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BRAF - Roche

1. S quence d acide amin S quence de nucl otides dv codon 600 1798 1800 Globale WT GTG 146 33 7 V600E GAG 236 54 5 V600K AAG 36 8 3 V600R AGG 7 1 6 V600E2 GAA 7 1 6 V600D GAT 0 0 0 Autre GAC 1 0 2 Total 433 100 0 En r sum le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a montr un fort pourcentage de corr lation positive avec le s quencage bidirectionnel 2X de Sanger 96 4 pour la d tection des mutations V600E 1799 T gt A Le pourcentage plus bas de corr lation n gative 80 0 tait principalement attribuable une plus grande sensibilit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600E pour la d tection des mutations V600E et la r activit crois e du test avec les mutations non V600E principalement V600K 06611818001 06FRC 26 Doc Rev 6 0 Bibliographie 1 2 10 11 12 Davies H Bignell GR Cox C et al Mutations of the BRAF gene in human cancer Nature 2002 417 949 54 McCubrey JA Steelman LS Chappell WH et al Roles of the Raf MEK ERK pathway in cell growth malignant transformation and drug resistance Biochim Biophys Acta 2007 1773 1263 1284 Flaherty K T et al Inhibition of M utated Activated BRAF in Metastatic Melanoma The New England J ournal of Medicine 2010 vol 363 no 9 809 819 Pollock PM Harper UL Hansen KS et al High frequency of BRAF mutations in nevi Nature Genetics 2003 33 19 20 COSMIC database http www sanger ac
2. 60 des m lanomes malins Les mutations du BRAF sont galement courantes dans le naevus b nin laissant supposer qu elles constituent un v nement tr s pr coce La d couverte de telles mutations somatiques du g ne BRAF dans le m lanome et d autres tumeurs humaines a particip l lucidation du r le central de la kinase BRAF dans les voies de signalisation contr lant la prolif ration la diff rentiation et la mort cellulaires Dans les cellules normales le BRAF fait partie de la voie de signalisation hautement r gul e m diant les effets des r cepteurs des facteurs de croissance tels que l EGFR par l interm diaire des prot ines RAS RAF MEK et ERF Les mutations oncog nes dans le BRAF entra nent une augmentation de la fonction kinase rendant ainsi la voie RAF M EK ERK constitutivement active en l absence de facteurs de croissance typiques La majorit des mutations BRAF dans le m lanome et d autres tumeurs humaines se produit dans le codon 600 Un certain nombre de mutations de dinucl otides affectant le codon 600 V600K V600R et V600D ont galement t observ es moins couramment principalement dans le m lanome et rarement dans d autres tumeurs comme le cancer colorectal Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 est un dosage par PCR en temps r el con u pour d tecter la pr sence de la mutation V600E T1799A PRINCIPES DE LA PROCEDURE Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 se base sur deux g
3. A R p ter la dilution du stock d ADN de l chantillon invalide en d marrant partir des proc dures Calcul de la dilution du stock d ADN de l chantillon et Dilution de l chantillon de la section AM PLIFICATION ET D TECTION B Apr s avoir effectu la dilution du stock d ADN 5 ng uL d crite la section Dilution de l chantillon effectuer une dilution suppl mentaire au 1 2 en prenant 20 uL de stock d ADN dilu et en ajoutant 20 uL de diluant d chantillon d ADN DNA SD C Continuer en effectuant la proc dure Pr paration du m lange r actionnel MM X actif et en effectuant le reste de la proc dure d amplification et de d tection Remarque si l chantillon est toujours invalide apr s r analyse une dilution au 1 2 r p ter la totalit de la proc dure de test pour cet chantillon en commen ant par le d paraffinage et l isolation de l ADN sur une nouvelle section de tissu FFPE de 5 um La concentration standard d ADN de 25 L 5 ng uL sans autre dilution doit tre utilis e pour l amplification et la d tection CONTR LE DE QUALIT Un jeu de t moin mutant du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 BRAF M UT et un jeu de t moin de type sauvage BRAF WT sont inclus dans chaque cycle d analyse Un cycle d analyse est valide si l tat de contr le des deux puits des t moins BRAF M UT A01 et BRAF WT B01 est valide Si l un des t moins BRAF MUT ou BRAF WT est invalide le cycle d analyse doit tre
4. Par cons quent 433 chantillons taient consid r s comme valuables c a d que chacun avait un r sultat valide au test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et un r sultat valide au s quen age de Sanger Tableau 18 Comparaison principale du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et du s quen age bidirectionnel 2X de Sanger pour les chantillons valuables S quencage de Sanger Test de mutation cobas 4800 BRAF V600 m thode de r f rence m thode de test Mutation BRAF V600E Mutation BRAF V600E d tect e non d tect e Jet Mutation Detected 215 42 257 Mutation Not Detected 8 168 176 Total 223 51 5 210 48 5 433 Pourcentage de corr lation positif IC 95 100 x 215 223 96 4 93 1 98 2 Pourcentage de corr lation n gative IC 95 100 x 168 210 80 0 74 1 84 8 Pourcentage de corr lation globale IC 95 100 x 383 433 88 5 85 1 91 1 PCP pourcentage de corr lation positive PCN pourcentage de corr lation n gative PCG pourcentage de corr lation globale a Mutation Detected indique la pr sence du type de mutation BRAF pr dominant V600E substitution mononucl otidique 1799 T gt A tel qu identifi par le s quen age bidirectionnel de Sanger b Mutation Not Detected indique l absence du type de mutation BRAF pr dominant V600E tel qu identifi par le s quen age bidirectionnel de Sange
5. d ADN dans le Taux de Mutation par s quen age 454 membre du panel Detected n 24 M lange 125 0 ng 25 uL 100 de tissu FFPE 9 1 62 5 ng 25 uL 100 0 10 31 3 ng 25 pL 100 125 0 ng 25 uL 96 5 0 ng 25 uL 100 M lange 1 2 5 ng 25 uL 100 ti FFPE 469 es oa 1 3 ng 25 pL 75 0 6 ng 25 uL 88 0 3 ng 25 uL 71 125 0 ng 25 uL 100 5 0 ng 25 uL 92 M lange 2 25 ng 25 uL 100 de ti FFPE 5 1 a 1 3 ng 25 pL 96 0 6 ng 25 uL 58 0 3 ng 25 uL 50 125 0 ng 25 uL 100 5 0 ng 25 uL 100 M lange 3 2 5 ng 25 uL 100 ti FFPE D 9 FR ee 1 3 ng 25 pL 100 0 6 ng 25 uL 96 0 3 ng 25 uL 71 M lange de 125 0 ng 25 uL 0 tissu FFPE 31 62 5 ng 25 uL 4 2 5 9 31 3 ng 25 uL 4 0 0 type sauvage 125 0 ng 25 uL Cette tude d montre que le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 peut d tecter la mutation BRAF V600E un taux de mutation 25 sur une concentration standard de 125 ng 25 uL La capacit du test d tecter la mutation a des concentrations d ADN inf rieures d montre que les chantillons peuvent contenir de l ADN d grad provenant du processus de fixation sans pour autant emp cher la d tection Tous les r sultats de test obtenus pour les chantillons BRAF de type sauvage taient M utation Not Detected 06611818001 06FRC 15 Doc Rev 6 0 Sensibilit analytique avec des chantillons de tissu FFPE Quarante huit sections individuelles de 5 um pro
6. 06611818001 06FRC 6 Doc Rev 6 0 PR L VEM ENT TRANSPORT ET CONSERVATION DES CHANTILLONS REMARQUE manipuler tous les chantillons comme s ils taient capables de transmettre des agents infectieux A Pr l vement des chantillons Les chantillons de tissu FFPE ont t valid s pour une utilisation avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 B Transport des chantillons Les chantillons de tissu FFPE peuvent tre transport s une temp rature comprise entre 15 et 30 C Le transport des chantillons de tissu FFPE doit satisfaire aux normes f d rales provinciales territoriales et locale pour le transport d agents tiologiques C Conservation des chantillons Les chantillons de tissu FFPE peuvent tre conserv s une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 12 mois apr s la date de pr l vement Les sections de 5 um mont es sur lames peuvent tre conserv es une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 60 jours M ODE D EM PLOI REMARQUE tous les r actifs l exception de RXNMIX MGAC et BRAF OM doivent tre temp rature ambiante avant utilisation RXN MIX MGAC et BRAF OM peuvent tre pris directement de l emplacement de conservation entre 2 et 8 C pour pr parer le m lange r actionnel actif REMARQUE seules des sections de tissu FFPE de 5 um d paisseur contenant au moins 50 de cellules tumorales peuvent tre utilis es dans le test de mutation cobas 4800 BRA
7. actionnel catalyse le clivage de l ADN contenant de la d soxyuridine au niveau des r sidus de d soxyuridine en ouvrant la cha ne de d soxyribose en position C1 Lorsqu elle est chauff e au cours de la premi re tape du thermocyclage un pH alcalin la cha ne d ADN de l amplicon se scinde la position de la d soxyuridine rendant ainsi l ADN non amplifiable L enzyme AmpErase est inactive une temp rature sup rieure 55 C c est dire pendant toutes les tapes du cycle thermique et ne d truit donc pas l amplicon cible R ACTIFS cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tests Trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas P N 05985536190 DNA TLB 1x10 mL Tampon de lyse de tissu d ADN Tampon Tris HCI Chlorure de potassium 0 04 d EDTA 0 1 de triton X 100 0 09 d azoture de sodium PK 1x 100 mg Prot inase K Proteinase K lyophilis e Xn F4 Prot inase K Nocif 06611818001 06FRC 2 Doc Rev 6 0 DNA PBB 1x10 mL Tampon de liaison de l ADN la paraffine Tampon Tris HCI 49 6 de chlorhydrate de guanidine 0 05 d ur e 17 3 de triton X 100 Xn Ix 49 6 p p de chlorhydrate de guanidine Nocif WB 1x25 mL Tampon de lavage de l ADN Tampon Tris HCI 64 de chlorhydrate de guanidine Xn x 64 p p de chlorhydrate de guanidine Nocif WB II 1x12 5 mL Tampon de lavage II de l ADN Tampon Tris HCl Chlorure de sodium DNA EB 1x6 mL Tampo
8. lange r actionnel actif pr par par l ajout de BRAF OM et MGAC RXNMIX doit tre conserv une temp rature comprise entre 2 et 8 C l abri de la lumi re Les chantillons et t moins pr par s doivent tre ajout s dans l heure qui suit la pr paration du m lange r actionnel actif Les chantillons trait s sont stables jusqu 24 heures une temp rature comprise entre 20 et 30 C jusqu 14 jours entre 2 et8 C ou jusqu 60 jours congel s 20 C Les chantillons trait s ADN extrait sont stables apr s avoir subi 4 cycles de cong lation d cong lation L ADN extrait doit tre amplifi au cours des p riodes recommand es de conservation ou avant la date de p remption indiqu e sur la trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas pour extraire l ADN selon la premi re ventualit L amplification doit tre d marr e au maximum 1 heure apr s l ajout des chantillons et des t moins trait s au m lange r actionnel actif pr par par l ajout de BRAF OM et de M GAC RXNMIX MATERIEL FOURNI A cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tests Trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas P N 05985536190 DNA TLB Tampon de lyse de tissu d ADN PK Prot inase K DNA PBB Tampon de liaison a la paraffine de l ADN WB Tampon de lavage de l ADN WB II Tampon de lavage Il de l ADN DNA EB Tampon d lution de l ADN FT Tubes de filtrat
