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Leica FW4000 Handbuchtitel

1. 17 2 1 3 Exigences concernant le Sie less dedaanlons 18 2 1 4 Conditions ambiantes auMmiISSIDI S 1 2 4 2 1 18 2 1 5 Dissipation de chaleur par le syst me et puissance frigorifique requise 19 2 8 9 082002 nn oe ma me ee 19 2 8 1 Vue d ensemble des lasers VIS UV utilisables 19 2 8 2 Vue d ensemble des lasers MP lasers IR utilisables 20 2 8 2 1 Lasers DICOSSCONGES siocisdiccinsiianPeondivstedcedaasnansnnsedeninaubiedestnaneedteeiiasdivibastexxeiaaint 20 2 8 2 2 Lasers fEMtOSECONCES cccccccceccceeeceececeeeesececeeeceueeseeeseueesaeessuseseeesaeesees 21 2 8 3 Vue d ensemble des lasers VIS UV utilisables avec le TCS SP5 X 22 2 8 4 A quelle classe de laser ce produit correspond il 7 23 2 8 5 Mesures de s curit concernant le laser ccccecceeeceeeceeeceeceeeseeeseeeseeenaes 23 3 Les consignes de s curit et leur signification 25 4 Consignes de s curit g n rales si ssnrrssrrrenrreenrnnns 27 4 1 Classe de laser pour syst mes VIS et UV 27 4 2 Classe de laser pour syst mes MP 27 4 3 Quelles sont les obligations de l exploitant 7 27 4 4 Consignes de s curit pour l utilisateur eeeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeaeeteeeeeeenes 29 4 5 S curit de TONCTONNG MCI sscus cicce ecece cece aise ne cre sense anche cree oLence ces 29 4 6 Charge lectrique maximale du bloc multiprises de l unit d alimentation
2. 30 5 Dispositifs de SC CUNILG amp acanacescuszcurccsapsstecsancesnasauasnonanssaccaneapectactanassanatenaustenreasies 31 5 1 DS OC geen eee ne nee eee are eee ee ee eee ee eee 31 5 2 interrupteur a CS an ee mea ee a on 32 30 Voyants indicateurs d mission laser cccecceeeceeeeeeceeceeeeeeceeeseeteeeeeeeeeseees 34 5 4 Prise de verrouillage a distance Interlock sur l unit d alimentation lectrique35 9 9 Prise de verrouillage distance sur le laser lumi re blanche 36 5 6 Prise de verrouillage distance sur les lasers externes 38 Ni Prise de verrouillage distance Interlock sur le scanneur 38 5 8 Fonction et position des interrupteurs de s curit 39 5 9 Dispositifs sp ciaux concernant la s curit laser 40 5 9 1 Gaine de protection laser et capteur de faisceau 40 5 9 2 Protection avec les syst mes MP lasers IR 41 5 10 Marques de s curit sur le syst me 42 5 10 1 Microscope invers DMI 6000 CS 42 5 10 2 Microscope droit DM 5000 6000 CS 44 5 10 3 T te de balayage iii 46 5 10 4 Laser lumi re blanche 2 222 e detecte 47 5 10 5 OS 48 5 10 6 Unit d alimentation lectrique Vs 49 5 10 7 Unit de couplage de faisceau MP 50 5 10 8 Cache pour bride de rechange 58 2 rancpenegtescessonnne ses 51 5 10 9 BOT E O eea E a ee de ES 52 6 Consignes de s
3. 89 10 2 Enregistrement de coupes optiques Experiments Setup Acquisition Light Path Ac quisition Mode xy Figure 63 L enregistrement de donn es s effectue dans toutes les applications Leica LAS AF grace la touche fl ch e Acquire Du fait que le Leica TCS SP5 offre de tres nombreuses possibilit s d application l interface utilisateur contient toutes sortes de fonctions Pour rendre le travail avec l appareil encore plus efficace et simple les fonctions momentan ment superflues sont masqu es Dans le bord sup rieur il y a a cet effet une rang e de touches fl ch es qui permettent de s lectionner les actions possibles L enregistrement de donn es qui est le theme de ces chapitres s effectue avec le bouton Acquire Figure 63 L aide en ligne contient la description des fonctions individuelles Dans ce chapitre nous allons maintenant decrire les elements indispensables du reglage des principaux param tres d enregistrement et ce qu il faut prendre en compte 10 2 1 Enregistrement de donn es L enregistrement de donn es commence par l activation de la touche Live Figure 64 Les donn es sont transf r es en continu la m moire vid o et repr sent es sur le moniteur Mais les donn es ne sont pas archiv es tout de suite de fa on tre disponibles Figure 64 Dans toutes les applications Leica LAS AF la touche Live permet de d marrer l enregistrement de donn es Il s agit donc d u
4. Ce proc d convient tr s bien pour les objets vivants quand l on d sire observer l objet pendant un certain temps et entre temps modifier le milieu environnant r aliser des stimulations lectriques ou des modifications d clench es par la lumi re 91 Figure 66 En LiveDataMode on peut enregistrer des donn es en continu tout en modifiant les param tres de r glage manipulant la pr paration ou r alisant des s quences de d coloration Le suivi chronologique porte sur l int gralit de l exp rience et il est possible d avoir une repr sentation graphique en ligne des modifications d intensit dans les sites d int r t Les param tres de r glage pour l enregistrement d une unique coupe optique sont d crits et discut s ci apr s Ces r glages sont identiques pour toutes les t ches r alis es avec l appareil Dans le cas de situations typiques pour les pr parations des jeux de param tres pr r gl s sont archives dans le logiciel Il est galement possible d enregistrer et de rappeler des jeux de param tres personnalis s La description qui suit prend pour hypoth se que vous utilisez une pr paration du type de la pr paration standard jointe La pr paration standard est une coupe de rhizome de muguet pourvue d une coloration fluorescente histologique Cette pr paration peut tre utilis e pour de tr s nombreux probl mes fondamentaux et elle a l avantage de ne presque pas d colorer 10 2 2 clairage
5. Figure 55 Arr t de l ordinateur 7 Sur le pupitre de commande mettez en position d arr t les interrupteurs de l ordinateur de contr le TCS Figure 56 position 5 du scanneur Figure 56 position 4 et des lasers Figure 56 position 3 Figure 56 Pupitre de commande 1 voyant indicateur d mission laser 2 interrupteur cl 3 interrupteur des lasers 4 interrupteur du scanneur 5 interrupteur de l ordinateur 8 Eteignez le microscope et les ventuelles lampes fluorescentes allum es les mettre hors tension en suivant les instructions contenues dans les manuels Si votre syst me dispose de lasers externes laser IR laser UV etc vous devez A d utilisation fournis par le fabricant du laser 76 9 Introduction au LAS AF 9 1 G n ralit s Le logiciel LAS AF sert la commande de l ensemble des fonctions syst me et d interface aux diff rents composants mat riels Le concept d exp rience du logiciel permet de g rer en commun les donn es combin es logiquement entre elles L exp rience est visualis e sous forme d arbre dans le logiciel et dispose de fonctions d exportation permettant d ouvrir des images individuelles JPEG TIFF ou des animations AVI dans une application externe 9 2 Aide en ligne 9 2 1 Organisation de l Aide en ligne L Aide en ligne est scind e en 4 chapitres Manuels Contenu Contient les notes legales et les informations g n rales G n ralit s s
6. La transmitivit ou la r flexivit des dichroites d pend d une certaine longueur d onde de la lumi re Pour un filtre passe bas RSP 510 reflection short pass par exemple la lumi re d excitation inf rieure 510 nm est r fl chie et elle est transmise lorsqu elle est sup rieure cette valeur Les valeurs de transmission se trouvent g n ralement entre 80 et 90 les valeurs de r flexion entre 90 et 95 Filtre num rique respectant les phases Un filtre num rique se compose d une r gle de calcul selon laquelle des donn es d image peuvent tre modifi es Pour les filtres on essaye toujours d loigner des composants d image parasites Un filtre respectant les phases garantit que les tailles quantifiables d image demeureront inchang es par le filtrage et est ainsi une condition pour des m thodes de mesure standardis es par ex caract risation de surfaces selon ISO Double dichroite Les filtres double dichroiques sont des filtres d interf rence pour un angle d incidence de la lumi re de 45 La transmitivit ou la r flexivit des dichroites doubles d pend de deux longueurs d onde de la lumi re fixes Pour une dichroite double DD 488 568 par exemple la lumi re d excitation est r fl chie 488 nm et 568 nm et transmise au del de ces valeurs Les valeurs de transmission se situent g n ralement autour de 80 les valeurs de r flexion entre 90 et 95 124 Experiment Fichier au format Leica sp cifique
7. laser il ne faut connecter ecuri 7 Pour des raisons de s ler a MIroIr le boit dro du microscope fait partie du c un microscope d ion t ISA en cas d util LA Inverse ou t Interlock IFCUI LA curit LA l interrupteur de s Interlock ISe de la pr Position Figure 18 38 5 8 Fonction et position des interrupteurs de s curit Si l interrupteur de s curit se d tache le trajet lumineux du faisceau laser est interrompu Figure 19 Position de l interrupteur de s curit du bras d clairage diascopique 1 et commutation du balayage l oculaire 2 Bras d clairage diascopique Commutation motoris e entre le balayage et l oculaire Microscope invers DMI 6000 CS Microscope invers DMI 6000 CS Le bras d clairage est bascul p ex pour travailler sur l chantillon Pivotement motoris du miroir de renvoi vers le scanneur Bloque la lumi re du laser pendant le travail sur l chantillon Bloque la lumi re parasite quand l utilisateur passe de l observation confocale l observation par l oculaire 39 5 9 Dispositifs sp ciaux concernant la s curit laser 5 9 1 Gaine de protection laser et capteur de faisceau Le guidage de s curit du faisceau et le capteur de faisceau sont int gr s aux microscopes inverses pour la protection contre le ra
8. lei pouvant comporter plusieurs images individuelles ou des s ries d images Cela permet de r unir des images prises selon des param tres de balayage diff rents ou des images qui ont t trait es Colorant fluorescent Colorant utilis pour l analyse qui r agit l excitation de l nergie lumineuse en mettant une lumi re d une longueur d onde diff rente loi de Stokes Par exemple fluoresc ine rhodamine osine diph nylamine DPA Microscopie par fluorescence Proc d de contraste d optique lumineuse pour repr senter des structures fluorescentes Les chantillons autofluorescents disposent d une fluorescence dite primaire Ils n ont pas besoin d tre enrichis par des substances fluorescentes suppl mentaires Des substances fluorescentes secondaires doivent en revanche d abord muter gr ce des colorants adapt s appel s fluorochromes Des teintures sp cifiques permettent ainsi de localiser exactement les l ments de structure color s d un objet La microscopie par fluorescence permet aussi bien d ex cuter un potentiel d examens morphologiques que d effectuer des examens dynamiques sur un plan mol culaire Objectif au fluor Classe de correction d un objectif Les objectifs au fluor sont semi apochromatiques c est dire que par le degr de correction ils se situent entre les objectifs achromatiques et apochromatiques Frame cadre Un cadre correspond un enregistrement d une coupe optique indi
9. 2 2 Aper u du syst me TCS SP5 X Figure 2 Composants syst me du TCS SP5 X vue d ensemble 1 2 3 5 6 T 2 3 Utilisation conforme aux prescriptions Scanneur du TCS SP5 X Pupitre de commande Station de travail TCS Unite d alimentation lectrique Console de commande Microscope Laser lumi re blanche Le syst me a t d velopp pour une acquisition d image foyer commun images balay es au laser d chantillons vivants ou fix s marquage fluorescent ainsi que pour la mesure quantitative dans le domaine des sciences biologiques Ce syst me est pr vu pour une utilisation en laboratoire Les applications du diagnostic in vitro au sens de la loi sur les produits m dicaux sont exclues de l utilisation conforme aux prescriptions 12 Le fabricant d cline toute responsabilit pour toute utilisation non conforme aux prescriptions et aux sp cifications de Leica Microsystems CMS GmbH ainsi que concernant les ventuels risques en r sultant En pareils cas la d claration de conformit perd sa validit 2 4 Conformit Cet appareil a fait l objet de tests et il est conforme aux exigences des normes suivantes Dispositions relatives la s curit des instruments lectriques de CEVEN 61010 1 mesure de commande de r glage et de laboratoire S curit des appareils laser partie 1 classification des mat riels prescriptions et guide de l utilisateur CEVEN 60825 1 Mat r
10. Dans les proc d s d crits la section 10 4 5 3 il est suppos en premier lieu que la projection s effectue le long de l axe visuel Mais tant donn que les donn es informatis es ont une homog n it spatiale l on peut aussi cr er des projections partir des directions de son choix Dans le plus simple des cas il est ainsi possible de repr senter c te c te deux projections qui ont t calcul es avec une petite diff rence d angle et que l on superpose par d faut d alignement angulaire unaided fusion Le cerveau humain cr e partir de l une image en relief comme il le fait avec tous les objets per us par les deux yeux Figure 81 En cas d utilisation d un canal unique l on peut galement repr senter les deux vues avec diff rentes couleurs et les observer ensuite avec des lunettes quip es de filtres chromatiques anaglyphe rouge vert Cette m thode est plus simple pour la plupart des observateurs mais elle n est pas utilisable avec des donn es multiparametriques Tout comme les coupes elles m me il est aussi possible de calculer des s ries de projections avec un angle progressif et d en faire un film Ces films 3D sont actuellement la forme la plus courante et la plus convaincante de repr sentation des donn es en relief 112 10 5 S ries chronologiques Un microscope confocal balayage laser enregistre les images comme un appareil de prise de vues Pour cette raison il permet aussi d
11. Seica MICROSYSTEMS dit par Leica Microsystems CMS GmbH Am Friedensplatz 3 D 68165 Mannheim Germany http www leica microsystems com http www confocal microscopy com Responsable du contenu r dactionnel Leica Microsystems CMS GmbH Copyright Leica Microsystems CMS GmbH Tous droits r serv s Sommaire 1 PUG SUG NVG S ine ia na noi neiindci 9 1 1 CODE nate bce ee sepceesoaee ssemeoueatenencenseeeagns os 9 1 2 A propos de ce mode GC CIN DOI ircisnscescudanciviiosinnutnianastesaadansvasaatentatsarevetetsiseonanes 10 2 Leica TCS SP5 TCS SPORE a nenn n ennnen 11 2 1 Aper u du syst me TCS SP5 iii 11 2 2 Aper u du syst me TCS SP5 XX iii 12 2 3 Utilisation conforme aux prescriptions ccccecceeecceeceeeeeeeceeeeeeeeeeeteeeteetaeeees 12 2 4 COS E naevus ce aaa aeeeaseene meee ee 13 2 5 BOVE I pte cts ets EE E AE E a EREE E EE EE 14 2 6 N de s rie a a ee eee eee 14 2 1 SS Clie ONS ae al e dan A 15 2 1 1 DIS DS ONS aeea E E A E 15 2 1 1 1 TCS SP5 avec microscope INVOTS S 2 2 das ssessnle ses es sde dresse 19 2 1 1 2 TCS SP5 avec microscope POI emmener enr me ces 15 2 1 1 9 TCS SP5 X avec microscope iINVErS iii 16 2 1 1 4 TCS SP5 X avec microscope OIL au cases sde sense cer 16 21 2 Donn es de raccordement lectrique Vs 17 2 1 2 1 Donn es de raccordement lectrique de l unit d alimentation 17 2 1 2 2 Donn es de raccordement lectrique du laser lumi re blanche
12. changer pivote hors du trajet optique et pointe vers l ext rieur 5 Changez alors d objectif Toutes les positions inoccup es dans le revolver objectifs doivent tre ferm es avec les capuchons fournis num rique sup rieure 0 85 ne doivent pas tre utilis s Ceci ne s applique pas aux objectifs immersion huile eau Pour les syst mes MP les objectifs sec objectifs a riens avec une ouverture les consignes de s curit relatives au changement d objectif avec mise au point Si votre syst me est quip d une mise au point pi zo lectrique respectez aussi A pi zo lectrique voir 6 10 1 58 6 7 Changer le bo tier de lampe diascopique Si aucun bo tier de lampe diascopique n est connect l ouverture Figure 35 ou Figure 36 doit tre bien ferm e avec le cache fourni avec le syst me Figure 34 pour assurer une protection contre une ventuelle sortie de rayonnement laser Figure 34 Cache Si aucun bo tier de lampe n est connect au microscope ou en l absence de cache il ne faut pas mettre les lasers en marche cause du risque de rayonnement laser Figure 35 Connexion du module d clairage diascopique sur le microscope invers 59 Figure 36 Connexion du module d clairage diascopique ou du bo tier miroir sur le microscope droit Si votre microscope dispose d un module d clairage diascopique que vous voulez remplacer proc dez comme suit
13. objet vous devez veiller ce que le couvre objet donc le dessus des pr parations enrob es pointe vers le bas Des informations compl mentaires sont fournies afin de vous aider comprendre la raison d tre et le but des divers r glages r aliser Il ne s agit donc pas d une simple description des fonctions et boutons de l appareil et de l interface graphique utilisateur mais d une information compl te sur les t ches essentielles Cette information est r guli rement mise jour au fur et mesure des r ditions ou am liorations 83 Bien s r il faut commencer par placer une pr paration dans le microscope Lors de la pose de la pr paration dans un microscope invers veillez ce que les objets fix s sur les porte objets avec le couvre objet soient dirig s vers le bas Figure 58 C est une cause fr quente d erreur qui rend la pr paration introuvable ou emp che un r glage correct 10 1 1 L objectif S lectionnez l objectif qui servira examiner la pr paration Indice de r fraction Glyc rol 80 H20 Vectashield h 1 452 Glyc rol C ft 1 462 Glyc rol g latin selon Kaiser Baume du Canada 1 523 Tableau 3 Tableau des divers milieux d immersion En cas d utilisation d objectifs immersion v rifiez que le milieu d immersion pr sent entre la pr paration et la lentille frontale de l objectif est en quantit suffisante L eau la glyc rine 80 et l huile d immersion sont utili
14. t enregistr C est bien s r le cas id al souvent l autre colorant est un peu excit lui aussi mais la s paration est nettement meilleure qu avec un enregistrement simultan On peut ainsi la plupart du temps viter le crosstalk presque compl tement Un autre avantage du proc d s quentiel est qu il permet de faire un r glage tendu des bandes d mission des colorants Cela a pour effet d am liorer la sensibilit et de pr server la pr paration 107 Un inconv nient manifeste est qu avec deux colorants l enregistrement dure deux fois plus longtemps mais cet inconv nient est compens par les avantages pr cit s 10 3 6 Unmixing Comme dans la plupart des cas il y a aussi une solution logicielle pour la diaphonie quand la s paration physique n est plus possible Il est toutefois recommand de faire avec des moyens instrumentaux une s paration aussi tendue que possible voir 10 3 4et 10 2 5 et de n utiliser les solutions informatiques que si le r sultat obtenu est encore insatisfaisant Le proc d d Unmixing demixage d termine les portions d mission d un colorant qui sont r parties dans les divers canaux d enregistrement On proc de pareillement avec les autres colorants Il en r sulte l obtention d une matrice de r partition que l on peut utiliser pour redistribuer les intensit s de signal en fonction des colorants respectifs La m thode est expliqu e pour deux colorants dans les figures ci con
15. 10 4 3 Distances Pour l enregistrement dans une pile z l paisseur des coupes optiques joue un r le Si les distances entre les enregistrements sont trop grandes sup rieures a l paisseur de coupe le bloc de donn es pr sente des lacunes et il y a une perte d informations II n est alors plus possible de calculer correctement une reconstruction D un autre cote il n est pas raisonnable d enregistrer autant de coupes que l on veut parce qu avec de tr s petites distances les diff rences d information d une coupe l autre sont toujours plus petites et il y a ainsi production de nombreuses donn es inutiles Cela se passe sur l axe z exactement comme avec le grossissement vide du microscope usuel Pour un enregistrement pais sans lacunes mais aussi sans oversampling ind sirable l on utilisera des distances entre les enregistrements qui sont environ la moiti ou le tiers de l paisseur de coupe optique Dans la pratique cela repr sente 0 7 0 2 um Il y a donc enregistrement d 1 a 5 coupes par microm tre en z essentiellement en fonction de l ouverture de l objectif utilis 109 10 4 4 Quantit s de donn es Lors de l enregistrement de s ries il faut par ailleurs tenir compte du fait que dans certaines circonstances de tr s grandes quantit s de donn es sont produites qui ne peuvent tre trait es que tr s lentement Une image normale de 512 x 512 pixels et un canal occupe avec la r solution en niveaux de gris s
