cificit SP 100 95 7 3 5 2 Degr d accord DA Les degr s d accord pour la m thode de r f rence et la m thode alternative et pour chaque niveau sont report s ci apr s Niveau M thode de r f rence M thode alternative LU DA 100 DA 1
69. s L mono Agar Les r sultats sont les suivants Concordants 77 Positifs suppl mentaires ou d viations positives de la m thode alternative 3 Conclusion l isolement sur une g lose chromog ne r alis partir de la g lose Palcam ou Oxford permet de confirmer les tests AccuProbe positifs ADRIA D veloppement 5 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux v Fid lit tude de 2003 Les donn es de fid lit ont t v rifi es au cours d un essai effectu en 2003 comprenant 12 laboratoires Les analyses ont t effectu es sur des chantillons de lait pasteuris demi cr m contamin s artificiellement avec une souche de Listeria monocytogenes isol e de lait cru aux 4 niveaux suivants 0 UFC 25ml 1 10 UFC 25ml 5 50 UFC 25ml et 10 100 UFC 25ml Les laboratoires ont test 2 chantillons pour chaque niveau de contamination soit 8 analyses par laboratoire Les r sultats par niveau de contamination sont les suivants Niveaux Nombre Nombre Nombre de Nombre de Nombre d chantillons d chantillons r sultats r sultats d chantillons total analys s n gatifs positifs inexploit s 0 UFC 25 q 24 24 24 0 0 1 10 UFC 25 q 24 24 1 23 0 5 50 UFC 25 g 24 24 0 24 0 10 100 UFC 25 24 24 0 24 0 Le sac contenant le milieu d enrichissement a t perc au cours de l incubation et a perdu la moiti de son contenu
70. t exclusivit la m thode AccuProbe est sp cifique et s lective v Praticabilit lors de l analyse d chantillons positifs la m thode AccuProbe offre un gain de temps de manipulation diminue le d lai de r ponse Les conclusions de l tude interlaboratoire sont les suivantes v La variabilit de la m thode alternative degr d accord concordance odds ratio est quivalente celle de la m thode de r f rence ADRIA D veloppement 27 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux Annexe 1 M thode AccuProbe Listeria monocytogenes Ref 39500 25 g d chantillon 225 ml de Fraser 1 2 18 24h 30 C Ecouvillonnage sur Palcam 18 24h 37 C 18 24 h suppl mentaires si n cessaire 30 C L L Absence de colonies Pr sence de colonies Ecouvillonnage sur Palcam 18 24h 37 C 24 h 37 C Pr sence de colonies Test AccuProbe Pr sence de colonies Absence de colonies Confirmations par A pr l vement sur g lose 24h 37 C Palcam au point d inoculation etisolement sur g lose chromog ne 9 9 TestAccuProbe a Pr sence de colonies Confirmations par pr l vement sur g lose Palcam au point d inoculation et isolement sur g lose chromog ne ADRIA D veloppement 28 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux TEST D IDENTIFICATION DE LISTER
71. tests AccuProbe positifs ont tous t confirm s la fois sur g loses OAA et RAPID L mono except pour l chantillon 932 hoki pan pour lequel des colonies suspectes ont t observ es uniquement sur g lose OAA L identification des colonies a bien donn Listeria monocytogenes par contre il s agit d une souche non h molytique non d tectable sur RAPID L mono Trois chantillons ont donn des tests AccuProbe positifs sans qu il soit possible de les confirmer sur g lose chromog ne Un second test appliqu sur les g loses a donn un r sultat n gatif Il s agit des chantillons 570 tome au lait cru 661 poivrons rouges et 663 fromage au lait cru ADRIA D veloppement 13 27 f vrier 2007 Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux 2 2 Niveau de d tection relatif 2 2 1 Matrices utilis es Cette tude a pour objectif de d terminer les quantit s minimales de Listeria monocytogenes d tectables dans la matrice alimentaire et de les comparer celles obtenues par la m thode de r f rence Les limites de d tection ont t d finies par l analyse du couple matrice souche quatre niveaux Six r plicats de chaque condition ont t r alis s Les couples matrices souches test s sont les suivantes rillettes inocul es par Listeria monocytogenes 1 2 V2 124 saumon fum inocul par Listeria monocytogenes 1 2a BR32 v g taux crus inocul s par Listeria monocyto
