SENSITITRE YEASTONE
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1. 11ml de milieu liquide d inoculum YeastOne pour donner un inoculum final de 0 5 5 x 104 cellules souches ml 7 Transf rer 100ul en suivant l une ou l autre de ces m thodes a Autolnoculator Sensititre Remplacer le capuchon du tube par une t te de dosage Sensititre usage unique et inoculer la plaque selon le mode d emploi de l Autolnoculator b Pipette manuelle Verser le milieu liquide dans une cuve d ensemencement st rile et inoculer la plaque l aide d une pipette appropri e Inoculer la plaque l aide du milieu liquide dans les 15 minutes 8 Un contr le du d nombrement des colonies devra tre effectu en retirant 10ul de la cupule de contr le positif et en les montant sur la plaque de g lose dextrose de Sabouraud SDA Un inoculum correct produira 15 80 colonies 9 Couvrir toutes les cupules avec la fermeture adh sive Eviter les plis car ils pourraient entra ner des sauts INCUBATION Au minimum tuver les plaques pendant 24 25 heures 35 C dans une tuve culture sans CO2 LesCryptococcus sp devront tre incub s pendant 72 heures Les Aspergillus sp devront tre incub s pendant 48 72 heures L incubation des temp ratures sup rieures 35 C risque d affecter les performances de ces plaques On peut empiler jusqu 3 plaques si elles ne sont pas tuv es avec le syst me de dosage ARIS 36 LECTURE DES RESULTATS DES TESTS Les plaques peuvent2. s CONTROLE QUALITE La fr quence des tests de contr le qualit devra tre conforme aux directives locales 1 L inoculum devra tre cultiv sur un milieu adapt pour en v rifier la puret Les r sultats des tests ne seront pas valid s si une culture m lang e est d tect e Toutes les plaques sensibles comprennent des cupules de contr le positif Les tests ne sont pas valid s s il ny a pas une croissance distincte dans toutes les cupules de contr le positif 38 Pour le contr le qualit utilisateur du syst me de CMI les cultures suivantes de la collection am ricaine des cultures type American Type Culture Collection ATCC sont recommand es Candida krusei ATCC 6258 Candida parapsilosis ATCC 22019 L ATCC liste maintenant ces organismes sous ssatchenkia orientalis Les r sultats ne devront pas tre report s si les r sultats du contr le qualit ne sont pas dans la plage acceptable Les valeurs de contr le qualit attendues sont fournies dans le Tableau 3 Contacter le distributeur de Sensititre ou TREK Diagnostic Systems au cas o les divergences du contr le qualit ne pourraient tre r solues TABLEAU 3 Plages Fourchettes de la CMI recommand es 24 et 48 heures pour les souches de contr le qualit ug ml Les plages qui diff rent ou additionnelles aux plages de contr le qualit publi es sont soulign es 1 Antifongique Candida krusei C
3. tre lues visuellement sous l clairage normal du laboratoire a l aide d un miroir de lecture pr sentant le dessous des cupules La croissance des levures dans les solutions antifongiques sera mise en vidence par le virage de l indicateur colorim trique de croissance du bleu n gatif au rouge positif Certaines levures peuvent ne pas faire virer compl tement l indicateur au rouge mais entra nent une prise de teinte plus pourpr e de l indicateur Certains organismes peuvent montrer une l g re coloration pourpre dans le posaconazole le voriconazole le fluconazole l itraconazole et le ketoconazole voir les d tails de lecture ci apr s 1 Examiner la cupule de croissance positive apr s 24 heures d incubation Si la cupule de croissance est rouge les points de virage des antifongiques peuvent tre interpr t s Si la cupule est rest e bleue ou seulement vaguement pourpr e re tuver pendant encore 24 heures et re examiner NE PAS LIRE LA TURBIDITE SUR LES PLAQUES YEASTONE SENSITITRE Ne lire que le changement de couleur 2 La CMI repr sentela plus faible concentration d un antifongique qui inhibe substantiellement la croissance de l organisme comme le d tecte le changement de couleur Le degr de changement de couleur dans les cupules contenant l antifongique devra tre compar la couleur des cupules de contr le croissance positive 3 Aucune croissance n est survenue s il ny a pas de virage de l in