16. Ce n est videmment pas souhaitable pour la fluorescence mais cela permet de cr er tr s facilement une image de r flexion La bande la plus troite fait 5 nm et pour des mesures de r flexion l on r gle en g n ral cette bande de 5 nm en dessous de la ligne d excitation Pour supprimer le brouillage de la lumi re d excitation r fl chie il suffit en g n ral de commencer le d but de la bande d mission environ 3 5 nm du c t rouge de la ligne d excitation Cela d pend bien s r beaucoup des propri t s r fl chissantes de la pr paration Pour cette raison l on doit galement garder une plus grande distance quand l on fait la mise au point proximit de la surface en verre Cela vaut tout particuli rement pour les pr parations enrob es dans un milieu aqueux Il faut s attendre a une r flexion d autant plus g nante que l indice de r fraction du mat riau d enrobage s carte de 1 52 Ainsi les pr parations contenant un assez grand nombre de v sicules lipidiques ont besoin d tre trait es avec un soin particulier 10 2 5 Le trou d aiguille et son effet L utilisation des microscopes confocaux a pour raison d tre qu ils permettent de cr er des coupes optiques minces sans qu un traitement m canique de la pr paration soit n cessaire La partie principale de l appareil qui cr e ces coupes est un petit diaphragme plac devant le d tecteur appel trou d aiguille Pinhole et d crit pr c demment au paragra
17. curit concernant l exploitation du syst me 53 6 1 Exigences concernant le lieu d installation lieu de stockage 53 6 2 Consignes de s curit g n rales relatives l exploitation 53 6 3 Protection OC aan eee ee een 54 6 3 1 Syst me MP avec microscope droit 54 6 3 2 6 3 3 6 4 6 5 6 6 6 7 6 8 6 9 6 10 6 10 1 7 1 1 2 19 9 1 9 2 9 2 1 9 2 2 9 2 3 9 3 9 3 1 9 4 10 10 1 10 1 1 10 1 2 10 1 3 10 1 4 10 2 10 2 1 10 2 2 10 2 3 Systeme MP avec microscope INVESSE cccceecceecteecceecceeeeseceseceeeeeueeseeeaees 54 Systemes VIS et UV avec microscope invers ou droit 55 Espace propre l chantillon 56 Changement des chantillons 57 Changement GODIN EE ee mes do one 58 Changer le bo tier de lampe diascopique ccceccceeeeeeeeeeeeeteeteeeeeeeaeeaaes 59 Bo tier miroir sur microscope droit 61 Changer le bloc de filtres le r partiteur optique ou le condenseur 63 Mise au point piezo electrique sur microscope droit 64 Changement d objectif avec une mise au point pi zo lectrique 6 65 Mise en Service du Syst me cccceseceeeeeeeeeceeeeceneseneseaneeaneseaeseanesseeesenessneeoaes 67 Mise en marche du syst me nn sen Deer te one cree cie cn 67 Ex cution de LAS AF a aa D a a 72 Creation dum ULINS ALG UP nee see senenoe me ces eeo seine denes const 74 Mise hors Circuit du syst
18. gions d int r t ROI Statistics Affichage des valeurs statistiques qui ont t d termin es dans les r gions d int r t ROI pr sentes Zone de travail Dans cette zone est disponible la bo te de dialogue Beam Path Settings dans laquelle se trouvent les l ments de contr le pour le r glage des param tres d acquisition 5 Fen tre Viewer Sert l affichage des images acquises Dans le param trage standard la fen tre Viewer est compos e de la fen tre d image au centre et des boutons pour le traitement d image 5a et l affichage du canal 5b 9 4 Raccourcis clavier Pour acc l rer l ex cution des fonctions logicielles r currentes vous pouvez galement utiliser les combinaisons de touches suivantes CTRL N Ouvre une nouvelle exp rience CTRL O Ouvre la bo te de dialogue Open permettant d ouvrir un fichier existant 81 82 10 Introduction au travail confocal 10 1 Pr paration Ces chapitres d crivent les gestes de base qui permettent d effectuer la plupart des t ches rendues possibles par cet appareil a Microscope droit 1 Objectif 2 Couvre objet 3 tanchement 4 Porte objet 5 Stage Focus b Microscope invers 1 Enrobage 2 chantillon 3 Immersion 4 Lens Focus Figure 58 Disposition du couvre objet et de la pr paration dans un microscope droit a et un microscope invers b En cas d utilisation d objectifs quip s d une correction du couvre
19. me ii nnrrrenrrenerenennnnne 75 introd ction au EAST ee ene reat et tee ee seen ee aera 77 Eee e so a ee if PVCS CRIE acee A 17 Organisation de l Aide en ligne 7 Appel de l Aide en ligne 18 Recherche globale avec crit res de recherche liens logiques 19 Organisation de l interface utilisateur 79 Organisation g n rale de l interface utilisateur 19 Raccourcis CIAVIST ressrnnseeaceer descend eseeeene rennes dessine 81 Introduction au travail confocal is srsrrrensrenennnss 83 FS ll OI os ee 83 HO 6 210 1 ere E E E EE 84 Microscopie CASIO a Snar ee EEIN Ea 84 Pourquoi faire un balayage 4 87 Comment s effectue une coupe optique 7 88 Enregistrement de coupes optiques Vs 90 Enregistrement de donn es 2 2 i2tsnsscsccnsessetcienec sense esenenten eee tostetnee 90 Eclairage ce teng ete seecee scant pecan ier eea i nE EE ea ete ereacetuae seepseceaeeeere 92 Division du faisceau IUMINGUX cccccccccccccccccccccccccccuceceuauecuuececccucuecuueueseenanes 93 10 2 4 Bandes OC IS SION a ee 94 10 2 5 Le trou d aiguille et SOM CMO b ose cncisccncsancctacaveesssnnaneedattctacdenentenedonesuusccewsceeatsescns 95 10 2 6 Section d image et r glages de la grille 97 10 2 7 Signal et DUT cnsse memes essence 101 10 2 8 COUDES GS DO a a set acta ae sa ee Dee non 103 10 3 Fluorescence multiparam trique cccecc cece eee seeceecee
20. mission est mise en vidence dans la zone rouge fonc Figure 78 Enregistrement simultan de 2 fluorescences qui ne sont excit es dans ce cas qu avec une seule ligne laser La repr sentation en vert et rouge est arbitraire La repr sentation simultan e d images fluorescentes et de r flexion est galement possible Avec une excitation suppl mentaire l on doit cet effet observer seulement une seconde bande d mission qui est situ e sous la ligne laser Mais normalement il y a utilisation de colorants qui n cessitent des longueurs d ondes d excitation diff rentes Dans ce but divers lasers sont normalement int gr s l appareil 105 Pour activer une ligne d excitation additionnelle il suffit de r gler selon la description faite pour l excitation simple au paragraphe 10 2 2 en plus le coulisseau souhait pour la seconde longueur d onde Il est tout aussi facile d activer d autres longueurs d ondes d excitation Pour les exp riences avec d coloration d crites plus bas il est parfois utile d activer plusieurs des lignes Ar m me si on n enregistre pas de signal ou si on enregistre un signal seulement dans un canal Il est ainsi possible d lever l intensit en plus Il est toujours int ressant d essayer plusieurs combinaisons de laser Constatation est souvent faite que quelques unes des lignes s lectionn es pour les colorants sont inutiles Ou bien une autre ligne s av re tre un meilleur compromis Pou
21. 1 2 3 4 5 60 D sactivez les lasers D branchez le module d clairage de l alimentation lectrique Enlevez le module d clairage R alisez sur le module d clairage les actions souhait es Quand vous avez termin revissez le nouveau module d clairage sur le microscope 6 8 Boitier miroir sur microscope droit Si aucun bo tier a miroir n est connect au microscope droit pour assurer une protection contre une ventuelle sortie de rayonnement laser il faut bien fermer l ouverture avec le cache fourni Figure 37 Figure 37 Cache Si aucun bo tier miroir n est connect au microscope ou en l absence de cache il ne faut pas mettre les lasers en marche cause du risque de rayonnement laser Si votre microscope droit dispose d un bo tier miroir tenez compte les instructions suivantes e Si vous d montez le bo tier miroir vous devez obturer le port sur le microscope Figure 36 l aide du cache Figure 37 e La prise Interlock situ e sur le bo tier de miroir Figure 38 fl che 1 doit toujours tre reli e la t te de balayage e La sortie inutilis e du bo tier miroir doit tre ferm e l aide du cache fourni Figure 38 pos 3 61 Au moment de monter le cache Figure 38 pos 3 veillez ce que le palpeur Figure 38 pos 2 soit actionn par le cache Figure 38 Bo tier a miroir sur microscope droit 62 6 9 Changer le bloc de filtres le
22. chapitre 2 8 1 lasers VIS UV chapitre 2 8 2 laser IR ou chapitre 2 8 3 lasers VIS UV 2 8 5 Mesures de s curit concernant le laser 3B Ib 3B Ib 4 1V Respectez les consignes de s curit concernant le travail avec les appareils laser de la classe 3B Illb syst mes VIS et UV ou de la classe 4 IV syst mes MP conform ment aux lois et aux r glementations en vigueur dans le pays respectif L exploitant est responsable du respect des prescriptions de s curit laser 23 24 3 Les consignes de s curit et leur signification DANGER Un tel avertissement signale que vous devez observer et respecter scrupuleusement un proc d d utilisation un processus une condition ou une remarque mentionn e dans ce mode d emploi sous peine de mettre votre vie en danger ATTENTION AUX RAYONS LASER Un avertissement laser de ce type attire votre attention sur un processus de fonctionnement un proc d une condition ou une instruction qu il est imp ratif d observer et de respecter car sinon il y a un risque de graves blessures oculaires pour les personnes travaillant avec le syst me MISE EN GARDE CONTRE UNE TENSION LECTRIQUE Un avertissement de tension de ce type attire votre attention sur un processus de fonctionnement un proc d une condition ou une instruction qu il est imp ratif d observer et de respecter car sinon il y a un risque pour l int grit physique et la vie des personnes t
23. d avoir des bandes d mission plus grandes et accroit ainsi la sensibilit Toute amelioration dans cette direction permet de r duire encore l nergie de l excitation ce qui entra ne une moindre d coloration Une autre possibilit de r glage pour viter la diaphonie consiste bien s r choisir des bandes d mission ad quates Les courbes d mission des colorants utilis s sont repr sent es dans l interface utilisateur et on gagne d j beaucoup en limitant les bandes d mission aux r gions sans chevauchement tout au moins dans le graphique affich l cran videmment une courbe gard e en r serve ne correspond pas forc ment l mission effective car de nombreux facteurs p ex valeur pH polarit m tabolites peuvent d caler ce spectre Mais l aussi il est possible de modifier et d optimiser les r glages pendant l enregistrement de donn es 10 3 5 Enregistrement s quentiel Une autre possibilit de r duire la diaphonie consiste enregistrer les informations pour les divers colorants non pas simultan ment mais successivement Cela pr sente deux avantages quand il y a utilisation de lignes laser diff rentes pour l excitation ce qui se produit en r gle g n rale un enregistrement s quentiel permet d obtenir une s paration nettement meilleure car en premier lieu un seul colorant est excit et l mission ne provient donc que de ce colorant ind pendamment de la r gion du spectre o le signal a
24. de la bande spectrale fournie par l interface utilisateur affiche les courbes d mission des colorants Il est donc tres simple de s lectionner ou une bande d mission doit commencer et ou elle doit finir Si une courbe d mission n est pas m moris e on peut galement l enregistrer directement avec le syst me et l archiver Une barre r glable sous la bande spectrale est attribu e tout d tecteur confocal Les limitations droite et gauche de ces barres indiquent les limites pour la bande d mission s lectionn e 94 Excl Exe2 Figure 69 Possibilit s de r glage du d tecteur SP pour 2 fluorescences avec des excitations diff rentes haut ou pour la fluorescence et la r flexion lors d une excitation bas L on peut facilement faire glisser toute la barre dans un sens comme dans l autre afin de r gler la fr quence centrale Tout comme l on peut simplement d placer les limitations II est ainsi tr s pratique de s orienter par rapport aux lignes d excitation et aux courbes d mission affich es et d adapter la bande d mission avec le syst me de d tection Leica SP Ceci est aussi possible pendant la capture d images C est pourquoi l on voit imm diatement l effet du r glage sur l image et cela permet de r gler empiriquement les valeurs qui conviennent Figure 69 D s que la bande d mission croise sous la ligne d excitation la lumi re d excitation r fl chie est galement repr sent e dans l image
25. de la t te de balayage TENTE EN si va amp a a D ha a Figure 26 Autocollant de s curit pour le scanneur 46 5 10 4 Laser lumi re blanche Panneau arri re du laser lumi re blanche Figure 27 Autocollant de s curit sur le panneau arri re du laser lumi re blanche Concerne seulement le syst me TCS SP5 X 47 5 10 5 Laser externe UV Figure 28 Autocollant de s curit sur le laser externe UV 4 Concerne uniquement les syst mes avec un laser externe UV 48 5 10 6 Unit d alimentation lectrique Vue de l unit d alimentation lectrique 52005 002 Figure 29 Autocollant de s curit pour l unit d alimentation TCS SP 5 vue avant 49 5 10 7 Unit de couplage de faisceau MP Vue oblique avant sur le c t droit de l unit de couplage de faisceau MP 52005 002 Figure 30 Autocollant de s curit pour l unit de couplage de faisceau MP dessus 50 5 10 8 Cache pour bride de rechange Vue avant sur le cache Figure 31 Cache pour bride de rechange Si la bride de rechange pour la diascopie n est pas quip e d un sous ensemble fonctionnel module d clairage par exemple l orifice doit tre ferm avec un cache en raison de la s curit laser 51 5 10 9 Boitier miroir Vue avant sur le bo tier de miroir Figure 32 Autocollant de s curit pour le bo tier de miroir
26. focalis On appelle ce diam tre diam tre du disque d Airy Le diam tre du disque d Airy se calcule facilement partir de l ouverture et de la longueur d onde Si l on donne ainsi au trou d aiguille la taille de la tache lumineuse limit e par diffraction l on obtient des coupes optiques nettes avec un bon rapport signal bruit S N Figure 71 Bien s r l appareil peut calculer et r gler tout seul cette valeur L objectif utilis est connu des appareils enti rement automatiques et il est possible de le r gler avec les syst mes manuels Les lignes d excitation utilis es sont galement connues du syst me 96 Figure 71 Coupes optiques r alis es avec diff rents diam tres de trou d aiguille objectif 63x 1 4 Diam tre du trou d aiguille d en haut gauche en bas droite 4 AE 2 AE 1 AE 0 5 AE 0 25 AE Permet de rep rer une forte perte de luminosit de tr s petits diam tres et un arri re plan important de tr s grands diam tres C est pourquoi un diam tre de trou d aiguille de 1 Airy est toujours r gl en standard En cas de changement d objectif le diam tre du trou d aiguille est modifi d autant automatiquement Dans les cas o l chantillon n est que faiblement fluorescent ou sensible l clairage l on peut aussi agrandir le trou d aiguille simplement en utilisant le coulisseau de l interface utilisateur De petits diam tres de trou d aiguille sont bien s r possibles quand la prepara
27. glementaire le balayage de l chantillon faisceau laser au niveau de l chantillon ne commence pas Dans un cas comme dans l autre il faut informer imm diatement le service apr s vente Leica 9 Pour les autres lasers externes la position du voyant indicateur d mission laser Ji est indiqu e dans le mode d emploi fourni par le constructeur du laser 5 4 Prise de verrouillage distance Interlock sur l unit d alimentation lectrique Sur le panneau arri re de l unit d alimentation se trouve la prise du verrouillage distance Interlock tension nominale 12 V CC Figure 16 A cette prise est reli le connecteur de verrouillage distance comportant un shunt Il est aussi possible de connecter des dispositifs de verrouillage distance associ s au local la porte ou d autres verrouillages de s curit qui sont fixes Si le contact est ouvert le trajet du faisceau laser est interrompu La longueur totale de la conduction entre les deux broches du connecteur de verrouillage distance ne doit pas d passer 10 m 35 Figure 16 Prise de verrouillage distance Interlock sur l unit d alimentation lectrique 9 5 Prise de verrouillage distance sur le laser lumi re blanche Le panneau arri re du laser lumi re blanche comporte la prise de verrouillage distance Interlock tension nominale 12 V CC voir Figure 17 A Si le laser lumi re blanche fonctionne comme c
28. les nettoyer fond Ceci A concerne particuli rement les syst mes qui se trouvent dans les laboratoires de recherche biom dicale Cela est n cessaire pour supprimer toute contamination ventuelle et viter ainsi le d placement de substances dangereuses et d agents pathog nes et la mise en danger de personnes 12 2 Elimination des d chets Prenez garde non seulement a la surface mais aussi aux ventilateurs et climatiseurs car ces appareils sont de v ritables nids poussi re Pour toute question concernant l limination des d chets veuillez vous adresser directement votre point de vente local Leica voir chapitre 13 119 120 13 Contact Pour toute autre question concernant votre syst me veuillez vous adresser directement votre succursale Leica Vous trouverez l adresse de contact concern e dans la liste de nos repr sentations locales dress e ci dessous Si votre pays n est pas mentionn dans la liste veuillez consulter la rubrique Area Selector sous le site Internet http www leica microsystems com Australia Austria Canada Denmark France Germany Italy Japan Korea Netherlands PRC Portugal Singapore Spain Sweden Switzerland United Kingdom USA Gladesville 61 2 9879 9700 61 2 9817 8358 43 1 486 80500 43 1 486 80 50 30 Richmond Hill 1 905 762 2000 1 905 762 8937 Ontario ss LL 1 847 405 0123 1 847 405 0164 121 122 14 Glossaire Ach
29. par fluorescence les fluorochromes sont excites l aide de la lumi re laser dans un haut tat d nergie le niveau singulet Si les mol cules excit es retombent a leur tat de base un signal fluorescent est emis En cas d excitation avec une intensit trop lev e les molecules de colorants peuvent passer par intercroisement d un tat de singulet a un tat de triplet En raison de la dur e de vie bien plus longue des tats de triplet phosphorescence ces mol cules excit es peuvent r agir chimiquement avec les acides triplets et sont perdues pour une autre excitation de fluorescence Visualisation des phases Le principe de visualisation des phases utilise par Leica est une methode alternative optimis e par rapport aux representations ratiometriques Le domaine d application principal est la mesure de concentrations ioniques en physiologie La visualisation des phases obtient au contraire du proc d ratiometrique plus d informations sur l chantillon C est pourquoi ce proc d permet d adapter la repr sentation des donn es physiologiques la dynamique de l il humain Vous pouvez demander des informations d taill es sur le principe de visualisation des phases directement aupr s de Leica Microsystems CMS GmbH Pixel Mot issu des termes anglais picture et element Un pixel est le plus petit l ment d image indivisible dans un syst me a deux dimensions Dans ce document on d signe par pixel aussi bien un spot anal
30. profil dans l chantillon de muguet Convallaria L paisseur est d environ 30 um 10 3 Fluorescence multiparametrique Dans de nombreux cas on utilise aujourd hui des pr parations qui ont plus d une coloration fluorescente Les colorations multiples sont obtenues par hybridation avec des fragments aux couplages diff rents hybridation fluorescente in situ FISH au moyen d anticorps aux marquages diff rents ou avec des prot ines fluorescentes ayant des propri t s spectrales diff rentes M me les colorations fluorescentes classiques issues de l histologie et autofluorescence sont des param tres utilisables Figure 77 Figure 77 Enregistrement simultan de 2 fluorescences qui ne sont excit es dans ce cas qu avec une seule ligne laser La repr sentation en vert et rouge est arbitraire 104 10 3 1 clairage Pour un chantillon aux colorations multiples il est en g n ral n cessaire de l clairer simultan ment ici avec des lignes laser avec plusieurs couleurs Mais cela ne se passe pas toujours ainsi il y a bien s r aussi des colorants d missions diff rentes qu il est pourtant possible d exciter avec la m me longueur d onde Un exemple marquant est par exemple une pr paration botanique ayant une coloration FITC excit e dans le bleu On peut alors voir l mission d isothiocyanate de fluoresc ine dans la zone bleu vert du spectre Mais cette m me excitation agit simultan ment sur la chlorophylle dont l
