Plasmid DNA purification - MACHEREY
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1. Plasmid DNA purification Excerpt from user manual Francais NucleoBond Xtra Midi NucleoBond Xtra Maxi NucleoBond Xtra Midi Plus NucleoBond Xtra Maxi Plus January 2013 Rev 11 MACHEREY NAGEL MN www mn net com Plasmid DNA purification Francais Introduction Purification de l ADN plasmidique avec les kits NucleoBond Xtra Midi Plus et Maxi Plus En ce qui concerne ce protocole il s agit d un extrait en fran ais du manuel Plasmid DNA Purification NucleoBond Xtra Il d crit tape par tape le protocole de purification qui se trouve dans le manuel en anglais au chapitre 7 Les informations d taill es concernant les kits NucleoBond Xtra ainsi que la proc dure de purification Ex culture des cellules bact riennes lyse des cellules tapes de la purification stockage des composants du kit fabrication des tampons et des r actifs indications de s curit troubleshooting se trouvent dans le manuel en anglais ll est recommand pour les utilisateurs qui utilisent le kit pour la premi re fois de lire compl tement le manuel d utilisation Les utilisateurs exp riment s peuvent travailler directement avec les protocoles sp cifiques 7 NucleoBond Xtra purification d ADN plasmidique 7 1 Purification de plasmides high copy Midi Maxi 7 2 Purification de plasmides low copy Midi Maxi 11 7 8 Concentration des luats NucleoBond Xtra avec NucleoBond Finalizer 15 MACHER2. travers le NucleoBond Finalizer tout en touchant un tissus ou papier propre avec la pointe du NucleoBond Finalizer pour absorber l thanol aussi fort que possible R p tez cette tape au moins les fois d clar s en bas jusqu ce que plus aucune goutte d thanol ne sorte du NucleoBond Finalizer Remarque une nouvelle seringue s che peut tre utilis e pour acc l rer la proc dure non fournie z 3 fois jusqu ce gt 6 fois jusqu ce que ce asoit sec que ce soit sec Option vous pouvez incuber NucleoBond Finalizer pendant 10 minutes 80 C pour minimiser la contamination thanolique Cependant le taux de r cup ration final peut tre r duit en raison d un s chage excessif de l ADN Elution de l ADN Enlevez le NucleoBond Finalizer de la seringue retirez le piston d une seringue 1 mL et fixez le NucleoBond Finalizer la sortie Remarque voir la section 4 12 Tableau 4 Midi ou 5 Maxi pour choisir le volume appropri de tampon d lution Pipetez un volume appropri de tampon d lution Buffer TRIS 5 mM Tris HCI pH 8 5 fourni dans le kit ou le tampon TE voir la section 4 12 dans la seringue Placez la pointe du NucleoBond Finalizer en position verticale au dessus d un nouveau tube collecteur et luez goutte goutte l ADN plasmidique en ins rant le piston 200 800 uL 400 1000 uL Enlevez le NucleoBond Finalizer de la seringue ret
3. celle recommand e voir section 4 7 pour des informations sur la lyse optimale des cellules D Clarification et chargement Assurez vous d avoir une suspension homog ne du pr cipit en inversant le tube 3 fois avant d appliquer directement le lysat sur le filtre NucleoBond Xtra pr alablement quilibr afin d viter que le filtre ne se bouche Le lysat est simultan ment clarifi et charg sur la colonne Rechargez le filtre si le volume de lyse est plus important que la capacit du filtre Laissez la colonne se vider par gravit Alternative Le pr cipit peut tre limin par centrifugation 2 5 000 x g pendant au moins 10 min par ex si plus du double de la masse cellulaire recommand e a t utilis S il reste des mati res en suspension transf rez dans un nouveau tube et r p tez l tape de centrifugation de pr f rence une vitesse plus lev e ou chargez le lysat sur le filtre NucleoBond Xtra pr alablement quilibr Cette tape de clarification est extr mement importante En effet les r sidus du pr cipit peuvent boucher la colonne NucleoBond Xtra Pour charger la colonne vous pouvez appliquer le lysat clarifi sur le filtre pr alablement quilibr ou enlever pr alablement le filtre s il est inutilis Laissez la colonne se vider par gravit Remarque Vous pouvez garder tous les filtrats pour les analyser voir section 8 1 MACHEREY NAGEL 01 2013 Re