9. 30 30 IV 100 2 15 9 75 75 IV 0 3 V600E2 36 1 75 80 Ill 0 4 68 0 75 75 IV 100 5 V600R 23 1 15 15 IV 0 6 16 5 25 25 III 0 7 215 35 40 IV 0 8 22 7 40 40 IV 0 9 31 4 60 60 IV 100 10 V600K 34 6 75 75 IV 100 11 39 3 80 80 IV 100 12 36 1 95 95 IIC 100 13 61 7 75 75 IV 100 14 68 8 80 80 IV 100 Le contenu tumoral de l chantillon a t valu au moyen d un examen effectu par un anatomopathologiste sur la premi re et la derni re des douze sections de 5 um adjacentes de chaque chantillon Le contenu tumoral de la premi re et de la derni re section est indiqu p ex 95 95 Un panel de dilution de onze membres pr sentant des concentrations d ADN allant de 5 0 0 0049 ng uL soit entre 125 et 0 1 ng d ADN dans le volume de 25 uL utilis pour le test a t pr par et chaque membre du panel a t test en triple afin de d terminer la plus faible quantit d ADN ayant donn un taux de 100 de r sultat M utation Detected pour les huit chantillons pr sentant une r action crois e avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 La plus faible quantit d ADN avant la perte de r activit crois e de l chantillon a t observ e entre 0 5 ng 25 uL pour un chantillon de BRAF V600K mutant avec un taux de mutation de 68 8 et 15 6 ng 25 uL pour un chantillon de BRAF V600D mutant av
10. 95 de r sultat BRAF V600E Mutation Detected lignes gris es Les r sultats de l tude sont pr sent s au tableau 6 Tableau 6 Sensibilit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 avec des chantillons de tissu FFPE Echantillon de Pourcentage de mutation Quantit d ADN dans le Taux de Mutation tissu FFPE par s quen age 454 membre du panel Detected n 48 125 0 ng 25 uL 100 15 6 ng 25 uL 100 7 8 ng 25 uL 98 Echantillon 1 6 1 391ng 25 UL 98 2 0 ng 25 uL 81 1 0 ng 25 uL 711 125 0 ng 25 uL 100 7 8 ng 25 uL 100 3 9 ng 25 uL 100 Echantillon 2 115 20 ng 25 uL 98 1 0 ng 25 uL 98 0 5 ng 25 uL 94 125 0 ng 25 uL 98 31 3 ng 25 uL 98 15 6 ng 25 uL 85 Echantillon 3 44 78 ng 25 ul 90 3 9 ng 25 uL 90 2 0 ng 25 uL 67 Cette tude d montre que le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 peut d tecter la mutation BRAF V600E dans des chantillons de tissu FFPE r els un taux de mutation 5 sur une concentration standard de 125 ng 25 uL La capacit du test d tecter la mutation a des concentrations d ADN inf rieures d montre que les chantillons peuvent contenir de l ADN d grad provenant du processus de fixation sans pour autant emp cher la d tection Un chantillon fortement pigment tait inclus dans l tude et ne semble pas avoir affect la sensibilit d
11. Z05 Une fois que le fluorophore rapporteur est s par du quencher par cette activit nucl ase une fluorescence d une longueur d onde caract ristique peut tre mesur e lorsque le fluorophore rapporteur est excit par un spectre de lumi re appropri Deux fluorophores rapporteurs sont utilis s pour marquer la sonde sp cifique aux cibles BRAF de type sauvage WT V600 et la sonde de mutation BRAF V600E L amplification des deux s quences BRAF peut tre d tect e de fa on ind pendante dans un seul puits r actionnel en mesurant la fluorescence deux longueurs d onde caract ristiques Amplification s lective L amplification s lective des acides nucl iques cibles partir des chantillons est r alis e avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 par l utilisation de l enzyme AmpErase uracil N glycosylase et du d soxyuridine triphosphate dUTP L enzyme AmpErase reconna t les brins d ADN contenant de la d soxyuridine et catalyse leur destruction mais pas celle de l ADN contenant de la thymidine L ADN naturel ne contient pas de d soxyuridine alors que l amplicon en contient toujours en raison de l utilisation de dUTP comme un des nucl otides triphosphates du m lange r actionnel Ainsi seuls l amplicon contient de la d soxyuridine La d soxyuridine rend les amplicons contaminants susceptibles d tre d truits par l enzyme AmpErase avant l amplification de l ADN cible L enzyme AmpErase contenue dans le m lange r
12. est conseill d utiliser des pipettes st riles jetables et des embouts de pipette exempts de DNase CONSERVATION ET MANIPULATION A B Ne pas congeler les r actifs Conserver DNA TLB DNA PBB WB I WB II DNA EB FT et CT une temp rature comprise entre 15 et 30 C Apr s ouverture du flacon ces r actifs restent stables pendant 8 utilisations jusqu 90 jours ou jusqu la date de p remption selon la premi re ventualit Conserver PK entre 15 et 30 C Apr s ajout d eau st rile sans nucl ase PK conserver la solution PK reconstitu e non utilis e par aliquotes de 450 uL 20 C Une fois reconstitu e la solution PK doit tre utilis e dans les 90 jours ou avant la date d expiration selon la premi re ventualit Apr s l ajout d thanol absolu conserver WB et WB II une temp rature comprise entre 15 et 30 C Ces solutions actives restent stables pendant 8 utilisations jusqu 90 jours ou jusqu la date de p remption selon la premi re ventualit Conserver RXNM IX M GAC BRAF OM BRAF MUT BRAF WT et DNA SD une temp rature comprise entre 2 et 8 C Apr s ouverture du flacon ces r actifs restent stables pendant 4 utilisations jusqu 60 jours ou jusqu la date de p remption selon la premi re ventualit BRAF OM et le m lange r actionnel actif pr par en ajoutant BRAF OM et M GAC RXNMIX doivent tre prot g s d une exposition prolong e la lumi re Le m
13. que tout le liquide est au fond du puits 06611818001 06FRC 11 Doc Rev 6 0 Figure 1 Disposition de la plaque d chantillons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BRAF Echant chant chant MUT 7 15 23 B BRAF chant Echant chant WT 8 16 24 c Echant chant Echant _ YP Ss iy iy yy yy yy iy YY YF fy 7 p Echant Echant Echant 2 10 18 g chant Echant Echant 3 11 19 p Echant Echant Echant 4 12 20 a chant chant chant 5 13 21 p chant chant chant 6 14 22 D Continuer jusqu ce que tous les chantillons du test aient t ajout s la plaque micropuits plaque AD E Couvrir la plaque micropuits plaque AD l aide du film scelleur fourni avec les plaques Utiliser l applicateur de film scelleur afin de s assurer que le film scelleur adh re bien la plaque micropuits plaque AD F V rifier que tout le liquide est dans le fond de chaque puits avant de d marrer l amplification et la d tection REMARQUE l amplification et la d tection doivent tre d marr es dans un d lai de 1 heure apr s l ajout de l ADN des chantillons au MMX actif D marrage de la PCR Se reporter au manuel d utilisation du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 pour obtenir les instructions d taill es des tapes de la proc dure de travail BRAF INTERPRETATION DES RESULTATS REMARQUE l ensemble des validations de cycle d analyse et d chantillon es
14. r p t Pr parer une nouvelle dilution du stock d ADN d chantillon pr c demment isol afin de r aliser une nouvelle plaque micropuits plaque AD avec les t moins ad quats pour effectuer une proc dure d amplification et de d tection T moin mutant BRAF Le r sultat du t moin BRAF M UT doit tre Valid Si le t moin BRAF M UT produit r guli rement des r sultats invalides contacter votre distributeur local Roche pour obtenir une assistance technique T moin BRAF de type sauvage Le r sultat du t moin BRAF WT doit tre Valid Si le t moin BRAF WT produit r guli rement des r sultats invalides contacter votre distributeur local Roche pour obtenir une assistance technique PR CAUTIONS RELATIVES LA PROC DURE Comme pour toute proc dure de test une bonne technique de laboratoire est essentielle pour une bonne performance de ce dosage En raison de la sensibilit analytique lev e de ce test il convient de porter une attention toute particuli re pour viter la contamination des r actifs et des m langes d amplification LIMITES DE LA PROC DURE 1 Ne tester que les types d chantillon indiqu s Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 n a t valid que pour une utilisation sur des chantillons de tissu FFPE de m lanome 2 Letest de mutation cobas 4800 BRAF V600 n a t valid que pour une utilisation avec la trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas Roche P N 05985
15. standard avec capacit de 20 000 x g Eppendorf 5417C ou quivalent Deux 2 blocs chaleur s che avec capacit de chauffage de tubes de microcentrifugeuse 56 C et 90 C Tubes de microcentrifugeuse Safe Lock de 1 5 mL st riles sans RNase DNase de qualit PCR Eppendorf n de r f 022363212 Spectrophotom tre UV Vis Nanodrop Thermo Scientific ND 1000 ou ND 2000 M langeur vortex Portoirs pour tubes de microcentrifugeuse Gants jetables non poudr s Thermom tre talonn pour bloc chaleur s che Bain marie pouvant maintenir une temp rature de 37 C Lame tranchant unique ou similaire Les pipettes doivent tre entretenues conform ment aux instructions du fabricant et leur pr cision ne doit pas diff rer de plus de 3 du volume d clar Utiliser des embouts filtre protection contre les a rosols ou d placement positif et exempts de DNase chaque fois que cela est sp cifi afin d viter toute d gradation de l chantillon et toute contamination crois e Tout le mat riel doit tre entretenu correctement conform ment aux instructions du fabricant Instruments et logiciel Analyseur cobas z 480 Unit de contr le du syst me cobas 4800 SR2 avec image Windows XP Logiciel du syst me cobas 4800 SR2 version 2 0 ou sup rieure Logiciel d analyse BRAF version 1 0 ou sup rieure Lecteur de codes barres ext USB Roche P N 05339910001 Imprimante HP P2055d Roche P N 05704375001
16. 06611818001 06FRC 22 Doc Rev 6 0 Plasmides homologues du BRAF Les chantillons ont t pr par s pour trois plasmides homologues du BRAF pseudog ne de BRAF ARAF et RAF1 plasmide BRAF V600E mutant et plasmide BRAF de type sauvage comme mentionn au tableau 17 De trois six r plicats de chaque membre de panel ont t analys s l aide du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Tableau 17 Echantillons de plasmides homologues du BRAF Panel Composition en volume Nom Membre Composant 1 Composant 2 1 95 de pseudog ne BRAF 5 de BRAF V600E Mutant Pseudog ne BRAF 2 100 de pseudog ne BRAF ARAF T 95 d ARAF 5 de BRAF V600E Mutant 2 100 d ARAF ae As 1 95 de RAF1 5 de BRAF V600E M utant 2 100 de RAF1 1 95 de BRAF de type sauvage 5 de BRAF V600E Mutant T moin 2 100 de BRAF de type sauvage 3 95 de tampon d lution de l ADN 5 de BRAF V600E M utant Aucun des trois plasmides homologues du BRAF test s n a t d tect par le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 lorsqu il tait test seul ce qui indique que les plasmides homologues du BRAF n ont pas de r action crois e avec le test Le plasmide BRAF V600E mutant 5 en pr sence de 95 de plasmides homologues du BRAF a donn un r sultat M utation Detected ce qui indique qu il n y a eu aucune interf rence des plasmides homologues dans la d tection de la mutation BRAF V600
