MycAssay™ Aspergillus
Contents
1. R sultat 2 Aspergillus spp d tect R sultat positif Ce test est galement susceptible de d tecter P nicillium spp R sultat 3 chec du test pr sence d inhibiteurs ou d une autre substance inconnue Limites du mode op ratoire La principale limite de ce mode op ratoire est li e la qualit de l chantillon primaire Si l chantillon est tr s petit ou n a pas t pr lev dans la zone affect e du poumon le test peut se r v ler moins sensible et donner un r sultat faussement n gatif l convient de centrifuger les chantillons de LBA avant extraction de l ADN du culot Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus chantillons Respiratoires LightCycler 2 0 Les donn es ont galement montr qu une diminution lors de l tape de centrifugation du volume de surnageant utilis pour l extraction r duit la proportion d inhibiteurs p n trant dans le syst me est possible d obtenir des r sultats faussement positifs si l agent infectieux est P nicillium spp car celui ci ne peut pas tre diff renci d Aspergillus spp avec ce kit Bien que le proc d d extraction d ADN fongique MycXtra soit con u pour liminer les inhibiteurs de la PCR tous les m dicaments et toutes les populations de patients n ont pas t valu s Ce mode op ratoire n a pas t valu de mani re approfondie sur les expectorations et n a pas non plus t valu sur les2. 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1 10 1 12 Pr paration de la PCR en temps r el Pour commencer mettre en marche le syst me de PCR en temps r el LightCycler 2 0 automate ordinateur reli et centrifugeuse et lancer le logiciel correspondant Saisir le nom d utilisateur et le mot de passe et s lectionner la base de donn es Diagnostic S il s agit de la premi re analyse de la journ e lancer un autotest de l automate avant de configurer une analyse Rappel Un cycle de compensation colorim trique doit avoir lieu avant d analyser les r sultats du test MycAssay Aspergillus sur LightCycler 2 0 Toutefois il n est pas imp ratif de lancer le cycle avant d utiliser le pr sent produit Le cycle peut tre r alis et appliqu aux fichiers d analyse r trospectivement V rifier que le plan de travail a t nettoy l aide d un agent de d contamination de l ADN et qu il est sec viter cependant l utilisation de tels agents pendant la pr paration du test car un exc s de solution nettoyante peut inhiber la PCR Un sachet contient un Tube 1 un Tube 2 un Tube 3 et un Tube 4 Chaque sachet contient les quantit s n cessaires de r actifs pour r aliser 8 r actions Pour chaque passage au moins une r action avec un t moin positif et une r action avec un t moin n gatif doivent tre r alis es avec les r actifs d un m me lot du kit Un sachet permet ainsi d analyser 6 chantillons de pat
3. 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 8 Tillie Leblond Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Fran ais 1 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires Les m thodes actuelles de diagnostic de l aspergillose pulmonaire chronique font appel la fois la radiologie qui n est pas sp cifique et la s rologie anticorps IgG d Aspergillus ou pr cipitines qui se r v le positive avec la plupart des formes d aspergillose et qui n est donc pas sp cifique d une manifestation particuli re d aspergillose Les cultures donnent des r sultats positifs dans seulement 40 65 des cas confirm s par radiologie ou s rologie Dans la mesure o le diagnostic diff rentiel est vaste et inclut notamment la tuberculose les mycobact rioses atypiques la sarco dose l histoplas
4. en cr er un avant de proc der l analyse des donn es et l interpr tation Une fois l analyse termin e v rifier le contenu du rapport affich l cran et l imprimer si n cessaire sie Les r sultats pour Aspergillus se trouvent dans la section d analyse des Agents pathog nes 530 et les r sultats pour l IAC dans la section d analyse IAC 560 Le Run fal acoles 7a ASP 530 7a C 560 l 3 4 Dans les deux sections ASP 530 et IAC 560 s lectionner le fichier de compensation colorim trique MycAssay CC file appliquer l analyse Channel 530 Color Compensation On 7 Select Color Compensation Include Color Pos e Myc ssay CC file 530 560 Sample 3 3 5 Analyser chaque chantillon en commen ant par les t moins comme indiqu dans l organigramme ci dessous plus d informations sont fournies dans le tableau situ en dessous de l organigramme 030 152 Version 1 3 01MAR12 Fran ais 8 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires LightCycler 2 0 V rifier le t moin n gatif La valeur de Cp ASP est elle de 39 0 ou non OUI d tect e Contamination V rifier le t moin n gatif ACTION R p ter l analyse La valeur de Cp IAC est elle comprise entre 202 at22 0 chec de l analyse ACTION R p ter l analyse chec de l analyse V rifier le t moin positif ACTION R p ter l analyse La valeur de Cp A
5. Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 S147 54 1 Denning DW Riniotis K Dobrashian R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 S265 80 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A Bazelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 12 Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 030 152 Version 1 3 01MAR12 Fran ais 2 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires LightCycler 2 0 est recommand d utiliser des embouts pour pipettes st riles exempts de DNAse et usage unique de type filtres faible r tention ou d placement direct Utiliser un embout neuf pour chaque chantillon et chaque r actif Mettre au rebut les r actifs inutilis s et les d chets conform ment la r glementation nationale r gionale et locale en vigueur Afin d viter la contamination par les amplicons d Aspergillus et de IAC ne pas ouvrir les tubes r actionnels apr s amplification L analyse de t moins suppl mentaires peut tre exig e par les recommandations ou la r glementation nationale r gionale et ou locale en vigueur ou par l
6. avant pr paration de la PCR Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable Le r actif du Tube 1 ou du Tube 2 n a pas t ajout au m lange r actionnel pour PCR ou deux fois trop de r actif du Tube 2 a t ajout R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide d un capillaire r actionnel est plus lev ou plus bas que celui des autres capillaires Un fichier de compensation colorim trique erron a t appliqu aux donn es Cr er un fichier de compensation colorim trique l aide du kit Myconostica MycAssay CC et l appliquer aux r sultats avant de les analyser nouveau Pour en savoir plus sur ce kit contacter le distributeur local 4 3 Le t moin positif donne un r sultat n gatif gt Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs s
7. de d contamination de l ADN Toutefois les agents de d contamination de l ADN sont susceptibles d inhiber la r action du test Il faut donc viter leur utilisation lors de la pr paration de la PCR en temps r el Transvaser les liquides au moyen de micropipettes Il convient d utiliser des micropipettes d di es la pr paration des r actions et de les d contaminer r guli rement Il est recommand d utiliser des embouts filtres faible r tention afin d viter toute perte d ADN pendant la phase de pr paration Manipuler le Tube 4 avec pr caution Il contient un t moin positif base d ADN qui en cas de contamination risque de donner des r sultats faussement positifs Toujours porter des gants Tous les tubes r actionnels doivent tre bouch s apr s utilisation et avant mise au rebut Noter pr cis ment la position de tous les capillaires contenant les chantillons sur le carrousel 32 positions sur un plan d essai L analyse pr cise des donn es exige l application d un fichier de compensation colorim trique g n r l aide du kit Myconostica MycAssay CC 13 Voir par exemple Miffin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA 030 152 Version 1 3 01MAR12 Fran ais 4 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires LightCycler 2 0 Mode op ratoire 1
8. l infection L aspergillose bronchopulmonaire allergique complique l asthme et la mucoviscidose et appara t rarement sans affection sous jacente La plupart des cas sont associ s l A fumigatus Occasionnellement d autres champignons sont impliqu s Cette maladie est caract ris e par un encombrement pisodique des voies a riennes par d pais bouchons d expectorations contenant de nombreuses hyphes d Aspergillus un taux d IgE totales s riques gt 1 000 IU mL et des anticorps IgE et IgG d tectables sp cifiques d A fumigatus ou un test positif de la piq re pidermique par Aspergillus Les cultures d expectorations peuvent tre positives pour A fumigatus et la bronchectasie est visible sur un tomodensitogramme de la poitrine Base de donn es des esp ces sur www aspergillus org uk Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 suppl 1 S207 38 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 gt Greub G and Bille J 1998 Aspergillus species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance Clin Microbiol Infect 4
9. un fragment d ADN non pr sent dans le g nome des Aspergillus d autres champignons des bact ries ni de l homme pour d tecter les substances inhibitrices de la PCR et confirmer la fonctionnalit des r actifs Les cibles d ADN amplifi es sont d tect es par des balises mol culaires Il s agit de sondes d hybridation oligonucl otidiques monobrins qui forment une structure tige boucle La boucle contient une s quence de la sonde compl mentaire la s quence de la cible tandis que la tige est form e par annelage de s quences lat rales compl mentaires de part et d autre de la s quence de la sonde Un fluorophore qui met de la fluorescence lorsqu il est excit par une lumi re de longueur d onde adapt e est fix par liaison covalente une extr mit d un bras et un extincteur de fluorescence qui inhibe la fluorescence du fluorophore lorsqu il en est physiquement proche est fix par liaison covalente l extr mit de l autre bras Libres en solution les balises mol culaires ne sont pas fluorescentes Par contre lors de l hybridation avec un brin d acide nucl ique contenant une s quence cible elles subissent un changement de conformation qui s pare le fluorophore et l extincteur de fluorescence ce qui les rend fluorescentes lorsqu elles sont excit es L intensit de la fluorescence pendant un cycle donn ou apr s un cycle d pend de la quantit d amplicons sp cifiques pr sents ce moment L automate de PCR en t
10. Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupport lab21 com Fran ais 15 030 152 Version 1 3 01MAR12
