GLABRATA R.T.T. FUMOUZE
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1. 3 GLABRATA R T T FUMOUZE Rapid Trehalose Test Test for the Identification of Candida glabrata INTENDED USE Candida yeasts may cause cutaneous mucous or systemic candidoses Candida are usually commensal yeasts in the gastric and urogenital mucosa They only become pathogenic when the conditions are favourable in the host organism Among the factors favouring the candidosis infection it is possible to distinguish the intrinsic physiological or pathological factors infancy or old age pregnancy diabetes immune deficiency and malignant diseases from the extrinsic iatrogenic factors 11 The occurrence of candidoses has considerably increased over the last 20 years after the emergence of new diseases such as AIDS the generalisation of antibiotic treatments and oral contraceptives the development of immunosuppressive therapies parenteral alimentation the multiplication of aggressive methods of investigation and surgical interventions By way of example the candidemias account for about 10 of all nosocomial infections This percentage may even reach 20 in certain studies In addition the prognosis remains very grim the mortality oscillating between 38 and 50 in fungemic patients C albicans is the species most often isolated It accounts for 60 to 80 of the clinical isolates However other species such as C dubliniensis a species very similar to C albicans C glabrata C tropicalis C krusei C lusitaniae C2. d une suspension de levures en eau distill e 2 Incubation de la suspension de levures avec le tr halose ou le maltose t moin levure ou le milieu de base t moin milieu d isolement 3 R v lation du glucose par le r v lateur qui est un m lange de glucose oxydase de peroxydase et de substrat chromog ne Milieu de culture Colonies de C glabrata A ect ean ete wit ean le ae ese mrmr G minI wA i 5 Tr halose alose eh COMPOSANTS DU TEST Glucose oxydase Peroxydase Chromog ne brun orange COMPOSITION DU COFFRET 10 cartes de 12 cupules contenant sous forme de taches bleues les milieux d shydrat s T M et B Les cupules T contiennent un milieu de base et du tr halose Les cupules M contiennent un milieu de base et du maltose Les cupules B contiennent un milieu de base Une carte permet d effectuer 4 identifications e R v lateur lyophilis 3 flacons reconstituer avec 1 3 mL d eau distill e st rile Notice d utilisation MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI DANS LE COFFRET Eau distill e st rile Tubes h molyse Une micropipette automatique pour distribuer un volume de 25 uL Une micropipette automatique pour distribuer un volume de 100 pL Une micropipette automatique ou une pipette st rile pour distribuer un volume de 1 mL Pipettes Pasteur boutonn es ou des ses pour pr lever les colonies PRECAUTIONS D EMPLOI Pour usage in vitro Po
3. parapsilosis C lipolytica are more and more often reported as mycoses agents According to the study C glabrata accounts for 5 to 25 of the yeast isolates in medical mycology In terms of frequency this yeast is currently the second species found in Man 2 4 Its pathogenic nature is no longer contested since it is responsible for 10 to 25 of all candidemias 9 Moreover C glabrata is generally less sensitive to azole derivatives 1 10 and certain isolates obtained from patients treated with fluconazole or ketoconazole even appear to be resistant to almost all azole derivatives The rapid isolation and identification of C glabrata is necessary for the implementation of an appropriate treatment Classically this identification uses biochemical tests carbon auxanogram study of the assimilation of oses as the source of carbon and energy and zymogram study of the use of oses in anaerobiosis that require a fairly long time from 24 to 48 hours 3 4 5 C glabrata may be identified more quickly with systems based on the detection of preformed enzymes that use chromogen substrates 5 or substrates based on the assimilation of trehalose 6 Recently a test based on the rapid detection of trehalase was proposed by Peltroche Llacsahuanga et al 8 and by Parant et al 7 GLABRATA R T T is also a rapid test for the identification of C glabrata and is based on the detection of this enzyme PURPOSE OF THE TEST GLABRATA R T T is a