31. que le microscope est en marche Si le voyant de disponibilit est teint il faut actionner l interrupteur bascule Figure 43 position 2 du bo tier lectronique Figure 43 Mise sous tension du microscope 68 4 Surle pupitre de commande mettez en marche le scanneur Figure 44 Mise sous tension du scanneur 5 Sur le pupitre de commande mettez les lasers en marche Figure 45 Mise sous tension du laser 1 Les blocs d alimentation et les ventilateurs du syst me d marrent 69 Le bloc d alimentation du laser lumi re blanche d marre quand l interrupteur 1 principal situ sur le panneau arri re du laser lumi re blanche est en position On Allum 6 Pour la mise en circuit des lasers dans l unit d alimentation lectrique actionnez l interrupteur cl du pupitre de commande voir Figure 46 Figure 46 Actionnement de l interrupteur cl Pour la mise en marche du laser lumi re blanche actionnez l interrupteur cl situ en fa ade du laser lumi re blanche voir Figure 47 Figure 47 Interrupteur cl du laser lumi re blanche partir de ce moment il peut y avoir un rayonnement laser dans l espace propre l chantillon du microscope laser balayage Observez les consignes de s curit du chapitre Consignes de s curit concernant l exploitation du systeme6 Concerne seulement le syst me TCS SP5 X 70 met hors
32. qui est la seule fa on de cr er des coupes optiques vraiment minces il faut clairer la pr paration sur une zone qui soit la plus petite possible On y parvient quand la tache clair e est limit e par diffraction et qu il n est donc plus possible de la diminuer physiquement Le diam tre d une tache ainsi limit e par diffraction est dg 1 22 e NA o est la longueur de l onde d excitation et NA l ouverture num rique de l objectif utilis Figure 61 Figure 60 Esquisse graphique du balayage Au moyen de deux miroirs le spot est d plac au dessus de l chantillon ligne par ligne sur le plan x y de fa on pouvoir reconstruire la totalit de l image en parall le Pour assembler une image bidimensionnelle il faut maintenant d placer ce spot sur toute la surface et enregistrer point par point le signal associ Cela s effectue lors d un balayage tr s semblable celui des microscopes lectroniques balayage ou des tubes faisceau lectronique comme ceux qui sont encore utilis s pour les moniteurs d ordinateurs ou les t l viseurs Figure 60 Dans un microscope confocal avec balayeur point par point le d placement est r alis avec deux miroirs qui sont mont s sur des galvanom tres Ces scanneurs sont mont s comme des moteurs lectriques de sorte que le rotor ne se d place pas librement mais qu il soit solidement fix au carter par la base Si l on applique une tension l axe tourne et la rotation
33. s assurer de leur application 27 A A Tous les dispositifs verrouillages et syst mes de s curit de l appareil laser doivent tre en tat de fonctionnement La d sactivation ou la d t rioration de ces dispositifs de s curit ou toute intervention dans l un de ces dispositifs de s curit peut entra ner de graves blessures oculaires corporelles ou des dommages mat riels Dans ce cas Leica Microsystems CMS GmbH d cline toute responsabilit L exploitant est tenu de nommer un responsable de s curit laser Laser Safety Officer ou un conseiller de protection laser Laser Protection Advisor conform ment la norme CEI EN 60825 1 S curit des appareils laser partie 1 classification des mat riels prescriptions et guide de l utilisateur et aux dispositions l gales en vigueur dans le pays concern Les r parations et interventions de service apr s vente doivent tre exclusivement effectu es par les techniciens de service apr s vente agr s de Leica Microsystems CMS GmbH L exploitant est enti rement responsable de toutes les cons quences r sultant d une ouverture d une maintenance non conforme ou d une r paration du syst me r alis es par d autres personnes que les techniciens agr s du service apr s vente Leica Lors de r parations et d interventions de service apr s vente n cessitant l ouverture d l ments de carter le s jour dans la pi ce o se trouve le sy
34. vous y donnera des conseils sur certains solvants utiliser pour le nettoyage Laissez vous conseiller dans le choix du solvant adapt car certains solvants peuvent dissoudre la colle utilis e pour fixer la lentille A N ouvrez jamais les objectifs pour les nettoyer Les lentilles d immersion doivent tre jet es directement apr s leur utilisation dans l huile d immersion 117 Enlevez l huile d immersion ensuite avec un chiffon propre Une fois que vous avez enlev une grande partie de l huile d immersion placez un tissu fin adapt aux lentilles sur la face d immersion de la lentille Faites tomber une goutte du solvant que l on vous a conseill et frottez doucement avec le tissu sur la surface de la lentille R p tez la proc dure jusqu ce que la lentille soit absolument propre Utilisez chaque fois un nouveau morceau de tissu propre 11 3 Nettoyage de la surface du microscope Utilisez un chiffon non pelucheux en coton ou une peau de chamois humect d alcool pour nettoyer la surface du bo tier de microscope ou du scanneur pi ces peintes Ne jamais utiliser d ac tone de xylol ou de diluant nitr car ces produits attaquent la peinture Tous les composants et syst mes Leica ont t fabriqu s soigneusement selon les methodes de production les plus modernes Si vous rencontrez des problemes avec votre appareil n essayez pas de r parer vous m me l appareil ou les composants mais adressez vous a votre re
35. 000 droit La platine doit tre positionn e en position basse avant le d marrage du syst me ou avant la mise en marche du LAS AF car elle pourrait toucher le revolver objectif pendant l initialisation et endommager les objectifs 1 Surle pupitre de commande allumez la station de travail commutateur PC Figure 42 Mise en marche de l ordinateur de contr le Le syst me d exploitation d marre automatiquement d s que vous allumez la station de travail Attendez la fin de la proc dure de d marrage 2 Connectez vous au syst me d exploitation Appuyez simultan ment sur les touches Ctrl Alt et Suppr pour demander l ouverture de la bo te de dialogue Login Information 67 Si vous avez un compte d utilisateur utilisez celui ci Ceci offre l avantage de pouvoir enregistrer et r utiliser les param tres personnalis s Si l administrateur 1 syst me n a pas encore cr votre compte connectez vous en utilisant le nom d utilisateur TCS User Un mot de passe n est pas n cessaire Une fois que vous vous tes enregistr avec votre code utilisateur vous pouvez Q modifier votre mot de passe Pour cela appuyez simultan ment sur les touches 1 Ctrl Alt et Suppr Cliquez ensuite sur Change password Une bo te de dialogue s ouvre Change password 3 V rifiez que le microscope est sous tension Quand le voyant de disponibilit Figure 43 position 1 est allum sur le bo tier lectronique cela signifie
36. 01 6 614 526 6 654 165 6 657 187 6 678 443 6 687 035 6 738 190 6 754 003 6 801 359 6 831 780 6 850 358 6 867 899 D autres demandes de brevets ont ete d pos es Le produit Leica TCS SP5 X est prot g par les brevets am ricains 5 886 784 5 903 688 6 137 627 6 222 961 6 285 019 6 311 574 6 355 919 6 423 960 6 433 814 6 444 971 6 466 381 6 510 001 6 567 164 6 611 643 6 614 526 6 654 165 6 654 166 6 657 187 6 678 443 6 687 035 6 710 918 6 738 190 6 754 003 6 796 699 6 801 359 6 806 953 6 831 780 6 850 358 6 867 899 6 888 674 6 898 367 6 958 858 6 961 124 7 005 654 7 092 086 7 110 645 7 123 408 D autres demandes de brevets ont ete d pos es 2 6 N de s rie Le num ro de serie de votre syst me est appos au dos du scanneur Figure 3 Dos du scanneur etiquette avec le numero de serie 14 2 7 Sp cifications 2 7 1 Dimensions 2 7 1 1 TCS SP5 avec microscope invers 2540 mm Figure 4 Dimensions du TCS SP5 avec microscope invers 2 7 1 2 TCS SP5 avec microscope droit 1490 mm 2400 mm 1200 mm Figure 5 Dimensions du TCS SP5 avec microscope droit 15 2 7 1 3 TCS SP5 X avec microscope inverse 1400 mm 3040 mm 1200 mm Figure 6 Dimensions du TCS SP5 X avec microscope inverse 2 7 1 4 TCS SP5 X avec microscope droit 1490 mm 2900 mm Figure 7 Dimensions du TC
37. 10 1 2001 Safety requirements for electrical equipment for measurement control and laboratory use Part 1 General requirements EN 60825 1 1994 A2 2001 A1 2002 Safety of laser products Part 1 Equipment classification requirements and users guide Manager Research amp Development Mannheim Germany AAA MUS p LA ANA February 04 2008 Dr Lucius Remer 134 135 Leica Microsystems CMS GmbH T l 49 0 621 7028 0 Am Friedensplatz 3 Fax 49 0 621 7028 1028 D 68165 Mannheim Germany http www leica microsystems com Copyright Leica Microsystems CMS GmbH All rights reserved N de commande 156500003 V08
38. 62 Cr ation d une coupe optique en lumi re r fl chie La lumi re qui ne provient pas du plan de mise au point est s par e au moyen d un filtre spatial ici un trou d aiguille Seule l information focalis e peut atteindre un d tecteur Le diaphragme agit donc comme un filtre spatial bien s r seulement si l clairage est correct c d punctiforme En principe la coupe optique devient de plus en plus mince au fur et mesure que le trou d aiguille devient de plus en plus petit A proximit de la longueur d onde de la lumi re utilis e cet effet diminue et pour un trou d aiguille de diam tre Z ro on obtient l intersection optique th oriquement la plus mince pour la longueur d onde et l ouverture num rique utilis es Apparemment il existe une plage d env 1 Airy qui il est vrai ne g n re pas encore les intersections optiques les plus minces mais qui n est que tr s peu loign e de la limite th orique Du fait que l intensit de la lumi re admise augmente peu pr s de fa on quadratique avec le diam tre du trou d aiguille il est pertinent de ne pas trop fermer le trou d aiguille afin d viter le parasitage des images 1 Airy est un tr s bon compromis que le Leica TCS SP5 r gle automatiquement pour vous Si vous souhaitez un diam tre plus petit ou plus grand une bo te de dialogue est pr vue cet effet Cela vaut la peine d essayer les divers param tres pendant une heure creuse et d observer leurs effets
39. Exc1 on ne peut collecter qu une bande troite du cote de l mission Em1 Lors de l excitation dans la r gion bleue o l intensit du laser peut tre lev e sans dommage on peut utiliser une bande d mission nettement plus large Em2 Cela vaut la peine de faire quelques essais L utilisation d un r partiteur acousto optique Acousto Optical Beam Splitter AOBS permet de faire tr s confortablement la mise en et hors circuit de toutes les lignes laser disponibles sans avoir se soucier des caract ristiques du r partiteur ou de la distance des lignes 10 2 4 Bandes d mission Apr s que la lumi re d excitation ait atteint l chantillon par l interm diaire de l AOBS et de l objectif l excitation cr e dans les mol cules fluorescentes une mission dont la lumi re est d cal e vers des longueurs d ondes plus longues donc rouges Ce d calage est appel Stokes Shift il d pend du fluorochrome Habituellement les spectres d excitation et de d sexcitation des colorants fluorescents se recoupent et le Stokes Shift est la distance du maximum d excitation au maximum d mission Quand le Stokes Shift est tr s lev cela favorise la s paration et le rendement Les colorants typiques ont un Stokes Shift de 10 a 30 nm Mais on peut avoir des valeurs sup rieures a 100 nm par exemple avec la chlorophylle naturelle qui est un colorant extraordinaire pour les exp rimentateurs curieux La repr sentation graphique
40. F est base sur la gestion des utilisateurs du syst me d exploitation des fichiers particuliers sont aussi cr s pour la gestion des profils sp cifiques aux utilisateurs du logiciel LAS AF Enregistrez vous en tant qu administrateur Utilisez le nom d utilisateur ID Administrator et le mot de passe Admin Ouvrez le gestionnaire des utilisateurs User Manager S lectionnez Start Programs Administrative Tools User Manager Definissez un nouvel utilisateur A cette fin entrez dans la boite de dialogue ouverte au minimum les indications suivantes e Nom d utilisateur e Password doit tre entr une deuxi me fois pour confirmation dans la ligne suivante S lectionnez les deux cases a cocher suivantes e User must change password at next logon afin que le nouvel utilisateur puisse d finir son propre mot de passe pour l enregistrement e Password never expires le mot de passe reste valable jusqu ce qu il soit modifi dans User Manager ou effac par l utilisateur S lectionnez l option Profiles dans la partie inf rieure de la bo te de dialogue A pr sent indiquez dans le champ Local path le chemin d acc s suivant pour l enregistrement du fichier sp cifique l utilisateur d users username username est un param tre substituable A cet endroit il faut en effet entrer un nom d utilisateur d fini Les disques durs mont s en atelier sont livr s avec deux partitions C et D Le r p
41. Le pr sent mode d emploi fait principalement tat des consignes de s curit qui doivent tre strictement observ es lors du travail avec le Leica TCS SP5 et le Leica TCS SP5 X En outre ce mode d emploi vous donne un bref aper u du principe de fonctionnement de microscopes balayage laser Le manuel vous montre les premiers pas pour le d marrage et la mise en service du syst me et vous fournit des informations tr s utiles sur le logiciel Leica Application Suite Advanced Fluorescence LAS AF Le syst me est livr avec la version actuelle de LAS AF Afin de maintenir les informations l tat le plus r cent il a t sciemment renonc la description de fonctions logicielles dans ce mode d emploi la place nous renvoyons l aide en ligne du logiciel LAS AF dans laquelle vous trouverez les explications et instructions les plus r centes concernant les fonctions logicielles appropri es Veuillez lire le chapitre Introduction au LAS AF dans ce mode d emploi afin de vous familiariser avec la construction et l utilisation du produit Vous trouverez dans l aide en ligne des informations compl mentaires sur des fonctions pr cises 10 2 Leica TCS SP5 TCS SP5 X 2 1 Aper u du syst me TCS SP5 Figure 1 Composants syst me du TCS SP5 vue d ensemble 1 2 3 4 5 6 Scanneur du TCS SP5 Pupitre de commande Station de travail TCS Unit d alimentation lectrique Console de commande Microscope 11
42. Mais les pr parations r fl chissantes donnent elles aussi des r sultats int ressants Si vous voulez observer la pr paration dans les oculaires en vision simple il est n cessaire de faire pivoter dans le trajet optique les blocs de filtres Figure 59 appropri s pour les fluorescences Pour la s lection des blocs de filtres de fluorescence consultez la brochure Leica consacr e la fluorescence ou demandez conseil votre charg de client le Leica Le tableau 4 de ce document pr sente une s lection de blocs de filtres Du fait que la fluorescence de la pr paration peut d colorer rapidement veillez ce que l obturateur plac devant la lampe vapeur de mercure soit toujours ferm quand vous ne regardez pas dans le microscope Pour commuter en mode Balayage Scan appuyez sur les touches correspondantes du microscope ou activez la fonction de commutation du logiciel La commutation peut varier en fonction de la motorisation du microscope Si vous avez des questions consultez l Aide 89 Tableau 4 B R 465 30 615 70 BFP GFP 420 BP 460 20 CFP 455 BP 480 40 BP 335 425 FI RH 500 BP 525 20 GIR 505 BP 525 20 GFP 500 BP 525 50 505 BP 527 30 BP 546 14 565 BP 600 40 565 BP 610 75 515 BP 535 30 Leica et sp cifications de filtres associ es 86 S lection de quelques blocs de filtres pour les microscopes de recherche 10 1 3 Pourquoi faire un balayage Afin d obtenir une v ritable image confocale ce
43. Pour l clairage il est possible de s lectionner les lignes laser appropri es pour l excitation de la fluorescence La r gulation de l intensit s effectue en continu au moyen du coulisseau associ la ligne laser Quand le coulisseau est tout en bas la ligne est d sactiv e Le coulisseau permet de s lectionner en continu le r glage de l intensit r alis au moyen d un filtre acousto optique AOTF Pour pr server la pr paration il faut faire des essais et d terminer l intensit suffisante pour que l objet produise une image exempte de bruit Cela d pend du colorant fluorescent et de la ligne utilis e de la profondeur de la coloration de la pr paration du lieu et de la largeur de la bande d mission choisie de la vitesse de balayage et du diam tre du trou d aiguille d mission 92 Figure 67 S lection de l intensit d clairage position 1 par filtre acousto optique AOTF position 2 et s lection de la bande d mission dans le d tecteur SP position 3 Quand vous s lectionnez le jeu de param tres FITC la ligne Argon 488 nm et une bande ad quate de 490 nm 550 nm sont r gl es L interface utilisateur fournit la repr sentation graphique de l int gralit du trajet optique Du c t de l mission vous trouvez une bande spectrale avec des possibilit s de r glage pour les bandes d mission D s qu une ligne laser est activ e cette ligne est visible l endroit appropri du spectre Quand vou
44. S SP5 X avec microscope droit 16 2 7 2 Donn es de raccordement lectrique L installation lectrique du b timent doit comporter trois raccordements au secteur s par s et pourvus des protections par fusibles suivantes e 3x tension secteur de 100 120 V 20 A ou e 3 x tension secteur de 200 240 V 12 16 A Pour avoir des informations techniques sur les lasers plac s l ext rieur du syst me tels que les lasers UV et MP veuillez consulter la documentation fournie par le fabricant du laser 2 2 1 Donn es de raccordement lectrique de l unit d alimentation Tension d alimentation 100 240 V CA 10 Fr quence 50 60 Hz Puissance absorb e 3200 VA 2 7 2 2 Donn es de raccordement lectrique du laser lumi re blanche Tension d alimentation 100 240 VCA 10 Fr quence 50 60 Hz Fusibles 2 x T4A 250 V CA 1 Concerne seulement le syst me TCS SP5 X 17 2 7 3 Exigences concernant le site A Veillez ce que le syst me ne soit jamais install proximit de climatisations ou d autres syst mes de ventilation R fl chissez bien l avance son placement A Au sujet de la protection contre les poussi res veuillez lire le chapitre 11 Maintenance et entretien Ne placez jamais le syst me dans un endroit courant d air Veillez ce que son environnement pr sente le moins de poussi re possible Il est conseill d installer le syst me dans des pi ce
45. alimentation voir Figure 12 Figure 12 Interrupteur cl du laser externe UV 9 Pour les autres lasers externes la position des interrupteurs cl est indiqu e dans le mode d emploi fourni par le constructeur du laser 33 5 3 Voyants indicateurs d mission laser L tat de service des lasers situ s dans l unit d alimentation lectrique est signal par un voyant indicateur d mission Figure 13 Le voyant indicateur d mission laser est situ au dessus de l interrupteur cl quand il est actif il brille en jaune Le voyant indicateur d mission laser du laser lumi re blanche est situ en fa ade du laser voir Figure 14 il est rouge quand il est allum D s que le voyant indicateur d mission laser est allum c est l indication fonctionnelle qu il peut y avoir un rayonnement laser au niveau de l chantillon Figure 13 Voyants indicateurs d mission laser sur le pupitre de commande ds LASER ON PALT C2 COHERENT Figure 15 Voyant indicateur d mission laser sur le bloc d alimentation du laser externe UV 34 Le syst me doit tre s par imm diatement de l alimentation lectrique si e le voyant indicateur d mission laser ne s allume pas apres une mise sous tension r alis e au moyen de l interrupteur cl e ou S il continue briller apr s une mise hors tension r alis e au moyen de l interrupteur cl e ou Si apres une mise sous tension r