17. 26 7 uL Calcul de la dilution du stock d ADN de l chantillon des concentrations gt 35 ng uL REMARQUE les stocks d ADN des chantillons doivent tre dilu s imm diatement avant l amplification et la d tection REMARQUE une seule amplification d tection est effectu e par chantillon en utilisant 25 uL d une dilution 5 ng uL du stock d ADN au total 125 ng A Si la concentration du stock d ADN est gt 35 ng L utiliser la formule suivante pour calculer la quantit de diluant d chantillon d ADN DNA SD n cessaire pour pr parer au moins 35 uL de stock d ADN dilu Cela permet d assurer que chaque chantillon utilise un minimum de 5 uL de stock d ADN Vol de DNA SD n cessaire en uL 5 uL de stock d ADN x conc du stock d ADN en ng L 5 ng uL 5 uL B Utiliser le volume calcul de DNA SD pour diluer 5 uL de stock d ADN Exemple Concentration du stock d ADN 42 ng uL A Vol de DNA SD n cessaire en uL 5 uL x 42 ng uL 5 ng uL 5 uL 37 uL B Utiliser le volume calcul de DNA SD pour diluer 5 uL de stock d ADN Dilution de l chantillon A Pr parer le nombre appropri de tubes Safe Lock de microcentrifugation de 1 5 mL pour les dilutions des stocks d ADN en les tiquetant avec l identification d chantillon appropri e dans la zone d ajout des chantillons B l aide d un pipetteur dot d embouts avec filtre de protection contre les a rosols pipeter le volume calcul de diluant d chanti
18. 5 suivi d un essuyage avec une solution d thanol 70 K Les solutions DNA PBB et WB contiennent du chlorhydrate de guanidine Si du liquide contenant ce tampon est renvers nettoyer avec un d tergent de laboratoire ad quat et de l eau En cas de d versement de liquide contenant des agents potentiellement infectieux nettoyer la zone affect e d abord avec du d tergent de laboratoire et de l eau puis avec de l hypochlorite de sodium 0 5 En cas de d versement de liquide sur l analyseur cobas z 480 suivre les instructions du manuel d utilisation du syst me cobas 4800 REM ARQUE l eau de Javel liquide vendue dans le commerce contient de l hypochlorite de sodium a une concentration de 5 25 Une dilution de l eau de J avel selon un rapport de 1 10 donnera une solution d hypochlorite de sodium 0 5 rronmnmouowx oe L Les chantillons doivent tre manipul s comme s il s agissait d agents infectieux en appliquant les proc dures de laboratoire d crites dans le document Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories et dans le document du CLSI M 29 A 35 M DNA TLB et DNA PBB contiennent du Triton X 100 irritant pour les membranes muqueuses viter tout contact avec les yeux la peau et les membranes muqueuses N DNA TLB DNA EB RXNMIX MGAC BRAF MUT BRAF WT et DNA SD contiennent de l azoture de sodium L azoture de sodium peut r agir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre et former des a
19. 536190 pour l extraction de l ADN g nomique 3 La d tection d une mutation d pend du nombre de copies du g ne mutant pr sentes dans l chantillon et peut tre affect e par l int grit de l chantillon la quantit d ADN isol ainsi que par la pr sence de substances interf rentes 4 Pour que les r sultats obtenus soient fiables il faut que les chantillons aient t fix s transport s conserv s et trait s de fa on appropri e Suivre les proc dures indiqu es dans la pr sente notice et dans le manuel d utilisation du syst me cobas 4800 5 L ajout de l enzyme AmpErase dans le m lange r actionnel du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 permet l amplification s lective de l ADN cible toutefois de bonnes pratiques de laboratoire et le respect strict des proc dures d crites dans la pr sente notice sont n cessaires pour viter la contamination des r actifs 6 L utilisation de ce produit doit tre limit e au personnel ayant re u une formation sur les techniques de PCR et l utilisation du syst me cobas 4800 7 Seul l analyseur cobas z 480 a t valid pour une utilisation avec ce produit Aucun autre syst me de PCR ne peut tre utilis avec ce produit 8 tant donn les diff rences inh rentes entre les technologies il est recommand aux utilisateurs de r aliser des tudes de corr lation entre les m thodes dans leur laboratoire avant de passer d une technologie une autre afin de d te
20. AF V600 m thode de quen ag au s quen age 454 r f rence M utation Detected M utation Detected 39 0 39 Mutation Not Detected H a se Mutation Not Mutation Detected 3 5 8 Detected Mutation Not Detected 3 52 a2 Total 62 82 144 a Mutation Detected indique la pr sence du type de mutation BRAF pr dominant V600E substitution mononucl otidique 1799 T gt A tel qu identifi par la m thode de s quencage sp cifique b Mutation Not Detected indique l absence du type de mutation BRAF pr dominant V600E tel qu identifi par la m thode de s quencage sp cifique c a d que le r sultat tait de type sauvage ou aucune mutation V600D V600E2 V600K et V600R On a observ 50 chantillons discordants Pour les 8 chantillons discordants ayant obtenu un r sultat Mutation Not Detected au test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et un r sultat M utation Detected au s quen age de Sanger les r sultats au s quen age 454 taient type sauvage dans deux cas V600K dans deux cas V600E2 dans un cas et V600E dans trois cas Ainsi trois chantillons ont obtenu un r sultat M utation Not Detected au test de mutation cobas 4800 BRAF V600 mais ont obtenu un r sultat positif pour V600E avec la m thode de r f rence et le s quen age 454 Sur les 42 chantillons qui ont obtenu un r sultat M utation Detected au test de mutation cobas 4800 BRAF V600
21. C 95 83 94 de corr lation totale 95 IC 95 91 97 Une fois les chantillons discordants entre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quen age bidirectionnel Sanger 2X r solus par s quen age 454 la concordance totale a t am lior e pour donner 98 et 95 pour le premier et le deuxi me lot respectivement Sp cificit La sp cificit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a t d termin e en testant 219 chantillons de tissu FFPE de m lanome en conjonction avec l tude de corr lation avec une m thode de r f rence S quen age Sanger La sp cificit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a t calcul e en d terminant le pourcentage d chantillons de tissu FFPE identifi s en tant que BRAF de type sauvage par le s quen age bidirectionnel Sanger 2X et correctement identifi s en tant que BRAF de type sauvage par le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 de corr lation n gative La sp cificit de corr lation n gative obtenue lors de l analyse des 219 chantillons tumoraux l aide du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 par rapport aux r sultats obtenus a l aide iu s quencage bidirectionnel Sanger 2X tait de 84 tableau 11 en utilisant le premier lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et de 79 tableau 12 pour le deuxi me lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Analyse des chantillons disc
22. E Microorganismes cutan s Les microorganismes cutan s suivants n ont pas montr de r action crois e dans le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 lorsqu ils taient ajout s un chantillon de type sauvage 1 x 10 unit s formatrices de colonies au cours de l tape de lyse tissulaire Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Corynebacterium xerosis Corynebacterium jeikeium Corynebacterium minutissimum 6 Corynebacterium ulcerans Les microorganismes test s n ont pas non plus montr d interf rence avec la d tection de la mutation BRAF V600E lorsque 1 x 10 unit s formatrices de colonies taient ajout es au cours de l tape de lyse tissulaire d un chantillon contenant un faible taux 7 6 de mutation BRAF V600E Interf rence CT CT NO UE Les triglyc rides lt 74 mM 2 x la concentration lev e recommand e par le CLS l h moglobine lt 2 mg mL 1 x la concentration lev e recommand e par le CLSI les tissus n crotiques lt 95 et la m lanine de synth se lt 4 g mL n ont pas montr d interf rence avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 lorsque la substance potentiellement interf rente tait ajout e l tape de lyse de la proc dure de pr paration des chantillons 06611818001 06FRC 23 Doc Rev 6 0 PERFORMANCES CLINIQUES Reproductibilit Une tude a t men e pour valuer la reproductibilit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 sur 3 sites d ana
23. F V600 Tout chantillon contenant moins de 50 de cellules tumorales devra subir une macro dissection avant le d paraffinage REMARQUE se r f rer au manuel d utilisation du syst me cobas 4800 pour des instructions d utilisation d taill es concernant l analyseur cobas z 480 REMARQUE les blocs chaleur s che permettant de chauffer les tubes de centrifugeuse doivent tre allum s et r gl s 56 C et 90 C Taille de la s rie La trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 est con ue pour l analyse d un minimum de 3 chantillons plus t moins et d un maximum de 24 chantillons plus t moins Il est possible d analyser moins de 3 chantillons plus t moins mais cela risque d entra ner un volume de r actifs insuffisant pour analyser un total de 24 chantillons plus t moins avec la trousse Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 contient des r actifs en quantit suffisante pour 8 cycles d analyse de 3 chantillons plus t moins Un t moin mutant du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 BRAF MUT et un t moin de type sauvage du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 BRAF WT sont n cessaires pour chaque cycle d analyse voir la section Contr le de qualit Proc dure de travail REMARQUE le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 peut tre utilis pour 24 chantillons en un cycle d analyse Pour maximiser l utilisation des r actifs un cycle d analyse doit inclure au minimum trois 3 c
24. analytique La sensibilit analytique du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a t tudi e l aide de panels de dilution pr par s partir de trois types d chantillons e M langes d chantillons pr par s en m langeant des stocks d ADN obtenus partir d chantillons de tissu FFPE de mutant BRAF V600E et d chantillons de tissu FFPE de BRAF de type sauvage e chantillons de tissu FFPE individuels pr par s partir de stocks d ADN provenant de trois chantillons de mutant BRAF V600E e M lange de lign es cellulaires pr par es en m langeant des stocks d ADN obtenus partir de lign es cellulaires de mutant BRAF V600E et de lign es cellulaires BRAF de type sauvage Tous les chantillons utilis s dans cette tude ont t s quenc s par un s quen age 454 afin de d terminer le pourcentage de mutation de chaque chantillon Sensibilit analytique sur des m langes d chantillons Les extraits d ADN d chantillons de tissu FFPE de mutant BRAF V600E ont t m lang s des extraits d chantillons de tissu FFPE de BRAF de type sauvage afin d obtenir un chantillon 10 trois chantillons 5 un chantillon 2 5 de taux de mutation et un chantillon BRAF de type sauvage Apr s le m lange les taux de mutation ont t v rifi s par s quen age 454 Chacun des cinq m langes d chantillons contenant une mutation V600E mais sans chantillon de type sauvage a t dilu afin