4. GLABRATA R T T FUMOUZE rg Diagnostics yf kad Rapid Trehalose Test Test d identification de Candida glabrata INTERET DU TEST Les levures du genre Candida peuvent tre l origine de candidoses cutan es muqueuses ou syst miques Les Candida sont des levures habituellement commensales des muqueuses digestives et urog nitales Elles ne deviennent pathog nes que lorsque des conditions favorables se pr sentent dans l organisme h te Parmi les facteurs favorisant l infection candidosique on distingue des facteurs intrins ques physiologiques ou pathologiques ges extr mes de la vie grossesse diab te d ficits immunitaires et maladies malignes et des facteurs extrins ques qui sont essentiellement de nature iatrog ne 11 La pr valence des candidoses a consid rablement augment au cours des 20 derni res ann es par suite de l mergence de nouvelles pathologies comme le SIDA de la g n ralisation des traitements antibiotiques et des contraceptifs oraux du d veloppement des th rapeutiques immunosuppressives de l alimentation parent rale de la multiplication des m thodes d investigations agressives et des interventions chirurgicales A titre d exemple les candid mies repr sentent environ 10 de l ensemble des infections nosocomiales ce pourcentage pouvant m me atteindre 20 selon certaines tudes En outre leur pronostic reste tr s sombre la mortalit oscillant chez les patients fong miques en
5. S Well T Well M Well B CONCLUSION Trehalose Maltose Basic medium Non C glabrata yeast Continue the identification Non C glabrata yeast Continue the identification Positive Positive Positive Non interpretable Repeat the tests by carefully sampling the yeasts without removing the agar PERFORMANCE CHARACTERISTICS The results of the evaluations of GLABRATA R T T show according to the isolation media used a sensitivity of 93 8 to 97 9 97 9 for Candida ID CandiSelect and Sabouraud media and 93 8 for the CHROMagar candida medium and a specificity of 97 6 to 98 8 98 8 for the Sabouraud and CHROMagar candida media 98 for the Candida ID medium and 97 6 for the CandiSelect medium Raymond Robert Laboratoire de Parasitologie Mycologie Facult de Pharmacie 49100 Angers et Anne Marie Freydi re Laboratoire de Microbiologie H pital Debrousse Hospices Civils de Lyon 69322 Lyon BIBLIOGRAPHIE REFERENCE 1 Abi said D Anaissie E Uzun O Raad L Pinzcowski H and Vartivarian S 1997 The epidemiology of hematogenous candidiasis caused by different Candida species Clin Infect Dis 24 1122 1128 2 Bouchara J P Declerck P Cimon B Planchenault C de Gentile L Chabasse D 1996 Routine use of CHROMagar Candida medium for presumptive identification of Candida yeast species and detection of mixed fungal populations Clin Microbiol Infect 2 202 208 3 Fenn J P Billetdeaux E Segal H Skodack Jo
6. ction n gative on observe une coloration l g rement bleut e INTERPRETATION DES RESULTATS RESULTATS Cupule T Cupule M Cupule B CONCLUSION Tr halose Maltose Milieu de base N gatif N gatif C glabrata N gatif N gatif N gatif Levure non C glabrata Poursuivre l identification N gatif Levure non C glabrata Poursuivre l identification N gatif N gatif Levure non C glabrata Poursuivre l identification Non interpr table Recommencer les tests en pr levant avec pr caution les colonies de levures sans pr lever de g lose PERFORMANCES DU TEST Les r sultats des valuations du GLABRATA R T T montrent selon les milieux d isolement utilis s une sensibilit de 93 8 97 9 97 9 pour les milieux Candida ID CandiSelect et Sabouraud et 93 8 pour le milieu CHROMagar candida et une sp cificit de 97 6 98 8 98 8 pour les milieux Sabouraud et CHROMagar candida 98 pour le milieu Candida ID et 97 6 pour le milieu CandiSelect Raymond Robert Laboratoire de Parasitologie Mycologie Facult de Pharmacie 49100 Angers et Anne Marie Freydi re Laboratoire de Microbiologie H pital Debrousse Hospices Civils de Lyon 69322 Lyon Fabriqu par Manufactured by SERFIB 2 rue de la Bourse 75002 PARIS FRANCE Distribu par Distributed by Fumouze Diagnostics Le Malesherbes 110 114 rue Victor Hugo 92300 LEVALLOIS PERRET FRANCE T l 33 0 1 49 68 41 00 Nom 0080055 12 07
7. d from 1997 through 1999 in the SENTRY antimicrobial surveillance program J Clin Microbiol 39 3254 9 10 Pfaller M A Messer S A Hollis R J Jones R N Doern G V Brandt M E and Hajjeh R A 1999 Trends in species distribution and susceptibility to fluconazole among blood stream isolates of Candida species in the United States Diag Microbiol Infect Dis 33 217 222 11 Senet J M Robert R 1995 Physiopathology of candidosis J Mycol Med 5 145 166 12 Freydiere A M Robert R Ploton C Marot Leblond A Monereau F Vandenesch F 2003 Aug Rapid identification of Candida glabrata with a new commercial test GLABRATA RTT J Clin Microbiol 41 8 3861 3 13 Freydiere A M Perry J D Faure O Willinger B Tortorano A M Nicholson A Peman J Verweij P E 2004 Oct Routine use of a commercial test GLABRATA RTT for rapid identification of Candida glabrata in six laboratories J Clin Microbiol 42 10 4870 2 14 Peman J Aparisi N Garcia Esteban C Gobernado M 2004 Jun Rapid identification of Candida glabrata using a new commercial kit Rev Iberoam Micol 21 2 82 4 15 Willinger B Wein S Hirschl A M Rotter M L Manafi M 2005 Jan Comparison of a new commercial test GLABRATA RTT with a dipstick test for rapid identification of Candida glabrata J Clin Microbiol 43 1 499 501 6
