KIT MUTAGENESE – effet des UV sur la levure Ade2
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1. b Utilisation au del de 10 jours apr s r ception Repiquer 5 jours avant le TP plusieurs bo tes on n est jamais l abri d un contaminant pour que le pigment rouge des colonies ainsi obtenues ne soit pas d grad Si des colonies blanches de plus grosse taille sont apparues ce ne sont pas des contaminants mais des colonies avec une mutation au niveau de la Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 5 sur 21 cha ne respiratoire pour plus d explications voir pages 12 et 13 n utilisez pas ces colonies Respecter les conditions n cessaires au rougissement La temp rature id ale de culture de cette souche est de 28 30 C si la temp rature n est pas suffisamment lev e les colonies resteront blanches mais il ne faut pas d passer 37 C Le temps n cessaire au rougissement est de 4 5 jours les colonies au d part ne sont pas pigment es elles rougissent seulement en fin de croissance Le rougissement est un ph nom ne a robiose il ne faut pas parafilmer les bo tes en culture Il est imp ratif de respecter les concentrations cellulaires indiqu es dans notre protocole lors de la pr paration des suspensions de levures Si il y a trop de colonies sur la bo te elles ne rougiront pas 3 Pr paration de la suspension A de levures Saccharomyces cerevisae Ade2 de concentration 10 cellules mL ATTENTION tape ne pas pr parer en avance mais Juste avan2. 0033 0 169922672 Ni i 0033 0 169922674 www sordalab com pe Sorda lab sordalab wanadoo fr KIT MUTAGENESE effet des UV sur la levure Ade2 REF SMP SMAC ou SMC m E3 A RECEPTION DU COLIS M V rifier la composition du colis indiqu e ci dessous en page 2 T Stockage dans des conditions diff rentes selon la version du kit Pour la version en poudre Stocker la bo te de p tri not Y contenant la souche 8 4 C 8 couvercle vers le bas conservation pendant 10 jours mais repiquage conseill voir p 5 6 Stocker le sachet not pour milieu complet g lifi temp rature ambiante conservation pendant 1 an Pour la version couler Stocker la bo te de p tri not Y contenant la souche 8 4 C 8 couvercle vers le bas conservation pendant 10 jours mais repiquage conseill voir p 5 6 Stocker les bouteilles 8 temp rature ambiante conservation pendant 1 an Pour la version coul e Stocker la bo te de p tri not Y contenant la souche et les bo tes de p tri coul es 8 4 C 8 couvercle vers le bas conservation pendant 10 jours mais repiquage conseill voir p 5 6 Stocker les sachets de bo tes de p tri coul es couvercle vers le bas 4 C conservation pendant 1 mois M Avant toute manipulation tudier la fiche s curit en page 21 Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 1 sur
3. ne Laisser l g rement refroidir attention il ne faut couler la g lose quand elle est encore bien liquide Couler 16 17 bo tes par bouteille 20 mL par bo te environ Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 4 sur 21 Laisser compl tement refroidir Conserver les bo tes couvercle vers le bas 4 C o Pour la version en poudre Dans un r cipient d au moins 2L par exemple un bidon verser le contenu des sachets not s Yeast extract pectone et glucose contenus dans le sachet not pour milieu complet g lifi Ajouter 2 L d eau dans ce r cipient Agiter R partir dans 4 flacons de 500 mL en verre ou en plastique resistant l autoclave Peser 10g d agar du sachet not agar contenu dans le sur sachet not milieu complet g lifi Verser 10g d agar dans chacun des 4 flacons de 500 mL Agiter Autoclaver 20 minutes 120 C ATTENTION manipuler avec pr caution pour viter toute br lure utiliser des gants antichaleur Laisser l g rement refroidir attention il ne faut couler la g lose quand elle est encore bien liquide Couler 100 bo tes de p tri Laisser compl tement refroidir Conserver les bo tes couvercle vers le bas 4 C 2 Repiquage ventuel de la souche Saccharomyces cerevisae Ade2 a Utilisation sous 10 jours apr s r ception Utiliser les colonies telles quelles leur pigment rouge n a pas encore t d grad