4. 8 Linares M J G Charriel F Solis F Rodriquez A Ibarra and M Casal 2005 Susceptibility of filamentous fungi to voriconazole tested by two microdilution methods Journal of Clinical Microbiology 43 250 253 9 Kartsonis N etal 2005 Caspofungin suceptibility testing of isolates from patients with esophageal candidiasis or invasive candidiasis relantionship of MIC to treatment outcome Antimicrobial Agents and Chemotherapy 49 3616 3623 10 Pfaller M A etal 2004 Clinical evaluation of a dried commercially prepared microdilution panel for antifungal susceptibility testing of five antifungal agents against Candida spp and Cryptococcus neoformans Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases 50 113 117 41 11 Pfaller M A A Espinel Ingroff and R N Jones 2004 Clinical evaluation of the Sensititre YeastOne antifungal susceptibility testing of the new triazoles voriconazole posiconazole and ravuconazole Journal of Clinical Microbiology 42 4577 4580 12 Espinel Ingroff A etal 2004 Multicenter comparison of the Sensititre YeastOne colorimetric antifungal panel with the NCCLS M27 A2 reference method for testing new antifungal agents against clinical isolates of Candida spp Journal of Clinical Microbiology 42 718 721 13 Linares M J G Charriel F Solis and M Casal 2004 Comparison of two microdilution methods for testing susceptibility of Candida spp to voriconazole Journal of Clinic
5. de terre Tampon de coton Solution saline st rile Tween 20 0 05 Spectrophotom tre COLLECTE ET PREPARATION DES CHANTILLONS Les chantillons devront tre collect s transport s entrepos s puis mont s sur le milieu d isolement primaire pour obtenir des colonies isol es l aide des proc dures standard 1 S LECTION DU BOUILLON DU TEST DE SENSIBILIT Les performances des bouillons approuv s Sensititre ont t mises l essai de sorte ce qu ils soient utilis s dans des produits de sensibilit Sensititre PROCEDURE D INOCULATION Candida et Cryptococcus sp Une densit finale d organismes d environ 1 5 8 X 10 cellules souches ml est recommand e 1 Pr lever plusieurs colonies bien isol es de plus de 1mm de diam tre dans une culture pure de 24 heures de l isolat de levure et emulsifier dans l eau st rile Agiter la suspension au Vortex pendant 15 secondes en veillant a ce que la suspension soit uniforme S il se produit des agglutinations les laisser se d poser avant d ajuster la densit Ajuster visuellement selon une norme 0 5 McFarland ou en utilisant un n ph lom tre Sensititre 2 Transf rer 20 ul de la suspension dans 11 ml de milieu liquide d inoculum YeastOne pour obtenir un inoculum de 1 5 a 8 X 10 cellules souches ml 35 Les tapes 1 et 2 devront tre r alis es en 15 minutes 3 Transf rer 100ul en suivant l une ou l autre de ces m thodes a Autolnoculat
6. n a pas compl tement vir positive 8 Les performances du voriconazole avec Cryptococcus sp et les esp ces de levures croissance rapide n ont pas t d termin es La CMI du voriconazole ne devra par cons quent tre report e que pour Candida sp 9 Utiliser exclusivement avec un milieu liquide d inoculum de sensibilit des levures agr Sensititre L utilisation d autres milieux liquides pourrait entra ner des erreurs 10 Comme pour toute m thode de tests de sensibilit in vitro les r sultats des tests devront tre corr l s avec la sensibilit clinique du patient la th rapie prescrite 11 Les performances n ont t tablies que pour l Amphot ricine B l Itraconazole le Posaconazole et le Voriconazole sur des esp ces Aspergillus 12 La r f rence 5 a montr un seuil lev gt 99 de concordance avec la m thode CLSI NCCLS pour l amphot ricine B et Aspergillus sp Une concordance inf rieure a t constat e avec l itraconazole A fumigatus A flavus et A terrus ont obtenu gt 90 de concordance tandis que A nidulans a obtenu 85 et A ustus 33 sur des panneaux tuv s pendant 48 heures avec un inoculum de 10 cellules souches ml Une concordance de plus de 90 a t observ e avec un inoculum de 10 cellules souches ml et 72 heures d incubation avec l itraconazole et l amphotericine B 6 13 La corr lation entre la CMI de la caspofungine et le r sultat du traitement apres utilis