25. ation e Plasmides BRAF non V600E e Plasmides homologues du BRAF e Microorganismes cutan s La r activit crois e a galement t valu e en d terminant si la pr sence de plasmides homologues du BRAF ou de microorganismes cutan s interf rait dans la d tection de la mutation BRAF V600E Echantillons de tissu FFPE BRAF non V600E avec diff rents pourcentages de mutation Quatorze 14 chantillons de tissu FFPE de m lanome BRAF mutant non V600E V600D V600E2 V600R ou V600K ont t analys s avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Les trois r plicats des huit chantillons BRAF non V600E ont montr une r activit crois e avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Les faux positifs obtenus pour ces r plicats provenaient d chantillons de BRAF V600D mutant 17 7 de mutation de BRAF V600E2 mutant 68 0 de mutation ou de BRAF V600K mutant taux de mutation sup rieur 30 Aucune r activit crois e n a t observ e pour l chantillon de BRAF V600R mutant mutation 23 1 tableau 15 06611818001 06FRC 21 Doc Rev 6 0 Tableau 15 Taux de Mutation Detected observ s l aide du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 pour les mutations BRAF Non V600E Num ro de tat de la Pourcentage Contenu Stade Taux de Mutation l chantillon mutation BRAF de mutation tumoral tumoral Detected n 3 1 V600D 17 7
26. cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test cobas DESTINE AU DIAGNOSTIC IN VITRO cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P N 05985536190 cobas 4800 BRAF V600 M utation Test BRAF 24 Tests P N 05985595190 INDICATION l achat de ce produit autorise l acheteur l utiliser des fins d amplification et de d tection des s quences d acides nucl iques par r action de polym risation en cha ne en temps r el PCR polymerase chain reaction et des processus associ s pour des diagnostics in vitro humains Aucun brevet g n ral ou autre licence de tout type autre que ce droit sp cifique d utilisation par l achat n est ainsi octroy USAGE PR VU Le test de mutation cobas BRAF V600 est un instrument diagnostique in vitro destin la d tection qualitative de la mutation BRAF V600E dans l ADN provenant de tissu m lanomateux humain fix la formaline et enrob de paraffine Le test de mutation cobas BRAF V600 est un test de PCR en temps r el utiliser avec le syst me cobas 4800 et qui sert identifier les patients atteints de m lanome dont les tumeurs sont porteuses de la mutation V600E sur le proto oncogene BRAF RESUME ET EXPLICATION DU TEST Des mutations activatrices du proto oncog ne BRAF se produisent dans de nombreux cancers humains notamment le m lanome malin le cancer colorectal le cancer des ovaires et le cancer de la thyroide Des mutations du BRAF ont t identifi es dans 40
27. condes Centrifuger entre 16 000 x g et 20 000 x g pendant 2 minutes et retirer le surnageant sans disperser le culot M ettre le surnageant au rebut avec les d chets chimiques REMARQUE sile culot flotte dans le surnageant restant centrifuger nouveau pendant 1 minute entre 16 000 xg et 20 000 x g Retirer tout surnageant restant J S cher le culot tissulaire pendant 10 minutes 56 C dans un bloc chauffant les tubes tant ouverts REMARQUE s assurer que l thanol s est compl tement vapor et que le culot est sec avant de passer l tape suivante REMARQUE si n cessaire les culots s ch s peuvent tre conserv s 24 heures une temp rature comprise entre 2 et 8 C K Remettre le culot tissulaire en suspension dans 180 uL de Tampon de lyse de tissu d ADN DNA TLB L Ajouter 70 uL de PK reconstitu e M Continuer l tape A de la proc dure Isolation de l ADN Isolation de l ADN A Passer au vortex le tube contenant le m lange chantillon DNA TLB PK pendant 30 secondes REMARQUE le tissu doit tre totalement immerg dans le m lange DNA TLB PK B Placer le tube dans le bloc chauffant sec 56 C et incuber pendant 60 minutes C Passer le tube au vortex pendant 10 secondes REMARQUE le tissu doit tre totalement immerg dans le m lange DNA TLB PK D Placer le tube dans le bloc chauffant sec 90 C et incuber pendant 60 minutes REMARQUE pendant l incubation pr parer le no
28. cropuits plaque AD n cessaire pour le cycle d analyse Ne pas toucher la plaque l ext rieur du puits avec l embout de la pipette TOoOomm Ajout des t moins et des chantillons A Ajouter 25 uL de t moin BRAF M UT au puits A01 de la plaque micropuits plaque AD et bien m langer l aide du pipetteur en aspirant puis en distribuant le liquide dans le puits au moins deux fois B En utilisant un embout de pipette neuf ajouter 25 uL de t moin BRAF WT au puits BO1 de la plaque a micropuits plaque AD et bien m langer l aide du pipetteur en aspirant puis en distribuant le liquide dans le puits au moins deux fois REMARQUE chaque cycle d analyse doit contenir un t moin BRAF MUT en position A01 et un t moin BRAF WT en position B01 Dans le cas contraire le cycle d analyse serait invalid par l analyseur cobas z 480 REMARQUE changer de gants selon les besoins afin d viter toute contamination entre les chantillons ainsi qu une contamination via la face externe des tubes de r action de PCR C l aide d un pipetteur dot d embouts avec filtre de protection contre les a rosols ajouter 25 uL d ADN d chantillon dilu au puits appropri contenant le MM X actif en commen ant par la position C01 de la plaque micropuits plaque AD en suivant le mod le de la figure 1 ci dessous M langer le contenu du puits en utilisant le pipetteur pour aspirer et distribuer le liquide dans le puits au moins deux fois S assurer
29. de produire les membres du panel d taill s au tableau 3 Pr paration des membres du panel de dilution partir des m langes d chantillons Tableau 3 moyen de Quantit d ADN dans les membres uniquement M lange mutation du panel de dilution ng 25 uL 9 1 125 62 5 31 3 M lange 10 n 6 46 125 5 2 5 1 3 0 6 0 3 M lange 1 5 n 5 5 1 125 5 2 5 1 3 0 6 0 3 M lange 2 5 n 5 5 5 125 5 2 5 1 3 0 6 0 3 M lange 3 5 n 5 3 1 125 62 5 31 3 M lange 2 5 n 5 0 type sauvage 125 Pourcentage moyen de mutation du m lange test par s quencage 454 Quantit d ADN g nomique contenue dans chaque membre du panel Le volume d chantillon du test est de 25 UL 06611818001 06FRC 14 Doc Rev 6 0 Huit 8 r plicats de chaque membre du panel ont t analys s sur chacun des 3 lots de trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 n 24 membre du panel Le tableau 4 montre la sensibilit de chaque m lange de tissu FFPE d termin e par la plus faible quantit d ADN ayant donn un taux d au moins 95 de r sultat BRAF V600E M utation Detected lignes gris es Tableau 4 Sensibilit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 sur des m langes de tissu FFPE M lange de tissu Pourcentage de mutation Quantit
30. e l chantillon Ajouter 180 uL de DNA TLB dans le tube Safe Lock de microcentrifugeuse de 1 5 mL tiquet Ajouter 70 uL de PK reconstitu e au tube Safe Lock de microcentrifugeuse de 1 5 mL contenant du DNA TLB Racler le tissu pour le retirer de la lame et immerger dans le m lange DNA TLB et PK Continuer l tape A de la proc dure Isolation de l ADN m rom D paraffinage des sections de tissu FFPE non mont es sur lames Remarque le xyl ne est un produit chimique dangereux Toutes les tapes du d paraffinage doivent tre effectu es sous une hotte chimique Voir Mises en garde et pr cautions A Placer une section de tissu FFPE de 5 um dans un tube Safe Lock de microcentrifugeuse de 1 5 mL tiquet avec l information d identification d chantillon pour chaque chantillon Ajouter 500 uL de xyl ne un tube Safe Lock de microcentrifugeuse contenant la section de tissu FFPE Bien m langer au vortex pendant 10 secondes Laisser le tube reposer pendant 5 minutes une temp rature comprise entre 15 et 30 C Ajouter 500 uL d thanol absolu et m langer au vortex pendant 10 secondes Laisser le tube reposer pendant 5 minutes une temp rature comprise entre 15 et 30 C Centrifuger entre 16 000 x g et 20 000 x g pendant 2 minutes et retirer le surnageant sans disperser le culot Mettre le surnageant au rebut avec les d chets chimiques Ajouter 1 mL d thanol absolu et passer au vortex pendant 10 se
31. e de votre r gion si vous avez d autres questions Honey 4 0 Section Instruments et logiciel mise a jour Ajout de ou No Mutation Detected comme type de r sultat de test dans le Tableau 2 de la section INTERPRETATION DES RESULTATS Mise jour des descriptions de la page des symboles harmonis s la fin de la notice Retrait de la phrase Tous droits r serv s du copyright Veuillez communiquer avec le repr sentant de Roche de votre r gion si vous avez d autres questions Doc Rev 5 0 Remplacement de l adresse am ricaine RMS du fabricant l gal par l adresse allemande RDG tents Veuillez contacter votre repr sentant local Roche si vous avez des questions Doc Rev 6 0 Les instructions de conservation et de manipulation des chantillons de la version Doc Rev 2 0 ont 07 2014 t r tablies Veuillez communiquer avec le repr sentant de Roche de votre r gion si vous avez d autres questions D Distributed by Fabriqu aux tats Unis Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Stra e 116 68305 M annheim Germany Roche Diagnostics 201 boulevard Armand Frappier H7V 4A2 Laval Qu bec Canada For Technical Assistance call Pour toute assistance technique appeler le 1 877 273 3433 COBAS COBAS Z et AM PERASE sont des marques de commerce de Roche La technologie de pr vention des interf rences dans l enzyme AmpErase est couverte par le brevet am ricain n 5 035 996 et ses contreparties trang r
32. e l hypochlorite de sodium une concentration de 5 25 Une dilution de l eau de Javel selon un rapport de 1 10 donnera une solution d hypochlorite de sodium 0 5 Pr paration de l instrument Se r f rer au manuel d utilisation de l instrument cobas 4800 pour un mode d emploi d taill concernant la configuration pour un nouveau cycle d analyse 06611818001 06FRC 9 Doc Rev 6 0 Calcul de la dilution du stock d ADN de l chantillon Calcul de la dilution du stock d ADN de l chantillon des concentrations comprises entre 5 ng L et 35 ng uL REMARQUE les stocks d ADN des chantillons doivent tre dilu s imm diatement avant l amplification et la d tection REMARQUE une seule amplification d tection est effectu e par chantillon en utilisant 25 uL d une dilution 5 ng uL du stock d ADN au total 125 ng A Pour chaque chantillon d terminer la quantit de stock d ADN n cessaire l aide de la formule suivante Volume de stock d ADN n cessaire 35 uL x5 ng ul concentration du stock d ADN en ng ul B Pour chaque chantillon d terminer la quantit de diluant d chantillon d ADN DNA SD n cessaire l aide de la formule suivante Volume de DNA SD n cessaire en uL 35 uL Volume de stock d ADN n cessaire en uL Exemple Concentration du stock d ADN 21 ng uL A Volume de stock d ADN n cessaire 35 uL x5 ng uL 21 ng ul 8 3 uL B Volume de DNA SD n cessaire en uL 35 uL 8 3 uL