4. resse finalement l apparition de r vertants blancs sur les bo tes t 15 t 120 Logiquement des colonies blanches sont cens es appara tre sur les 4 bo tes si ce n est pas le cas c est simplement le fait du Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 19 sur 21 hasard les mutations engendr es par les UV n ont pas touch de g nes impliqu s dans ce ph nom ne de pigmentation Trois types de mutations peuvent entra ner le retour un ph nom ne blanc 1 L introduction d une mutation dans un g ne en amont d ade2 dans la cha ne de biosynth se de l ad nine implique si cette mutation supprime la fonction du g ne touche que l AIR ne peut plus tre synth tis donc ne s accumule pas 2 Moins probable l introduction d une seconde mutation dans le g ne ade2 peut r tablir la fonction et ainsi l AIR est transform donc ne s accumule plus Dans ce cas l les levures peuvent pousser sur milieu minimum 3 Une mutation dans un g ne vital pour la respiration emp che la formation du pigment rouge car c est un ph nom ne qui se produit en a robiose ONB Si au moment de l talement l l ve traverse la g lose avec son taleur les levures qui vont se d velopper sous la g lose seront blanches car la formation du pigment rouge est un ph nom ne a robie R f rences Internet http wwwusers imaginet fr pol Se rendre dans le manuel de travaux pr
5. 21 COMPOSITION DU COLIS e 1 bo te de p tri not e Y ensemenc e de la souche de levures Saccharomyces cerevisae Ade2 e 3 versions diff rentes o En poudre 1 sachet not pour milieu complet g lifi contenant 3 sachets sachet not agar contenant 40 g d agar sachet not glucose contenant 60g de glucose sachet not extrait levures peptone contenant 20g d extrait de levure et 20g de peptone o A couler 6 bouteilles not es YPD contenant chacune 400 mL de YPD Yeast extract Peptone Glucose agar flacon de 175 mL d eau st rile not eau st rile o Coul e 5 sachets 20 bo tes de milieu complet YPD Yeast extract Peptone Glucose agar flacon de 175 mL d eau st rile not eau st rile e Option mat riel pour 40 l ves soit 20 bin mes Sachet contenant o 70 compte gouttes st riles de 3 mL goutte 40 microL o 45 taleurs st riles o 45 tubes st riles de 5 mL o 10 pipettes st riles de 5 mL o 5 cure dents st riles o 1 lame de d nombrement KOVA o 2 tubes st riles de 50 mL o 4 tubes st riles de 10 mL o 1 flacon de 250 mL pour la dilution suspension B e Option bo te de p tri pour 40 l ves soit 20 bin mes 100 bo tes de p tri st riles Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 2 sur 21 MATERIEL NECESSAIRE Pour toutes les versions du kit Microscope ref 74800 dans la partie o
6. GOGIQUE A Organisation du travail Les travaux pratiques se d rouleront en deux s ances Premi re s ance d 1h30 e Mise en suspension de colonies de levures pr lev es sur bo te de p tri r alis e par le pr parateur juste avant le TP e Comptage sur lame et dilution afin d obtenir une suspension de levures de concentration connue r alis es par le pr parateur juste avant le TP Il est possible de montrer le principe de comptage aux l ves pendant la s ance Conseil Il est recommand d utiliser une cam ra reli e au microscope pour montrer aux l ves le fonctionnement d une lame de comptage Vous pouvez ainsi leur montrer le nombre de levures par carr de comptage pour la suspension A e Etalement sur milieu complet r alis par les l ves e Irradiation aux UV 254 nm r alis e par le professeur ou par les l ves sous surveillance du professeur e Mise en incubation 28 C ou temp rature ambiante Deuxi me s ance la semaine suivante e Observation e Interpr tation des r sultats ONB le mat riel de l option mat riel ou mat riel et bo te de p tri est pr vu pour 20 bin mes soit 40 l ves La fiche de pr paration est pr vue pour 10 bin mes car les suspensions pr par es ne peuvent pas tre gard es d une semaine l autre B Int r ts p dagogiques Initiation la microbiologie utilisation du microscope d couverte des milieux de