11. PIAC 560 pr sente un cart significatif par rapport la ligne de base habituelle comme illustr sur l image ci dessous les fl ches indiquant les trac s anormaux Amplification Curves Fluorescence 560 oO o La PCR a t inhib e gt V rifier que le plan de travail et l quipement soient compl tement secs apr s nettoyage avec un agent de d contamination et avant pr paration de la PCR gt R p ter l analyse de l chantillon patient Si le probl me persiste l chantillon contient un inhibiteur de la PCR Mentionner cet chantillon comme ind termin dans le rapport 4 6 Les r sultats de la section IAC 560 sont presque identiques ceux de la section de l agent pathog ne 530 Aucun fichier de compensation colorim trique n a t appliqu aux r sultats d essai ou un fichier erron a t appliqu gt Dans les deux sections d analyse v rifier si l option ON est s lectionn e pour Colour Compensation et que le m me fichier de compensation colorim trique MycAssay CC a t appliqu aux deux voies 4 7 Les valeurs de base de certains chantillons sont identiques celles du t moin n gatif indiquant que l amplification n a pas eu lieu Toutefois le logiciel indique une valeur de Cp positive comme illustr ci dessous Lors des tudes de validation sur les 154 r actions n gatives r alis es une valeur de Cp positive pour un trac d amplification n gatif
12. Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 my conosjica Echantillons Respiratoires MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires REF 080 045 Usage pr vu L utilisation de MycAssay Aspergillus r serv e au personnel de laboratoire qualifi est indiqu e pour la d tection qualitative d ADN g nomique Aspergillus spp extrait d chantillons respiratoires des voies respiratoires inf rieures par exemple chantillons bronchiques comme aide au diagnostic chez les patients adultes suspects d infection ou d allergie Aspergillus Le test MycAssay Aspergillus a t valid pour une utilisation sur lautomate Roche LightCycler 2 0 R sum et explication Aspergillus spp est une moisissure opportuniste ubiquiste qui provoque des syndromes la fois allergiques et invasifs Ce genre se d cline en 300 esp ces environ parmi lesquelles 41 sont associ es des maladies chez l homme La majorit des infections sont provoqu es par fumigatus A flavus A terreus et A niger Moins couramment A nidulans et d autres esp ces rares telles qu A sydowii A versicolor A lentulus et A pseudofischeri sont impliqu es La plupart des infections et des allergies dues Aspergillus spp affectent les voies respiratoires Les syndromes allergiques incluent notamment l aspergillose bronchopulmonaire allergique et la sinusite aspergillaire allergique g n ralem
13. SP est elle comprise entre 15 0 et 20 0 OUI Positif pour l ADN d Aspergillus V rifier l chantillon La valeur de Cp ASP est elle lt 37 0 EE n V rifier l chantillon de patient N gatif pour l ADN d Aspergillus La valeur de Cp IAC est elle comprise entre 30 3 et 33 9 chec de l IAC ACTION R p ter l analyse de l chantillon En cas d obtention du m me r sultat suspicion de pr sence d inhibiteur dans l chantillon Cp agent pathog ne Cp IAC 560 Interpr tation Action n cessaire 530 T moin n gatif 39 0 ou Cp non Entre 30 3 et 33 9 T moin n gatif Les r sultats patient d tect e acceptable sont valides T moin n gatif 39 0 ou Cp non lt 30 3 ou gt 33 9 chec du t moin R p ter toute d tect e n gatif l analyse T moin n gatif lt 39 0 Entre 30 3 et 33 9 Contamination R p ter toute l analyse T moin positif Entre 15 0 et 20 0 Sans objet T moin positif Les r sultats patient acceptable sont valides T moin positif lt 15 0 ou gt 20 0 Sans objet chec du t moin R p ter toute positif l analyse chantillon de patient 2 39 0 ou Cp non Entre 30 3 et 33 9 N gatif pour R sultat mentionner d tect e Aspergillus dans le rapport R sultat 1 chantillon de patient lt 37 0 Sans objet Positif pour R sultat mentionner Aspergillus dans le rapport R sultat 2 chantillon de patient 39 0 ou Cp non lt 30 3 ou gt 33 9 chec de l IAC dans R p ter l analyse de
14. a t observ e deux reprises seulement gt Si cela se produit r p ter l analyse de l chantillon afin de confirmer le r sultat n gatif Amplification Curves 1 37 1 2 no Cp reported 113 33 2 Fran ais 11 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires 4 8 Lors de l application du fichier de compensation colorim trique certaines des valeurs de la voie IAC 560 chutent si bien que les valeurs de Cp correspondantes se trouvent en dehors de la plage acceptable Amplification Curves 0 kam TT a 85 2 22 24 2 2 30 32 A4 5 5 4 Cycles Ce ph nom ne est tout fait normal pour les r actions forte concentration en ADN cible et n a aucune cons quence sur l interpr tation des r sultats du patient gt Suivre l analyse normale Pour les chantillons positifs pour Aspergillus les r sultats de lIAC ne sont pas n cessaires la pose d un diagnostic pour le patient 4 9 Aucune voie ne donne de r sultat pour aucun des chantillons ni des t moins Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration gt V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et