33. ec un taux de mutation de 17 7 tableau 16 Tableau 16 Plus faible concentration d ADN donnant un r sultat Mutation Detected au test de mutation cobas 4800 BRAF V600 permettant de d tecter une r activit crois e Num ro de tat de la Pourcentage Plus faible quantit d ADN avant la perte l chantillon mutation BRAF de mutation de la r activit crois e n 3 1 V600D 17 7 15 6 ng 25 uL 2 V600E2 68 0 7 8 ng 25 uL 3 314 3 9 ng 25 uL 4 34 6 3 9 ng 25 uL 5 39 3 3 9 ng 25 uL 6 POSER 36 1 2 0 ng 25 uL 7 61 7 3 9 ng 25 uL 8 68 8 0 5 ng 25 uL Plasmides BRAF non V600E Des panels de dilution de plasmides avec un pourcentage de mutation allant de 5 75 dans un arri re plan de plasmide de type sauvage ont t pr par s pour les neuf mutations BRAF non V600E suivantes D594G G596R K601E L597Q L597S V600D V600E2 V600K et V600R Trois r plicats de chacun des membres des dix panels de dilution de plasmides ont t analys s l aide du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Une r activit crois e a t observ e dans les 3 r plicats pour le plasmide BRAF V600D a un taux de mutation gt 10 pour le plasmide BRAF V600K un taux de mutation gt 35 et pour le plasmide BRAF V600E2 a un taux de mutation gt 65 Aucune r activit crois e n a t observ e avec des plasmides pour les autres mutations BRAF test es
34. erni re section est indiqu p ex 95 95 Des r sultats indiquant M utation Not Detected ont t obtenus sur la totalit des 24 chantillons BRAF de type sauvage test s avec un contenu tumoral allant de moins de 1 50 Une r activit crois e a t observ e avec deux chantillons de BRAF V600K mutant et un chantillon de BRAF V600D mutant Des r sultats Mutation Not Detected ont t obtenus sur les 13 autres chantillons BRAF V600K et sur un seul chantillon BRAF V600R mutant avec un contenu tumoral allant de 5 45 06611818001 06FRC 18 Doc Rev 6 0 Corr lation avec une m thode de r f rence Deux cent dix neuf 219 chantillons de tissu FFPE de m lanome ont t test s l aide de 2 lots de la trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Les chantillons qui pr sentaient un contenu tumoral inf rieur 50 ont subi une macro dissection Les tests de comparaison par s quen age bidirectionnel Sanger 2X ont t effectu s sur tous les chantillons Les r sultats discordants entre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le test de s quencage bidirectionnel Sanger 2X ont t r solus par un s quen age 454 R sultats du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et du s quencage bidirectionnel Sanger 2X Les informations sur les chantillons et les r sultats du s quen age bidirectionnel Sanger 2X pour les 219 chantillons sont r sum s au tableau 9 qui ind
35. es sont retir es par centrifugation Les acides nucl iques absorb s sont lav s puis lu s dans une solution aqueuse La quantit d ADN g nomique est d termin e par spectrophotom tre et ajust e une concentration fixe devant tre ajout e au m lange d amplification d tection L ADN cible est ensuite amplifi et d tect sur l analyseur cobas z 480 l aide des r actifs d amplification et de d tection fournis dans la trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 La section Information sur les r visions apport es au document est situ e la fin de ce document 06611818001 06FRC 1 Doc Rev 6 0 Amplification PCR et d tection S lection des cibles Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 utilise des amorces qui d finissent une s quence de 116 paires de bases de la r gion du g nome humain contenant le site de l exon 15 BRAF V600E Le g ne BRAF complet n est pas amplifi Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 est con u pour d tecter le changement de nucl otide 1799 T gt A dans le g ne BRAF qui entra ne une substitution valine acide glutamique au codon 600 V600E Les sondes TaqMan marqu es par fluorophore sp cifiques aux cibles BRAF de type sauvage et V600E se lient aux s quences sauvages et V600E respectivement La s quence sauvage et la s quence V600E sont d tect es par des canaux optiques d di s chaque s quence Amplification des cibles L ADN polym rase Thermus species Z05 e
36. es d tenus par Invitrogen Corporation et utilis sous licence par Roche M olecular Systems Inc EPPEN DORF est une marque de commerce d Eppendorf AG PIPET AID est une marque de commerce de Drummond Scientific NANODROP est une marque de commerce de Thermo Scientific 2014 Roche M olecular Systems Inc 07 2014 Doc Rev 6 0 06611818001 06FRC 06611818001 06FRC 28 Doc Rev 6 0 Les symboles suivants sont d sormais en usage pour l tiquetage des produits diagnostiques par PCR de Roche SW Logiciel auxiliaire Mandataire dans la Communaut europ enne Fiche technique a codes barres Consulter les instructions d utilisation Suffisant pour lt n gt tests Contenu du kit Distributeur Dispositif m dical de diagnostic in vitro Fichier de d finition de tests Limite sup rieure de la plage assign e 06611818001 05FRC j A nm OEE 29 Code du lot Risques biologiques R f rence du catalogue Pour valuation de performance IVD uniquement Limite inf rieure de la plage assign e Fabricant Conserver dans un endroit sombre Limites de temp rature Utiliser jusque Doc Rev 7 0
37. et Mutation Not Detected pour la mutation V600E au s quen age de Sanger 17 ont obtenu un r sultat positif pour V600E au s quen age 454 De plus la mutation V600K a t d tect e dans 24 chantillons au s quen age de Sanger et au s quen age 454 Pour un chantillon ayant obtenu un r sultat positif au test de mutation cobas 4800 BRAF V600 le s quen age de Sanger a montr une mutation rare au codon 600 GAC Au total 94 chantillons concordants ont t analys s par s quencage 454 La corr lation avec le s quencage 454 tait de 100 39 39 pour les chantillons mutants concordants et de 94 5 52 55 pour les chantillons non mutants concordants Mutations non V600E Les r sultats combin s du s quen age de Sanger et du s quen age 454 pour la population admissible qui comprend 32 chantillons avec des r sultats valides au s quen age 454 et des r sultats invalides au s quen age de Sanger ont permis d identifier les mutations non V600E suivantes V600K V600R et V600E2 tableau 20 ci dessous Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a d tect la mutation chez 70 des patients valuables porteurs de mutations V600K tel que d termin au s quen age de Sanger 06611818001 06FRC 25 Doc Rev 6 0 Tableau 20 Pr valence des types de mutation BRAF V600 tel que d termin par s quen age bidirectionnel 2X de Sanger ou par s quen age 454 dans la population valuable
38. flacon de WB M langer en retournant le flacon 5 10 fois Noter sur le flacon que l thanol a t ajout avec la date Conserver le tampon WB I actif une temp rature comprise entre 15 et 30 C 4 Pr parer le Tampon de lavage Il de l ADN WB II actif en ajoutant 50 mL d thanol absolu au flacon de WB II M langer en retournant le flacon 5 10 fois Noter sur le flacon que l thanol a t ajout avec la date Conserver le tampon WB II actif une temp rature comprise entre 15 et 30 C D paraffinage des sections de tissu FFPE mont es sur lames Remarque le xyl ne est un produit chimique dangereux Toutes les tapes du d paraffinage doivent tre effectu es sous une hotte chimique Voir Mises en garde et pr cautions A Ajouter une lame sur laquelle est mont e une section de tissu FFPE de 5 um dans un r cipient contenant une quantit suffisante de xyl ne pour recouvrir le tissu et laisser tremper pendant 5 minutes 06611818001 06FRC 7 Doc Rev 6 0 B Transf rer la lame vers le r cipient avec une quantit d thanol absolu suffisante pour recouvrir le tissu et laisser tremper pendant 5 minutes C Retirer la lame et laisser la section s cher compl tement l air 5 10 minutes Effectuer une macro dissection si l chantillon contient moins de 25 de cellules tumorales tiqueter un tube Safe Lock de microcentrifugeuse de 1 5 mL pour chaque chantillon avec l information d identification d
39. hantillons de patients plus les t moins Le processus de test avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 consiste en une pr paration manuelle des chantillons l aide de la trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas DNA suivie par l amplification la d tection sur l analyseur cobas z 480 l aide de la trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 La taille des cycles d analyse peut varier d un chantillon plus t moins 24 chantillons plus t moins Pr paration des r actifs 1 Reconstituer la Prot inase K PK en ajoutant 4 5 mL d eau st rile de qualit PCR au flacon l aide d une pipette s rologique jetable et st rile de 5 mL M langer en retournant le flacon 5 10 fois Aliquoter 450 uL de PK reconstitu e dans des tubes Safe Lock de microcentrifugeuse de 1 5 mL et conserver 20 C Si la Prot inase K a d j t reconstitu e et congel e d congeler un nombre suffisant d aliquotes pour traiter le nombre d chantillons analyser avant le d paraffinage il faut 70 uL de PK reconstitu e pour chaque chantillon 2 Toutes les solutions conserv es entre 15 et 30 C doivent tre claires En pr sence d un pr cipit dans l un des r actifs chauffer la solution dans un bain marie 37 C jusqu dissolution du pr cipit Ne pas utiliser tant que tous les pr cipit s ne sont pas dissous 3 Pr parer le Tampon de lavage de l ADN WB actif en ajoutant 15 mL d thanol absolu au
40. ification de l ADN REMARQUE la mesure de la concentration de l ADN doit tre effectu e imm diatement apr s la proc dure d isolation de l ADN avant conservation Quantification de l ADN A M langer chaque stock d ADN en le passant au vortex pendant 5 secondes avant la quantification B Quantifier l ADN l aide d un spectrophotom tre UV Vis Nanodrop ND 1000 ou ND 2000 conform ment au protocole indiqu par le fabricant Utiliser DNA EB comme blanc pour l instrument Il est en moyenne n cessaire d effectuer 2 lectures Les deux mesures ne doivent pas diff rer de plus de 10 l une par rapport l autre lorsque les lectures de concentration d ADN sont 2 20 0 ng uL Pour des lectures de concentration d ADN lt 20 0 ng uL les deux mesures ne doivent pas diff rer de plus de 2 0 ng uL C La concentration du stock d ADN doit tre gt 5 ng uL pour effectuer le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Une seule amplification d tection est effectu e par chantillon en utilisant 25 uL d une dilution 5 ng uL du stock d ADN au total 125 ng REM ARQUE chaque stock d ADN doit avoir une concentration minimale de 5 ng uL pour effectuer le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Si la concentration du stock d ADN est lt 5 ng L la proc dure d isolation de l ADN devra tre r p t e pour cet chantillon l aide de deux sections de tissu FFPE de 5 um Apr s le d paraffinage passer l tape D du D paraffinage des
41. ion Not 2 5 5 47 Detected Mutation Not 3 5 5 11 Detected Mutation Not 4 10 10 43 Detected 5 10 10 13 9 Mutation Detected 6 15 10 6 3 Mutation Detected 7 15 15 22 7 Mutation Detected 8 15 15 3 3 Mutation Detected 9 15 15 28 9 Mutation Detected 10 15 15 13 8 Mutation Detected 11 15 15 13 9 Mutation Detected 12 15 20 5 2 Mutation Detected 13 20 20 28 0 Mutation Detected 14 20 20 23 Mutation Detected 15 25 20 12 8 Mutation Detected 16 25 25 25 3 Mutation Detected 17 30 25 19 5 Mutation Detected 18 30 30 9 9 Mutation Detected 19 30 35 44 Mutation Detected 20 30 35 17 2 Mutation Detected 21 35 30 8 1 Mutation Detected 22 35 35 72 Mutation Detected 23 35 35 11 5 Mutation Detected 24 35 35 21 5 Mutation Detected 25 35 40 36 3 Mutation Detected 26 40 35 6 5 Mutation Detected 27 40 35 11 6 Mutation Detected 28 40 40 141 Mutation Detected 29 40 40 20 9 Mutation Detected 30 40 40 28 0 Mutation Detected 31 40 45 35 8 Mutation Detected 32 45 45 9 8 Mutation Detected 33 50 40 79 Mutation Detected Le contenu tumoral de l chantillon a t valu au moyen d un examen effectu par un anatomopathologiste sur la premi re et la derni re des douze sections de 5 um adjacentes de chaque chantillon Le contenu tumoral de la premi re et de la d