8. e The M wells contain a basic medium and maltose The B wells contain a basic medium A card can be used for 4 identifications Lyophilised Active Reagent 3 bottles to reconstitute by adding 1 3 mL of sterile distilled water Package insert MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED IN THE KIT Sterile distilled water Haemolysis tubes A 25 uL automatic micropipette A 100 uL automatic micropipette A 1 mL automatic micropipette or a sterile pipette Pasteur pipettes or inoculating loops to sample the colonies A container for contaminated wastes WARNINGS AND PRECAUTIONS For in vitro use e Only for professional use Do not use the reagents after the shelf life indicated on the kit e Check that the dehydrated media have not been altered Presence of a blue spot in all of the cells e Comply with the instructions e Do not use reagents from other kits e Before use allow the reagents to return to room temperature e The material directly in contact with the yeast samples should be considered as potentially dangerous and be handled with care e In case of accidental spill of reagents clean the surface with absorbent paper If the liquid contains yeasts wear gloves and clean with absorbent paper and bleaching water The samples reagents as well as the contaminated materials and products are eliminated in a container for contaminated wastes according to the prevailing recommendations and regulations Cards with well
9. nes L Padilla PE Bale M Carroll K 1999 Comparison of four methodologies for rapid and cost effective identification of Candida glabrata J Clin Microbiol 37 3387 9 4 Fidel P L Vazquez J A Sobel J D 1999 Candida glabrata review of epidemiology pathogenesis and clinical disease with comparison to C albicans Clin Microbiol Rev 12 80 96 5 Freydiere A M Guinet R and Boiron P 2001 Yeast identification in the clinical microbiology laboratory phenotypical methods Med Mycol 39 9 33 6 Lopez J Dalle F Mantelin P Moiroux P Nierlich A C Pacot A Cuisenier B Vagner O and Bonnin A 2001 Rapid identification of Candida glabrata based on trehalose and sucrose assimilation using Rosco diagnostic tablets J Clin Microbio l 39 1172 1174 7 Parant F Freydiere A M Gille Y Boiron P and Odds F C 2001 A one minute trehalase detection test for the identification of Candida glabrata J Mycol Med 11 26 31 8 Peltroche Llacsahuanga H Schnitzsler N L tticken R Haase G 1999 Rapid identification of Candida glabrata by using a Dipstick to detect trehalase generated glucose J Clin Microbiol 37 202 5 9 Pfaller M A Diekama D J Jones R N sader H S Fluit A C Hollis R J Messer S A 2001 International surveillance of bloodstream infections due to Candida species frequency of occurrence and in vitro susceptibilities to fluconazole ravuconazole and voriconazole of isolates collecte
10. oride R22 Nocif en cas d ingestion R42 Peut entra ner une sensibilisation par inhalation R45 Peut provoquer le cancer S22 Ne pas respirer les poussi res S45 En cas d accident ou de malaise consulter imm diatement un m decin si possible lui montrer l tiquette S53 Eviter l exposition Se procurer des instructions sp ciales avant l utilisation 2 CONSERVATION Conserver les cartes ainsi que le r v lateur lyophilis ou reconstitu a 2 8 C et labri de la lumi re Apr s reconstitution le r v lateur est stable 2 mois 2 8 C La dur e de conservation du r v lateur reconstitu peut tre prolong e jusqu 6 mois en le congelant 20 C sous forme d aliquots de 75 uL dans des microtubes qui seront soigneusement bouch s imm diatement apr s reconstitution Le r v lateur d congel ne peut tre recongel MODE D EMPLOI 1 Pr paration des chantillons Le GLABRATA R T T peut tre r alis sur des levures isol es apr s culture 37 C ou 22 C pendant 24 96 heures sur les milieux de Sabouraud et sur les milieux chromog nes pour Candida 2 Reconstitution du r v lateur Ouvrir le flacon avec pr caution flacon sous vide Reconstituer le r v lateur en ajoutant 1 3 mL d eau distill e st rile dans le flacon R v lateur et agiter doucement 3 R alisation du GLABRATA R T T Sortir 1 ou plusieurs cartes en fonction du nombre de levu