7. ar les levures s dimentent rapidement e Prendre l habitude de noter au marqueur ind l bile le contenu des bo tes et les initiales du bin me qui a manipul e Ne pas contaminer l esp ce tudi e avec des souches externes et ne pas polluer l environnement avec les exp riences men es sur la souche tudi e o Nettoyer la paillasse l alcool ou l eau de javel o Passer les mains l alcool o Porter une blouse en coton o Travailler dans une zone de st rilit lors de la manipulation des levures des milieux et instruments st riles Dans un diam tre de 35 cm autour de la flamme d un bec bensun ou Dans le diam tre recommand par le contructeur d un bec lectrique ou Dans un diam tre de 25 30 cm autour d une lampe alcool ou Dans la zone de st rilit d une hotte flux o Eviter les mouvements brusques et de parler devant les bo tes ouvertes o Utiliser des instruments et des milieux st rilis s o Placer les pipettes souill es dans un pot de javel amp ATTENTION une fois qu un instrument ou un milieu st rile est entr en contact avec une cellule le sol une main le col d un tube une solution il est contamin Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 14 sur 21 B MANIPULATION Le mat riel des options mat riel ou mat riel et bo tes permet de travailler en demi groupe 1 Pr paration pour tout le groupe 10 manipul
8. ations de la suspension B de concentration 10 levures mL partir de la suspension de concentration 10 levures mL D poser avec le compte goutte 0 1 mL 2 gouttes de suspension A dans 100 mL d eau st rile Noter ce flacon suspension B R partir dans chacun des 10 tubes de 5 mL 2 mL de la suspension B Noter ces tubes suspension B Chaque bin me dispose d un tube de suspension B CNB cette tape peut tre r alis e par l enseignant si celui ci pense qu elle est source de contamination quand les l ves le font eux m me Cette tape peut tre commune toute la classe si le professeur veut utiliser moins de tube 2 Etalement des suspensions de levure sur la g lose des bo tes de p tri Verser avec un compte gouttes st riles 0 1 ml 2 gouttes de la suspension B pr par e au point 1 sur une bo te de milieu Etaler imm diatement avec un taleur st rile d un mouvement circulaire et r p t afin de r partir le mieux possible le liquide sur le milieu ATTENTION ne pas soulever la g lose lors de l talement Noter cette bo te t 0 elle ne sera pas expos e aux UV Penser galement indiquer le num ro ou les initiales du bin me pour retrouver la bo te facilement D poser avec un autre compte gouttes st rile 0 1 mL de la suspension A pr alablement agit e sur les 4 autres bo tes de milieu puis taler imm d
9. atiques virtuel R f rences bibliographiques Travaux pratiques de Biologie des levures de Didier POL Editions Ellipses Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 20 sur 21 FICHE SECURITE Il faut respecter les conditions de s curit propre aux UV La mutagen se et l utilisation d un milieu complet sont des manipulations qui doivent se faire dans des conditions de s curit pour que les mutants et les contaminants qui peuvent coloniser la bo te ne se r pandent pas il faut plonger les bo tes dans de la javel concentration 1 ou de l eau oxyg n e pour tuer tous les germes et bien se laver les mains FICHE CONSERVATION Quelque soit la version du kit La bo te de p tri not e Y contenant les colonies de la souche se conserve pendant 2 semaines 4 C Mais un repiquage est n cessaire 5 jours avant le TP pour avoir de bons r sultats Pour la version en poudre Le contenu des petits sachets du sur sachet not milieu complet g lifi se conserve pendant 1 an temp rature ambiante Pour la version couler Le contenu des bouteilles se conserve pendant 1 an temp rature ambiante Pour la version coul e en bo te les bo tes de p tri se conservent couvercle vers le bas pendant 1 mois 4 C FICHE TRI ET RECUPERATION La g lose des bo tes doit tre d contamin e des ventuels contaminants et des mutants avec de la javel concentration 1 ou de l eau
10. bservation du catalogue R cipient d au moins 2 L ex bidon de 5L ref DPHDS Mat riel de l option mat riel voir description en page 2 Bo te irradiation UV C ref IR dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Feutres permanents ref FLMP dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Bec bensun ref BCBI ou BCB2 lectrique ref TECBEC LAB2 ou LAB3 ou hotte flux Pour la version en poudre du kit Flacons de 500 mL en verre ref FGVS500 dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue OU en plastique r sistant l autoclave ref PPS dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Autoclave ref AUTOCL ou MICR dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Balance