42. ion avec bouchons CT Tubes de pr l vement 06611818001 06FRC 5 Doc Rev 6 0 B cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test BRAF 24 tests P N 05985595190 RXNM IX M lange r actionnel bouchon avec bouton de couleur blanc cass MGAC Ac tate de magn sium bouchon avec bouton jaune BRAF OM M lange oligo BRAF bouchon noir avec bouton blanc BRAF MUT T moin mutant BRAF bouchon avec bouton rouge BRAF WT T moin BRAF de type sauvage bouchon avec bouton bleu DNA SD Diluant chantillon d ADN bouchon avec bouton violet MATERIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI 2k Xyl ne Sigma n de r f 247642 ou Fisher Scientific n de r f X5 4 Ethanol absolu Sigma n de r f E7023 ou Fisher Scientific n de r f BP2818 500 Isopropanol Sigma n de r f 190764 ou Fisher Scientific n de r f A451 1 Eau st rile eau de qualit PCR Applied Biosystems n de r f AM 9937 ou eau de qualit biologique mol culaire Thermo Scientific n de r f SH 3053801 Pipettes s rologiques jetables et st riles 5 et 25 mL Plaque micropuits plaque AD et film scelleur Roche P N 05232724001 du syst me cobas 4800 Pipetteurs multi canaux capacit 10 uL 20 uL 200 uL et 1000 uL avec embouts de protection contre les a rosols ou d placement positif exempts de DNase Dispositif d aide au pipetage Drummond P N 4 000 100 ou quivalent Microcentrifugeuse de table
43. ique Une tude clinique a t men e pour valuer le pourcentage de corr lation positive et n gative du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 avec le s quen age bidirectionnel 2X de Sanger comme m thode de r f rence pour la d tection des mutations dans le codon 600 du proto oncogene BRAF Des chantillons de tissu m lanomateux humain fix la formaline et enrob de paraffine ont t obtenus d une cohorte de patients ayant subi un d pistage s quentiel dans le cadre d essais cliniques de phase Il et Ill sur le v muraf nib Le principal objectif tait d valuer la corr lation entre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quencage de Sanger pour la d tection de la mutation canonique V600E 1799 T gt A Caract ristiques d mographiques et cliniques Les caract ristiques d mographiques des patients de cette tudes montrent que l ge le sexe et l origine ethnique des patients ayant particip aux essais de phases Il et Ill taient semblables et elles taient comparables aux donn es d mographiques des patients d autres essais cliniques de grande envergure men s sur le traitement action g n rale dans le m lanome au stade avanc Patients chantillons admissibles et valuables On a obtenu un r sultat valide au test de mutation cobas 4800 BRAF V600 pour les 477 patients admissibles dans cette cohorte Le s quen age de Sanger n a pas donn de r sultat valide dans 9 2 des chantillons 44 477
44. ique le stade tumoral en fonction du s quen age Sanger ainsi qu au tableau 10 qui montre le pourcentage de contenu tumoral en fonction du s quencage Sanger Quatre vingt dix neuf 99 des 219 chantillons contenaient du BRAF V600E mutant alors que 120 des chantillons contenaient soit du BRAF de type sauvage soit du BRAF V600E non mutant d apr s le s quen age Sanger Tableau 9 Stade tumoral en fonction du s quencage Sanger R sultats du s quen age bidirectionnel Sanger 2X Type Stade tumoral V600E sauvage V600K V600R du total Stade 0 1 0 0 0 5 Stade II 7 11 3 1 Stade III 25 27 1 0 Stade IV 67 67 9 0 143 Total 99 106 13 1 219 Tableau 10 du contenu tumoral en fonction du s quen age Sanger R sultats du s quencage bidirectionnel Sanger 2X du contenu Type tumoral sauvage V600K V600R du total lt 50 20 1 219 100 0 Les r sultats obtenus lors de l analyse des 219 chantillons tumoraux l aide du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 par rapport aux r sultats obtenus a l aide du s quencage bidirectionnel Sanger 2X sont indiqu s au tableau 11 pour le premier lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et au tableau 12 pour le Acne lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Tableau 11 Test de mutation cobas 4800 BRAF V600 premier lot en fonction du s quen age bidirectionnel Sanger 2X S quencage bidirectio
45. llon d ADN DNA SD dans chaque tube d chantillon tiquet C Passer au vortex chaque chantillon de stock d ADN pendant 10 secondes D l aide d un pipetteur dot d embouts avec filtre de protection contre les a rosols pipeter d licatement le volume calcul de chaque stock d ADN d chantillon dans le tube tiquet de fa on appropri e contenant le DNA SD Utiliser un embout de pipette neuf pour chaque chantillon E Fermer et m langer chaque stock d ADN d chantillon en le passant au vortex pendant 10 secondes F Changer de gants 06611818001 06FRC 10 Doc Rev 6 0 Pr paration du m lange r actionnel M M X actif REMARQUE le m lange Oligo BRAF et le MMX actif sont sensibles la lumi re Tout m lange ouvert de BRAF OM et de MMX actif doit tre prot g d une exposition prolong e la lumi re A Calculer le volume de RXNM IX n cessaire l aide de la formule suivante Volume de RXNM IX n cessaire nombre d chantillons 2 t moins 1 x 10 uL B Calculer le volume de BRAF OM n cessaire l aide de la formule suivante Volume de BRAF OM n cessaire nombre d chantillons 2 t moins 1 x8 uL C Calculer le volume de M GAC n cessaire l aide de la formule suivante Volume de M GAC n cessaire nombre d chantillons 2 t moins 1 x7 uL Le tableau 1 peut tre utilis pour d terminer le volume de chaque r actif n cessaire pour la pr paration du MMX actif en fonction du n
46. lyse externes 2 op rateurs par site 3 lots de r actifs et 5 jours d analyse non cons cutifs avec un panel de 8 membres d chantillons d ADN provenant de sections de tissu FFPE de m lanome malin Ce panel comprenait la fois des chantillons pigment s et non pigment s et une plage de pourcentages de contenu tumoral et de pourcentages d all les mutants y compris un chantillon la limite de d tection LOD de 5 Au total 92 des 94 cycles d analyse 97 9 taient valides Sur les 1442 chantillons test s 2 0 14 ont donn des r sultats non valides Pour tous les membres de panel l exception des chantillons LOD des r sultats corrects ont t enregistr s pour 100 des tests valides y compris les membres de panel d chantillons pr sentant un taux de mutation de 20 et deux membres de panel identifi s comme tant fortement pigmentes Pour le membre de panel LOD la mutation V600E a t d tect e dans 90 162 180 des chantillons Aucun faux positif n a t enregistr pour les chantillons WT test s Pour r sumer le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 s est av r hautement reproductible la fois dans les chantillons pigment s et non pigment s dans les chantillons pr sentant un faible contenu tumoral et un faible pourcentage d all les mutants et pour tous les sites d analyse op rateurs lots de r actifs et jours d analyse La sp cificit analytique tait de 100 tude d utilit clin
47. mbre n cessaire de tubes de filtration FT avec bouchon charni re en les pla ant sur les tubes de pr l vement CT et tiqueter chaque unit FT CT avec l identification correcte sur le bouchon de chaque FT REMARQUE chaque chantillon n cessite 1 FT 3 CT et un tube d lution tube de microcentrifugeuse d 1 5 mL REMARQUE pendant l incubation tiqueter le nombre n cessaire de tubes d lution tubes de centrifugeuse de 1 5 mL avec l identification d chantillon correcte E Laisser le tube refroidir une temp rature comprise entre 15 et 30 C Apr s refroidissement centrifuger par coups pour recueillir tout ventuel liquide en exc s provenant du bouchon Ajouter 200 uL de DNA PBB et m langer en pipettant et en rejetant 3 fois Incuber le tube une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 10 minutes Ajouter 100 uL d isopropanol a chaque tube et m langer le lysat en pipettant et en rejetant 3 fois Transf rer tout le lysat dans l unit FT CT correctement tiquet e onmonw Fee Gi ae 06611818001 06FRC 8 Doc Rev 6 0 J Centrifuger les unit s FT CT 8000 x g pendant 1 minute K Placer chaque FT sur un nouveau CT J eter la fraction contenue dans l ancien CT avec les d chets chimiques et mettre au rebut l ancien CT de fa on appropri e L Ajouter 500 uL de WB actif au FT REMARQUE la pr paration du WB actif est d crite la section Pr paration des r actifs M Cen
48. n d lution de l ADN Tampon Tris HCI 0 09 d azoture de sodium FT 1x25 unit s Tubes de filtration avec bouchons 3 x 25 unit s Tubes de pr l vement cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test BRAF 24 tests P N 05985595190 RXNMIX 3x0 16 mL m lange r actionnel Tampon tricine Ac tate de potassium Hydroxyde de potassium Glyc rol Tween 20 EDTA 5 de dim thylsulfoxyde lt 0 09 de dNTP lt 0 10 d ADN polym rase Z05 d origine microbienne lt 0 10 d enzyme AmpErase uracile N glycosylase d origine microbienne lt 0 003 d aptam re oligonucl otidique 0 08 d azoture de sodium M GAC 3x0 15 mL Ac tate de magn sium Ac tate de magn sium 0 09 d azoture de sodium BRAF OM 3x0 13 mL M lange oligo BRAF Tampon Tris HCl EDTA 0 09 d azoture de sodium ARN poly rA synth tique lt 0 01 d amorces BRAF en amont et en aval lt 0 01 de sondes BRAF marqu es par fluorescence 06611818001 06FRC 3 Doc Rev 6 0 BRAF MUT 2x0 13 mL T moin mutant BRAF Tampon Tris HCI EDTA ARN poly rA synth tique 0 05 d azoture de sodium lt 0 001 d ADN plasmidique d origine microbienne contenant une s quence mutante de BRAF lt 0 001 d ADN plasmidique d origine microbienne contenant une s quence de type sauvage de BRAF BRAF WT 2x0 13 mL T moin BRAF de type sauvage Tampon Tris HCI EDTA ARN poly rA synth tique 0 05 d azoture de sodium lt 0 001 d ADN
49. nnel Sanger 2X Test de mutation cobas 4800 Type sauvage BRAF V600 Mutant V600E ou V600E Total non mutant Mutation Detected V600E 94 19 113 Mutation Not Detected 101 106 Total 99 120 219 de corr lation positive 95 IC 95 89 98 de corr lation n gative 84 IC 95 77 90 de corr lation totale 89 IC 95 84 93 06611818001 06FRC 19 Doc Rev 6 0 Tableau 12 Test de mutation cobas 4800 BRAF V600 deuxi me lot en fonction du s quen age bidirectionnel Sanger 2X S quencage de l ADN bidirectionnel Sanger Test de mutation cobas 4800 Type sauvage BRAF V600 Mutant V600E ou V600E Total non mutant Mutation Detected V600E 95 25 120 Mutation Not Detected 3 95 99 Total 99 120 219 de corr lation positive de corr lation n gative 96 IC 95 90 98 79 IC 95 71 85 de corr lation totale 87 IC a95 82a 91 La concordance totale entre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quencage bidirectionnel Sanger 2X tait de 89 pour le premier lot de r actifs au total 24 r sultats discordants et de 87 pour le deuxi me lot au total 29 chantillons discordants Les r sultats d chantillons discordants ont t r solus l aide du s quen age 454 Analyse des chantillons discordants par s quen age 454 Les r sultats discordants en