7. T EK DIAGNOSTIC SYSTEMS SENSITITRE YEASTONE A utiliser pour le diagnostic in vitro UTILISATION PREVUE Le syst me de sensibilit Sensititre est un produit de diagnostic in vitro destin tester la sensibilit des levures non exigeantes dont Candida sp Cryptococcus sp Aspergilllus sp et diverses autres esp ces de levures a croissance rapide Cette m thode de microdilution en milieu liquide fournit des r sultats qualitatifs et quantitatifs de Concentration Inhibitrice Minimale CMI sous forme d une plaque s che PRINCIPES D UTILISATION Le test de sensibilit des levures Sensititre est un test de microdilution colorim trique Chaque plaque est dos e avec des antifongiques aux dilutions appropri es et avec un indicateur colorim trique Les r sultats sont lus manuellement par l observation de la concentration antifongique la plus basse indiquant l inhibition de la croissance mise en vidence par l absence de changement de couleur TABLEAU 1 Antifongiques et dilutions Antifongique Fourchette de dilutions ug ml PRECAUTIONS Les r sultats devront tre utilis s comme aide la s lection du m dicament retenir pour le traitement Seul un personnel form aux techniques des tests de sensibilit devra utiliser le syst me tant donn que les micro organismes vivants utilis s avec ce produit peuvent tre infectieux pour l utilisateur des m thodes correctes de manipulation et d limina
8. al Microbiology 42 899 902 CLAUSE DE NON RESPONSABILITE Lire le mode d emploi et les r f rences avant d utiliser le produit Tout changement ou modification par rapport aux instructions peut affecter les r sultats TREK Diagnostic Systems ne ne peut tre tenu responsable des dommages r sultant de changements par rapport aux pr cautions donn es ou aux proc dures d entreposage de manipulation ou de tests de la version actuelle des instructions Les informations contenues dans ce document technique sont valables au moment de l impression et peuvent tre modifi es sans notification pr alable Veuillez contacter le distributeur TREK local pour les derni res mises jour Fabricant TREK Diagnostic Systems Limited Imberhorne Lane East Grinstead West Sussex RH19 1QX UK Tel 44 1342 318777 Sensititre YeastOne et SensiTouch sont des marques d pos es de TREK Diagnostic Systems IVD_YO8_F_V1 0 C 42
9. andida parapsilosis ATCC 6258 ATCC 22019 24 heures 48 heures 24 heures 48 heures Posaconazole 0 06 0 5 0 12 1 0 06 0 25 0 06 0 25 Amphot ricine B 0 5 2 0 5 2 0 25 2 0 5 4 Fluconazole 8 64 16 128 2 8 2 8 Itraconazole 0 12 1 0 25 1 0 12 0 5 0 12 0 5 K toconazole 0 12 1 0 25 1 0 03 0 25 0 06 0 5 5 Flucytosine 4 16 8 32 0 12 0 5 0 12 0 5 Voriconazole 0 06 0 5 0 25 1 0 016 0 12 0 03 0 25 Caspofungine 0 12 1 0 25 1 0 25 1 0 5 4 TABLEAU 4 Crit res d interpr tation de la CMI ug ml pour Candida sp Antifongique Sensible selon Sensible la dose Interm diaire R sistant Fluconazole lt 8 16 32 gt 64 Itraconazole lt 0 125 0 25 0 5 gt 1 Flucytosine lt 4 8 16 gt 32 Voriconazole lt 1 2 gt 4 Candida krusei r cup r e de surinfections ne s est pas av r e sensible au fluconazole et peut n cessiter une th rapie antifongique alternative Veuillez vous rapporter au CLSI 1 pour obtenir davantage d informations sur l interpr tation des r sultats 39 LIMITATIONS 1 Les plaques YeastOne Sensititre sont destin es a tre utilis es avec les levures non exigeantes dont Candida sp Cryptococcus sp Aspergillus sp et diverses levures a croissance rapide Elles ne sont pas pr vues pour les levures exigeantes ou a croissance lente telles que Histoplasma ou Blastomyces ainsi que les champignons filamenteux 2 La com
10. ation de la caspofungine n a pas t compl tement tablie 9 14 Les performances de YeastOne avec caspofungine vis a vis des esp ces Cryptococcus et Aspergillus et des esp ces de levures a croissance rapide autres que les esp ces Candida n ont pas t compl tement tablies Les CMI de la caspofungine ne doivent donc tre indiqu es que pour les esp ces Candida 15 Les performances de YeastOne avec Posaconazole vis a vis des esp ces Cryptococcus n ont pas t compl tement tablies 40 RESULTATS Les panneaux sont soit lus manuellement soit con us pour donner des performances comparables celles de la proc dure de microdilution en milieu liquide de r f rence CLSI NCCLS Des r sultats comparables se d finissent comme gt 90 de concordance dans la limite du doublement de la dilution de la CMI de r f rence 1 Pour de plus amples informations contacter TREK Diagnostic Systems ou le distributeur local BIBLIOGRAPHIE 1 Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts M27 National Committee for Clinical Laboratory Standards Villanova PA USA 2 Espinel Ingroff A Pfaller M Messer S A Knapp C C Killian S Norris H A Ghannoun M A 1999 Multicentre comparison of the Sensititre YeastOne Colorimetric Antifungal Plate with the National Committee for Clinical Laboratory Standards M27 A Reference Method for Testing Clinical Isolates of Common and Emerging Candi