15. chantillons provoqu s dans le s rum physiologique ni sur des chantillons pr lev s sur des enfants Des r sultats faussement positifs peuvent tre obtenus en cas de contamination externe de l chantillon initial ou du test par exemple par de l air contenant de l Aspergillus par une mauvaise technique de manipulation du t moin positif ou par contamination externe en particulier de la pipette par l ADN d Aspergillus Dans la mesure o un r sultat vraiment positif peut tre obtenu avec des chantillons de patients colonis s temporairement ou en permanence par Aspergillus spp le r sultat du test doit tre interpr t cliniquement dans le contexte de la maladie LICENCE TopTaq Hot Start est fourni par QIAGEN QIAGEN est une marque d pos e de Qiagen GmbH Hilden Allemagne Ce produit est vendu sous licence par le Public Health Research Institute PHRI Newark New Jersey tats Unis et il est sous protection de la propri t intellectuelle du PHRI Son utilisation se limite au diagnostic humain in vitro SmartCycler est une marque d pos e de Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale Californie 94089 tats Unis Une partie de ce produit est soumis une autorisation exclusive d exploitation de brevet en instance d tenu par le Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle Etats Unis LightCycler est une marque d pos e de Roche Diagnostics GmbH Lab21 184 Cambridge Science Park ml Cambridge CB4 OGA United
16. d tect e l chantillon l chantillon R sultat 3 VLC valeur limite clinique Tous les r sultats inf rieurs ou gaux cette valeur sont consid r s comme positifs d un point de vue clinique Les autres chantillons peuvent pr senter une valeur Cp gt 37 0 ce qui traduit un niveau normal ou naturel d Aspergillus dans l chantillon respiratoire Pour en savoir plus sur les R sultats 1 2 et 3 voir la section Rapport clinique Fran ais 9 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires 4 D pannage 4 1 Le t moin n gatif a mis un signal positif dans la voie 530 gt Une contamination s est produite pendant la pr paration Aucun des r sultats de l analyse n est fiable R p ter toute l analyse en faisant preuve de pr caution lors de l ajout des matrices en particulier du t moin positif Tube 4 pour viter toute contamination crois e Veiller ce que le plan de travail et l quipement soient bien d contamin s avant et apr s utilisation Le t moin n gatif a t mal positionn sur l automate Veiller correctement nommer les capillaires dans le logiciel 4 2 La valeur Cp de PIAC du t moin n gatif ne se trouve pas dans la plage acceptable gt La PCR a t inhib e V rifier que le plan de travail et l quipement soient compl tement secs apr s nettoyage avec un agent de d contamination et
17. donn de r sultat positif Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius L ADN humain et les 3 esp ces suivantes Pneumocystis jirovecii Histoplasma capsulatum et Alternaria alternata n ont pas t test s sur l automate LightCycler 2 0 mais l ont t sur le SmartCycler Ces 3 esp ces ont donn un r sultat n gatif avec le test Reproductibilit et r p tabilit La r p tabilit et la reproductibilit du test ont t d termin es par quatre op rateurs qui ont analys un ensemble de sept matrices en trois exemplaires chacune soit au total 168 tests Les exp riences ont t men es sur un lot de fabrication du kit MycAssay Aspergillus sur deux automates situ s sur deux sites au Royaume Uni Les r sultats ont t compar s la limite du blanc et la valeur limite clinique une concentration gale six fois le seuil de d tection 100 des chantillons ont donn des r sultats conformes la limite du blanc r sultats positifs et 87 5 des chantillons ont donn des r sultats conformes la valeur limite clinique des concentrations sup rieures Six fois le seuil de d tection 100 des chantillons pr sentaient des r sultat
18. ement le plan de travail l aide d un agent de d contamination de l ADN R alisation de l analyse Introduire le CD ROM du mode op ratoire du test MycAssay Aspergillus Myconostica Dans le menu File s lectionner Import puis Object ixo files Importer le fichier Macro MAA v1 2 ixo du CD dans la base de donn es File Edit wiew Tools Window Help EA Mew Ctrl M Fe MEET E S Open Ctri O glose g Save Chris Logout Export COF Std Curve Files Batch import Object ixo files Batch export i Report EtrlHR Print winda Exit Import File Look in MA LC CC CD ROM JMacro MAA CC ixo 7 My Documents js My Computer File name Macro MAA CC ixo D My Network Files of type Object ixo fles xo 030 152 Version 1 3 01MAR12 Fran ais 6 Pour diagnostic in vitro Echantillons Respiratoires MycAssay Aspergillus LightCycler 2 0 2 3 Dans le menu File s lectionner Save et enregistrer le macro l emplacement souhait de la base de donn es Save Experiment Kit dga 2 Root E System Admin __ Experiments Preferences Special Data BE reies and Macros C Analysis Templates __ Experiment Macros __ Report Templates C Run Templates __ Sample List Templates Name Macro MAA v 1 2 Cancel 2 4 S lectionner l option Run Macro dans la barre d outils 5 DA New it Run GE Analysis EI Open A Report aN rm Gre