ref BALI dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Eau st rile Pour la version couler du kit Micro ondes ou bain marie ref AQUATERM dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Pour les versions couler ou en poudre Gants anti chaleur ref GCHAL dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Bo tes de p tri de l option bo te de p tri voir composition en page 2 MATERIEL RECOMMANDE Vortex ref VORT dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Etuve ref BACTERIO dans la partie mat riel de laboratoire du catalogue Cam ra pour microscope ref 76455 ou 76457 ou 76458 dans la partie observation du catalogue Kit m
11. culture des techniques de dilution et de repiquage Apprendre manipuler en conditions st riles Montrer que les caract res ph notypiques directement li s au g notype se transmettent de g n ration en g n ration Approche de la relation G notype Ph notype Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 10 sur 21 Etudier l effet mutag ne des UV sur les levures en d duire qu ils agissent directement sur l ADN en introduisant des mutations apparition de r vertants diminution du nombre de clones effet l tal C Notions sur les levures Les levures se reproduisent par bourgeonnement ou plus rarement par scissiparit cloisonnement transversal sp cificit des Schizosaccharomyces pombe Les levures forment des colonies coniques sur bo te de p tri contrairement aux bact ries qui ont plut t tendance former des colonies plates et aux champignons dont le myc lium est facilement reconnaissable Leur taille 5 15um est sup rieure celle des bact ries 1 3 um ce qui permet de les observer facilement au grossissement 400 D Notions sur la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Il s agit d un eucaryote unicellulaire haplo de C est le plus petit g nome eucaryote connu 14 000 kb et 6200 g nes La souche utilis e porte une mutation qui affecte le g ne ade2 impliqu dans la cha ne de biosynth se de l ad nine voir le sch ma en page 12 Le g ne a
12. de2 a pour fonction de transformer un interm diaire de cette cha ne l Amino imidazole ribotide ou AIR qui est oxyd en un pigment rouge en a robiose La mutation Ade a deux effets e La souche tant incapable de synth tiser l ad nine elle ne poussera pas sur milieu minimum sans ad nine e Si on apporte de l ad nine en suppl mentant le milieu de culture ou en faisant pousser sur milieu riche la souche mut e va l utiliser pour pousser Comme la quantit d ad nine fournie la souche n est pas tr s importante la souche n a pas assez d ad nine pour pousser au mieux de ses capacit s La souche fera donc fonctionner la cha ne de biosynth se de l ad nine Elle pr sentera un ph notype rouge du fait de l accumulation de l AIR et de son oxydation amp ATTENTION dans le cas o on donne assez d ad nine la souche pour parer tous ses besoins elle ne fera plus tourner le cycle d obtention d ad nine et ainsi PAIR ne s accumulera plus et le ph notype blanc appara tra Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 11 sur 21 CHAINE DE BIOSYNTHESE DE L ADENINE Gmes adad ad 5 cde3 amp 3 adas ada7 4 4 4 4 4 Enzymes Enzl Enz2 Em3 Enz4 Enz 5 4 4 4 4 4 Preduks PRPP gt PRA gt GAR gt FSAR FGAM gt AIR ade gt Enz gt v CAIR a i gt Caz7 gt H AIP qe AMP ADS IMI FALUAR ALUAR SAKAR Aoidos nuelsiquos t T Tt Tt Enz 12 En
13. e d observation des r sultats CNB Si un contaminant type champignon par exemple appara t sur une bo te cartez la imm diatement pour viter de contaminer les autres bo tes de la pile Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 17 sur 21 INTERPRETATIONS ET CONCLUSIONS Exemple de r sultat obtenu Temps d exposition Nombre total de clones Nombre de clones age de blancs blancs 0 seconde 31 x 100 3 100 0 0 15 secondes 1 700 13 0 7 30 secondes 520 7 1 34 60 secondes 40 3 7 5 120 secondes 7 1 14 ONB Il faut multiplier le nombre de colonies par 100 pour la bo te non irradi e pour pouvoir comparer les r sultats ceux des autres bo tes la suspension B tal e sur la bo te t 0 est 100 fois moins concentr e que la suspension A tal e sur les bo tes irradi es Pr cisez bien aux l ves que cette dilution sur la bo te t O a t faite pour les aider compter les colonies plus facilement Quelques raisons d echec et actions correctives Les levures en suspension dans l eau peuvent clater sous l effet de la pression osmotique il est conseill de ne pas pr parer les suspensions la veille du TP mais juste avant la manipulation Lors de l interpr tation des r sultats des colonies de levures sont roses et non rouges Elles doivent tre consid r es comme rouges ces levures n ont pas suffisamme