4. Resuspension Buffer RES RNase A en pipettant par aspiration refoulement ou en vortexant Important pour une lyse efficace des cellules il ne doit plus subsister d agr gats en suspension Remarque Augmentez proportionnellement le volume du tampon RES si vous avez utilis une masse cellulaire sup rieure celle recommand e voir la section 4 7 pour plus d informations sur les conditions de lyse optimales des cellules et la section 4 8 pour les souches difficiles lyser MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 5 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais Lyse cellulaire Buffer LYS Avant d utiliser le tampon LYS v rifiez que le SDS n a pas pr cipit Si un pr cipit blanc est visible chauffez le tampon quelques minutes 30 40 C jusqu ce que le pr cipit soit compl tement dissout Ramenez le tampon temp rature ambiante 18 25 C Ajoutez le tampon de lyse Lysis Buffer LYS la suspension M langez avec pr caution en inversant le tube 5 fois Ne pas utiliser de vortex sinon l ADN chromosomique se fractionnerait se d tacherait des d bris cellulaires et contaminerait alors la suspension Incubez le m lange temp rature ambiante 18 25 C pendant 5 min Attention Un temps d incubation trop long sous des conditions alcalines peut d naturer et d grader irr versiblement l ADN plasmidique et lib rer l ADN chromosomique dans le lysat Remarque Augmentez proportionnelle
5. 5 comme r f rence Inoculez une culture overnight en diluant la pr culture au 1 1000i me dans un volume donn de milieu LB contenant l antibiotique s lectif appropri Faites pousser la culture toute la nuit 37 C 300 rpm pendant 12 16 h 100 mL 300 mL R cup ration des cellules bact riennes Mesurez la DO de la culture cellulaire et d terminez le volume de culture recommand V mL V mL 400 OD 1200 MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais Culottez les cellules par centrifugation 4 500 6 000 x g pendant z 10 min 4 C et liminez compl tement le surnageant Remarque Il est possible bien s r d utiliser de plus grands volumes par ex si le plasmide ne se comporte pas comme un vecteur high copy voir section 4 6 pour plus d informations Dans ces conditions il est n cessaire d augmenter proportionnellement les volumes des tampons RES LYS et NEU dans les tapes 4 5 et 7 Eventuellement il faudra commander un volume suppl mentaire de tampon de lyse voir l information de commande du NucleoBond Xtra Buffer Set I Si le volume de culture est plus du double du volume recommand il est plus judicieux de centrifuger pour clarifier le lysat tape 8 plut t que d utiliser le filtre NucleoBond Xtra Resuspension Buffer RES Rependre compl tement le culot cellulaire dans le tampon de resuspension
6. EY NAGEL 01 2013 Rev 11 3 NucleoBond Xtra Midi Maxi Fran ais 7 7 1 NucleoBond Xtra purification d ADN plasmidique Purification de plasmides high copy Midi Maxi Remarque Les renvois dans le protocole se r f rent aux chapitres correspondant dans le procotole principal en anglais Pr paration d une pr culture Inoculez 3 5 mL d un milieu de pr culture LB avec une colonie piqu e sur une plaque d Agar fraichement stri e Assurez vous que la plaque et le milieu de culture contiennent le bon antibiotique afin d tre s r d obtenir le plasmide pour d autres informations voir section 4 3 Agitez 37 C 300 rpm pendant 8 h 2 Pr paration d une culture overnight Remarque Afin d utiliser au maximum la capacit de fixation des colonnes NucleoBond Xtra il est n cessaire de charger une grande quantit d ADN plasmidique Si la culture pr sente une faible croissance ou si le plasmide ne se comporte pas comme un plasmide high copy consultez la section 4 6 du protocole pour l utilisation de plus grands volumes de culture Si vous n tes pas s r du nombre de copies de votre plasmide ou du comportement de la culture vis vis de la croissance bact rienne augmentez le volume de culture et d cidez l tape 3 du nombre de cellules utiliser pour la pr paration Le volume mentionn ci apr s de la culture overnight est calcul pour la valeur de lOD de 4 voir chapitre 4