19. emps r el surveille simultan ment la fluorescence mise par toutes les balises Pr cautions L utilisation du kit est r serv e aux professionnels de laboratoire Les modes op ratoires doivent tre suivis de mani re viter la production d a rosols lors de la manipulation des chantillons Il convient d observer les pr cautions habituelles et les recommandations en vigueur dans l tablissement lors de la manipulation des chantillons Une fiche de donn es de s curit est disponible aupr s de Myconostica Ltd Ce test est r serv au diagnostic in vitro Ce test est r serv une utilisation sur l automate Roche LightCycler 2 0 avec le logiciel LightCycler v4 1 Ne pas utiliser les r actifs ni les t moins si les sachets protecteurs sont ouverts ou endommag s la livraison Les r actifs et les t moins ne sont pas interchangeables d un lot un autre Ne jamais m langer les r actifs ou les t moins provenant de diff rents tubes m me s ils sont du m me lot Ne jamais utiliser les r actifs ni les t moins au del de la date d expiration convient de ne pas recongeler ni r utiliser les r actifs et les t moins apr s ouverture Porter des v tements de protection et des gants usage unique pour manipuler les r actifs du kit viter la contamination des r actifs par les microbes et la d soxyribonucl ase DNAse lors du pr l vement des parties aliquotes des tubes
20. ent dues A fumigatus Les aspergilloses pulmonaires chroniques comprennent l aspergillome l aspergillose pulmonaire cavitaire chronique et l aspergillose fibrosante chronique L aspergillose invasive appara t chez les groupes de patients risque notamment ceux trait s par cortico ides et ceux atteints de neutrop nie ou de dysfonctionnement du syst me phagocytaire c est dire granulomatose chronique ou infection VIH Environ 80 des cas d aspergillose invasive touchent les poumons Le diagnostic g n ral de l aspergillose pulmonaire invasive inclut un examen de tomodensitom trie TDM une bronchoscopie et un lavage broncho alv olaire observation sous microscopie et culture une recherche de l antig ne d Aspergillus dans le sang ou un examen histologique d chantillons pr lev s par biopsie Dans ce cas de figure les cultures sont souvent faussement n gatives En effet le lavage broncho alv olaire donne un r sultat positif par culture dans environ 40 des cas seulement m me lorsque le diagnostic a t confirm par d autre moyens ce qui traduit le manque de sensibilit de la culture pour la d tection de l aspergillose invasive et de l aspergillose pulmonaire chronique N anmoins les cultures sont importantes lorsqu elles sont positives car la plupart des tests de diagnostic n indique ni le genre ni l esp ce du champignon responsable de la maladie ni le profil de sensibilit de l isolat qui entra ne
21. es 8 Repl of sp 10e4 copies 1 9 Repl of sp 10e4 copies 10 Asp 10e5 copies IAC 560 11 Repl of sp 10e5 copies 12 Repl of Asp 10e5 copies 13 Asp 10e6 copies 14 Repl of Asp 10e6 copies 15 Repl of sp 10e6 copies 16 Positive Control ASP 530 Fran ais 7 Repl Of Sample Note 10 10 13 13 Selected Channels 530 560 610 640 670 705 Print Samples MPLC Batch ID Color Comp ID 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires 2 9 Placer le carrousel contenant les chantillons centrifug s sur l automate LightCycler 2 0 Veiller enclencher l axe de l enceinte thermique dans l encoche situ e sous la position 1 sur le carrousel V rifier que le carrousel est bien introduit dans l enceinte et fermer le couvercle 2 10 Une fois l op ration termin e cliquer sur le bouton Start S assurer que l automate a identifi tous les capillaires pr sents sur le carrousel et que le programme a d marr Experiment Kit Wizard x The experiment iz ready to run Before starting edit the sample imformation and run protocol as necessary Cancel 3 Analyse et interpr tation des donn es 3 2 Rappel Un fichier de compensation colorim trique doit tre appliqu avant d analyser les r sultats du test MycAssay Aspergillus sur LightCycler 2 0 Si aucun fichier na t cr pour l instant
22. ient S il y a plus de 6 chantillons analyser plusieurs sachets peuvent tre utilis s condition que ceux ci proviennent du m me lot du kit Toutefois la capacit de l automate LightCycler 2 0 est limit e 32 chantillons par analyse Par cons quent un maximum de 30 chantillons de patient peuvent tre analys s en un seul cycle 4 sachets Calculer le nombre de r actions requises en se reportant au tableau ci dessous Nombre de sachets Nombre maximum d chantillons de patient Sortir le nombre adapt de sachets du cong lateur Ne pas utiliser un sachet non scell En cas de cong lation des chantillons de patient apr s extraction sortir galement ceux ci du cong lateur Ouvrir le nombre n cessaire de sachets en les d chirant et en extraire les tubes En cas d utilisation de plusieurs sachets mais d analyse d un seul jeu de t moins positif et n gatif les Tubes 3 et 4 ne doivent tre retir s que d un seul sachet Manipuler le Tube 4 avec pr caution Il contient un t moin positif base d ADN qui en cas de contamination risque de donner des r sultats faussement positifs Laisser le contenu des tubes d congeler temp rature ambiante pendant 5 10 minutes V rifier que le contenu de chaque tube est enti rement d congel avant utilisation Agiter les tubes et les chantillons de patient au vortex pour en m langer le contenu puis centrifuger bri vement dans une microcentrifugeuse pour s assurer