46. and preparations in accordance with the essential require ments of safety precautions and physical toxicological and ecological data 2 how to handle store use and transport them safely No liability for damage occured in connection with the use of this information or with the use application adaption or processing of the products here described will be accepted An ex ception will be made in the case that our legal representatives should come to be held re sponsible and liable by reason of intent or gross negligence No liability will be accepted for damage indirectly incured We provide this information and data according to our present level of knowledge and expe rience No assurances concerning the characteristics of our product are hereby furnished 133 15 2 D claration de conformit Leica MICROSYSTEMS EC Declaration of Conformity Manufacturer Leica Microsystems CMS GmbH Address Am Friedensplatz 3 Germany 68165 Mannheim Product TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope TCS SP5X Confocal Laser Scanning Microscope We declare that the product described herein complies with the following European Directives 2004 108 EG Directive on Electromagnetic compatibility 2006 95 EG Directive on Low voltage equipment The product conforms to the standards EN 61326 1 2006 Electrical equipment for measurement control and laboratory use EMC requirements Part 1 General requirements Emission Class A EN 610
47. aragraphe 10 2 4 valent bien s r pour les bandes d mission la diff rence pr s que maintenant pour tous les colorants jusqu aux plus rouges d entre eux deux lignes laser d limitent la bande et qu il faut donc v rifier en cons quence que la lumi re d excitation n atteint pas le d tecteur De plus l effet n gatif du crosstalk peut influer fortement sur le choix des limites de fr quence Le chapitre suivant explique cela en d tail Le r glage des bandes est expliqu au chapitre 10 2 10 3 4 Crosstalk Les spectres d mission des colorants m me des colorants responsables de autofluorescence ont typiquement une allure tr s simple avec un maximum d mission et une inclinaison plus abrupte sur le flanc bleu que du c t rouge L mission se poursuit encore loin des deux c t s mais une amplitude tr s faible C est le c t rouge qui pose surtout un probleme Crosstalk diaphonie ou Bleed through signifie que l mission d un colorant contribue au signal non seulement dans un canal mais aussi dans les autres canaux de d tection C est bien s r viter dans une exp rience car ce crosstalk fait 106 s afficher l cran des r sultats incorrects et fausse les calculs de corr lation Tout comme l vitement du crosstalk un autre sujet d importance consiste rendre sure la s paration Il est possible de prendre en compte plusieurs param tres pour y parvenir intensit lumineuse selection du laser enregis
48. aser d onde nm sortie du laser 5 mW plan focal mW d impulsion cw Diode 405 p lt ae Pulse 60 ps 458 476 488 ar continue Onde continue cw Onde continue tt Onde continue eee keo cw m keo cw Tableau 1 lasers utilisables avec le TCS SP5 sans MP 19 Les composants assurant la s curit laser ne sont install s que pour les variantes de laser cit es 2 8 2 Vue d ensemble des lasers MP lasers IR utilisables Le syst me MP peut en outre contenir des lasers VIS UV voir le tableau Lasers VIS UV utilisables 2 8 2 1 Lasers picosecondes Rendement Rendement Longueur lumineux la lumineux dans Largeur d onde nm sortie du laser le plan focal d impulsion W MaiTai ps 780 920 Puls 1 0 1 5 ps MaiTai ps wideoend 710 950 Pulse 1 0 1 5 ps MaiT ai ps P Poad oend 710 990 Puls 1 0 1 5 ps Type de laser Chameleon ps 690 1020 Ultra Chameleon ps 690 1040 Ultra Chameleon ps 680 1080 Ultra II Tableau 2 lasers MP utilisables avec le TCS SP5 et le TCS SP5 X Puls 1 0 1 5 ps Puls 1 0 1 5 ps Puls 1 0 1 5 ps i 20 2 8 2 2 Lasers femtosecondes Rendement Rendement ne del Longueur lumineux la lumineux dans Largeur yP d onde nm sortie du laser le plan focal d impulsion W W MaiTai fs 780 920 lt 1 2 ee Puls 80 fs MA ANS 710 950 Puls 80 fs wideband MaiTai fs er loto s h H t Chamel
49. ation qu un point d image en 3D Laser lumi re blanche Laser avec lequel on peut s lectionner simultan ment jusqu 8 bandes de longueurs d onde dans la plage de longueurs d onde de 470 670 nm Piles z Les piles z se composent d images bidimensionnelles qui ont t prises avec diff rents plans de mise au point et sont repr sent es en trois dimensions 10 Concerne seulement le syst me TCS SP5 X 128 15 Annexe 15 1 Fiches techniques de s curit des constructeurs tiers Le scanneur est quip d un liquide de refroidissement Vous trouverez ci apr s les fiches techniques de s curit du fabricant Innovatek pour le r frig rant utilis 129 EEC SAFETY DATA SHEET Gem 91 155 EG 2001 58 EG Stand 2 12 2004 innovatek TE gt innovatek OS GmbH www innovatek de info innovatek de 1 Substance preparation and company name Trade name company Tel 08405 92590 Fax 08405 925921 innovatekProtect IP innovatek OS GmbH Stadtweg 9 85134 Stammham Emergency phone No 08405 92590 2 Composition information on ingredients Chemical nature Hazardous Compounds Ethanediol 2 ethylhexanoic acid sodium salt Ethylene glycol ethane diol Corrosion inhibitors CAS No 107 21 1 Hazard symbol Xn R phrases 22 Content w w gt 90 EC No 203 473 3 INDEX No 603 027 00 1 CAS No 19766 89 3 Hazard symbol Xn Content w w 2 3 EC No 243 283 8 R phrases 63 Th
50. ation sans pr avis Leica Microsystems CMS GmbH est d tenteur de tous les droits d auteur de cette documentation L adaptation la traduction et la reproduction du texte et des figures m me partielle par impression photocopie microfilm ou autres proc dures dont celles impliquant des syst mes lectroniques ne sont permises qu avec l autorisation expresse et crite de Leica Microsystems CMS GmbH Les programmes tels que LAS et LAS AF sont prot g s par des lois sur les droits d auteur Copyright Tous droits r serv s Toute reproduction adaptation ou traduction de ces programmes est interdite sans autorisation crite pr alable de Leica Microsystems CMS GmbH Le terme Windows peut figurer dans ce document sans indication sp cifique II s agit d une marque d pos e de Microsoft Corporation Sinon m me si des noms de marques sont utilises sans mention particuli re l on ne peut en d duire pour autant que leur utilisation est libre Tous les autres noms de marque et noms de produit mentionnes dans ce document sont des marques marques de prestation marques de fabrique ou marques d pos es des fabricants respectifs fabriqu en R publique F d rale d Allemagne Copyright Leica Microsystems CMS GmbH Tous droits r serv s 1 2 A propos de ce mode d emploi Quand il est question du syst me ou que le syst me n est pas pr cis les remarques instructions et informations valent pour le TCS SP5 et le TCS SP5 X
51. ces et que ce signal contenait bien une information Cette information s est perdue Figure 75 ll est de plus important de d terminer correctement le point z ro cet effet l on teint la lumi re avec l AOTF et l on r gle le signal sur le point z ro au moyen du r glage Offset S il y a alors un nouveau r glage de la lumi re on peut r gler le renforcement de fa on a viter la saturation Pour pouvoir r aliser plus facilement ces r glages des tableaux chromatiques sp ciaux sont tr s utiles Ainsi Glow over Glow under est un tableau chromatique qui utilise en premier lieu le jaune et le rouge pour les intensit s avec des nuances pour repr senter l intensit du signal La valeur de gris z ro est repr sent e en vert et la valeur de gris 255 est repr sent e en bleu Ces deux valeurs sont ainsi imm diatement reconnaissables Le r glage du point z ro est correct si lorsque la lumi re est teinte pr s de la moiti des pixels ont la valeur z ro et sont donc repr sent s en vert Pour plus de s ret l on peut lever l offset d une ou deux valeurs de gris afin que le signal ne soit pas coup vers le bas La perte de dynamique est n gligeable environ 0 4 par valeur de gris 8 bits Figure 75 En haut gauche prise de vues 8 bits 256 niveaux de gris droite le m me objet avec une dynamique bien moindre Sur l image en fausses couleurs du bas l on discerne 6 niveaux de gris C est moins q
52. circuit L cran du laser lumi re blanche affiche un message d erreur La temp rature de la pi ce doit redevenir normale pour que la remise en marche H Si la temp rature ambiante est sup rieure 40 C le laser lumi re blanche se du laser lumi re blanche soit possible afficher un message d erreur Dans ce cas teignez le laser lumi re blanche et Si le laser lumi re blanche est expos des secousses l cran du laser peut 1 remettez le en marche 10 secondes apr s 8 Pour la mise en marche du laser externe UV actionnez l interrupteur cl situ en facade du laser lumi re blanche voir Figure 48 Interrupteur cl du laser externe UV partir de ce moment il peut y avoir un rayonnement laser dans l espace propre l chantillon du microscope laser balayage Observez les consignes de s curit du chapitre 6Consignes de s curit concernant l exploitation du syst me Pour teindre le syst me respectez les indications fournies au chapitre 8 Mise hors circuit du syst me Concerne uniquement les syst mes avec un laser externe UV 11 7 2 Ex cution de LAS AF Avec la platine motoris e 156504145 pour le DMI 6000 inverse Puisque la platine motoris e est initialis e et pour viter d endommager le condenseur le bras d clairage du microscope inverse doit tre pivot vers Avec la platine motoris e 156504155 pour le DM 6000 droit A
53. ctionnement Avant le retrait du scanneur il faut avoir mis hors tension tout le syst me le rayonnement laser pourrait s av rer dangereux N utilisez donc que les condenseurs de microscope Leica S1 et S28 63 6 10 Mise au point pi zo lectrique sur microscope droit Figure 39 Mise au point pi zo lectrique sur le revolver a objectifs Si votre syst me est quip d une mise au point pi zo lectrique veuillez respecter les consignes de s curit ci dessous Avant d allumer le syst me ou d ex cuter le logiciel LAS AF positionnez la platine aussi bas que possible et enlevez le porte objet l chantillon de la platine A Sinon l initialisation de la mise au point pi zo lectrique risque d endommager ou de d truire l chantillon et le porte objet pendant le d marrage du syst me logiciel La course de l objectif est limit e 150 um vers le haut ou le bas La course totale est de 300 um Affichage sur le controleur de la mise au point piezo lectrique Position haute 350 um Position moyenne 200 um Position basse 50 um Zone de balayage xz 250 um Figure 40 Contr leur de la mise au point pi zo lectrique Ne modifiez aucun r glage sur le contr leur celui ci ayant t r gl de mani re optimale par Leica 64 F Figure 41 Douille entretoise sur l objectif Notez que la position de focalisation d un objectif avec une mise au point pi zo lectrique est 13 mm pl
54. dessus 52 6 Consignes de s curit concernant l exploitation du syst me 6 1 Exigences concernant le lieu d installation lieu de stockage Cet appareil a t con u pour une utilisation dans les laboratoires et il ne doit pas tre utilis en association avec des appareils servant au maintien de la vie tels que ceux utilis s par exemple en m decine intensive Cet appareil a t con u pour tre connect a une prise mise la terre La prise mise la terre est une fonction de s curit importante Pour viter les risques tels que les chocs lectriques ou les dommages mat riels cette fonction ne doit pas tre d sactiv e Pour viter les risques tels que les incendies et les chocs lectriques l appareil ne doit jamais tre expos la pluie ou l humidit N ouvrez le carter en aucun cas II ne doit jamais y avoir p n tration de liquides dans le carter du systeme et les composants electriques ne doivent pas entrer en contact avec des liquides L appareil doit tre compl tement sec avant un branchement sur l alimentation lectrique ou une mise sous tension 6 2 Consignes de s curit g n rales relatives l exploitation Ne regardez pas dans les oculaires pendant le balayage Ne regardez pas dans les oculaires pendant la commutation de trajet optique sur le microscope Ne regardez jamais directement un faisceau laser ou une r flexion de faisceau laser Evitez tout co
55. destination et de respect des consignes de s curit lors du fonctionnement du syst me il n y a aucun risque pour l utilisateur Respectez une distance de s curit d au moins 20 cm entre vos yeux et l ouverture de l objectif 56 6 5 Changement des chantillons Ne changez jamais les pr parations pendant un balayage Pour faire un changement de pr paration proc dez comme suit Microscope droit Microscope invers Mettez fin au balayage Mettez fin au balayage Assurez vous qu il n y a plus aucun Assurez vous qu il n y a plus aucun rayonnement laser dans l espace propre rayonnement laser dans l espace propre l chantillon l chantillon Basculez le bras de diascopie en arri re Vous pouvez alors changer la pr paration Placez correctement l chantillon dans le porte chantillons Changez de pr paration Placez correctement l chantillon dans le porte chantillons Basculez le bras de diascopie pour le ramener en position de travail 57 6 6 Changement d objectif Ne changez pas d objectif pendant un balayage Pour faire un changement d objectif proc dez comme suit 1 Mettez fin au balayage 2 Eteignez le laser interne en utilisant l interrupteur cl 3 Eteignez le laser externe ventuel avec son interrupteur cl en suivant les indications contenues dans le mode d emploi du fabricant du laser 4 Tournez le revolver objectifs de sorte que l objectif
56. du scanneur On mesure ainsi le changement d intensit lumineuse sur un point fixe s lectionn au pr alable Avec le Leica TCS SP5 cela s effectue avec une r solution temporelle de 40 MHz correspondant a 25 ns Bien s r on doit aussi tenir compte du fait qu ce point la pr paration se d colore tr s rapidement 10 5 3 Lignes La limitation aux images provenant d une seule ligne est moins rapide mais elle convient toutefois pour de nombreux processus la dynamique lev e Les donn es sont repr sent es en une image xt o la premi re dimension est le lieu la ligne s lectionn e et la seconde dimension le temps Avec un scanneur r sonance de 8 kHz il est ainsi possible en mode bidirectionnel d avoir une r solution 16 KHz 63s 10 5 4 Surfaces Le cas standard est l enregistrement d images xy en tant que s rie t Ici la resolution temporelle d pend de la vitesse du scanneur et du nombre de lignes par image En se limitant une image lin aire de 16 lignes il est ainsi possible d enregistrer avec un scanneur resonance jusqu 200 images par seconde 5 ms Cette proc dure d enregistrement habituelle g n ralement avec 512 x 512 pixels est galement utilis e pour les experiences de longue dur e au cours desquelles 113 l enregistrement de la pr paration s effectue sur de longues p riodes pendant des heures voire m me des jours afin de suivre le d veloppement des embryons ou des cultures cellula
57. e mot d coupes 9 3 Organisation de l interface utilisateur 9 3 1 Organisation g n rale de l interface utilisateur L interface utilisateur de l application LAS AF est scind e en cing zones 19 Figure 57 Interface utilisateur du logiciel LAS AF 1 Barre de menus la barre de menus contient les menus qui servent ex cuter les fonctions 2 Symboles fl ches tapes de travail avec les diff rentes fonctions Ces tapes de travail refl tent le d roulement typique d une acquisition d image et du traitement d image cons cutif Les fonctions ont t regroup es selon ces tapes de travail e Configuration e Acquire e Process e Quantify e Application 80 3 Onglets chaque tape de travail symbole fl che appartiennent diff rents onglets dans lesquels il est possible d effectuer les r glages pour l exp rience Experiments Arbre des r pertoires des fichiers ouverts ee Setup Param trages mat riels pour l exp rience actuelle SS Acquisition Parametrages pour l acquisition d image Experiments Arbre des r pertoires des fichiers ouverts Tools Arbre des r pertoires avec toutes les fonctions disponibles dans l tape de travail respective Quantify Experiments Arbre des r pertoires des fichiers ouverts Tools Onglets avec les fonctions disponibles dans cette tape de travail Graphs Repr sentation graphique de valeurs mesur es figurant dans les r
58. e wording of the hazard symbols and R phrases is specified in Chapter 16 if dangerous ingredients are mentioned 3 Hazard identification Harmful if swallowed 4 First aid measures General advice If inhaled On skin contact On contact with eyes On ingestion Note to physician 5 Fire fighting measures Suitable extinguishing media Special protective equipment Further information 130 Remove contaminated clothing If difficulties occur after vapour aerosol has been inhaled fresh air summon physician Wash thoroughly with soap and water Wash affected eyes for at least 15 minutes under running water with eyelids held open Rinse mouth immediately and then drink plenty of water seek medical attention Symptomatic treatment decontamination vital functions Administer 50 ml of pure ethanol in a drinkable concentration Water spray alcohol resistant foam dry extinguishers carbon dioxide CO2 In case of fire wear a self contained breathing apparatus The degree of risk is governed by the burning substance and the fire conditions Contaminated extinguishing water must be disposed of in accordance with local legislation EEC SAFETY DATA SHEET t k Gem 91 155 EG 2001 58 EG n n ovate TE gt innovatek OS GmbH Stand www innovatek de 2 12 2004 info innovatek de 6 Accidental release measures Personal precautions Avoid excessive contact with skin and eyes In case of release of larger amou
59. ectrale cd 115 10 7 COPIDINALO OURS a aan a na nn 115 11 11 1 11 2 11 3 11 4 12 12 1 12 2 13 14 15 15 1 15 2 Maintenance et entretien sisssssnersrrrsrrnenneenennnnnnns 117 G R E E EA 117 Nettoyage du syst me optique RL 117 Nettoyage de la surface du microscope 118 Maintenance du syst me de refroidissement du scanneur 118 Transport et d pollution ccccceeeeeeeeeeeeeeeeeneceneceneceneceeeeeeecesenesenesenesenesens 119 Changement de lieu d installation 119 Elimination des d chets iii 119 CONC A GE naren 121 Glossa e a ae ee Aa E 123 PNG EE ED CPR 129 Fiches techniques de s curit des constructeurs tiers 129 D claration de conformit cc cece cece cccececcccecececcacccececeacececeaeacsueaeansceneaeaeess 134 1 Allgemeines 1 1 Copyright Les informations contenues dans le pr sent document repr sentent l tat actuel de la technique et des connaissances Nous avons r dig ce document texte et figures avec le plus grand soin Toutefois nous n assumons aucune responsabilit quelle qu elle soit pour l exactitude du contenu de ce manuel Si vous souhaitez faire des commentaires sur ce mode d emploi ou sur notre documentation en g n ral nous vous remercions d s maintenant de nous faire parvenir vos suggestions Les informations contenues dans ce mode d emploi peuvent faire l objet d une modific
60. els r solus 400 nm pour divers objectifs observ s sur l int gralit du champ de balayage On voit ici que 64 m gapixels 8000x8000 pixels conviennent tout fait pour une microscopie de grande valeur Avec ce r glage l on peut vraiment transf rer en une seule image toute l information de l objet dont le microscope peut g rer la r solution Cela cr e bien s r de grandes quantit s de donn es ce qui n est pas souhaitable en particulier pour les mesures dont la haute r solution prend du temps Ici le zoom est la solution qui convient Si l on enregistre les donn es au format standard 512 x 512 pour viter une perte d informations l on doit comme dans l exemple donn ci dessus se limiter un champ 10 15 fois plus petit Avec un facteur de zoom de 10x et plus l on re oit des donn es qui sont encore agrandies utilement mais avec des champs de vision tr s petits Il s agit ici de faire un compromis en fonction de l information souhait e Cette image est tout d abord un cadrage au milieu du champ de balayage Ceci n est pas toujours souhaitable car un centrage aussi pr cis des structures int ressantes est difficile C est pourquoi l on peut encore d caler sur tout le champ de balayage la zone effectivement utilis e pour le balayage ce proc d s appelle panning 99 Figure 73 Section d image identique avec diff rentes resolutions de pixels L on constate souvent que le support d impression est incapable de re