7. ampon de lyse Lysis Buffer LYS la suspension Remarque augmentez proportionnellement le volume de tampon LYS si vous avez utilis une masse cellulaire sup rieure celle recommand e voir la section 4 7 pour plus d informations sur la lyse optimale des cellules M langez avec pr caution en inversant le tube 5 fois Ne pas utiliser de vortex sinon l ADN chromosomique se fractionnerait se d tacherait des d bris cellulaires et contaminerait alors la suspension Incubez le m lange temp rature ambiante 18 25 C pendant 5 min Attention Un temps d incubation trop long sous des conditions alcalines peut d naturer et d grader irr versiblement l ADN plasmidique et lib rer l ADN chromosomique dans le lysat Equilibration Buffer EQU Equilibrez la colonne NucleoBond Xtra avec le filtre int gr avec le tampon d quilibration Equilibration Buffer EQU D posez le tampon sur la collerette du filtre comme le montre le sch ma et assurez vous que le filtre est entierement mouill Laissez la colonne se vider par gravit La colonne ne s ass che pas MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 13 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais 9 Neutralisation Buffer NEU Ajoutez le tampon de neutralisation Neutralization Buffer NEU la suspension et m langez imm diatement avec pr caution le lysat en inversant le tube 10 15 fois Ne pas utiliser de vortex Le
8. flacon ou le tube utilis pour cette tape ne doit pas tre rempli au plus des deux tiers afin de permettre un m lange homog ne Veillez neutraliser compl tement pour pr cipiter toutes les prot ines et l ADN chromosomique Le lysat doit passer d une forme gluante et visqueuse une forme moins visqueuse une suspension homog ne et un floculat blanc Passez l tape 8 du protocole de purification des plasmides high copy section 7 7 Une incubation du lysat n est pas n cessaire Remarque augmentez proportionnellement le volume de tampon NEU si vous avez utilis une masse cellulaire sup rieure celle recommand e voir la section 4 7 pour plus d informations sur la lyse optimale des cellules 14 MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Fran ais 7 3 Concentration des luates NucleoBond Xtra avec NucleoBond Finalizer Remarque Les renvois dans le protocole se r f rent aux chapitres correspondant dans le procotole principal en anglais Utilisez les NucleoBond Finalizers seulement pour les vecteurs inferieur 50 kbp Midi NucleoBond Maxi NucleoBond Finalizer Finalizer Large 1 Pr cipitation de l ADN Remarque Contr ler la concentration en ADN avant la pr cepitation V rifier le contenu d ADN plasmidique de vos luats avant de passer l tape de pr cipitation en mesurant voir la section 4 13 Ajoutez 0 7 volumes d isopropan
9. irez le piston et rattachez le NucleoBond Finalizer la sortie de la seringue Transf rez le premier luat dans la seringue et luez dans le m me tube collecteur une seconde fois Charger Charger compl tement le compl tement le premier luat premier luat 16 MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais Midi NucleoBond Maxi NucleoBond Finalizer Finalizer Large Retirer le NucleoBond Finalizer de la seringue remonter le piston de la seringue pour aspirer de l air remettre en place le NucleoBond Finalizer et presser l air pour expulser le maximum d luat D terminez le rendement d ADN plasmidique par spectrophotom trie UV et confirmez l int grit du plasmide par lectrophor se sur gel d agarose voir section 4 12 MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 17
10. ment le volume du tampon LYS si vous avez utilis une masse cellulaire sup rieure celle recommand e voir section 4 7 pour plus d informations sur la lyse optimale des cellules Equilibration Buffer EQU Equilibrez la colonne NucleoBond Xtra avec le filtre int gr avec le tampon d quilibration Equilibration Buffer EQU D posez le tampon sur la collerette du filtre comme le montre le sch ma et assurez vous que le filtre est entierement mouill Laissez la colonne se vider par gravit La colonne ne s ass che pas MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais 9 Neutralisation Buffer NEU Ajoutez le tampon de neutralisation Neutralization Buffer NEU la suspension et m langez imm diatement avec pr caution le lysat en inversant le tube 10 15 fois Ne pas utiliser de vortex Le flacon ou le tube utilis pour cette tape ne doit pas tre rempli au plus des deux tiers afin de permettre un m lange homog ne Veillez neutraliser compl tement pour pr cipiter toutes les prot ines et l ADN chromosomique Le lysat doit passer d une forme gluante et visqueuse une forme moins visqueuse une suspension homog ne et un floculat blanc Proc dez imm diatement l tape 8 Une incubation du lysat n est pas n cessaire Remarque Augmentez proportionnellement le volume du tampon NEU si vous avez utilis une masse cellulaire sup rieure