50. ombre d chantillons inclus dans le cycle d analyse Tableau 1 Volumes de r actifs n cessaires pour le m lange r actionnel actif Nmbre d chantillons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 RXN MIX 10 pL 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 BRAFOM 8L 32 40 48 56 64 72 80 88 96 104 MGAC 7 pL 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 Volume total pL 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 Nombre d chantillons 2t moins 1 D Retirer le nombre appropri de flacons de RXNMIX BRAF OM et MGAC de l emplacement de conservation a une temp rature comprise entre 2 et 8 C Passer chaque r actif au vortex pendant 5 secondes afin de recueillir le liquide au fond du tube avant utilisation Etiqueter un tube de microcentrifugation st rile pour le m lange r actionnel actif M M X Ajouter le volume calcul de RXNM IX au tube MMX tiquet Ajouter le volume calcul de BRAF OM au tube M MX tiquet Ajouter le volume calcul de M GAC au tube MM X tiquet Passer le tube au vortex pendant 5 secondes afin d assurer un m lange ad quat REMARQUE les chantillons et les t moins doivent tre ajout s la plaque micropuits dans un d lai de 1 heure apr s la pr paration du m lange r actionnel MM X actif REMARQUE utiliser uniquement les plaques micropuits plaque AD et le film scelleur Roche P N 05232724001 du syst me cobas 4800 Ajouter avec pr caution 25 uL de MMX actif chaque puits r actionnel de la plaque mi
51. ordants par s quen age 454 La sp cificit a t am lior e pour donner 95 pour le premier lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 tableau 13 et 90 pour le deuxi me lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 tableau 14 apr s utilisation du s quencage 454 pour r soudre les r sultats discordants entre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quen age de l ADN bidirectionnel Sanger 2X L am lioration de la sp cificit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 apr s la r solution par s quen age de l ADN 454 tait principalement due la capacit du s quen age de l ADN 454 d tecter les mutations BRAF V600E n ayant pas t d tect es par le s quen age Sanger en raison des faibles pourcentages de mutation observ s pour ces chantillons et de la faible sensibilit du s quen age Sanger compar au s quen age 454 La diff rence de sp cificit entre les deux lots de trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 95 par rapport 90 tait principalement due la diff rence de d tection des chantillons de BRAF V600K mutant avec un de mutation proche du seuil de d tection du BRAF V600K mutant soit environ 35 R activit crois e La r activit crois e du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a t valu e en analysant les tudes suivantes e chantillons de tissu FFPE de m lanome BRAF non V600E avec diff rents pourcentages de mut
52. plasmidique d origine microbienne contenant une s quence de type sauvage de BRAF DNA SD 2x1 mL Diluant d chantillon d ADN Tampon Tris HCI 0 09 d azoture de sodium M ISES EN GARDE ET PR CAUTIONS DESTIN AU DIAGNOSTIC IN VITRO Ce test est pr vu pour une utilisation avec des chantillons de tissu fix s la formaline et enrob s de paraffine Ne pas pipeter la bouche Ne pas manger boire ni fumer dans les zones de travail de laboratoire viter la contamination des r actifs par des microbes et par l ADN liminer les r actifs non utilis s et les d chets conform ment la r glementation nationale f d rale provinciale et locale Ne pas utiliser les trousses apr s leur date de p remption Ne pas m langer de r actifs provenant de trousses ou de lots diff rents Porter des gants et en changer entre la manipulation des chantillons et celle des r actifs cobas 4800 pour viter toute contamination Pour viter toute contamination du m lange r actionnel actif avec les chantillons d ADN l amplification et la d tection doivent tre effectu es dans une zone s par e de celle de l isolation de l ADN La zone de travail d amplification et de d tection doit tre soigneusement nettoy e avant d effectuer la pr paration du m lange r actionnel Pour un nettoyage ad quat toutes les surfaces y compris les portoirs et les pipetteurs doivent tre essuy es avec une solution d hypochlorite de sodium 0
53. r c d que le r sultat de Sanger tait de type sauvage ou aucune mutation V600D V600E2 V600K et V600R Remarque les chantillons de m lanome pr sentant des r sultats valides par paire la fois avec le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quen age Sanger ont t consid r s valuables Remarque IC r sultat intervalle de confiance 06611818001 06FRC 24 Doc Rev 6 0 Corr lation entre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quen age bidirectionnel 2X de Sanger dans la d tection des mutations BRAF V600E Comme le montre le tableau 16 ci dessus le pourcentage de corr lation positive PCP avec le s quen age de Sanger tait de 96 4 215 223 et le pourcentage de corr lation n gative PCN de 80 168 210 avec un pourcentage de corr lation globale de 88 5 Cette tude avait pour objectif secondaire d valuer tous les r sultats discordants ainsi qu un sous groupe al atoire de r sultats concordants en utilisant le s quen age 454 comme m thode ind pendante de d tection des mutations Le tableau 19 ci dessous montre les r sultats de cette analyse Tableau 19 R sultats du s quen age 454 comparativement ceux du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et du s quen age de Sanger Comparaison originale M thode de r solution S quen age Test de mutation bidirectionnel 2X ee Oe Mutation non Total cobas 4800 de Sanger a Rs d tect e BR
54. rands proc d s 1 pr paration manuelle des chantillons pour obtenir de l ADN g nomique partir de tissu FFPE fix s la formaline enrob s de paraffine 2 amplification par PCR de l ADN cible a l aide d une paire d amorces compl mentaires et de deux sondes oligonucl otidiques marqu es par des fluorophores diff rents Une sonde est con ue afin de d tecter la s quence BRAF V600 de type sauvage et l autre est con ue afin de d tecter la s quence de mutation V600E Deux t moins externes de cycle d analyse sont fournis et l all le de type sauvage sert de t moin interne complet du processus Pr paration des chantillons Les chantillons de tissu FFPE sont trait s et l ADN g nomique est isol l aide de la trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas une pr paration manuelle standard reposant sur la liaison de l acide nucl ique des fibres de verre Une coupe d paraffin e de 5 um de tissu FFPE est lys e par incubation temp rature lev e l aide d un tampon de liaison lyse chaotrope et prot atique qui lib re les acides nucl iques et prot ge l ADN g nomique lib r contre des DNases Ensuite on ajoute de l isopropanol au m lange de lyse qui est centrifug dans une colonne contenant un filtre en fibres de verre Au cours de la centrifugation l ADN g nomique se lie la surface du filtre en fibres de verre Les substances non li es comme les sels les prot ines et autres impuret s cellulair
55. rminer les diff rences de technologie 9 Les effets des autres variables potentielles comme les variables relatives la fixation de l chantillon n ont pas t valu s 10 Bien qu il s agisse d un cas rare des mutations l int rieur des r gions de l ADN g nomique du g ne BRAF couvert par les amorces et ou les sondes du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 peuvent entra ner l chec de la d tection de la pr sence d une mutation 11 La pr sence d inhibiteurs de la PCR peut entra ner des faux n gatifs ou des r sultats non valides 12 Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 montre une r activit crois e limit e avec les chantillons de mutant non V600E V600K V600D et V600E2 ce qui entra ne des faux positifs Veuillez vous reporter la section Evaluation de la performance non clinique pour obtenir de plus amples renseignements 13 La m lanine est un inhibiteur connu des r actions PCR La trousse de pr paration de l chantillon d ADN limine la m lanine de l chantillon lors de l extraction cependant la m lanine dans un chantillon pourrait quand m me entra ner des r sultats non valides Si l on soup onne une inhibition de la m lanine il est sugg r de r p ter les analyse avec une dilution au 1 2 tel que d crit la section R analyse des chantillons pr sentant des r sultats invalides 06611818001 06FRC 13 Doc Rev 6 0 EVALUATION DE LA PERFORMANCE NON CLINIQUE Sensibilit
56. sections de tissu FFPE mont es sur lames ou l tape K du D paraffinage des sections de tissu FFPE non mont es sur lames en combinant les tissus des deux sections dans un m me tube Continuer la proc dure d isolation de l ADN Si la concentration du stock d ADN est lt 5 ng uL il peut tre n cessaire de demander un autre chantillon de tissu FFPE au site clinique de r f rence REMARQUE conserver le stock d ADN chantillon trait une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 2 semaines ou 20 C pendant 60 jours L ADN doit tre amplifi au cours des p riodes recommand es de conservation ou avant la date de p remption indiqu e sur la trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas pour extraire l ADN selon la premi re ventualit AM PLIFICATION ET D TECTION REMARQUE pour viter toute contamination du m lange r actionnel actif avec les chantillons d ADN l amplification et la d tection doivent tre effectu es dans une zone s par e de celle de l isolation de l ADN La zone de travail d amplification et de d tection doit tre soigneusement nettoy e avant d effectuer la pr paration du m lange r actionnel Pour un nettoyage ad quat toutes les surfaces y compris les portoirs et les pipetteurs doivent tre essuy es avec une solution d hypochlorite de sodium 0 5 suivi d un essuyage avec une solution d thanol 70 l eau de Javel liquide vendue dans le commerce contient d
57. st utilis pour l amplification de la cible Le m lange r actionnel de PCR est d abord chauff afin de d naturer l ADN g nomique et d exposer les s quences cibles aux amorces A mesure que le m lange refroidit les amorces en amont et en aval s hybrident avec les s quences d ADN cible L ADN polym rase Z05 en pr sence d ion m tallique divalent et de dNTP en exc s allonge chaque amorce hybrid e synth tisant ainsi un deuxi me brin d ADN Le premier cycle de PCR est alors achev produisant une copie d ADN bicat naire de la r gion cible de 116 paires de bases du g ne BRAF Ce processus est r p t pendant un certain nombre de cycles chaque cycle doublant effectivement la quantit d ADN d amplicon L amplification se produit uniquement dans la r gion du g ne BRAF entre la paire d amorces appropri e Le g ne complet n est pas amplifi D tection automatis e en temps r el Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 utilise la technologie d amplification par PCR en temps r el Dans la r action chaque sonde oligonucl otidique sp cifique la cible est marqu e par un fluorophore servant de rapporteur et par une mol cule quencher qui absorbe les missions fluorescentes du fluorophore rapporteur quand la sonde est intacte Au cours de chaque cycle d amplification une sonde compl mentaire de la s quence d ADN monocat naire dans l amplicon se lie et est ensuite cliv e par l activit nucl ase 5 3 de l ADN polym rase