14. iatement avec l autre taleur st rile comme d crit ci dessus Noter les bo tes t 15 t 30 t 60 t 120 Noter galement le nom du bin me Les bo tes sont alors pr tes tre irradi es Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 15 sur 21 3 Irradiation des bo tes not es t 15 t 30 t 60 et t 120 aux UV C ONB les autres types d UV ne donneront pas des r sultats satisfaisants Le type d UV est not sur le tube ATTENTION amp Les UV C sont dangereux et les cellules irradi es sont sujettes l apparition de mutations l ADN des cellules expos es peut tre cass et d form a Respecter les consignes de s curit Si vous n utilisez pas notre bo te irradiation nous vous conseillons de porter gants blouse et lunettes protectrices d s l approche de la zone d irradiation afin que la manipulation soit sans aucun risque Si vous utilisez notre bo te d irradiation suivez les consignes de s curit suivantes M Eteindre la lampe avant d ouvrir la porte M V rifier que la porte est bien ferm e avant d allumer la lampe M V rifier le positionnement de la bavette transparente qui permet de stopper les UV qui pourraient s chapper avant chaque p riode d irradiation M Ne pas laisser les l ves manipuler seuls la bo te UV ONB le port de gants et de lunettes n est pas n cessaire lors de l utilisation de notre lampe si les c
15. l ad nine l AIR en compos toxique Ces colonies mut es sont blanches et plus grosses que les rouges car elles poussent plus facilement non g n es par le pigment toxique ce n est pas pour autant qu elles ont r cup r la capacit synth tiser leur propre ad nine E Notions sur les UV_ agent mutag ne Les UV utilis s sont de type C et de longueur d onde 254 nm La distance optimale d exposition est de 25 cm Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 12 sur 21 La boite d irradiation Sordalab permet de travailler en toute s curit et efficacit Pour ce faire suivez le protocole d crit dans la fiche de manipulation par les bin mes page 14 La mol cule d ADN poss de la propri t d absorber la lumi re UV 254 nm les UV entra nent des mutations L absorption de l nergie des UV par l ADN entra ne la formation de dim res de thymines adjacentes ce qui provoque des cassures au sein de la mol cule due des distorsions de la double h lice Dans la majorit des cas ces cassures vont tre r par es par les enzymes impliqu es dans la r plication de l ADN nucl ases polym rases Seulement ces enzymes peuvent commettre des erreurs et des mutations peuvent appara tre Plus on sollicite ces enzymes plus le risque d apparition de mutation est important Ces mutations peuvent tre l tales si elles affectent un g ne responsable de la synth se d une p
16. n ration en g n ration puisqu ils sont directement li s au g notype ONB S il y a des colonies blanches sur la bo te t 0 soit cela est d une contamination durant l exp rience en particulier si le nombre de colonies blanches est lev soit les conditions de rougissement n ont pas t respect es concentration trop lev e temp rature non respect e conservation trop longtemps soit il est possible que ces colonies blanches apparaissent par r version spontan e En effet toutes les souches Ade2 pr sentent un taux de r version spontan e plus ou moins lev la souche s lectionn e poss de un faible taux de r version mais des colonies blanches peuvent tout de m me appara tre gt Ensuite il est important de remarquer que le nombre de colonies diminue progressivement des bo tes t 15 t 120 Cela nous permet de constater que les UV ont un effet l tal dose d pendant sur les levures Dans le cas o cet effet l tal ne serait pas vident il est possible que a soit d une suspension de levures pr par e trop en avance ou la mauvaise concentration ou bien la lampe UV Vous pouvez la tester en exposant une bo te de p tri de levures pendant 3 minutes apr s incubation vous devez observer un effet l tal total Dans le cas o ce n est pas le cas la lampe ne fonctionne pas aux UV C ou alors sa puissance n est pas suffisante recommandation 6 W gt Puis on s int