11. ntrifugation dissoudre par aspiration refoulement ou par rotation constante dans un volume appropri de tampon pendant 10 60 min 3D shaker D terminez le rendement d ADN plasmidique par spectrophotom trie UV Confirmez l int grit du plasmide par lectrophor se sur gel d agarose voir la section 4 13 10 MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Fran ais 7 2 Purification de plasmides low copy Midi Maxi Remarque Les renvois dans le protocole se r f rent aux chapitres correspondant dans le procotole principal en anglais Le volume de tampon de lysis contenu dans le kit est calcul pour la purification d ADN plasmidique high copy En cons quence il faut commander des tampons suppl mentaires pour la purification continue d ADN plasmidique low copy voir section 8 2 sur l information de commande 1 Pr paration d une pr culture Inoculez 3 5 mL d un milieu de pr culture LB avec une colonie piqu e sur une plaque d Agar fraichement stri e Assurez vous que la plaque et le milieu de culture contiennent le bon antibiotique afin d tre s r d obtenir le plasmide pour d autres informations voir sections 4 3 Agitez 37 C 300 rpm pendant 8h 2 Pr paration d une culture overnight Hemarque Afin d utiliser au maximum la capacit de fixation des colonnes NucleoBond Xtra il est n cessaire de charger une quantit suffisante d ADN e plasmidique P
12. ol temp rature ambiante non fourni dans les kits Vortexez pr cautionneusement et laissez le m lange reposer pendant 2 minutes ex pour 5 mL d luat NucleoBond Xtra Midi ajoutez 3 5 mL d isopropanol pour 15 mL d luat NucleoBond Xtra Maxi ajoutez 10 5 mL d isopropanol 3 5 mL pour 10 5 mL pour 5 mL d luat 15 mL d luat 2 Chargement du pr cipit Enlevez le piston de la seringue 30 mL et fixez un NucleoBond Finalizer en sortie Versez le m lange de pr cipitation dans la seringue ins rez le piston gardez la seringue en position verticale et pressez le m lange afin de le faire passer doucement travers le NucleoBond Finalizer en utilisant une force minimale Eliminez le filtrat 3 Lavage du pr cipit Enlevez le NucleoBond Finalizer de la seringue retirez le piston et rattachez le NucleoBond Finalizer la sortie de la seringue Versez d thanol 70 non fourni dans les kits dans la seringue ins rez le piston gardez la seringue en position verticale et pressez l thanol doucement travers le NucleoBond Finalizer Eliminez l thanol 2mL 5 mL MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 15 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais Midi NucleoBond Maxi NucleoBond Finalizer Finalizer Large S chage de la membrane Enlevez le NucleoBond Finalizer de la seringue retirez le piston et rattachez le NucleoBond Finalizer Faites passer de l air
13. our le protocole low copy standard le volume de culture recommand est doubl par rapport au protocole high copy Cependant tant donn que le contenu plasmidique des cellules peut tre 10 100 fois inf rieur le volume de culture peut tre insuffisant Si vous avez besoin de grandes quantit s de plasmides low copy augmentez nouveau le volume de culture d un facteur 3 5 voir la section 4 6 pour plus d informations et d cidez l tape 3 de la quantit de cellules utiliser pour la pr paration Le volume mentionn ci apr s de la culture overnight est calcul pour la valeur de l OD de 4 voir chapitre 4 6 comme r f rence Inoculez une culture overnight en diluant la pr culture au 1 1000i me dans un volume donn de milieu LB contenant l antibiotique s lectif appropri Faites pousser la culture toute la nuit 37 C 300 rpm pendant 12 16 h 200 mL 600 mL MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais R cup ration des cellules bact riennes Mesurez la DO de la culture cellulaire et d terminez le volume de culture recommand V mL V mL 800 OD 2400 0D Culottez les cellules par centrifugation 4 500 6 000 x g pendant gt 10 min 4 C et liminez le surnageant compl tement Remarque il est possible bien s r d utiliser de plus grands volumes de culture par ex si un grande quantit de plasmides low co