61. enregistrer des s ries temporelles pour ainsi dire une pile z sans changement de z De telles exp riences Time Lapse repr sentent un outil tr s important dans les secteurs de la physiologie et de la biologie du d veloppement dans lesquels les processus dynamiques sont d un int r t primordial 10 5 1 Vitesse de balayage Bien s r lors de proc dures dynamiques en particulier lors d examens cin tiques de processus biophysiques cellulaires la r solution temporelle est un param tre important Mais il y a malheureusement des limites d une part la vitesse m canique des scanneurs et la largeur de bande des lignes de transmission de donn es d autre part tout simplement la quantit de photons que l on peut esp rer de la pr paration pendant la p riode d observation Il y a en principe des solutions aux probl mes m caniques et informatiques d autant plus que de grands progr s ont t r alis s ces derni res ann es mais la limitation par la lumi re reste un obstacle insurmontable Une faible luminosit donne un mauvais rapport signal bruit et donc des images trop mauvaises dont la r solution est galement mauvaise C est pourquoi il faut rev rifier les param tres mesurer Une difference tr s importante entre les diverses mesures est la dimensionnalit qui essaie de compenser les limitations m caniques 10 5 2 Points On peut obtenir la r solution temporelle la plus haute en ne bougeant pas du tout le m canisme
62. entionn pr c demment la repr sentation d une image tridimensionnelle sur un moniteur bidimensionnel n est pas vraiment possible C est pourquoi il existe plusieurs proc d s permettant de pr senter ces informations 110 10 4 5 1 Galerie Le plus simple consiste a ranger toutes les coupes d une s rie dans une galerie tout comme on le ferait d une collection de timbres poste Figure 79 L on peut ainsi analyser les changements de coupe en coupe et les repr senter dans un journal 10 4 5 2 Films Actuellement de nombreuses publications sont egalement proposees sur Internet sous forme lectronique et on publie aussi des films dont le d roulement des s quences s effectue a une vitesse agr able Le spectateur a ainsi l impression de faire directement au microscope la mise au point de la pr paration Ces deux proc d s conviennent aussi bien pour les enregistrements monochromes noir et blanc que pour ceux r alis s sur plusieurs canaux 10 4 5 3 Projections orthogonales Une autre fa on de comprimer la totalit de l information avec perte d information deux dimensions consiste calculer les projections partir de la s rie enti re Le proc d le plus connu s appelle la projection maximum On cherche ici d terminer la valeur la plus claire pour chaque pixel le long de l axe z et on l entre cet endroit dans l image r sultante On obtient ainsi une image compos e uniquement de valeurs correspondant un r gla
63. eon fs 690 1020 Puls 140 fs Ultra Chameleon fS 90 1040 l lt 4 lt 1 9 Puls 140 fs Ultra Chameleon fS 90 1080 lt 4 lt 1 9 Puls 140 fs Ultra ll Tableau 3 lasers MP utilisables avec le TCS SP5 et le TCS SP5 X Les composants assurant la s curit laser ne sont install s que pour les variantes de laser cit es 21 2 8 3 Vue d ensemble des lasers VIS UV utilisables avec le TCS SP5 X Le Leica TCS SP5 X contient une combinaison des lasers mentionn s ici Rendement lumineux Longueur maximal la Type de laser d onde nm sortie du laser mW Rendement lumineux maximal dans le Largeur plan focal mW er Diode 405 p am see asp Puls 60 ps iano a 476 488 ond continue Lasera lumiere 470 670 lt 500 puls blanche Tableau 4 Lasers utilisables avec le TCS SP5 X Les composants assurant la s curit laser ne sont install s que pour les variantes de laser cit es 22 2 8 4 quelle classe de laser ce produit correspond il Variante Plage de longueurs Classe de Configuration de laser d ondes laser 400 700 nm rayonnement laser visible 390 1 050 nm rayonnement laser visible et invisible 350 700 nm UV rayonnement laser visible et invisible Combinaison de lasers du chapitre 2 8 1 ou 2 8 3 sans lasers de longueurs d onde 350 400 nm Combinaison de lasers du chapitre 2 8 1 ou 2 8 3 lasers VIS et UV Combinaison de lasers du
64. ertoire utilisateur doit se trouver sur la partition D 8 Mise hors circuit du syst me A 1 Respectez imp rativement la s quence de mise hors circuit Le non respect de la s quence de mise hors circuit mentionn e ci apr s peut endommager les lasers Enregistrement des donn es images S lectionnez dans la ligne de menu File Save as pour enregistrer l enregistrement de donn es Fermez l application LAS AF Dans la barre de menu s lectionnez File Exit Fermez le logiciel LAS AF En actionnant l interrupteur cl Figure 56 position 2 du pupitre de commande mettez les lasers hors tension dans l unit d alimentation lectrique Le voyant indicateur d mission laser Figure 56 position 1 s teint Arr tez le laser lumi re blanche avec l interrupteur cl voir Figure 53 situ en fa ade du laser Le voyant indicateur d mission laser s teint Figure 53 Interrupteur cl du laser lumi re blanche 5 En actionnant l interrupteur cl voir Figure 54 mettez le laser externe UV hors tension Le voyant indicateur d mission laser s teint Figure 54 Interrupteur cl du laser externe UV Concerne seulement le syst me TCS SP5 X Concerne uniquement les syst mes avec un laser externe UV 19 6 Arr tez pr sent l ordinateur Dans la barre d outils s lectionnez Start Shutdown pour arr ter l ordinateur de contr le du TCS
65. eseeceeceeeceeseeeseceeeeeeeaes 104 10 3 1 ES ELEC CRE 105 10 3 2 Division du faisceau lumineux cccceececececeeecceeceeeeeceeceeeesueeseeesseeeaaeesaues 106 10 3 3 Bandes D S SIT ee a de vee 106 10 3 4 GOSA a EE E 106 10 3 5 Enregistrement S QUENNClE des ccecem essence tee dtece sector costs nes 107 10 3 6 CA nissan sosele co TE 108 10 4 CSS D seara EE N E 109 10 4 1 a lt ky E E A E E E E eee eee 109 10 4 2 paisseurs de COUPE eeccccesscseesecestecensecenseeceeeserseeeatesenseeeneesentevenseeenteeens 109 10 4 3 18 J S EE OS ES RER E once eae E EE E souteeo ete 109 10 4 4 Quantit s de donn es iii 110 10 4 5 BS Se A ONS SR ae ia ou ai 110 10 4 5 1 Ce ee ee 111 10 4 5 2 ni AS PR E bese EEE E E E 111 10 4 5 3 Projections orthogonales ccccccscccseceeeseeeseeeseeeceecceeceueeeeesasecseesaeenaes 111 10 4 5 4 Projections ONENMI S cen scicnsecwaserecseusdvesebieeseusesunsusache cuaaadeesieresesbasssbensdecees 112 10 5 SENES GC ROMO OCICS S srania E ESE e 113 10 5 1 Vitesse de balayage cccccccscccscccececeeccueccueeaueceeesaeecaeecseecueecuesaeesseesaeeses 113 10 5 2 PO E E 113 10 5 3 ES E E 113 10 5 4 CO cheese rc E E E E E 113 10 5 5 Dimensions AIME SACS de ne etes une e rene ns 114 10 5 6 SSSR ETER EE 114 10 6 DEMESS SD CUAIES esse snacnseses sons ess races quana E noie nes Dames cie 114 10 6 1 Enregistrement et utilisation des donn es 114 10 6 2 Au sujet de la r solution sp
66. ess par de rapides changements d intensit dans les objets vivants on est volontiers pr t accepter une image parasit e Toutefois le compromis d pend de l chantillon et de l application Outre l intensit lumineuse il y a encore d autres possibilit s d influencer le rapport du signal au bruit la vitesse d enregistrement des donn es Autant la vitesse de balayage proprement parler qui se r gle avec la fr quence de lignes de 1 1 400 Hz seulement avec les scanneurs classiques que le moyennage sont ici des possibilit s d am liorer le signal La modification de la vitesse de balayage elle m me entra ne un moyennage des pixels car l enregistrement des donn es sur chaque pixel prend du temps Lors du moyennage des lignes la m me ligne est enregistr e plusieurs fois et le r sultat du moyennage est repr sent Lors du moyennage de l image il y a toujours enregistrement d une image compl te et compensation au m me endroit avec l image suivante Tous les proc d s ont comme toujours des avantages et des inconv nients pour les objets mobiles la corr lation temporelle est importante donc un balayage plus lent est affich Par ailleurs les ph nom nes de triplet jouent en faveur de longs intervalles entre les moyennages donc pour le moyennage d images compl tes Le moyennage des lignes est un compromis Le moyennage d images compl tes est le proc d qui a le plus grand effet de pr servation mais il a toute
67. et inf rieure en proc dant ainsi d placement manuel au dessus de la pr paration marquage de cet endroit d placement au dessous de la pr paration et marquage de la position II suffit alors de determiner le nombre de coupes enregistrer entre ces deux positions et l appareil s occupe du reste 10 4 2 paisseurs de coupe Comme il a t d crit aux sections 10 1 4 et 10 2 5 l paisseur de la coupe optique d pend de la longueur d onde et de l ouverture num rique de l objectif Et bien s r du diam tre du trou d aiguille Le lien entre ces param tres est tabli par la formule d crite ici Pour cr er de bonnes coupes c est dire minces il faut que l ouverture soit la plus grande possible C est pourquoi en microscopie confocale on n utilise que des objectifs ouverture lev e La longueur d onde de l mission est en g n ral comprise entre 450 nm et 600 nm ce qui correspond grosso modo a 500 nm Si l on choisit le diam tre de trou d aiguille d 1 Airy on obtient des paisseurs de coupe comprises entre 0 5 um et 2 5 um pour des ouvertures de 0 7 1 4 Dans la pratique ce sont des valeurs typiques Dans la litt rature en particulier dans les mat riaux publicitaires on indique souvent une paisseur nulle pour des coupes en r flexion avec un diam tre de trou d aiguille cette valeur est bien plus petite et fait donc meilleur effet mais elle n est pas pertinente pour la pratique en microscopie de fluorescence
68. et et ne font qu alt rer la nettet d image et le contraste Laser MP Multiphoton d signe un laser IR laser infrarouge caract ris par un important flux de photons produit par un laser impulsions Filtre neutre Les filtres neutres sont des petites plaques de verre partiellement recouvertes d un miroir Ils servent r partir le trajet optique ind pendamment de la longueur d onde La lumi re incidente est partiellement r fl chie et partiellement transmise Les filtres neutres sont normalement plac s un angle de 45 dans le trajet du faisceau Les donn es assign es d un filtre neutre se rapportent au rapport de la r flexion sur la transmission Pour un filtre neutre RT 30 70 par exemple 30 de la lumi re d excitation sont r fl chis et 70 sont transmis Ouverture num rique L ouverture est le sinus de l angle d ouverture dans lequel la lumi re entre dans la lentille frontale d un objectif microscopique Symbole NA c t de la luminosit l ouverture influence aussi le pouvoir s parateur d une optique d objectif Comme il peut exister plusieurs milieux entre l objectif et la pr paration par ex le milieu encastrant la pr paration l ouverture num rique est d habitude NA n sina utilis e comme unit de mesure pour l intensit lumineuse et le pouvoir s parateur 126 Blanchiment optique Destruction de colorants fluorescents appel s fluorochromes par un clairage intensif Dans la microscopie
69. euse ponctuelle diaphragme d excitation et comme d tecteur de points diaphragme de d tection Le diam tre du diaphragme de d tection d termine la longueur d onde et l ouverture num rique de l objectif utilis mais aussi l tendue axiale d une coupe optique r solution optique Filtre passe bas Les filtres passe bas sont des filtres d interf rence qui transmettent la lumi re ondes courtes et refl tent en revanche la lumi re ondes longues Le filtre optique passe bas est caract ris par l indication d ar te de longueur d onde sur laquelle le filtre passe de la transmission la r flexion seuil de 50 S rie lambda Pile compos e d images individuelles d un plan optique unique qui sont d tect es chaque fois avec une longueur d onde d termin e Filtre passe haut Les filtres passe haut sont des filtres d interf rence qui r fl chissent la lumi re ondes courtes et sont transparents en revanche pour la lumi re ondes longues Le filtre optique passe haut est caract ris par l indication d ar te de longueur d onde sur laquelle le filtre passe de la transmission la r flexion seuil de 50 Grossissement vide Grossissement sans autre gain d information On parle de grossissement vide d s que des distances inf rieures au pouvoir s parateur sont repr sent es Les grossissements plus grande chelle que celle du grossissement vide ne mettent jour aucune autre information sur l obj
70. fois pour inconv nient que l on ne voit pas imm diatement la qualit du r sultat dont il est plus facile de faire l valuation avec d autres proc d s Par ailleurs lors du moyennage d images il est galement possible de l interrompre de fa on interactive si on a l impression que la qualit est suffisante Il n y a pas de recette valable pour toutes les applications II convient de trouver le proc d le plus appropri en faisant des essais et en se basant sur l exp rience acquise 10 2 8 Coupes de profil Nous avons jusqu ici toujours pris pour hypoth se que les images sont enregistr es parall lement au plan de mise au point C est galement juste et pertinent pour la microscopie classique Mais un syst me confocal de balayage point par point offre aussi de nouvelles possibilit s d enregistrement des donn es qui sont int ressantes Si le d placement du spot s effectue toujours sur une seule et m me ligne et si au lieu d un d placement y incr mentiel entre les lignes il y a d placement du plan focal par ex avec la platine SuperZ de mise au point fine command e par galvanom tre qui est rapide et pr cise l on obtient l cran une coupe de profil de l chantillon qui est peu pr s comparable avec une entame de g teau Les syst mes bas s sur des appareils de prise de vues confocaux eux aussi permettent de calculer ces profils seulement partir de piles enti res Figure 76 103 Figure 76 Coupe de
71. ge d une grande nettet et cela m me sur toute la distance de l enregistrement en direction zZ Cette op ration a donc permis d augmenter la profondeur de champ sur toute la hauteur de la pile z C est pourquoi l on nomme ces projections des images profondeur de champ tendue extended depth of focus Avec ce proc d il est galement possible de traiter les enregistrements sur plusieurs canaux Si l on colore maintenant chaque coupe diff remment en reproduisant l arc en ciel sur l axe z par exemple il est possible de lire imm diatement partir de cette projection la position en z des structures Cela ne fonctionne bien s r qu avec un canal car la couleur est utilis e pour la hauteur Cette repr sentation s appelle Profondeur de champ tendue par un codage en couleur de la hauteur height color coded extended depth of focus Figure 80 111 Figure 80 Profondeur de champ tendue par un codage en couleur de la hauteur pour la s rie repr sent e ci dessus Le proc d SFP simulated fluorescence projection utilise des approches plus complexes qui donnent des images tr s impressionnantes contenant des ombres port es De toute fa on il faut ici toujours faire un contr le pr cis de la quantification 10 4 5 4 Projections orient es Figure 81 Image st r o des m mes donn es 3D Un peu de pratique est n cessaire mais cet investissement est rentable pour tout adepte de la microscopie confocale
72. icity was observed after oral ingestion of high doses in studies with rats and mice but this effect was not seen in a study with rabbits Experiences in humans Lethal dose if swallowed approx 1 5 g kg body weight Lethal dose approx 90 110 g for adults and correspondingly less for children Smaller doses can result in consciousness is affec ted kidney damage damage to the central nervous system Additional information The statements are based on the properties of the individual components There is no reason to fear a risk of damage to the developing embryo or fetus when the MAK value is ad hered to The whole of the information available provides no indication of a carcinogenic effect 12 Ecological information Ecotoxicity Toxicity to fish Leuciscus idus LC50 96 h gt 100 mg l Aquatic invertebrates daphnia magna EC50 48 h gt 100 mg l Aquatic plants algae EC50 72 h gt 100 mg l Microorganisms Effect on activated sludge Inhibition of de gradation activity in activated sludge is not to be anticipated during correct introduction of low concentrations Persistence and Elimination information Degradability Test method OECD 301A new version Method of analysis DOC reduction Degree of elimination gt 70 Evaluation readily biodegradable Additional information Other ecotoxicological advice Do not release untreated into na tural waters The product has not been tested The statement was derived from the propert
73. iels lectriques de mesure de commande et de laboratoire Prescriptions relatives la CEM classe A CEI EN 61326 Il s agit d un appareil de Classe A pour l utilisation dans des b timents non habitationnels et pour l utilisation dans des b timents qui ne sont pas raccord s directement au r seau lectrique basse tension qui alimente les b timents habitationnels Compatibilit electromagnetique CEM Partie CEVEN 61000 3 2 2 Limites Limites pour les missions de courant harmonique Compatibilit electromagnetique CEM Partie 3 3 limitation des variations de tension des fluctuations de tension et du papillotement dans les r seaux publics d alimentation basse tension CEI EN 61000 3 3 La d claration de conformit pour le syst me est fournie en annexe ce mode d emploi Pour l utilisation aux USA Laser Products U S Food and Drug Administration FDA Complies with FDA performance standards for laser products except for deviations pursuant to laser notice No 50 dated 26 July 2001 CDRH 21 CFR 1040 10 Pour les Etats Unis zone de comp tence des CDRH FDA USA il faut remplacer dans le texte la d signation Classe de laser 3B par Illb et la d signation Classe 4 par IV 13 2 5 Brevets Le produit Leica TCS SP5 est prot g par les brevets am ricains 5 886 784 5 903 688 6 137 627 6 222 961 6 285 019 6 311 574 6 355 919 6 423 960 6 433 814 6 444 971 6 466 381 6 510 0
74. ies of the individual components 13 Disposal considerations innovatekProtect must be dumped or incinerated in accordance with local regulations 132 EEC SAFETY DATA SHEET t k Gem 91 155 EG 2001 58 EG innovate TED innovatek OS GmbH Stand www innovatek de 2 12 2004 info innovatek de Contaminated Uncontaminated packs can be reused Packs that cannot packaging be cleaned should be disposed of in the same manner as the contents 14 Transport information Not classified as hazardous under transport regulations ADR RID ADNR IMDG GGVSee ICAO IATA 15 Regulatory information Regulations of the European union Labelling National legislation Regulations Directive 1999 45 EEC Preparation Directive Hazard Symbol Xn Harmful R phrases LL Harmful if swallowed S phrases 7 Keep out of reach of children 24 25 Avoid contact with skin and eyes 46 If swallowed seek medical advice immediately and show this container or label Hazard determinant component for labelling Ethanediol Other regulations none 16 Further Information Full text of hazard symbols and R phrases if mentioned as hazardous components in chapter 2 Xn Harmful 22 Harmful if swallowed 63 Possible risk of harm to the unborn child Vertical lines in the left hand margin indicate an amendment from the previous version This safety data sheet is intended to provide information and recommendations as to 1 how to handle chemical substances
75. imis es dans un fichier et de les charger ult rieurement simplement au moyen d un double clic Les enregistrements de param tres mis en evidence par la lettre L sont pr d finis par Leica et ne peuvent pas tre modifi s Les enregistrements d finissables par l utilisateur se trouvent dans l arborescence sous la lettre U User Courbure de champ La surface courb e sur laquelle est repr sent e nettement une image microscopique est appel e courbure de champ Elle est produite par la convexit de la lentille et se manifeste comme une erreur cause des faibles distances focales pour les objectifs microscopiques Ainsi l objet ne peut pas ainsi tre repr sent de fa on nette la fois au centre et la p riph rie Les objectifs qui pr sentent une correction par rapport la courbure de champ sont appel s objectifs plans plan champ d image plan Indice de r fraction Facteur pour lequel la vitesse de la lumi re dans un milieu optique est inf rieure celle dans le vide Aberration chromatique Erreur de construction optique provoqu e par la r fraction diff rente des rayons lumineux de diverses longueurs d onde sur une lentille De ce fait les rayons lumineux avec une longueur d onde plus courte pr sentent une distance focale plus longue que les rayons lumineux avec une longueur d onde plus longue Dichroite Les filtres dichroiques sont des filtres d interf rence pour un angle d incidence de la lumi re de 45