17. nt lanc leur cha ne de biosynth se de l ad nine et accumul peu d AIR Les lames de comptage sont imp ratives pour la pr paration de la suspension cellulaire car une mauvaise concentration peut fausser les r sultats finaux En effet s il y a trop de levures sur la bo te de p tri le rougissement est moins vident car les diff rentes colonies doivent se partager les constituants du milieu Eviter la culture 37 C et plus car la levure Ade2 pr sente un comportement thermosensible et peut ne pas bien rougir au del de cette temp rature Apr s plus de 10 jours au r frig rateur les levures rouges ont tendance blanchir probablement par d gradation du pigment tenez compte de ce param tre Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 18 sur 21 Observations mener Tout d abord il est important de remarquer que la bo te t O non soumise l action des UV pr sente des colonies de levures isol es qui ont toutes un ph notype rouge CNB Si vous voulez faire des rapport entre les nombres de colonies des diff rentes bo tes pensez que la bo te t O a t ensemenc e avec une suspension 100 fois moins concentr e que la suspension d ensemencement des autres bo tes Il faut donc multiplier le nombre de colonies de la bo te t 0 pour le comparer ceux des autres bo tes Cela permet de d montrer que les caract res ph notypiques se transmettent de g
18. onditions de s curit ci dessus sont bien respect es b Suivre le mode d emploi de la bo te irradiation La bo te irradiation Sordalab est livr e avec un mode d emploi qui est repris ci dessous Allumer la bo te 30 minutes avant le d but de l irradiation ceci permet de cr er une atmosph re st rile dans la bo te Eteindre la lampe Introduire les bo tes de p tri maximum 8 la fois g lose vers le haut Enlever le couvercle des bo tes Il est conseill de laisser les couvercles l int rieur pour qu ils restent dans des conditions de st rilit Fermer soigneusement la porte battante Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 16 sur 21 Allumer la lampe Lancer le chronom tre une fois la lampe allum e Laisser 15 secondes les bo tes not es t 15 Laisser 30 secondes les bo tes not es t 30 Laisser 60 secondes les bo tes not es t 60 Laisser 120 secondes les bo tes not es t 120 Eteindre la lampe Replacer les couvercles et r cup rer les bo tes de p tri Refermer la bo te d irradiation Conseil Les l ves qui ne sont pas occup s l irradiation peuvent observer les levures au microscope 4 Incubation des bo tes Incuber les 5 bo tes pendant 5 jours 28 C ou une semaine temp rature ambiante si vous ne disposez pas d tuve couvercle vers le bas Puis conserver 4 C couvercle vers le bas jusqu la s anc
19. oxyg n e puis jet e la poubelle Les bo tes de p tri ayant contenu la g lose peuvent tre jet es dans les bacs de r cup ration du plastique apr s avoir bien t d contamin es ATTENTION on ne contr le jamais totalement ce qui pousse sur milieu complet la d contamination est obligatoire Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 21 sur 21
20. p n trer sous la lamelle Placer la lame sous l objectif du microscope au grossissement 400 Mettre au point Compter les cellules pr sentes dans une dizaine de carr s de comptage Faire une moyenne moyenne nombre de levures sur les carr s nombre de carr s compt s Sachant que chaque carr contient 0 01 uL calculer la concentration de la suspension de comptage en cellules par mL Concentration suspension de comptage en cellules mL moyenne x100 000 Sachant que la suspension m re a t dilu e d un facteur 10 pour obtenir la suspension de comptage calculer la concentration de la suspension m re en cellules par mL Concentration suspension m re en cellules mL concentration suspension de comptage x 10 Il faut que cette concentration soit sup rieure ou gale 10 000 000 cellules mL Si la suspension m re est moins concentr e r it rer les tapes de pr l vement de colomies sur bo te et de mise en suspension Puis r aliser nouveau les points B et C Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 7 sur 21 Conseil 5 Marquer chaque cupule de comptage utilis e au marqueur ind l bile afin de ne pas confondre les cupules usag es si vous utilisez la m me lame la semaine suivante travail en demi groupe ATTENTION les dilutions et le comptage des cellules en vu de la pr paration de la suspension A doivent tre effectu s avec soinet en conditions st