11. rapid 20 minutes and unit test for the rapid identification of colonies of Candida glabrata PRINCIPLE Among the yeasts of medical interest C glabrata may in certain conditions very quickly hydrolyse trehalose into glucose The detection of this production of glucose is then used to identify the yeast However two controls have to be carried out in addition to the trehalose test e A maltose control since certain isolates of C tropicalis may also break down trehalose but as opposed to C glabrata they assimilate maltose A control in the absence of ose basic medium control of the reagent since the isolation media contain glucose and a poor sampling of colonies that contain gelose may result in a false positive reaction GLABRATA R T T is used in a three step test for the identification of C glabrata 1 Preparation of a yeast suspension in distilled water 2 Incubation of the yeast suspension with trehalose or maltose yeast control or the basic medium isolation medium control 3 Detection of the glucose by the agent that is a mixture of oxidase glucose peroxidase and chromogen substrate Culture medium COMPONENTS OF THE TEST Glucose oxidase Colonies of C glabrata HA Irehalose Peroxidase orange brown Chromogen 4 COMPOSITION OF THE KIT 10 cards with 12 wells containing the dehydrated media T M and B in the form of blue spots The T wells contain a basic medium and trehalos
12. re identifi plus rapidement avec des syst mes bas s sur la d tection d enzymes pr form es qui utilisent des substrats chromog nes 5 ou bas s sur l assimilation du tr halose 6 R cemment un test bas sur la d tection rapide de la tr halase a t propos par Peltroche Llacsahuanga et collaborateurs 8 et par Parant et collaborateurs 7 Le GLABRATA R T T est aussi un test rapide d identification de C glabrata bas sur la mise en vidence de cette enzyme BUT DU TEST GLABRATA R T T est un test rapide 20 minutes et unitaire pour l identification rapide des colonies de Candida glabrata PRINCIPE Parmi les levures d int r t m dical C glabrata peut dans certaines conditions hydrolyser tr s rapidement le trehalose en glucose La r v lation de cette production de glucose permet alors l identification de la levure Cependant en plus du test trehalose deux t moins doivent tre r alis s un t moin maltose car certains isolats de C tropicalis peuvent aussi d grader le tr halose mais contrairement C glabrata ils assimilent le maltose e un t moin en absence d ose t moin milieu de base du r actif car les milieux d isolement contiennent du glucose et un mauvais pr l vement des colonies qui contiendrait de la g lose pourrait conduire une r action faussement positive Le GLABRATA R T T permet la r alisation d un test en trois tapes pour l identification de C glabrata 1 Pr paration
13. res a tudier Pour une levure d couper une carte de fa on a avoir les 3 cupules T M et B Identifier un tube a h molyse et ajouter 100 uL d eau distill e st rile Pr lever avec pr caution des colonies de la levure identifier et les homog n iser dans les 100 uL d eau distill e de mani re avoir une suspension de densit quivalente au point 5 de la gamme de Mc Farland 3 4 colonies si la culture a t r alis e sur milieu de Sabouraud et 3 8 selon la taille des colonies si la culture a t r alis e sur un milieu chromog nique Attention Ne pas pr lever de g lose en m me temps que les colonies D poser l aide d une micropipette 25 uL de la suspension de levures pr par e sur chacune des taches bleues T M et B Laisser incuber 10 minutes a temp rature ambiante un prolongement du temps d incubation de 10 minutes n a pas d influence sur le r sultat final Ajouter 25 uL de r v lateur l aide d une micropipette dans chacune des cupules T M et B Laisser incuber 5 a 10 minutes a temp rature ambiante Effectuer la lecture Apparition d une coloration orange plus ou moins fonc e R action Positive Absence de coloration R action N gative IMPORTANT Si la lecture doit tre diff r e la r action sera bloqu e en ajoutant dans chaque cupule 25 uL de H S0 3 M Pour une r action positive la coloration devient alors marron gris puis fuchsia et dans le cas d une r a
14. s T Toxic Contains Chloramphenicol e R45 May cause cancer S45 In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show the label where possible e S53 Avoid exposure obtain special instructions before use Lyophilised Active Reagent T Toxic Contains glucose oxidase and 3 3 dimethoxibenzidine dihydrochloride e R22 Harmful if swallowed R42 May cause sensitization by inhalation e R45 May cause cancer S22 Do not breathe dust S45 In case of accident or if you feel unwell seek medical advice immediately show the label where possible e S53 Avoid exposure obtain special instructions before use STORAGE Store the cards as well as Active Reagent lyophilised or reconstituted at 2 8 C and in the dark After reconstitution the Active Reagent is stable for 2 months at 2 8 C The shelf life of the reconstituted Active Reagent may be extended to 6 months by freezing it 20 C in the form of 75uL aliquots in carefully sealed microtubes immediately after reconstitution The Active Reagent once thawed out can not be frozen again PROCEDURE 1 Preparation of the samples GLABRATA R T T can be carried out on isolated yeasts after culture at 37 C or 22 C for 24 to 96 hours on Sabouraud media and Candida chromogenic media 2 Reconstitution of the Active Reagent Carefully open the bottle vacuum bottle Reconstitute the Active Reagent by adding 1 3 mL of sterile distilled