76. ion r glables en continu Ici aussi il est possible de faire un enregistrement en s rie en utilisant le d placement incr mentiel de la bande d mission Le d tecteur Leica SP a donc t le premier appareil permettant d enregistrer des s ries d images spectrales dans un microscope confocal La technologie utilis e a fait ses preuves et s est av r e tre la plus efficace En effet tous les autres microscopes spectraux apparus entre temps sur le march pr sentent de nettes faiblesses eu gard au rapport signal bruit 10 6 1 Enregistrement et utilisation des donn es L enregistrement d une s rie Lambda ne diff re pas fondamentalement de celui d une s rie z ou d une s rie chronologique On d termine la bande d mission pour le d but et la fin de la mesure et stipule combien de coupes le spectrom tre doit r aliser pour mesurer la r gion entr e Des r gions de l image sont s lectionn es de fa on interactive pour l valuation leur intensit moyenne est ensuite repr sent e dans un graphe en tant que fonction de la longueur d onde C est un spectre l endroit s lectionn 114 10 6 2 Au sujet de la r solution spectrale Il y a eu derni rement en relation avec les series spectrales une discussion portant sur la technologie qui offre la meilleure r solution spectrale et permet donc de r v ler les modifications les plus fines survenues dans le spectre De fait l on peut d placer avec le TCS SP5 les bandes d
77. ires Ici les limitations de vitesse d origine m canique et photonique ne jouent qu un r le secondaire c est pourquoi le syst me doit tre tr s stable exempt de d rive et climatis 10 5 5 Dimensions Time Space Le d veloppement tridimensionnel des structures en biologie pr sente videmment un grand int r t Ici le grand domaine d application de la microscopie 4D s est entre temps implant Les piles z sont enregistr es s quentiellement et servent faire des films 3D temps L avenir nous r serve dans ce domaine passionnant de nombreuses innovations et des r sultats captivants 10 5 6 Mesures FRAP Un tout autre domaine d application de la microscopie balayage laser est celui des examens dynamiques ou un syst me est mis en desequilibre par une perturbation et ou l on examine ensuite comment s effectue la mise en place d un nouvel quilibre Le proc d FRAP fluorescence recovery after photobleaching est tres connu ou une partie de la pr paration est d color e par un clairage puissant et ou l on mesure ensuite la redistribution de la fluorescence dans ce secteur Ces exp riences permettent de d duire la perm abilit des membres la vitesse de diffusion et le comportement de liaison des mol cules L enregistrement de s ries temporelles est toujours associ une mesure de ce type 10 6 S ries spectrales La section 10 2 4 d crit comment le d tecteur Leica SP peut s lectionner des bandes d miss
78. l arri re avant le d marrage du syst me ou de LAS AF 1 La platine doit tre positionn e en position basse avant le d marrage du syst me ou avant la mise en marche du LAS AF car elle pourrait toucher le revolver objectif pendant l initialisation et endommager les objectifs D marrez le logiciel en cliquant sur l ic ne LAS AF du bureau Figure 49 Symbole LAS AF sur le bureau 2 Choisissez si le syst me doit tre utilis en mode r sonant ou non r sonant 12 Leica Application Suite vested Fuwsr scence LEP boat 173 Figure 50 Fonctionnement r sonant ou non 3 A pr sent d marrez le programme LAS AF en cliquant sur le bouton OK i A i i i M i ri Map LI Lot F4 JL ci L Adrances Pucretcence LES Bei LT HIiCHBLELINNE Figure 51 Fen tre de d marrage LAS AF A pr sent vous vous trouvez dans la vue de base de LAS AF mT M Dm Go me 02 ARADON ow Figure 52 Vue de base LAS AF d L affichage peut varier selon la configuration syst me to 7 3 Creation d un utilisateur Le nom d utilisateur standard du syst me est TCS User Un mot de passe par d faut n est pas d fini Il est recommand de cr er une ID utilisateur sp cifique r pertoires personnels sont cr s qui ne peuvent tre ouverts que par l utilisateur pour chaque utilisateur du syst me en utilisant l administrateur de syst me Des 74 concerne Comme le logiciel LAS A
79. lement les perturbations d arri re plan ou les autofluorescences Le proc d qui donne les r sultats les plus corrects est la Channel Dye Separation Ici les r partitions des colorants sp cifiques dans les divers canaux sont d termin es directement avec des donn es de r f rence color es individuellement Il est important que les param tres r gl s sur l appareil ne soient plus modifiables car bien s r l intensit du laser et l amplification sur le photomultiplicateur influent sur ces coefficients Le proc d Spectral Dye Separation a recours aux spectres d mission des colorants utilis s qu ils soient connus de par la litt rature ou mesur s directement sur l appareil afin de calculer l intensit relative des colorants Ce proc d convient particuli rement quand les colorants ne modifient pas consid rablement leur mission in situ et quand les donn es sont bien connues 108 10 4 S ries 3D S il y a d placement de la position du foyer entre deux enregistrements l on peut enregistrer une s rie compl te de coupes optiques qui repr sentent la structure dans un bloc de donn es tridimensionnel Bien sur il n est pas possible de regarder directement cette image tridimensionnelle mais elle contient l information spatiale des structures examin es et en cas de colorations multiples leur lien spatial 10 41 Pilez Pour enregistrer ces s ries 3D piles z on d termine simplement les limites sup rieure
80. mission par pas d 1 nm ce qui donne une r solution formelle d un nanometre La r solution spectrale optique d pend de toute fa on de la longueur d onde elle est d environ 0 5 nm dans le bleu et 2 nm dans le rouge Cette r solution est bien sup rieure aux exigences requises dans la pratique dans les pr parations typiques de consistance liquide g latineuse temp rature ambiante la nettet des missions de fluorescence ne d passe gu re 20 nm 10 7 Combinatorique L association de bon nombre des proc d s d crits plus haut est possible ce qui ouvre de nouvelles perspectives en biologie autant sur les pr parations fix es que sur les pr parations vivantes De cette combinatorique est n le concept de microscopie multidimensionnelle De toute fa on il est facile de constater ici une certaine inflation Il ne suffit pas de multiplier les dimensions param tres de mesure pour faire une bonne exp rience et encore moins obtenir un bon r sultat La synth se de nombreuses mesures est souvent difficile et requiert l intervention de l intelligence humaine afin d viter l accumulation de donn es inutiles et les conclusions erron es 115 116 11 Maintenance et entretien 11 1 G n ralit s Vous trouverez dans le mode d emploi du microscope des informations sur la maintenance et l entretien du microscope Les instructions et les informations suppl mentaires concernant les composants du syst me foyer comm
81. n mode Aper u Preview Les r glages de l appareil sont faits dans ce mode Quand l enregistrement des donn es est termin le balayage s arr te aussit t m me si la representation de l image est incomplete 90 Il y a aussi la possibilit d acqu rir une image unique Cette image est archiv e dans l exp rience d o il est possible de la rappeler ult rieurement ou de l enregistrer sur le support de son choix Cet enregistrement d une image unique a l avantage de ne solliciter l chantillon qu une fois mais son utilisation est plus compliqu e s il faut encore proc der des r glages Si le r glage de tous les param tres est correct on peut ainsi enregistrer l image r sultante Des fonctions telles que l accumulation ou la pond ration sont applicables La troisi me situation d enregistrement des donn es est l enregistrement d une s rie pour laquelle les param tres s lectionn s au pr alable sont modifi s incr mentiellement entre les enregistrements individuels Il est ainsi possible de cr er des s ries z des s ries chronologiques ou des s ries lambda Figure 65 Piles Z S rie chronologique S rie lambda Figure 65 Enregistrement par lot pour les s ries 3D les s ries chronologiques et les s ries lambda Si l appareil fonctionne en LiveDataMode toutes les images enregistr es sont automatiquement m moris es avec l heure correspondante Par cons quent il n y a pas de Preview Mode Figure 66
82. nt d un coulisseau Bien s r comme toujours avec les microscopes le grossissement global doit tre pertinent et il ne faut donc ni sous valuer ni sur valuer le grossissement requis si l on veut obtenir des images r ussies Pour les aper us et lors d exp riences avec d coloration d autres r gles sont importantes Etant donn que l on peut facilement se tromper en interpr tant les donn es captur es vous trouverez ci dessous un exemple vous expliquant comment calculer le grossissement total requis et vous indiquant les informations fournies automatiquement par le logiciel l utilisateur ae l I l I Figure 72 Champs de vision pour le scanneur classique auparavant 21 2 mm aujourd hui 22 mm et le scanneur r sonance 15 1 mm Un angle de balayage plus petit augmente le grossissement zoom et un d calage de balayage a pour effet de d caler la section d image l int rieur du champ de vision Pan La longueur d ar te du champ repr sent avec le scanneur classique est de 15 mm en l absence de grossissement d objectif chelle 1x Cela permet d exploiter un indice de champ de 21 2 ou 22 Figure 72 Ceci convient pour la plupart des microscopes de recherche de bonne qualit Combien de points sont donc effectivement r solus par voie optique dans cette dimension Cela d pend de l ouverture num rique de l objectif et de la longueur d onde selon la formule d Ernst Abbe deux poin
83. ntact avec le faisceau laser 53 int gralement le chapitre Dispositifs concernant la s curit laser pour vous familiariser avec les dispositifs de s curit du syst me Ne d sactivez jamais les dispositifs de protection contre les rayons laser Lisez A Ne placez aucun objet reflechissant dans le trajet optique A Observez imp rativement le mode d emploi du microscope joint la livraison 6 3 Protection oculaire 6 3 1 Syst me MP avec microscope droit Le port d une protection oculaire n de commande 156502570 est prescrit de Yam mani re obligatoire Une protection oculaire correspondant au rayonnement laser NOKOJ TA i E wo IR est livr e avec le syst me Cette protection oculaire ne prot ge pas du rayonnement laser visible VIS m Pendant le balayage toutes les personnes pr sentes dans la pi ce doivent porter we les lunettes de protection Le faisceau laser IR peut tre r fl chi ou dispers sur l chantillon ou les objets qui ont t mis dans l espace propre l chantillon Il n est donc pas possible d exclure compl tement un risque oculaire du au rayonnement laser IR La protection oculaire fournie n offre une protection s re que pour les lasers infrarouge fournis par Leica Microsystems CMS GmbH 6 3 2 Syst me MP avec microscope invers Le port d une protection oculaire n est pas n cessaire Lors d une utilisation conforme destination et respectant les con
84. nts remove contaminated clothing and wash bo dy down thoroughly with water Hand protection Pick up im mediately as product renders floors slippery Environmental pre Contain contaminated water firefighting water Do not discharge cautions product into natural waters without pretreatment biological treatment plant Methods for cleaning Bind the liquid by using suitable absorbent material saw dust up taking up sand etc and dispose of in accordance with the regulations Wash away spills thoroughly with large quantities of water In case of release of larger quantities which might flow into the draining system or waters contact appropriate authorities 7 Handling and storage Handling Ensure thorough ventilation of stores and work areas Protection against Take precautionary measures against static discharges fire and explosion If exposed to fire keep containers cool by spraying with water Storage Product is hygroscopic Containers should be stored tightly sealed in a dry place Storage in galvanized containers is not recommended 8 Exposure controls and personal protection Components with workplace control parameters 107 21 1 Ethylene glycol MAK value D 26 mg m 3 10 ppm TRGS 900 DE Top limit category 1 There is no reason to fear a risk of damage to the developing embryo when the MAK value is adhered to Skin resorption hazard wear suitable gloves see below Personal protective equipment Respira
85. omposant du syst me TSC SP5 X vous devez utiliser la prise de verrouillage distance situ e sur l unit d alimentation voir le chapitre 5 4 Le connecteur de verrouillage distance pontage de court circuit doit tre branch sur la prise de verrouillage distance du laser lumi re blanche Si vous faites fonctionner s par ment le laser lumi re blanche sans le connecter au syst me TCS SP5 vous devez utiliser la prise de verrouillage distance situ e sur le laser lumi re blanche voir Figure 17 comme port des verrouillages distance Il est aussi possible de connecter des dispositifs de verrouillage distance associ s au local la porte ou d autres verrouillages de s curit qui sont fixes Si le contact est ouvert le trajet du faisceau laser est interrompu Concerne seulement le syst me TCS SP5 X 36 Figure 17 Prise de verrouillage distance Interlock sur le laser lumi re blanche 37 Prise de verrouillage distance sur les lasers externes 9 6 Pour les lasers externes veuillez consulter le mode d emploi fourni par le fabricant du laser pour conna tre la position de la prise de verrouillage distance Prise de verrouillage distance Interlock sur le scanneur 5 7 inale lon nomina nr Sur le panneau arri re du scanneur se trouve la prise Interlock tens 12 V CC Figure 18 ICrOSCOpe tte prise que le m Cela garantit que a Ce
86. ondant au mot cl recherch double cliquez sur le mot cl ou cliquez sur le bouton Display Search Entrez le terme ou l expression rechercher et cliquez sur le bouton LIST TOPICS afficher les sujets pr sent une liste de rubriques structure hi rarchique s affiche About Ouvre la bo te de dialogue User Configuration o vous pouvez entre autres s lectionner la langue dans laquelle l aide en ligne sera pr sent e 18 9 2 3 Recherche globale avec crit res de recherche liens logiques En cliquant dans l onglet Search sur le triangle droite de la bo te de saisie vous faites afficher les op rateurs logiques 1 S lectionnez l op rateur souhait 2 A la suite de l op rateur entrez la deuxi me cl de recherche li e au premier par l op rateur diaphragme Cette expression recherche les rubriques d aide contenant la fois le mot and d coupes diaphragme et le mot d coupes diaphragme or Cette expression recherche les rubriques d aide contenant soit le mot d coupes diaphragme soit le mot d coupes ou les deux Cette expression recherche les rubriques d aide dans lesquelles le mot diaphragme diaphragme et le mot d coupes sont a une certaine distance l un de near d coupes l autre En outre la fonction recherche aussi les mots ayant une orthographe similaire diaphragme not Cette expression recherche les rubriques d aide contenant le mot d coupes diaphragme mais pas l
87. phe 10 1 4 Dans l id al le diam tre de ce trou d aiguille est aussi petit que voulu mais un trou trop petit ne laissera plus passer la lumi re et de ce fait aucune image ne pourra tre g n r e Mais si le trou d aiguille a une trop grande ouverture l effet est perdu et de nombreuses parties de 95 l image issues des r gions de l objet ou situ es au dessus ou au dessous du plan de mise au point manquent de nettet La d pendance de l paisseur de la coupe optique par rapport au diam tre du trou d aiguille est lin aire pour les grands diam tres avec de petits diam tres elle se rapproche d une valeur limite et elle est donc presque constante proximit de z ro Figure 70 La valeur limite d pend de la longueur d onde de la lumi re et de l ouverture num rique Du fait que l ouverture du trou d aiguille n entra ne qu une faible modification de l paisseur de coupe mais que la lumi re admise augmente quadratiquement avec le diam tre il est opportun de ne pas utiliser de diam tres trop petits Figure 70 Rapport entre l paisseur de coupe optique axe y et le diam tre du trou d aiguille axe x Il y a un bon compromis quand la limite de diffraction d pendance constante se transforme en limitation g om trique d pendance lin aire Le trou d aiguille a cet endroit quand on le reproduit sur le plan de la pr paration peu pr s la taille du disque de lumi re limit par diffraction d un rayon
88. pour syst mes VIS et UV Ce syst me est conform ment la norme CEI EN 60825 1 un appareil laser de classe SB IIIb Evitez absolument l irradiation des yeux ou de la peau par un rayonnement direct Les rayons laser peuvent causer des blessures oculaires irreparables 4 2 Classe de laser pour syst mes MP Ce syst me est conform ment la norme CEI EN 60825 1 un appareil laser de classe AIIV et indirect Les rayons laser peuvent causer des blessures oculaires et cutanees Evitez absolument l irradiation des yeux ou de la peau par un rayonnement direct A irreparables 4 3 Quelles sont les obligations de l exploitant L exploitant du produit est responsable du fonctionnement conforme a destination et s r et de la maintenance du syst me effectu e en toute s curit ainsi que du respect des dispositions relatives a la securite qui sont en vigueur L exploitant est enti rement responsable de toutes les consequences r sultant d une utilisation du syst me dans d autres buts que ceux qui sont cit s dans le mode d emploi ou l aide en ligne a la manipulation du syst me et inform es du potentiel de risques li au Cet appareil laser ne peut tre utilis que par des personnes ayant t form es A rayonnement laser dans le pays concern l exploitant est tenu de prendre les mesures de s curit Conformement a la norme CEI EN 60825 1 et aux dispositions legales en vigueur appropri es et de
89. presentation Leica Ceci concerne particuli rement les syst mes qui se trouvent dans les laboratoires Avant tout d placement du syst me confocal il faut le nettoyer minutieusement A de recherche biom dicale Ceci est n cessaire afin d viter une ventuelle contamination et de faire courir un danger d autres personnes Prenez garde non seulement la surface mais aussi aux ventilateurs et climatiseurs car ces appareils sont de v ritables nids poussi re 11 4 Maintenance du syst me de refroidissement du scanneur Le scanneur du syst me est quip d un liquide de refroidissement Suivez les instructions de la feuille de donn es de s curit du fabricant Innovatek concernant le r frig rant utilis elle est en annexe 9 Le refroidissement du scanneur doit faire l objet tous les deux ans d une 1 maintenance par le service apr s vente de Leica ou le service agr par Leica En cas d mergence de liquide de refroidissement le syst me doit tre imm diatement mis hors tension Informez en imm diatement le service apr s vente de Leica ou le service agr par Leica Le liquide de refroidissement est m lang une substance irritante Evitez tout contact avec les yeux et la peau 118 12 Transport et d pollution 12 1 Changement de lieu d installation Avant tout d placement du microscope laser balayage il faut le nettoyer fond En cas d enl vement des pi ces du syst me il faut
90. produire les r solutions C est pourquoi il vous sera probablement difficile de voir une diff rence dans les deux images du haut Cependant les diff rences relatives la r solution optique sont normes C est un l ment prendre en compte lors des publications Le plus simple est de combiner les deux proc d s avec la fonction appel e Zoom In Elle consiste s lectionner sur le moniteur une case qui circonscrit les structures int ressantes et l appareil r gle alors automatiquement les valeurs Zoom et Pan ad quates C est tr s rapide et pr serve ainsi la pr paration La fonction Undo Zoom permet de revenir l tat initial et de se concentrer rapidement par ex sur un autre endroit du champ de vision Les dimensions des espacements de grille utilis s figurent parmi les informations sur les images Sous la d signation Voxelsize il y a la distance des pixels en x y et z Les images calcul es plus haut avec un zoom 1 auraient donc un espacement de grille compris entre 200 et 300 nm Des distances plus grandes entraineraient des pertes de resolution avec un objectif ayant une ouverture de 0 4 Figure 73 Pour les taux d enregistrement d images plus lev s il importe d avoir des formats rectangulaires Un autre parametre de reglage est ici necessaire la rotation du champ de balayage Du fait que dans le Leica TCS SP5 la rotation du champ s effectue de fa on optique les rotations de 100 sont sans effet sur la