21. riles les concentrations des suspensions sont un l ment d cisif pour la r ussite du TP D Pr paration de 50 mL de suspension de levures de concentration 10 cellules mL pour le TP suspension A Pr lever un volume de suspension m re calcul avec la formule suivante Volume V en mL de suspension m re pr lever 50 000 000 Concentration de la suspension m re en cellules mL Verser ce volume dans un tube pouvant contenir au moins 50 mL Compl ter avec un volume d eau tel que Volume d eau st rile ajouter en mL 50 Volume de suspension m re pr lev La suspension de concentration 10 cellules mL obtenue sera not e suspension A R partir 2 mL de cette suspension par tube dans 10 tubes de 5 mL 1 tube par bin me soit une pr paration pour 20 l ves Noter ces tubes suspension A 4 Pr paration de la salle Pr parer en champ st rile bec bunsen ou lectrique ou hotte flux 1 flacon contenant 100 mL d eau st rile Pr voir un compte gouttes st rile pour la classe Disposer sur chaque paillasse un tube st rile de 5 mL 2 compte gouttes st riles 5 bo tes de p tri de milieu complet 1 tube contenant 2 mL de la suspension 2 taleurs st riles Conseils 5 Afin que le mat riel reste st rile ne pas faire manipuler tous les bin mes en m me temps et distribuer les compte gouttes et les taleurs au fur et mesure Les l ves ayant tal leurs
22. rot ine vitale ou non et dans ce cas l on apparition d un mutant La manipulation consiste exposer notre souche mut e aux UV et observer l apparition de colonies blanches sur milieu suppl ment en ad nine qui peuvent tre issues des situations suivantes L introduction d une mutation dans un g ne en amont d ade2 dans la cha ne de biosynth se de l ad nine emp che l accumulation de l AIR c est un r vertant L introduction d une seconde mutation dans le g ne ade2 peut r tablir sa fonction dans ce cas la levure peut nouveau synth tiser l ad nine et n accumule plus l AIR donc sera blanche on dit qu on a un r vertant vrai celui ci poussera alors sur milieu minimum L introduction d une mutation dans un g ne impliqu dans la cha ne respiratoire emp che la transformation de l AIR en pigment rouge car c est un ph nom ne a robiose Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 13 sur 21 FICHE DE MANIPULATION PAR LES BINOMES A CONSIGNES GENERALES POUR LE TP ATTENTION pour votre s curit et la r ussite de l exp rience respecter bien les conditions de travail suivantes e Ne pas toucher le milieu des bo tes de p tri avec les mains et bien les laver en fin de s ance on ne contr le jamais totalement ce que l ont fait pousser sur un milieu complet e Toujours agiter une suspension de levures avant d en pr lever c
23. solutions peuvent proc der l irradiation pendant que les autres commencent l talement Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 8 sur 21 5 Apr s le travail des l ves a Incubation Incuber les 5 bo tes sans les parafilmer pendant 5 jours 28 C ou une semaine temp rature ambiante si vous ne disposez pas d tuve couvercle vers le bas Puis conserver 4 C couvercle vers le bas jusqu la s ance d observation des r sultats CNB Si un contaminant type champignon par exemple appara t sur une bo te cartez la imm diatement pour viter de contaminer les autres bo tes de la pile ATTENTION Il est imp ratif de respecter les concentrations cellulaires indiqu es dans notre protocole lors de la pr paration des suspensions de levures Si il y a trop de colonies sur la bo te elles ne rougiront pas b Nettoyage Placer tous les instruments dans l eau de javel concentration 1 en fin de manipulation Vous avez mut des micro organismes aussi une fois que les r sultats ont t observ s placer les bo tes dans de l eau de javel concentration 1 ou les autoclaver ATTENTION Ne pas toucher le milieu avec les mains et bien les lavers apr s manipulation on ne contr le jamais vraiment ce que l on fait pousser sur milieu complet Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 9 sur 21 PRINCIPE ET INTERET PEDA