23. mose la coccidio domycose la pneumoconiose le poumon rhumato de la pelvispondylite rhumatismale et d autres il est important d tablir la pr sence d Aspergillus spp dans les chantillons respiratoires afin d viter tout retard de diagnostic de l aspergillose et les traitements inadapt s MycAssay Aspergillus est un kit de diagnostic mol culaire qui repose sur la d tection de l ADN g nomique d Aspergillus spp par la technologie de la PCR en temps r el balises mol culaires Le mode op ratoire complet extraction d ADN de l chantillon clinique comprise peut tre r alis en 4 heures alors que la m thode par culture peut prendre plusieurs jours pour produire des r sultats positifs Ce test pr sente plusieurs avantages par rapport aux m thodes de diagnostic actuelles de l aspergillose invasive aigu et de l aspergillose pulmonaire chronique notamment une d tection plus rapide d Aspergillus spp et une augmentation potentielle de la sensibilit Aspergillus spp chez les patients fortement immunod prim s suspects d aspergillose pulmonaire invasive Principes de la m thode Apr s m lange des r actifs du kit MycAssay Aspergillus avec un chantillon contenant la s quence cible d ADN d Aspergillus une partie du g ne ribosomal 18S d Aspergillus un cycle thermique entra ne l amplification de l ADN Le test utilise galement un contr le interne d amplification IAC pour Internal Amplification Control
24. ne 2 5 S lectionner le fichier de mod le Macro MAA v1 2 puis cliquer sur Open 2 6 Suivre les instructions de l assistant S il sagit de la premi re analyse de la journ e cocher la case Perform Self Test Experiment Kit Wizard xj Welcome to the Experiment Kit Wizard The Experiment Kit Wizard helps you run a new experiment using the provided kit The first step is to create the new experiment To start the wizard and create a new experiment click Next If you don t want to create a new experiment at this time click Cancel Experiment Kit Wizard x Select the instrument you want to run the experiment on If the instrument is not in the list click Search LC_1 6937 LC 1 3 05 on COM1 LC_16337 lt Back Next gt Cancel 2 7 Nommer et enregistrer le fichier d analyse l emplacement souhait 2 8 Acc der la section Samples en cliquant sur l onglet correspondant gauche de l cran Modifier le nombre d chantillons dans la case Samples Count et les noms des chantillons dans l onglet Capillary view Nommer les chantillons conform ment au plan de l essai et aux positions sur le carrousel Sample data gt Analysis Type 7 Sample Count 16 LC Carousel ID Assay Cat No Assay Lot No Kewene 2 b 1 Negative Conto 2 Repl of Negative Control 3 Repl of Negative Control 4 Asp 10e3 copies 5 Repl of sp 10e3 copies 6 Repl of sp 10e3 copies 7 Asp 10e copi
25. nomique total des chantillons cliniques de LBA et d autres chantillons des voies respiratoires inf rieures cette fin il est recommand d utiliser le kit d isolement et l quipement suivants employ s pour la validation du test Kit d extraction d ADN fongique MycXtraT R F 080 005 disponible aupr s de Myconostica _ Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York tats Unis Adaptateur vortex R F 080 015 disponible aupr s de Myconostica Kit MycAssay Colour Compensation CC L analyse pr cise des donn es obtenues par le test MycAssay Aspergillus exige l application d un fichier de compensation colorim trique g n r l aide du kit Myconostica MycAssay CC fr f 080 080 Une fois cr le fichier peut tre appliqu plusieurs analyses r alis es sur le m me automate Pour en savoir plus contacter le distributeur local Remarques sur le mode op ratoire Lire le mode op ratoire dans son int gralit avant de commencer La dur e totale du mode op ratoire du test MycAssay Aspergillus extraction d ADN exclue est d environ 2 heures selon le nombre d chantillons analys s Il convient de pr parer le test sur un poste de travail pour PCR ou dans un laboratoire pr PCR Si aucun poste de travail pour PCR n est disponible il convient de pr parer le test dans une zone d di e du laboratoire s par e des zones utilis es pour l extraction d ADN et nettoy e r guli rement avec un agent
26. organisme d agr ment Ne pas manger boire ni fumer proximit des zones de manipulation des chantillons et des r actifs L ADN faible concentration peut tre instable s il n est pas conserv correctement Il est recommand de conserver l ADN extrait des chantillons cliniques 80 C afin d en pr server l int grit Dans la mesure du possible il convient galement d viter la d cong lation et la recong lation r p t es Contenu du kit Description Le kit est constitu de 5 sachets en aluminium 3 compartiments scell s utilisables individuellement Chaque sachet contient les quantit s n cessaires de r actifs pour r aliser 8 r actions Volume Tube 1 dNTP 66 uL bouchon MgCl orange Solution tamponn e de complexe d ADN polym rases Tube 2 lt 0 01 d amorces 66 uL bouchon lt 0 01 de balises mol culaires vert lt 0 0001 d IAC L IAC est un plasmide recombinant contenant une s quence non infectieuse et sans relation avec la s quence cible Aspergillus Tampon Tris HCI Tube 3 T moin n gatif 25 uL bouchon Eau transparent Tube 4 T moin positif 25 uL bouchon lt 0 0001 d ADN t moin positif noir La mol cule du t moin positif est un plasmide recombinant contenant la s quence cible d Aspergillus Tampon Tris HCI Autres l ments contenus dans le kit CD ROM du mode op ratoire du test MycAssay Aspergillus Myconostica Mode d emploi Certificat d analy