91. ps 450 nm 550 nm et 650 nm et la relation des sinus est respect e pour au moins deux couleurs La courbure de champ n est pas corrig e Distance de travail Distance de la lentille frontale d un objectif pour la mise au point Pour une distance de travail variable il faut indiquer l loignement entre la lentille frontale de l objectif et le couvre objet ou l chantillon non couvert La plupart des objectifs poss dant une grande distance de travail pr sentent une faible ouverture num rique en revanche les objectifs de grande ouverture pr sentent une faible distance de travail Pour un objectif pr sentant une grande ouverture et une grande distance de travail le diam tre de la lentille de l objectif doit tre grand en correspondance Il s agit pour la plupart d optiques faiblement corrig es car le respect des pr cisions de fabrication extr mes pour un grand diam tre de lentille ne peut tre atteint qu au prix d un grand effort 123 Enregistrement de param tres de prise de vue Un enregistrement de param tres de prise de vue IPS Instrument Parameter Setting est un fichier contenant tous les r glages mat riels sp cifiques une technique de prise de vues donn e Les abr viations FITC TRITC d signent par exemple les r glages pour un enregistrement dans deux canaux avec les deux couleurs fluorescentes FITC et TRITC Un enregistrement de param tres de prise de vue permet d enregistrer des configurations de mat riel opt
92. r partiteur optique ou le condenseur Ne changez pas de bloc de filtres ou de r partiteur optique pendant un balayage et teignez les au moyen de la case cocher Si les d tecteurs sont encore sous Dans LAS AF r glez la tension nominale de tous les d tecteurs externes sur 0 V A tension le contact avec la lumi re ambiante peut les endommager Pour faire un changement de bloc de filtres ou de r partiteur optique proc dez comme suit Microscope droit Microscope invers Mettez fin au balayage Mettez fin au balayage Dans LAS AF r glez la tension nominale Dans LAS AF r glez la tension nominale de tous les d tecteurs externes sur 0 V de tous les d tecteurs externes sur 0 V Enlevez le cache du module de fluorescence voir le mode Retirez le module de fluorescence d emploi du microscope Enlevez le bloc de filtres ou le r partiteur Enlevez le bloc de filtres ou le r partiteur optique optique Installez le bloc de filtres ou le Installez le bloc de filtres ou le r partiteur optique souhait r partiteur optique souhait Remettez en place le cache du module de 7 Reinstallez le module de fluorescence fluorescence A N utilisez pas de condenseur de microscope S70 En raison de la grande distance de travail et de la faible ouverture num rique du condenseur de microscope S70 Ne retirez jamais de c ble fibres optiques Ne s parez jamais le scanneur du microscope en cours de fon
93. r la plupart des combinaisons typiques de colorants des prereglages de l clairage et de la division du faisceau lumineux ainsi que le r glage des bandes d mission sont propos s et accessibles dans une liste 10 3 2 Division du faisceau lumineux Dans les syst mes AOBS la description de la division du faisceau lumineux est tr s simple car il est inutile de s en soucier L AOBS active automatiquement pour les lignes s lectionn es une bande troite de fa on ce que l excitation atteigne l chantillon Ces bandes ont une largeur d peu pr s 2 nm Tout le reste est disponible pour l enregistrement de l mission Avec les appareils quip s de r partiteurs optiques classiques l on doit s lectionner le r partiteur optique ad quat Il est important de savoir qu il existe non seulement des r partiteurs optiques simples mais aussi des doubles et des triples DD et TD pour double dichro que et triple dichroique Les lignes adjacentes ne sont pas utilisables avec des repartiteurs dichroiques Ainsi il n y a pas sur le march des r partiteurs utilisables pour l utilisation simultan e de lignes HeNe de 594 nm et 633 nm L AOBS est ici un net avantage avec les bandes tr s troites d 1 2 nm il permet d activer les deux lignes pour l excitation et m me d enregistrer encore une bande d mission de 35 nm avec le d tecteur SP 10 3 3 Bandes d mission Les m mes conditions de compatibilit que celles d crites au p
94. ravaillant avec le syst me MISE EN GARDE CONTRE DES MATI RES NOCIVES O IRRITANTES Un avertissement de ce type attire votre attention sur une substance nocive pour la sant ATTENTION Une consigne de s curit de ce type attire votre attention sur un processus de fonctionnement un proc d une condition ou une instruction qu il est imp ratif d observer et de respecter strictement car sinon il y a un risque de graves dommages mat riels pour le syst me ou de perte de donn es PORTER UNE PROTECTION OCULAIRE Un symbole d obligation de ce type vous signale qu une protection oculaire appropri e est prescrite de mani re obligatoire pour la mise en service et l exploitation du syst me L ex cution de ces op rations sans protection oculaire appropri e peut entra ner des blessures graves et irr versibles aux yeux 25 26 RESPECTER LE MODE D EMPLOI Un symbole d obligation de ce type vous indique que les consignes de s curit et les instructions du mode d emploi doivent tre imp rativement respect es afin d assurer un fonctionnement s r et parfait du syst me Toutes les personnes travaillant avec le syst me doivent respecter le mode d emploi et en particulier les consignes de s curit Les remarques contiennent soit des informations compl mentaires sur un th me d termin soit des instructions particuli res concernant le maniement du produit 4 Consignes de s curit g n rales 4 1 Classe de laser
95. re quitte l objectif du microscope et atteigne l chantillon Avec les syst mes quip s de laser infrarouge plage de longueurs d ondes gt 700 nm le faisceau est conduit par le guidage de s curit du faisceau et le cas ch ant galement par un c ble fibres optiques Figure 21 Ainsi la protection contre le faisceau laser est totale jusqu ce qu il quitte l objectif du microscope et atteigne la pr paration Figure 21 Guidage de s curit du faisceau 1 et laser IR 2 41 5 10 Marques de s curit sur le syst me Les marques de s curit en anglais ou en allemand sont choisies en fonction de la configuration laser VIS UV MP Elles sont appos es aux endroits d crits ci apr s 5 10 1 Microscope invers DMI 6000 CS Vue oblique arri re sur le c t droit du microscope Figure 22 Autocollant de s curit pour microscope invers DMI 6000 CS 42 Vue oblique avant sur le c t droit du microscope 29100 017 zust 00 S2O08 005 ust 01 Figure 23 Autocollant de s curit pour microscope invers DMI 6000 CS 43 5 10 2 Microscope droit DM 5000 6000 CS Vue oblique avant sur le c t droit du microscope Figure 24 Autocollant de s curit pour microscope droit DM 5000 6000 CS 44 Vue arri re du microscope Figure 25 Autocollant de s curit pour microscope droit DM 5000 6000 CS 45 5 10 3 T te de balayage Vue oblique avant sur le c t gauche
96. remi re fois des op rations avec le syst me 7 commencez par lire la description correspondante de la fonction dans l aide en 1 ligne il Le sommaire de l aide en ligne donne une vue d ensemble des fonctions individuelles On ne peut pas pr voir toutes les situations risque c est pourquoi lors du fonctionnement du produit il convient de proc der avec soin en faisant preuve de bon sens et de prendre toutes les mesures de s curit appropri es qui sont en vigueur pour les lasers de classe 3B IIIb ou les syst mes MP de classe 4 IV Aucune d rogation aux proc dures de fonctionnement et de maintenance fix es n est admise Toute d rogation a lieu exclusivement aux risques de l utilisateur et peut le cas ch ant entra ner l extinction de la garantie 4 5 S curit de fonctionnement Cet appareil doit tre raccord uniquement une alimentation lectrique quip e Cet appareil ne doit pas tre utilis en association avec des appareils servant au maintien de la vie tels que ceux utilis s par exemple en m decine intensive d une mise la terre Tout contact avec des liquides ou la p n tration de liquides dans le syst me doivent en principe tre vit s 29 4 6 Charge lectrique maximale du bloc multiprises de l unit d alimentation La consommation de courant totale de tous les appareils connect s au bloc multiprises Figure 8 ne doit pas d passer 800 VA au maximum Les prises sont pr v
97. romate Classe de correction d un objectif Pour les objectifs de ce type l aberration chromatique est corrig e pour deux longueurs d onde D habitude un tel objectif est corrig pour une longueur d onde sous 500 nm et au dessus de 600 nm En outre la relation des sinus pour une longueur d onde est respect e La courbure de champ n est pas corrig e Disque d Airy On appelle disque d Airy le cercle interne clair entour d anneaux de diffraction alternativement fonc s et clairs de l image diffract e compos e d une source de lumi re ponctuelle Les disques de diffraction de deux points d objet situ s l un c t de l autre se superposent partiellement ou totalement et limitent ainsi le pouvoir s parateur spatial Aliasing Erreur de construction g n r e par un taux de balayage trop faible par rapport la fr quence du signal AOTF Acousto Optical Tunable Filter Le filtre acousto optique r glable est un cristal transparent optiquement avec lequel on peut r gler en continu l intensit et la longueur d onde de la lumi re incidente Dans le cristal un champ ondes ultrasonores dont la longueur d onde peut tre r gl e volont est produit Perpendiculairement au champ d ondes ultrasonores la lumi re incidente se diffracte comme sur un quadrillage Apochromate Classe de correction d un objectif Avec les objectifs de ce type l aberration chromatique est corrig e pour trois longueurs d ondes la plupart du tem
98. s es comme milieu d immersion tab 3 Appliquez en g n reusement Toutefois dans le cas des microscopes invers s veillez ce que le liquide ne s infiltre pas dans le statif 10 1 2 Microscopie classique Pour voir la pr paration de la fa on classique c est dire directement dans les oculaires il faut que le mode de fonctionnement soit r gl sur VISUAL SCAN est le mode d enregistrement par balayage laser Recherchez ensuite une position appropri e et faites une mise au point de la pr paration 84 1 Bloc de filtres 2 chantillon 3 Lentille d objectif 4 Obturateur 5 Lampe 6 Oculaire Figure 59 Sch ma de fluorescence en lumi re r fl chie la lumi re provenant d une lampe au mercure est collimat e avec un filtre d excitation et la s lection spectrale est dirig e vers l chantillon au moyen d un miroir chromatique Un obturateur permet d obscurcir la pr paration L mission d une longueur d onde sup rieure celle de l excitation est rendue visible dans l oculaire gr ce au miroir chromatique et un filtre d mission Le filtre d excitation le miroir chromatique et le filtre d mission sont r unis dans un bloc de filtres Les coupes optiques sont produites en lumi re r fl chie Votre chantillon doit donc tre r fl chissant ou fluorescent Dans la plupart des cas les pr parations sont fluorescentes Souvent il s agit d examiner un chantillon aux colorations multiples
99. s arr te quand les forces de torsion et la force lectromagn tique sont en quilibre Ainsi l application d une tension alternative permet de faire bouger le miroir vers la droite selon un angle d termin 87 Figure 61 Spot limit par la diffraction et dont la diminution n est plus possible tache d Airy En bas profil d intensit Pour imager une ligne il faut d placer le miroir x au dessus du champ de vision et d caler un peu le miroir y Puis le miroir x passe la ligne suivante Les signaux provenant de l chantillon sont m moris s de fa on synchrone ce qui permet de les repr senter sur le moniteur 10 1 4 Comment s effectue une coupe optique La d signation confocal est purement technique elle ne d crit pas les effets de cette disposition Nous allons les rappeler ici Comme cela a d j t d crit la section 10 1 3 la pr paration est toujours clair e sur la plus petite tache lumineuse possible d o la d signation focal La disposition confocale pr voit aussi une observation punctiforme L on obtient cette r partition de la sensibilit punctiforme du d tecteur en focalisant la lumi re de l chantillon sur une tr s petite ouverture appel e trou d aiguille Ce trou d aiguille permet d liminer l information qui ne provient pas du plan de mise au point Figure 62 88 D focalis Mise au point 2 Focalis 3 Diaphragme trou d aiguille Figure
100. s obscures Pour l installation la maintenance et le transport du syst me il faut pr voir des largeurs int rieures de porte de 1 00 m En ce qui concerne la portance minimale du sol tenez compte du fait que le syst me a une charge statique de 200 kg m A 2 7 4 Conditions ambiantes admissibles Veillez un environnement l abri de secousses Plage de temp rature admissible pour le 18 25 C fonctionnement Plage de temp rature requise pour un 22 C 1 C comportement optique optimal 7 Humidite relative admissible 20 80 sans condensation Vibrations admissibles Plage de fr quence 5 Hz 30 Hz lt 30 um s valeur effective Plage de fr quence gt 30 Hz lt 60 um s valeur effective 18 2 7 5 Dissipation de chaleur par le syst me et puissance frigorifique requise Le syst me TCS SP5 a une puissance consomm e maximale de 3 2 kW pour le syst me VIS et de 6 2 kW pour le syst me MP Le TCS SP5 X a une puissance consomm e maximale de 3 4 kW Pour avoir des informations techniques sur les lasers plac s l ext rieur du syst me tels que les lasers UV et MP veuillez consulter la documentation fournie par le fabricant du laser 2 8 Equipement 2 8 1 Vue d ensemble des lasers VIS UV utilisables Le Leica TCS SP5 contient une combinaison des lasers mentionn s ici Rendement Rendement lumineux 5 lumineux Longueur maximal la i maximal dans le Largeur Type de l
101. s regardez l chantillon au microscope quand vous actionnez le coulisseau vous voyez la lumi re de la couleur choisie s claircir ou s assombrir En cas d utilisation conforme et de respect des consignes de s curit il n y a aucun risque pour les yeux de l utilisateur Respectez une distance de s curit d au moins 20 cm entre vos yeux et l ouverture de l objectif cet effet veuillez aussi lire les consignes de s curit donn es dans le pr sent mode d emploi Si tous les r glages sont en ordre on peut voir sur le moniteur des images plus claires et plus sombres en actionnant le coulisseau de l clairage 10 2 3 Division du faisceau lumineux Dans le cas le plus simple on s lectionne une ligne laser pour exciter un colorant fluorescent qui est presqu au maximum du spectre d excitation de ce colorant Cela permet d obtenir le meilleur rendement En g n ral les lasers fournissent beaucoup plus de lumi re qu il n est n cessaire et une diminution de 10 est habituellement suffisante pour obtenir de bonnes images cela d pend videmment tr s fortement de la coloration de la pr paration Ainsi l on peut galement exciter la fluorescence du c t bleu avant le maximum d excitation ce qui pr sente l avantage qu une bande plus large est disponible pour la collecte de l mission Figure 68 93 Figure 68 Spectre d excitation d un colorant fluorescent bleu et spectre d mission rouge Si l on excite au maximum
102. signes de s curit la limite de rayonnement laser est respect e ce qui exclut tout risque oculaire 54 6 3 3 Syst mes VIS et UV avec microscope invers ou droit Le port d une protection oculaire n est pas n cessaire Lors d une utilisation conforme a destination et respectant les consignes de s curit la limite de rayonnement laser est respect e ce qui exclut tout risque oculaire 99 6 4 Espace propre l chantillon La lumi re de tous les lasers VIS plage de longueurs d ondes 400 700 nm spectre visible et lasers UV plage de longueurs d ondes lt 400 nm invisible install s est conduite par un c ble fibres optiques qui assure une protection int grale jusqu ce que la lumi re quitte l objectif du microscope et atteigne la pr paration La divergence du faisceau en fonction de l objectif utilis est d au maximum 1 16 rad Figure 33 Espace propre l chantillon sur microscopes droit et invers Dans l espace propre l chantillon du microscope laser balayage le rayonnement laser est librement accessible pendant le balayage apr s la sortie de l objectif Cet tat de fait exige une attention et une prudence particuli res Tout contact oculaire avec le rayonnement laser peut causer de graves blessures oculaires C est pourquoi il est indispensable d agir avec circonspection d s qu un ou plusieurs des voyants indicateurs d mission laser sont allum s En cas d utilisation conforme
103. st me n est autoris qu aux personnes comp tentes les techniciens du service apres vente Leica Ne connectez aucun appareil de fabrication ext rieure Ne peuvent tre connect s au produit que les appareils lectriques cit s dans ce mode d emploi Pour toute question concernant les appareils compatibles adressez vous votre agence locale de service apr s vente Leica ou contactez directement Leica Microsystems CMS GmbH Leica Microsystems CMS GmbH n est responsable d aucun dommage r sultant du non respect des informations cit es ci dessus Les informations cit es ci dessus ne modifient en aucune fa on que ce soit implicitement ou explicitement les clauses de garantie et de responsabilit contenues dans les Conditions g n rales de vente de Leica Microsystems CMS GmbH 28 4 4 Consignes de s curit pour l utilisateur Lisez et observez les consignes de s curit contenues dans le pr sent mode d emploi et les marques de s curit appos es sur le syst me Le non respect de ces consignes de s curit peut entra ner des blessures corporelles graves ou des dommages consid rables pour le syst me ainsi que la perte de donn es Cet appareil laser est de classe 3B ou 4 en fonction des lasers utilis s Cet appareil laser ne peut tre utilis que par des personnes ayant t form es a la manipulation du syst me et inform es du potentiel de risques li au rayonnement laser Avant d ex cuter pour la p
104. tandard de 8 bits un volume de 0 25 Mo Des centaines de ces images soit peu pr s une pr paration d une paisseur de 20 um haute r solution occupent d j 25 Mo ce qui tait il y a quelques ann es peine une quantit de donn es tr s difficile g rer Si maintenant il y a enregistrement en parall le de 5 canaux et si le format d image est de 1000 x 1000 pixels cette pile fait d j 500 Mo soit presque la capacit d un CD courant Avec une profondeur des niveaux de gris de 16 bits et 8000 x 8000 pixels on obtient un bloc de donn es de 64 Go ce qui reste indigeste pour la plupart des ordinateurs actuels Il convient donc de faire preuve d esprit critique quant aux param tres d enregistrement des donn es 10 4 5 Repr sentations z BU jun f 2 1 059 pm 5 2 196 pm gt z d 4f jim 2 4 296 jim a 253495 jam Aa 7 6 594 pm 259 091 pm 2 10 0 390 pm SEALE um RATT pm gt z 14 287 pm o z 15 386 pm i 2 16 445 pm r a Fa w A 1 F w kg Le Fa 7 A a ig No E i ie ec ad A i I k s me M al F rae we Fa F a F ia O F zg F 2 17 584 pm FO 218 683 pm O 215 782 pm VO z 2088lpm 2 21980pm 2 23079um z 4178pm 225 277 um k k ee a i z 26 476 jum 227 475 lin F 28 574 pm F f 673 p Z a0 7 FE om 231 0717 p Figure 79 Galerie d une s rie z Cette collection de timbres poste convient particuli rement pour les publications monochromes Comme il a t m