14. py doit tre r cup r e voir la partie 4 6 pour plus d informations Dans ce cas augmentez les volumes des tampons RES LYS et NEU proportionnellement aux tapes 4 5 et 7 Eventuellement il faudra commander un volume suppl mentaire de tampon de lyse voir l information de commande du NucleoBond Xtra Buffer Set 1 Utilisez la centrifugation pour la clarification du lysat plut t que les colonnes filtres NucleoBond Xtra Resuspension Buffer RES Rependre compl tement le culot cellulaire dans le tampon de resuspension Resuspension Buffer RES RNase A en pipettant par aspiration refoulement ou en vortexant Important pour une lyse efficace des cellules il ne doit plus subsister d agr gats en suspension Remarque augmentez proportionnellement le volume de tampon RES si vous avez utilis une masse cellulaire sup rieure celle recommand e voir la section 4 7 pour plus d informations sur les conditions de lyse optimales des cellules et la section 4 8 pour les souches difficiles lyser 12 MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais Lyse cellulaire Buffer LYS Avant d utiliser le tampon LYS v rifiez que le SDS n a pas pr cipit Si un pr cipit blanc est visible chauffer le tampon quelques minutes 30 40 C jusqu ce que le pr cipit soit compl tement dissout Ramenez le tampon temp rature ambiante 18 25 C Ajoutez le t
15. salage au moyen du syst me NucleoBond Finalizer NucleoBond Xtra Midi Plus ou NucleoBond Finalizer Large NucleoBond Xtra Maxi Plus Option D terminez le rendement d ADN plasmidique par spectrophotom trie UV afin d ajuster la concentration de l ADN l tape 15 et calculez le taux de r cup ration apr s l tape de pr cipitation 13 Pr cipitation Ajoutez l isopropanol temp rature ambiante pour pr cipiter l ADN plasmidique lu Vortexez pr cautionneusement Centrifugez 5 000 x g pendant gt 5 min s temp rature ambiante de pr f rence 15 000 x g pendant 30 min 4 C Eliminez pr cautionneusement le surnageant 3 5 mL 10 5 mL 14 Lavage et s chage du culot d ADN Ajoutez l thanol 70 temp rature ambiante sur les culots 2mL 5mL Centrifugez 5 000 x g de pr f rence z15 000xg pendant 5 min temp rature ambiante 18 25 C MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 9 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais Eliminez pr cautionneusement l thanol compl tement avec une pipette Laissez s cher le culot temp rature ambiante 18 25 C Remarque l ADN plasmidique peut tre plus difficile dissoudre si le culot est tr s Sec 15 Reconstitution de l ADN Dissoudre le culot d ADN dans un volume ad quat de tampon TE ou d eau st rile En fonction du type de tube utilis pour la ce
16. v 11 7 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais 9 Lavage du filtre et de la colonne Buffer EQU Lavez le filtre NucleoBond Xtra et la colonne NucleoBond Xtra avec le tampon Equilibration Buffer EQU D posez le tampon sur la collerette du filtre et assurez vous que le lysat est bien lav Omettre cette tape ou d poser simplement le tampon dans le filtre r duit le rendement d ADN plasmidique 10 Eliminer le filtre Retirez le filtre NucleoBond Xtra ou liminez le en retournant la colonne 11 Lavage de la colonne Buffer WASH Lavez la colonne NucleoBond Xtra avec le tampon de lavage Wash Buffer WASH Il est important d liminer le filtre avant e d appliquer le tampon de lavage En effet ceci pourrait avoir un mauvais impact sur la puret de l ADN MACHEREY NAGEL 01 2013 Rev 11 NucleoBond Xtra Midi Maxi Francais 12 Elution Buffer ELU Eluez l ADN plasmidique avec le tampon d lution Elution Buffer ELU Collectez le tampon d lution avec l ADN plasmidique dans un tube de centrifugation de 15 mL ou 50 mL Remarque Chauffer tampon d lution ELU 50 C avant l lution peut am liorer le rendement d ADN plasmidique de gros taille comme des BACs Passez l tape 13 pour le protocole de centrifugation apr s la pr cipitation l isopropanol ou continuez avec la section 7 9 pour la concentration de l ADN plasmidique et son d
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