27. qu il ne reste pas de d p t au fond des tubes avant utilisation Placer le nombre requis de capillaires de 20 uL sur le portoir Veiller ne laisser aucune trace sur le verre Pr parer toujours le t moin n gatif en premier suivi des chantillons de patients Il convient de toujours pr parer le t moin positif en dernier Les volumes de r actifs et d ADN sont indiqu s dans le tableau ci dessous R action T moin n gatif chantillons de T moin positif patient Ajouter les r actifs dans l ordre indiqu dans le tableau ci dessus Tube 1 suivi du Tube 2 puis de la matrice t moin n gatif chantillon de patient ou t moin positif Faire preuve de pr caution lors du pr l vement des Fran ais 5 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires 2 1 parties aliquotes du Tube 1 le liquide est l g rement visqueux et peut adh rer la paroi interne du tube Si c est le cas proc der une nouvelle centrifugation pour recueillir le reste du contenu dans le fond du tube avant de tenter de pr lever les derni res parties aliquotes Utiliser un embout de pipette neuf pour chaque transfert de liquide Apr s utilisation reboucher chaque tube r actionnel et jeter imm diatement le tube et le contenu restant dans un conteneur d chets cliniques scellable Il est impossible de conserver les r actifs inutilis s pour un usage ult rieur Fai
28. r p t e Ces r sultats obtenus sur l automate SmartCycler sont consid r s transf rables l automate LightCycler 2 0 Sensibilit analytique partir du mode op ratoire pour l automate LightCycler 2 0 d crit ci dessus et des matrices de PCR g n r es par Myconostica la limite du blanc d termin e pour le test MycAssay Aspergillus correspond Cp 39 0 tandis que le seuil de d tection d termin avec la souche AF293 d Aspergillus fumigatus est lt 25 copies de l ADN cible S lectivit analytique L ADN g nomique extrait de P nicillium spp donne galement des r sultats positifs Cela s explique par le fait que les s quences des cibles mol culaires sont tr s similaires entre Aspergillus et P nicillium Par cons quent il est noter qu un r sultat positif avec ce test peut provenir d une infection P nicillium plut t qu une infection Aspergillus La s lectivit analytique a t valu e l aide d ADN extrait de diverses esp ces fongiques et non fongiques Les esp ces suivantes n ont pas donn de r sultat positif Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Les esp ces bact riennes suivantes n ont pas
29. re preuve d une extr me pr caution lors du pr l vement la pipette dans le Tube 4 ADN t moin positif afin de ne pas contaminer d autres r actions Le bouchage de tous les autres capillaires avant ouverture du Tube 4 peut r duire le risque de contamination crois e Boucher avec pr caution les capillaires l aide des bouchons fournis et du dispositif de bouchage V rifier que les capillaires sont bien bouch s Le bouchage peut intervenir apr s l ajout de la matrice dans le m lange r actionnel afin de r duire le risque de contamination crois e et de contamination de l environnement En l absence d une centrifugeuse carrousel centrifuger les chantillons dans une minicentrifugeuse l aide des adaptateurs fournis avec le portoir Sinon passer la Section 1 17 Transf rer tous les capillaires sur le carrousel avec le plus grand soin dans l ordre des positions sur le portoir en pla ant le premier capillaire sur la position 1 et en poursuivant dans l ordre croissant sans laisser d espace vide Pousser chaque capillaire fond vers le bas jusqu ce qu il tienne fermement en place S ils n ont pas encore t centrifug s etape 1 16 centrifuger les chantillons sur la centrifugeuse carrousel LightCycler 2 0 Passer aussit t la Section 2 Les r actions du test MycAssay Aspergillus restent stables temp rature ambiante pendant un maximum de 60 minutes Apr s pr paration de la PCR nettoyer soigneus
30. s conformes la valeur limite clinique et la limite du blanc Transfert de la valeur limite clinique La valeur limite clinique de 36 0 a t d termin e sur l automate SmartCycler Cette valeur limite a t transf r e analytiquement l automate LightCycler 2 0 l aide d une matrice dont la concentration en Aspergillus a permis d obtenir un taux de r sultats positifs 2 95 la valeur limite clinique sur l automate SmartCycler Une valeur de Cp de 37 0 a t d termin e puis confirm e l aide de trois matrices de concentration diff rente Fran ais 13 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires SE SSD eaen a a Performances tablies l aide de automate Cepheid SmartCycler Substances interf rentes contre indications Les compos s suivants ont t analys s des concentrations pertinentes du point de vue clinique et d termin s comme non inhibiteurs du test ac tylcyst ine amphot ricine dipropionate de b clom tasone bud sonide colistim thate sodique propionate de fluticasone fumarate de formot rol dihydrat bromure d ipratropium lidoca ne mannitol sulfate de salbutamol salm t rol chlorure de sodium cromoglicate de sodium terbutaline tobramycine valuation des performances Des chantillons respiratoires LBA pr lev s dans deux h pitaux dont l ADN a t extrait avec le kit MycXtra p