105. tion est tr s claire En particulier avec des chantillons r fl chissants l on peut fermer le trou d aiguille jusqu un cinqui me ou m me un dixi me d unit Airy AU et cr er des coupes aussi minces que possible 10 2 6 Section d image et r glages de la grille Le microscope classique montre en fonction de l objectif utilis un cadrage circulaire de la pr paration Le diam tre de ce cercle multipli par l chelle de reproduction de l objectif est l indice de champ C est donc un indice du microscope ind pendant de l objectif et il permet toujours en faisant l op ration inverse de calculer les dimensions de la pr paration observ e Un scanneur observe toujours des cadrages carr s ou rectangulaires Quand un carr de ce type est circonscrit par le champ de vision la diagonale est nouveau exactement l indice de champ et l on peut voir sur le moniteur l image agrandie sans limitations Mais le scanneur peut la diff rence de l il humain ou d un appareil habituel de prise de vues tre aussi r gl simplement sur un angle plus petit Alors un cadrage du champ de 97 vision s affiche sur le moniteur avec un agrandissement sup rieur Sans autre optique il est galement possible de zoomer sur les d tails Du fait que les angles de balayage peuvent tre tr s rapidement r gl s en continu sur un champ plus large il est possible d obtenir un grossissement plus lev jusqu pr s de 40x par un simple d placeme
106. tory Protection Do not inhale gases vapours aerosols Hand protection Chemical resistant protective gloves EN 374 Recommended nitrile rubber protective index 6 Manufacturers directions for use should be observed because of great diversity of types Eye protection Safety glasses with side shields frame goggles EN 166 General safety and The usual precautions for the handling of chemicals must hygiene measures be observed 9 Physical and chemical properties Form Liquid Colour Colourless Odour Product specific pH value 500 g l 20 C 7 0 9 0 Solidification temperature lt 18 C DIN ISO 3016 Boiling point range gt 165 C ASTM D 1120 Flash point gt 120 C DIN ISO 2592 Lower explosion limit 3 0 vol Upper explosion limit 15 0 vol 131 EEC SAFETY DATA SHEET Gem 91 155 EG 2001 58 EG n n ovatek TED innovatek OS GmbH Stand www innovatek de 2 12 2004 info innovatek de 10 Stability and reactivity Substances to avoid Strong oxidizing agents Hazardous reactions No hazardous reactions when stored and handled according to instructions Hazardous decomposition No hazardous decomposition products if stored and handled products as prescribed indicated 11 Toxicological data LD50 oral rat gt 2000 mg kg LD50 dermal rabbit gt 2000 mg kg literature data Primary skin irritation rabbit non irritant Information on Ethylene glycol Further information Developmental tox
107. tre mais elle vaut pareillement pour un nombre quelconque de colorants La condition pr alable est que le nombre de canaux utilis s est au moins aussi grand que le nombre de colorants impliqu s Ainsi les m thodes simples des syst mes d quations lin aires permettent de faire une redistribution correcte des portions Mais la t che essentielle d un bon d mixage consiste d terminer les coefficients de la matrice L encore le logiciel Leica met divers proc d s la disposition des utilisateurs Afin de d terminer le proc d adapt la t che fix e il est pertinent de faire quelques essais Puisque toutes les donn es de mesure sont affect es d une certaine marge d erreur et d un pourcentage de bruit il n y a pas de recette miracle permettant de trouver l ultime v rit Le plus simple pour l utilisateur consiste d terminer les coefficients partir des donn es statistiques des images enregistr es Ce proc d d termine les coefficients avec des m thodes statistiques partir des diagrammes de dispersion des deux canaux Il incombe alors l utilisateur de d terminer la puissance d activation de la s paration Il existe deux proc d s de s paration un souple et un dur Quand les coefficients sont connus suite d autres exp riences on peut entrer manuellement les donn es dans une matrice Ce proc d convient galement pour les tentatives manuelles d am lioration quand il faut compenser manuel
108. trement s quentiel bandes d mission et proc d d Unmixing Nous nous occupons maintenant des param tres d clairage et d mission Souvent le crosstalk est d au fait que les concentrations des fluorochromes utilis s sont tr s diff rentes Avec un clairage homog ne le colorant le plus concentr produira un tr s bon signal mais il causera aussi tr s probablement des perturbations dans l autre ou les autres canaux Pour y rem dier on peut r gler les diverses intensit s de laser de sorte que le colorant peu concentr soit excit avec une intensit lev e et que le colorant tr s concentr le soit avec une faible intensit Un tel quilibrage permet souvent d liminer un probl me de diaphonie cons quent l aide du r glage en continu de l intensit offert par l AOTF on peut suivre le r sultat directement l cran et faire ainsi un r glage en ligne pertinent en fonction des informations re ues Afin d avoir une latitude suffisante pour le r glage des bandes d mission cela vaut la peine de faire des essais d excitation avec des lignes laser diff rentes Pour l quilibrage il est galement possible d utiliser ce param tre quand un colorant est tr s dominant en choisissant une autre ligne d excitation on peut r duire l intensit de cette coloration et am liorer ainsi la s paration par rapport l autre colorant et agrandir simultan ment la distance par rapport l autre excitation ce qui permet
109. ts peuvent encore tre per us s par ment si la distance est au moins gale d e 2 NA Il s ensuit qu une ligne contient au plus 15 mm d de points r solus appel s resolved elements Resel Si nous prenons un objectif r el p ex plan apochromatique 10x 0 4 la longueur d ar te est de 1 5 mm 15 mm 10 et d 0 625 um avec une lumi re bleu vert d une longueur d onde de 500 nm Cette image contient donc dans la direction x et la direction y 1 500 0 625 2 400 l ments r solus optiquement Pour transf rer cette r solution dans une image matricielle compos e num riquement de pixels les donn es doivent tre enregistr es avec une r solution deux fois plus lev e afin d viter les pertes th or me de Nyquist L image aurait donc 4800 x 4800 pixels Les 98 puristes attendent m me un triple oversampling donc 7200 x 7200 pixels ce que l on sp cifie aujourd hui par 52 m gapixels Le format d image se r gle pour x et y avec une tr s grande finesse de graduations et ind pendamment l un de l autre avec le Leica TCS SP5 des formats d enregistrement jusqu 64 m gapixels sont possibles 8000 x 8000 points tab 5 Grossissement les 40 Mo Ouverture num rique D a 125 0 4 Resolution optique 400 nm 0 5 intermediate Image Edge 15 Field Edge 1500 Resel Field Resolution 1667 2344 3000 Double Oversampling 3333 4688 6000 Triple Oversampling 5000 7031 9000 Tableau 5 Tableau des pix
110. ue 3 bits Les carts lectroniques par rapport au point z ro sont g n ralement insignifiants mais toutefois il est pertinent de contr ler le r glage de temps en temps Mais la signification sp cifique du r glage de la valeur Offset est qu une fluorescence non sp cifique ou propre la pr paration peut tre masqu e d s l enregistrement Pour ce faire l on r gle le d calage de fa on ce que la fluorescence d arri re plan disparaisse Veuillez noter que des signaux contenant des informations risquent alors d tre coup s Ce r glage doit toujours tre associ un contr le pr cis du r sultat 102 L amplification du signal doit tre effectu e apr s la correction de l offset Avec le tableau chromatique d crit c est tr s simple en r gulant la haute tension du photomultiplicateur veillez ce que les pixels bleus ne soient plus visibles Il est recommand de garantir par une focalisation que ce sont vraiment les signaux les plus clairs du champ d image observ qui sont mis contribution par le r glage C est ici le moment qui convient pour v rifier que la lumi re d excitation est correctement r gl e Pour r duire le bruit dans l image il est possible d lever l intensit de l clairage en r glant l AOTF Il faut toujours prendre en compte qu une intensit d clairage plus forte endommage la pr paration plus rapidement Avec des chantillons tr s sensibles et si l on est particuli rement int r
111. ues pour e Ordinateur de contr le TCS e Moniteur 1 e Moniteur 2 e Microscope r O Figure 8 Bloc multiprises panneau arri re de l unit d alimentation 30 5 Dispositifs de s curit 5 1 Disjoncteur Du c t droit du panneau arri re de l unit d alimentation lectrique il y a un disjoncteur Main Circuit Breaker qui assure par couplage la d connexion lectrique du syst me Figure 9 Le disjoncteur a la fois la fonction de commutateur et de fusible de s ret Ce disjoncteur ne sert pas la mise sous et hors tension du syst me L unit d alimentation lectrique doit tre dispos e de fa on ce que le disjoncteur soit toujours librement accessible Figure 9 Unit d alimentation lectrique avec disjoncteur 31 5 2 Interrupteur cl L interrupteur cl assure une protection contre toute utilisation non autoris e des appareils laser il est situ sur le pupitre de commande voir Figure 10 Figure 10 Interrupteur cl pour les lasers internes L interrupteur cl assure une protection contre toute utilisation non autoris e du laser externe lumi re blanche il est situ en fa ade du laser lumi re blanche voir Figure 11 Figure 11 Interrupteur cl du laser lumi re blanche 32 L interrupteur cl assure une protection contre toute utilisation non autoris e du laser externe UV il est situ en fa ade du bloc d
112. ueur d onde elles mettent une lumi re d une autre longueur d onde plus longue Cette diff rence entre lumi re d excitation et lumi re fluorescente est appel e la loi de Stokes Sans la loi de Stokes il ne serait pas possible dans un microscope par fluorescence de s parer la lumi re d excitation de forte intensit des signaux fluorescents de faible intensit 127 Triple dichroite Les filtres triple dichro ques sont des filtres d interf rence pour un angle d incidence de la lumi re de 45 La transmitivit ou la r flexivit des dichroites triples d pend de trois longueurs d onde de la lumi re fixes Pour une dichroite triple TD 488 568 647 par exemple la lumi re d excitation est r fl chie 488 nm 568 nm et 633 nm et transmise au del de ces valeurs Les valeurs de transmission se situent g n ralement autour de 80 les valeurs de r flexion entre 90 et 95 Objectif sec Objectif microscopique utilis sans milieu d immersion Entre la lentille d objectif et la pr paration se trouve de l air Laser UV Laser d une longueur d onde lt 400 nm rayonnement laser invisible Laser VIS Laser ayant une plage de longueurs d ondes comprise entre 400 et 700 nm rayonnement laser visible Voxel Mot issu des termes anglais volume et pixel Un voxel est le plus petit l ment de volume indivisible dans un syst me a trois dimensions Dans ce document on d signe par voxel aussi bien un element de volume dans la prepar
113. un sont r sum es ci dessus A Prot gez le microscope de la poussi re et de la graisse Lorsque vous n utilisez pas le syst me recouvrez le toujours d une housse comprise dans la livraison ou d un tissu en coton propre Le syst me doit tre activ dans un environnement aussi exempt de poussi re et de graisse que possible Si aucun objectif ne se trouve dans le revolver objectifs les emplacements des objectifs doivent tre pourvus de leur cache anti poussi re A Utilisez les produits chimiques agressifs avec grande pr caution Soyez extr mement prudent lorsque vous utilisez en cours de travail des acides des solutions alcalines ou d autres produits chimiques agressifs Prenez garde ce que ces substances n atteignent pas les composants optiques et m caniques du syst me 11 2 Nettoyage du syst me optique Le syst me optique du microscope doit toujours tre nettoy Il ne faut en aucun cas toucher les composants optiques avec les doigts ou quelque chose de sale ou de gras Eliminez la poussi re l aide d un pinceau fin et sec Si cela ne suffit pas vous pouvez utiliser un chiffon non pelucheux imbib d eau distill e Les salet s tenaces d pos es sur la surface du verre s enl vent avec de l alcool pur ou du chloroforme Si une lentille d objectif a t contamin e accidentellement par de l huile d immersion non adapt e ou par l chantillon veuillez vous adresser votre agence Leica la plus proche On
114. ur LAS AF Contient des informations g n rales sur l Aide en ligne LAS AF Aide en ligne LAS AF Descriptions des boites de Contient une description d taill e des bo tes de dialogue dialogues de l interface utilisateur LAS AF Contient des informations compl mentaires sur le LAS AF et des th mes relatifs aux applications par exemple le traitement d image num rique et la s paration des colorants Dye Separation Informations compl mentaires 7 9 2 2 Appel de l Aide en ligne L appel de l aide en ligne peut s effectuer de trois mani res diff rentes Dans le contexte respectif contextuel Par le menu Help Via la combinaison de touches CTRL F1 Dans le contexte respectif contextuel Cliquez sur le point d interrogation se trouvant dans l angle sup rieur droit de chaque bo te de dialogue L aide en ligne s ouvre sur la description de la fonction correspondante Par le menu Help Cliquez dans la barre de menus sur la commande Help Le menu s ouvre vers le bas et pr sente diff rentes options de recherche dont Contents Ce champ de dialogue comprend un sommaire arborescent qui peut tre agrandi ou r duit Double cliquez sur une entr e du sommaire afin d afficher les informations correspondantes Index Entrez le terme que vous voulez chercher L aide en ligne vous indique le mot cl qui se rapproche le plus du crit re mentionn S lectionnez un mot cl Pour afficher la page d aide corresp
115. us basse qu avec les objectifs ordinaires Pour assurer que A le plan de mise au point soit le m me une douille entretoise est install e sur tous les autres objectifs Figure 41 6 10 1 Changement d objectif avec une mise au point pi zo lectrique automatique risquerait d endommager le c ble de la mise au point pi zo Ne pas effectuer le changement d objectif automatiquement Le mouvement A lectrique Avant de changer l objectif associ la mise au point pi zo lectrique vous devez en plus de la proc dure normale voir le chapitre 6 6 abaisser le plus possible la A platine et enlever de la platine le porte objet ou l chantillon Sinon l initialisation de la mise au point pi zo lectrique risque d endommager ou de d truire l chantillon et le porte objet pendant le d marrage du syst me logiciel Apr s un remplacement de l objectif sur la mise au point pi zo lectrique d clarez le nouvel objectif dans le logiciel LAS Suivez attentivement les instructions contenues dans le mode d emploi du microscope 65 66 7 Mise en service du syst me 7 1 Mise en marche du systeme Avec la platine motoris e 156504145 pour le DMI 6000 inverse Puisque la platine motoris e est initialis e et pour viter d endommager le condenseur le bras d clairage du microscope inverse doit tre pivot vers l arri re avant le d marrage du syst me ou de LAS AF A Avec la platine motoris e 156504155 pour le DM 6
116. viduelle Si on enregistre par exemple une coupe optique individuelle 4 x pour faire la moyenne des donn es et liminer les bruits alors quatre cadres frame sont produits pour cette coupe optique Objectif immersion Objectif microscopique qui a t d velopp sous la condition d utiliser des milieux d immersion Utiliser aucun ou un mauvais milieu d immersion avec un objectif immersion peut conduire des pertes de r solution et des d t riorations de la correction Laser IR Laser d une longueur d onde gt 700 nm rayonnement laser invisible infrarouge Sous m thodes confocales Ces m thodes d riv es des m thodes de contraste classiques fond clair contraste interf rentiel contraste de phase polarisation servent a examiner les microstructures en association avec un syst me confocal Ces m thodes d finissent chaque fois une configuration d termin e d l ments optiques bloc de filtres prismes ICT anneaux de phase Certaines d entre elles d pendent en outre de l objectif s lectionn 125 Confocalit Alors que le concept optique d un microscope classique assure une d tection identique des composants de l image quelle que soit leur nettet le principe confocal limine les structures situ es hors du plan de mise au point de l objectif du microscope C est cela que servent les diaphragmes plac s sur des lieux de conjonction optique sur le trajet optique Ils fonctionnent comme une source lumin
117. vitesse et les formats de grille possibles Figure 74 100 Figure 74 Exemple pr sentant simultan ment Zoom Pan et Rotation Pour finir il ne faut pas oublier de mentionner dans ce chapitre qu une bonne image microscopique dans un contexte scientifique contient toujours une graduation La graduation peut figurer simplement sur l image et il est possible d en adapter la forme la couleur et la taille Pour plus de clart la graduation a t omise dans ce document 10 2 7 Signal et bruit Lors de l enregistrement de donn es l amplification du syst me d enregistrement doit tre adapt e l intensit du signal Les intensit s du signal varient sur plusieurs ordres de grandeurs et cette adaptation est n cessaire pour garantir une dynamique lev e lors de l enregistrement Le but est de r partir toute la plage des diff rences d intensit sur les valeurs de gris utilis es Lors d enregistrements r alis s avec une num risation de 8 bits l image reconna t 256 valeurs de gris diff rentes de 0 255 Quand le r glage de l amplification est trop faible l on ne trouve le signal proprement dit que peut tre que sur 5 niveaux de gris ce qui a pour effet que l image affiche effectivement ces niveaux Si le r glage de l amplification est trop lev des parties du signal sont d coup es c est dire qu elles sont toujours repr sent es par la valeur de gris 255 bien qu l origine il y ait eu des 101 diff ren
118. yonnement laser et se trouvent entre la base du condenseur et le d tecteur de diascopie voir Figure 20 1 Gaine de protection laser laser protection tube 2 Capteur de faisceau cette figure montre le capteur de faisceau associ au syst me MP 3 Base du condenseur Figure 20 Microscope invers Si vous commandez ult rieurement une base de condenseur Figure 20 position 3 Sachez que la base de condenseur est livr e sans le capteur de faisceau Figure 20 position 2 1 Vous devez en tout cas remonter le capteur de faisceau Figure 20 position 2 existant Suivez les instructions contenues dans le mode d emploi livr avec le microscope En cas d utilisation d une base de condenseur avec porte filtre il faut toujours veiller faire pivoter les porte filtres inutilis s hors du trajet optique et couvrir le trajet optique avec la gaine de protection laser L quipement de porte filtres avec des filtres doit se faire de bas en haut de sorte que la gaine de protection laser couvre le plus possible le trajet optique Il ne faut pas faire pivoter les filtres pendant le balayage 40 5 9 2 Protection avec les syst mes MP lasers IR La lumi re de tous les lasers VIS plage de longueurs d ondes 400 700 nm spectre visible et lasers UV plage de longueurs d ondes lt 400 nm invisible install s est conduite par un c ble fibres optiques qui assure une protection int grale jusqu ce que la lumi
119. yseur dans la pr paration qu un point d image Objectif plan Classe de correction d un objectif Pour les objectifs de ce type la courbure de champ est corrig e L limination de cette erreur requiert une lentille tr s concave et forte densit m diane Selon le type d aberration suppl mentaire chromatique corrig e on distingue les objectifs planachromatique planapochromatique et plan au fluor ROI Cette abr viation signifie Region of Interest R gion d int r t Une ROI comprend une r gion sur laquelle sera effectu e une exploitation de mesure Une ROI peut de plus caract riser la r gion d int r t d un chantillon devant tre balay e balayage ROI Rapport signal fum e Rapport des signaux qui sont d tect s dans la pr paration par rapport aux signaux ind sirables qui proviennent des divers composants optiques et lectroniques et qui sont aussi capt s par le d tecteur Aberration sph rique Aberration optique due au fait que des rayons lumineux de longueur d onde identique et parall les l axe ne sont pas la m me distance de l axe optique Les rayons lumineux qui traversent la zone ext rieure de la lentille pr sentent une distance focale plus courte que les rayons qui traversent le milieu de la lentille axe optique La loi de Stokes La loi de Stokes est un concept central de la microscopie par fluorescence Si les mol cules fluorescentes sont excit es avec une lumi re d une certaine long

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