24. t le d but du TP pour que les cellules n clatent pas ATTENTION tape r aliser en conditions de st rilit bec bensun ou lectrique ou encore hotte flux A Pr paration de la suspension m re de levure Verser la pipette 10 mL d eau st rile dans un tube st rile de 10 mL Pr lever avec un cure dent st rile quelques colonies de levures Ade2 isol es sur bo te de p tri Mettre en suspension dans les 10 mL d eau st rile Agiter Continuer ces tapes de pr l vement et de mise en suspension jusqu obtention d une suspension trouble Agiter nergiquement au vortex si possible pour rendre la suspension bien homog ne Noter ce tube suspension m re B Pr paration de la suspension de comptage dilution d un facteur 10 de la suspension m re Kit mutagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 6 sur 21 Pr lever 0 5 mL de la suspension m re avec un compte gouttes st rile contenu dans le sachet de mat riel en option 2 graduations sur la poire Verser dans un tube st rile de 10 mL Ajouter 4 5 mL d eau st rile avec une pipette st rile Agiter Noter ce tube suspension de comptage C Comptage Avec des lames KOVAS Pr lever avec un compte gouttes st rile une goutte de la suspension de comptage pr alablement agit e D poser dans le coin d une des 10 cupules de comptage NB par capillarit la suspension va
25. utagen se de la levure Saccharomyces cerevisae Ade2 Page 3 sur 21 FICHE PREPARATEUR 1 Pr paration du milieu pour les levures mode op ratoire diff rent selon la version choisie du kit o Pour la version coul e Les bo tes sont pr tes l emplot Conserver les bo tes convercle vers le bas 4 C o Pour la version couler possibilit de se servir d un bain marie ou d un micro ondes r aliser cette tape en avance pour plus de s curit Avec un bain marie Placer les bouteilles dans un bain marie bouillant avec le bouchon l g rement d viss Surveiller l avanc e de la fonte du milieu La totale dissolution prend environ 30 60 minutes cette tape peut tre beaucoup plus longue si la temp rature du bain n est pas suffisante ATTENTION manipuler avec pr caution pour viter toute br lure utiliser des gants antichaleur Laisser l g rement refroidir attention il ne faut couler la g lose quand elle est encore bien liquide Couler 16 17 bo tes par bouteille 20 mL par bo te environ Laisser compl tement refroidir Conserver les bo tes couvercle vers le bas 4 C Avec un micro ondes Placer les bouteilles avec bouchon d viss au micro ondes puissance moyenne pour viter les projections Contr ler l tat du milieu toutes les 30 secondes et agiter par rotation Arr ter le chauffage lorsqu il ne reste plus de grumeaux et que le milieu est bien homog
26. z11 Em10 Enz 9 Enz 8 T T T adeis akel cdeis3 PRPP phosphoribosyl pyrophasphate PRA 5 phosphoribosylamine GAR glyc nanmide ribocide FGAR formyl glycinamlide ribotide FGAM formyl glycinamidine ribotide AIR amino imidazole ribotide CAIR 5 amino 4 carboxyimidazols ribotide SALCAR 5 amino 4 succincearboxy imidazolo ribotide AICAR 3 auiuv d cuboxuunide imidazole riboide FAILCAR amino 4 carbomamide imidazole ribotide IMIP inosine monochosphais Le ph notype rouge et l incapacit pousser sur milieu pauvre nous permettent de disposer d un crible positif visible il nu et d un syst me de s lection sans utilisation d antibiotique On diff rencie ainsi facilement les souches qui portent la mutation Ade apr s croissance sur bo te de p tri En effet sur bo te riche ou suppl ment e en ad nine les levures sans mutation pousseront et auront un ph notype blanc tandis que les levures Ade2 pousseront mais auront un ph notype rouge Sur bo te de milieu pauvre sans ad nine les levures non mut es poussent et sont blanches alors que les levures Ade2 ne poussent pas ATTENTION amp les mutations sont courantes chez la levure Ade2 car le pigment AIR qui s accumule est toxique et augmente la pression de s lection Il est courant que la levure mute spontan ment au niveau de la cha ne respiratoire de mani re viter d oxyder l interm diaire de biosynth se de
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