15. tre 38 et 50 C albicans est l esp ce la plus souvent isol e Elle repr sente 60 80 des isolats cliniques Toutefois d autres esp ces telles que C dubliniensis une esp ce tr s proche de C albicans C glabrata C tropicalis C krusei C lusitaniae C parapsilosis C lipolytica sont de plus en plus fr quemment signal es comme agents de mycoses C glabrata repr sente selon les tudes 5 25 des isolements de levures en mycologie m dicale En terme de fr quence cette levure est actuellement la deuxi me esp ce rencontr e chez l Homme 2 4 Son caract re pathog ne n est plus contest aujourd hui dans la mesure o elle est responsable de 10 25 des candid mies 9 Par ailleurs C glabrata pr sente g n ralement une moindre sensibilit aux d riv s azol s 1 10 et certains isolats provenant de patients trait s par du fluconazole ou du k toconazole apparaissent m me d embl e r sistants la quasi totalit des d riv s azol s L isolement et l identification rapide de C glabrata est donc indispensable la mise en route d une th rapeutique appropri e Classiquement cette identification est r alis e l aide des tests biochimiques auxanogramme du carbone tude de l assimilation des oses comme source de carbone et d nergie et zymogramme tude de l utilisation des oses en ana robiose qui n cessitent un d lai de r ponse assez long de 24 48 heures 3 4 5 C glabrata peut t
16. ur usage professionnel uniquement Ne pas utiliser des r actifs au del de la date de p remption inscrite sur le coffret V rifier que les milieux d shydrat s ne sont pas alt r s Pr sence d une tache bleue dans toutes les cupules Respecter les instructions de la notice d utilisation Ne pas utiliser des r actifs provenant de coffrets diff rents Avant toute utilisation laisser les r actifs revenir temp rature ambiante Le mat riel directement en contact avec les chantillons de levures doit tre consid r comme potentiellement dangereux et tre manipul avec pr caution e En cas de dispersion accidentelle des r actifs nettoyer la surface a l aide de papier absorbant et d eau Si le liquide contient des levures prot ger les mains avec des gants et nettoyer l aide de papier absorbant et d eau de javel Les chantillons les r actifs ainsi que le mat riel et les produits contamin s seront limin s dans un conteneur pour d chets contamin s selon les recommandations et la r glementation en vigueur e Cartes cupules T Toxique Contient du Chloramph nicol e R45 Peut provoquer le cancer S45 En cas d accident ou de malaise consulter imm diatement un m decin si possible lui montrer l tiquette e S53 Eviter l exposition se procurer des instructions sp ciales avant l utilisation R v lateur lyophilis T Toxique Contient de la glucose oxydase et du 3 3 dim thoxybenzidine dihydrochl
17. water in the Active Reagent bottle and shake gently 3 GLABRATA R T T procedure Remove 1 or several cards depending on the number of yeasts to study for one yeast cut a card so as to have 3 T M and B wells Identify a haemolysis tube and add 100 uL of sterile distilled water Carefully sample the yeast colonies to identify and homogenize them in 100 uL of distilled water so as to obtain a suspension with a density equal to point 5 in the Mc Farland scale 3 to 4 colonies if the culture is on Sabouraud medium and 3 to 8 according to the size of the colonies if the culture is on a chromogenic medium N B Do not remove the agar at the same time as the colonies Use a micropipette to deposit 25 uL of the prepared yeast suspension on each of blue spots T M and B Incubate for 10 minutes at room temperature an additional 10 minutes of incubation does not have an effect on the final results Use a micropipette to add 25 uL of Active Reagent to each of wells T M and B Incubate for 5 to 10 minutes at room temperature Take the reading Appearance of a more or less dark orange colour Positive reaction No colour Negative reaction N B If the reading has to be differed the reaction will be blocked by adding 25 uL of H2SO 3 M to each well For a positive reaction the colour then becomes brown grey then fuchsia In the case of a negative reaction a slightly bluish colour is observed INTERPRETATION OF THE RESULT
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