72. tous produits alimentaires et chantillons d environnement ou Oxford produits laitiers et l incuber 18 24 heures 37 1 C g lose N 1 3 L incubation du bouillon Fraser demi est prolong e de 18 24 heures 30 1 C JO 48h 4 Apr s 18 24 heures d incubation 37 1 C de la g lose N 1 la d tection de Listeria monocytogenes est faite partir des colonies caract ristiques ou non caract ristiques d velopp es sur la g lose s lective selon le protocole d crit dans la partie A de ce chapitre et en se rapportant au chapitre MODE OPERATOIRE En l absence de colonies sur la boite prolonger l incubation de la g lose N 1 pendant 18 24H suppl mentaires 37 4 1 C 5 En cas de test Accuprobe n gatif g lose N 1 ou en l absence de colonie sur la g lose N 1 ensemencer une nouvelle g lose s lective g lose N 2 partir du bouillon Fraser demi incub pendant 48 heures Incuber la g lose pendant 24 heures 37 1 C JO 72h 6 Apr s 48 heures d incubation g lose N 1 ou 24 heures d incubation g lose N 2 proc der la d tection de Listeria monocytogenes selon le protocole d crit dans la partie A de ce chapitre et en se rapportant au chapitre MODE OPERATOIRE Confirmation des r sultats positifs dans le cadre du protocole valid AFNOR tout r sultat trouv positif par la m thode AccuProbe doit tre confirm La confirmation sera r alis e gr ce l
73. tures Oxford ou Palcam J2 jJ4 Pour des chantillons positifs ou pr sentant des colonies suspectes les d lais d obtention des r sultats sont les suivants Etape M thode ISO 11290 1 A1 M thode AccuP robe D but de l analyse J0 Jo Isolements J1 3 J1 J2 Lectures OAA et Palcam J2 5 Lectures Oxford ou Palcam J2 J4 Test AccuProbe J2 J4 Confirmation du test AccuP robe J3 J6 Confirmation du genre J6 7 Confirmation de l esp ce Jil 12 Lors de l analyse d chantillons positifs la m thode AccuProbe offre un gain de temps de manipulation temps divis par 2 diminue le d lai de r ponse ADRIA D veloppement Synth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 27 f vrier 2007 Soci t BioMerieux 3 ETUDE INTERLABORATOIRES 3 1 Organisation de l tude 3 1 1 Mise en oeuvre v Nombre de laboratoires collaborateurs 13 laboratoires collaborateurs ont particip l tude interlaboratoires v Matrice et souche utilis es Du lait pasteuris demi cr m inocul par Listeria monocytogenes 4b 153 v Nombre d chantillons par laboratoire Les flacons de lait ont t inocul s individuellement raison de 8 flacons par taux et par laboratoire soit 24 flacons analyser par laboratoire 3 1 2 Modalit s de pr paration et de contamination des chantillons y compris le niveau de contamination Tous les chantillons ont t r partis par le laboratoire exp
74. ynth se AccuProbe L monocytogenes Version 1 Soci t BioMerieux D BAIN MARIE le niveau d eau doit tre maintenu de mani re ce que la totalit du liquide r actionnel contenu dans les tubes de R actif de Sonde soit immerg e E UTILISATION DU VORTEX il est important d avoir un m lange homog ne lors de l tape de SELECTION plus particuli rement apr s l addition du R actif 3 F RESOLUTION D INCIDENTS 1 Les valeurs lev es de contr le n gatif Listeria grayi ATCC 19120 sup rieures 20 000 RLU Relative Light Units sur le luminom tre LEADER ou 600 PLU Photometric Light Units sur le luminom tre AccuLDR anciennement PAL peuvent tre d es soit une homog n isation insuffisante apr s l addition du R actif 3 R actif de S lection soit la pr sence de diff rents types de colonies Pour v rifier si l on est en pr sence d une culture mixte repiquer une partie de lP chantillon sur un milieu de culture g los appropri et le mettre incuber V rifier l aspect des colonies 2 Des valeurs faibles de contr le positif Listeria monocytogenes ATCC 35152 inf rieures 50 000 RLU sur le luminom tre LEADER ou 1 500 PLU sur le luminom tre AccuLDR peuvent tre d es un nombre insuffisant de bact ries ou lorsque des cultures mixtes ou g es sont test es Pour v rifier si l on est en pr sence d une culture mixte repiquer une partie de l chantillon sur un milieu de

Validation AFNOR, selon le référentiel EN ISO 16140, du test

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Validation AFNOR, selon le r&eacute;f&eacute;rentiel EN ISO 16140, du test

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Validation AFNOR, selon le référentiel EN ISO 16140, du test