58. t effectu par le logiciel cobas 4800 REMARQUE un cycle d analyse valide peut comporter des r sultats d chantillon valides et invalides Si le cycle est valide interpr ter les r sultats des chantillons comme le montre le tableau 2 Tableau 2 Interpr tation des r sultats du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 R sultats du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Mutation Detected Mutation d tect e dans le site du codon 600 BRAF de l exon 15 Mutation Not Detected Interpr tation ou Mutation non d tect e dans le site du codon 600 BRAF de l exon 15 No Mutation Detected Le r sultat est invalide R p ter l analyse des chantillons pr sentant des r sultats invalides en suivant les Invalid instructions mentionn es a la section R analyse des chantillons pr sentant des r sultats invalides ci dessous Failed Echec du cycle d analyse en raison d un probleme mat riel ou logiciel Contacter votre distributeur local Roche pour obtenir une assistance technique Un r sultat Mutation Not Detected ou No Mutation Detected n exclut pas la pr sence d une mutation dans le site du codon 600 du BRAF car les r sultats d pendent du pourcentage de s quences mutantes de l int grit des chantillons de l absence d inhibiteurs et d une quantit suffisante d ADN d tect e 06611818001 06FRC 12 Doc Rev 6 0 R analyse des chantillons pr sentant des r sultats invalides
59. tre le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et le s quen age bidirectionnel Sanger 2X ont t r solus par s quen age 454 et sont indiqu s au tableau 13 pour le premier lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 et au tableau 14 pour le deuxi me lot de r actifs du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Tableau 13 Test de mutation cobas 4800 BRAF V600 premier lot en fonction du s quencage bidirectionnel Sanger 2X r solus par s quen age 454 S quencage Sanger r solu par s quen age 454 Test de mutation cobas 4800 Type sauvage BRAF V600 M utant V600E ou V600E Total non mutant M utation Detected V600E 108 5 113 Mutation Not Detected 0 106 106 Total 108 111 219 de corr lation positive 100 IC 95 97 100 de corr lation n gative 95 IC 95 90 98 de corr lation totale 98 IC 95 95 99 Tableau 14 Test de mutation cobas 4800 BRAF V600 deuxi me lot en fonction du s quencage bidirectionnel Sanger 2X r solus par s quen age 454 06611818001 06FRC S quen age Sanger r solu par s quen age 454 Test de mutation cobas 4800 Type sauvage BRAF V600 Mutant V600E ou V600E Total non mutant Mutation Detected V600E 109 11 120 Mutation Not Detected 0 99 99 Total 109 110 219 de corr lation positive 100 IC 95 97 100 de corr lation n gative 90 I
60. trifuger les unit s FT CT 8000 x g pendant 1 minute N Jeter la fraction contenue dans chaque CT avec les d chets chimiques Replacer le FT sur le m me CT O Ajouter 500 uL de WB II actif au FT REMARQUE la pr paration du WB II actif est d crite la section Pr paration des r actifs P Centrifuger les unit s FT CT 8000 x g pendant 1 minute Q Placer un FT sur un nouveau CT J eter la fraction contenue dans l ancien CT avec les d chets chimiques et mettre au rebut le CT utilis de fa on appropri e Centrifuger les unit s FT CT entre 16 000 x g et 20 000 xg pendant 1 minute afin de s cher la membrane du filtre S Placer le tube FT dans un tube d lution tube de centrifugeuse d 1 5 mL pr tiquet avec l identification de l chantillon J eter la fraction contenue dans l ancien CT avec les d chets chimiques et mettre au rebut le CT utilis de fa on appropri e T Ajouter 100 uL de DNA EB au centre de la membrane du FT sans toucher la membrane du FT U Incuber le FT avec le tube d lution une temp rature comprise entre 15 et 30 C pendant 5 minutes V Centrifuger le FT avec le tube d lution 8000 x g pendant 1 minute pour recueillir l luat dans le tube d lution tube de microcentrifugeuse de 1 5 mL pr tiquet Mettre au rebut le FT utilis de fa on appropri e L luat est constitu du stock d ADN W Fermer les bouchons des tubes d lution Passer l tape A de la section Quant
61. u 1 32 de la concentration d ADN recommand e de 125 ng 25 uL Cela indiquerait que le test pourra d tecter la mutation BRAF V600E lorsque 97 de l ADN est d grad en raison du processus de fixation en supposant que l ADN de la lign e cellulaire tait 100 intact et amplifiable Contenu tumoral minimal Trente trois 33 chantillons du g ne mutant BRAF V600E 24 chantillons du g ne BRAF de type sauvage et 17 chantillons du g ne BRAF V600E non mutant tableau 8 ont t test s afin de d terminer la sensibilit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 pour la d tection de la mutation BRAF V600E dans des chantillons pr sentant un contenu tumoral allant de 5 50 sans macro dissection Une 1 section de chaque chantillon a t test e l aide du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 Le test de mutation cobas 4800 BRAF V600 a d tect tous les chantillons de BRAF V600E mutant ayant un contenu tumoral d au moins 15 et un pourcentage de mutation d au moins 2 3 tableau 8 06611818001 06FRC 17 Doc Rev 6 0 Tableau 8 R sultats de l analyse de 33 chantillons de BRAF V600E pr sentant diff rents pourcentages de contenu tumoral et diff rents pourcentages de mutation Num ro de Contenu de l chantillon tumoral mutation R sultat du test Mutation Not 1 5 5 2 8 Detected Mutat
62. u test 06611818001 06FRC 16 Doc Rev 6 0 Sensibilit analytique avec un m lange de lign es cellulaires Deux extraits d ADN de lign es cellulaires de m lanome SK M EL 28 mutant BRAF V600E et SK M EL 2 BRAF de type sauvage ont t m lang s pour obtenir un chantillon ayant un taux de mutation de 4 5 v rifi par s quen age 454 Trois panels de dilution s par s contenant de 125 ng 25 uL 0 ng 25 uL d ADN ont t pr par s Vingt 20 r plicats de chaque membre du panel ont t test s l aide de chacun des 3 lots de trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 60 r plicats au total La sensibilit a t d termin e par la plus faible quantit d ADN ayant donn un taux d au moins 95 de r sultat BRAF V600E Mutation Detected ligne gris e Les r sultats de l tude sont pr sent s au tableau 7 Tableau 7 Sensibilit du test de mutation cobas 4800 BRAF V600 avec un m lange de lign es cellulaires Pourcentage moyen M lange de de mutation par Quantit d ADN dans le Taux de Mutation lign es cellulaires s quen age 454 membre du panel Detected n 60 125 0 ng 25 uL 97 31 3 ng 25 uL 100 15 6ng 25 uL 95 M lange de 15 7 8 ng 25 uL 98 lign es cellulaires fee 3 9 ng 25 uL 95 2 0 ng 25 uL 82 1 0 ng 25 uL 78 0 5 ng 25 uL 77 Le test a donn un taux de 95 de r sultat Mutation Detected 3 9 ng 25 uL dilution a
63. uk perl genetics CGP cosmic Release 47 M ay 2010 Longo M C Berninger M S and Hartley J L 1990 Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 Chosewood L C and Wilson D E Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories HHS Publication Fifth edition CDC 21 1112 2009 Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections Approved Guideline Third Edition CLSI Document M 29 A3 Villanova PA CLSI 2005 International Air Transport Association Dangerous Goods Regulations 52nd Edition 2011 Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI EP7 A2 Appendix D 2005 Hauschild A Agarwala SS Trefzer U et al Results of a phase Ill randomized placebo controlled study of sorafenib in combination with carboplatin and paclitaxel as second line treatment in patients with unresectable stage III or stage IV melanoma J Clin Oncol 2009 J un 10 27 17 2823 2830 Hodi FS O Day SJ McDermott DF et al Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma N Engl J Med 2010 Aug 19 363 8 711 723 06611818001 06FRC 27 Doc Rev 6 0 Information sur les r visions apport es au document Doc Rev 3 0 Les instructions de manipulation et de conservation des chantillons ont t mises jour 07 2013 Veuillez communiquer avec le repr sentant de Roch
64. venant de chacun des 3 chantillons de tissu FFPE de mutant BRAF V600E et contenant des taux de mutation de 6 1 11 5 et 4 4 ont t trait es individuellement l aide de 3 lots de trousse de pr paration des chantillons d ADN cobas afin d isoler l ADN Des dilutions de l ADN de chaque section ont t pr par es afin de produire les membres du panel d taill s au tableau 5 Tableau 5 Pr paration des membres du panel de dilution partir d chantillons de tissu FFPE Information sur l chantillon moyen de Echantillon de mutation Quantit d ADN dans les membres tissu FFPE V600E Pigmentation du panel de dilution ng 25 uL z Fortement 4 7 20 9 h Echantillon 1 6 1 pigment t 125 0 15 6 7 8 3 9 2 0 1 0 Echantillon 2 11 5 NHP 125 0 7 8 3 9 2 1 0 5 Echantillon 3 44 NHP 125 0 31 3 15 6 7 8 3 9 2 0 Pourcentage moyen de mutation de l chantillon d termin par s quencage 454 Pigmentation lev e fond e sur une valuation visuelle concentration en m lanine 0 17 UL 25 UL ek NHP Not Highly Pigmented pigmentation non lev e selon valuation visuelle Seize 16 r plicats de chaque membres du panel ont t analys s chacun sur 3 lots de trousse de test de mutation cobas 4800 BRAF V600 n 48 membre du panel La sensibilit de chaque chantillon de tissu FFPE a t d termin e par la plus faible quantit d ADN ayant donn un taux d au moins
65. zotures m talliques tr s explosifs Lors de l limination des solutions contenant de l azoture de sodium dans les lavabos de laboratoire rincer les drains grande eau froide pour viter l accumulation d azotures O Le xyl ne est un produit chimique dangereux et doit tre utilis dans une hotte chimique Mettre au rebut avec les d chets chimiques conform ment aux r glementations f d rale provinciale territoriale et locale P Porter des lunettes de protection une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de la manipulation de tout r actif viter le contact de ces mat riaux avec la peau les yeux ou les muqueuses En cas de contact rincer imm diatement grande eau Des br lures peuvent appara tre en l absence de traitement En cas de d versement diluer avec de l eau avant d essuyer Tous les articles jetables sont usage unique Ne pas les r utiliser R Ne pas utiliser les articles jetables au del de leur date de p remption 06611818001 06FRC 4 Doc Rev 6 0 U Ne pas utiliser de solution d hypochlorite de sodium eau de J avel pour nettoyer l analyseur cobas z 480 Nettoyer l analyseur cobas z 480 en suivant les proc dures d taill es dans le manuel d utilisation du syst me cobas 4800 Pour plus d information sur les mises en garde pr cautions et proc dures visant r duire le risque de contamination pour l analyseur cobas z 480 consulter le manuel d utilisation du syst me cobas 4800 Il

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