11. da spp and other Yeasts and Yeast like Organisms Journal of Clinical Microbiology 37 591 595 3 Espinel Ingroff A Knapp C C Holiday N Killian S 2002 Sensititre YeastOne colorimetric antifungal panel for testing voriconazole against Isolates of Candida spp a comparison with the NCCLS M27 A microdilution reference method Clinical Microbiology and Infection 8 Suppl 1 Abstract 0125 4 Davey K G Szekely A Johnson E M Warnock D W 1998 Comparison of a new commercial colorimetric microdilution method with a standard method for in vitro susceptibility testing of Candida spp and Crytococcus neoformans Journal of Antimicrobial Chemotherapy 42 439 444 5 Meletiadis J Moutin J W Meis F G M Bouman B A Verweij P E and EuroFung Network 2002 Comparison of the E Test and the Sensititre Colorimetric Methods with the NCCLS Proposed Standard for Antifungal Susceptiblity Testing of Aspergillus species Journal of Clinical Microbiology 40 2876 2885 6 Espinel Ingroff A etal 1997 Multicenter Evaluation of Proposed Standardized Procedure for Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi Journal of Clinical Microbiology 35 139 143 7 Pem n J etal 2001 Comparison of the Sensititre YeastOne Colorimetric method against reference M38 P for testing susceptibility of Aspergillus to Amphoteracin B and Itraconazole Clinical Microbiology and Infection 7 Suppl 1 Abstract P694
12. dicateur bleu n importe quelle dilution d un antifongique L organisme est sensible la plus faible concentration de l antifongique 4 La CMI est enregistr e comme la plus faible concentration de l antifongique emp chant le d veloppement d une cupule de croissance rouge ou pourpre c est dire en premier bleue 5 L organisme est r sistant la plus haute concentration de l antifongique quand la croissance est observ e dans les cupules Le point de virage auquel la CMI devrait se trouver est enregistr comme sup rieur gt la plus haute concentration 6 Pour Aspergillus sp lire la CMI comme la plus basse concentration avec une couleur bleue 37 INTERPRETATION DES RESULTATS TABLEAU 2 Illustration et interpr tation des r sultats des tests que l on peut rencontrer Concentration de la cupule ug ml R ROUGE Indication positive de croissance 1 2 4 8 16 B BLEU Indication n gative de croissance Mod le de croissance typique le point de virage de la CMI est 8 ug ml Croissance dans toutes les cupules le point de virage de de la CMI est gt 32 ug ml Aucune croissance dans aucune cupule le point de virage de la CMI est lt 1 ug ml Cupule saut e Le point de virage de la CMI est gt 32 ug ml Ne pas tenir compte du saut si les cupules ont une croissance des deux c t s Si plusieurs sauts devaient se produire dans une colonne les r sultats du test seraient inval
13. id s Double cupule saut e Le test devra tre r p t 1 Avec une technique soigneuse ces v nements sont rares NOTES DE LECTURE Amphot ricine B Pour l amphot ricine B 24 heures les points de virage se d finissent en g n ral facilement et la CMI est lue comme la plus faible concentration en m dicament emp chant tout changement de couleur discernable On ne rencontre pas habituellement de points de virage diffus avec l amphot ricine B Flucytosine et antifongiques Azole Candida albicans C glabrata et C tropicalis avec la flucytosine et les azoles tels que le fluconazole l itraconazole le k toconazole le voriconazole et le posaconazole peuvent donner des points de virage en g n ral moins tranchants en raison de la croissance diffuse et peuvent constituer une source significative de variabilite La diffusion se caract rise par un l ger changement de couleur et elle est souvent identique pour toutes les concentrations du m dicament sup rieures a la CMI La CMI devra tre lue comme la premi re cupule montrant un virage moins intense compar la cupule de contr le croissance positive Les souches de r f rence de la sensibilit d finie peuvent galement aider former le personnel Les isolats de Candida krusei sont suppos s tre intrins quement r sistants au fluconazole et leur CMI ne devra pas tre interpr t e 1 un commentaire devra accompagner les r sultats des tests rapport