31. se Conservation II convient de conserver le kit au cong lateur de 15 C 25 C jusqu la date d expiration indiqu e sur l tiquette de la bofte du kit date au del de laquelle il convient de mettre le kit au rebut conform ment la r glementation locale en vigueur Le contenu d un sachet doit tre utilis imm diatement apr s ouverture Ne pas le recongeler ni le r utiliser ult rieurement Fran ais 3 030 152 Version 1 3 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro LightCycler 2 0 chantillons Respiratoires Equipement et mat riel n cessaires et non fournis Automate de PCR en temps r el Roche LightCycler 2 0 avec manuel d utilisation ordinateur reli et logiciel LightCycler version 4 1 Centrifugeuse carrousel LightCycler 2 0 adaptateurs de capillaires pour minicentrifugeuse facultatifs Carrousel d chantillons pour capillaires de 20 uL Capillaires LightCycler 2 0 de 20 ul munis de bouchons Portoir pour capillaires jecteur de capillaires Dispositif de bouchage Microcentrifugeuse Agitateur vortex Micropipettes volumes de 7 5 uL 20 uL Embouts filtres st riles faible r tention Gants usage unique non poudr s Solution de d contamination de l ADN exclusive Kit d isolement d ADN voir ci dessous Kit MycAssay CC voir ci dessous chantillon L chantillon soumettre au test MycAssay Aspergillus est l ADN g
32. si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable L automate ne fonctionne pas de fa on optimale gt V rifier que l entretien et l talonnage de l automate de PCR en temps r el sont jour conform ment aux instructions du guide d installation et de maintenance La configuration du logiciel a t faite avec un fichier de mode op ratoire incorrect gt Se reporter la Section 2 et s lectionner le fichier de mode op ratoire correct sur le CD ROM de mode op ratoire Myconostica tel qu indiqu pour chaque version du logiciel Seul le fichier compatible avec le logiciel peut tre charg R p ter l analyse avec le fichier de mode op ratoire correct Pour toute question ou en cas de probl me contacter le Service d assistance technique productsupport lab21 com 030 152 Version 1 3 01MAR12 Fran ais 12 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires LightCycler 2 0 Caract ristiques de performance et limites Le kit a initialement t valid l aide de l automate Cepheid SmartCycler Certaines revendications de performances du test ont t valid es nouveau sur l automate LightCycler 2 0 l aide de capillaires de verre Roche r f 04929292001 et 11909339001 comme indiqu ci dessous Lorsqu il a t estim que les diff rences entre les automates n affectent pas les performances du test ni par cons quent la revendication l tude n a pas t
33. uis qui ont t congel s ont servi valuer les performances du kit MycAssay Aspergillus avec les chantillons cliniques Les r sultats ont t compar s la fois au diagnostic clinique et la culture La valeur limite de Ct 36 0 a t d termin e suite au passage en revue d un ensemble de donn es d chantillons issus de diff rents sites et pr lev s sur diff rentes populations de patients La probabilit de diff renciation entre la maladie et l tat sain a t valu e avec plusieurs valeurs limites Comparaison entre la PCR et le diagnostic clinique RE Diagnostic clinique positif Diagnostic clinique n gatif PCR positive Ooo a 1 os7 ve PCR n gative O 10 0 88 VPN 0 94 0 91 Sensibilit Sp cificit Comparaison entre la PCR et la culture d Aspergillus ouwepostve Cutwrer gaie 7 o Sensibilit Sp cificit Parmi les chantillons analys s 0 8 contiennent des inhibiteurs de la PCR suite l extraction l aide du kit MycXtra comme indiqu par l IAC Rapport clinique Le kit MycAssay Aspergillus est destin servir d aide au diagnostic Les r sultats doivent tre consid r s dans le contexte de l tat clinique du patient et en association avec les r sultats d autres tests de diagnostic Il est recommand d employer la phras ologie suivante dans le rapport en fonction de l interpr tation des r sultats du test R sultat 1 Aspergillus spp non d tect
34. ur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable Une erreur s est produite au cours des tapes 1 11 1 13 et la matrice du t moin positif Tube 4 a t plac e dans le mauvais tube r actionnel R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide d un tube r actionnel est plus lev que celui d un autre Le r actif du Tube 1 ou du Tube 2 n a pas t ajout au m lange r actionnel R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide de ce capillaire r actionnel est plus bas que celui des autres capillaires Le t moin positif a t mal positionn sur l automate Veiller correctement nommer les capillaires dans le logiciel 030 152 Version 1 3 01MAR12 Fran ais 10 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires LightCycler 2 0 4 4 Les chantillons patient sont n gatifs et PIAC se trouve en dehors de la plage acceptable R sultat 3 est probable que les chantillons de patient contiennent des inhibiteurs de la PCR gt Il est recommand d extraire l ADN des chantillons l aide du kit d extraction d ADN fongique MycXtra 4 5 L chantillon patient est n gatif dans la section ASP 530 et la courbe de
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