14. or Sensititre Remplacer le capuchon du tube par une t te de dosage Sensititre usage unique et inoculer la plaque selon le mode d emploi de l Autolnoculator b Pipette manuelle Verser le milieu liquide dans une cuve d ensemencement st rile et inoculer la plaque l aide d une pipette appropri e Inoculer la plaque l aide du milieu liquide dans les 15 minutes 4 Un contr le du d nombrement des colonies devra tre effectu en retirant 10ul de la cupule de contr le positif et en les montant sur la plaque de g lose dextrose de Sabouraud SDA Un inoculum correct produira 15 80 colonies 5 Couvrir toutes les cupules avec la fermeture adh sive Eviter les plis car ils pourraient entra ner des sauts PROCEDURE D INOCULATION Aspergillus sp 5 7 1 Extraire une sous culture de la g lose a dextrose de Sabouraud vers la g lose a dextrose de Takashio ou de pomme de terre Etuver pendant 7 jours a 35 C pour obtenir une sporulation ad quate 2 Collecter les conidies l aide d un tampon de coton et les suspendre dans la solution saline st rile Tween 3 Laisser les particules lourdes se d canter pendant 3 5 minutes 4 Collecter le surnageant et agiter l aide d un agitateur Vortex 5 Ajuster la turbidit du surnageant entre 80 et 82 de facteur de transmission 530nm mesur avec un spectrophotom tre quivalent un inoculum de 0 6 5 x 10 cellules souches mi 6 Ajouter 100u
15. paraison entre la plaque YeastOne Sensititre 24 heures et la m thode de r f rence CLSI NCCLS a 48 heures a t valu e Cependant en raison de la difficult corr ler les points de virage des organismes diffus C albicans 48 heures d incubation des taux d erreur lev s sont observ s 3 Les tests sur les champignons et les antifongiques sont par essence moins pr cis que les tests bact riologiques 4 Certains chercheurs pensent que la lecture 24 heures est plus appropri e que la lecture 48 heures en raison du probleme de diffusion de certains isolats La norme CLSI NCCLS officielle indique que les lectures devront tre accomplies 48 heures Sous r serve qu assez de donn es soient collect es et analys es la question du d lai de lecture le plus pertinent au plan clinique reste sans r ponse Le compte rendu des r sultats devra indiquer clairement les d lais de lecture 5 titre de guide suppl mentaire il est conseill d tudierla norme CLSI NCCLS M27 des sensibilit s aux antifongiques 6 Le changement de couleur est indicateur du point de virage non de la turbidit Ce fait att nue certaines des principales inqui tudes li es l interpr tation de certaines esp ces de Candida en raison de la diffusion La diffusion s observe plus couramment sur les isolats autres que sanguins et ceux d autres fluides corporels st riles 7 Ne pas lire 24 heures si la cupule de contr le
16. tion doivent tre suivies STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION Les plaques devront tre entrepos es temp rature ambiante 15 25 C loin de l exposition directe aux rayons du soleil et la chaleur Chaque plaque est emball e dans 34 une feuille contenant du gel de silice d shydratant Ne pas utiliser la plaque ou le bouillon si la date limite est d pass e si la couleur du dessiccatif n est pas bleue ou si l enveloppe en aluminium est endommag e Inoculer la plaque dans les 5 heures qui suivent sa sortie du sachet PROCEDURE Mat riel fourni Plaque de sensibilit YeastOne Fermeture adh sive Mat riel n cessaire non fourni code produit TREK Eau d min ralis e Sensititre T3339 Milieu liquide d inoculum de sensibilit des levures Sensititre Y3462 T tes de dosage Sensititre utiliser avec Autolnoculator E3010 Autolnoculator Sensititre SensiTouch Sensititre Visionneuse manuelle Norme de turbidit 0 5 McFarland E1041 Anse bact riologique Pipette 20ul R servoir d inoculum st rile Pipettor 100ul et embouts jetables Souches de contr le qualit Plaques de milieu de culture fongique l agar agar par ex g lose a dextrose de Sabouraud SDA Etuve culture 34 36 C sans CO2 Agitateur Vortex Documents actuels du CLSI NCCLS Commission nationale de normes de laboratoires d analyses m dicales Aspergillus sp uniquement G lose dextrose de Takashio ou de pomme
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