B27 - Immucor, Inc.
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1. 2 de r actions irr guli res Une comparaison des r sultats obtenus avec les plaques de typage HLA et ceux obtenus par la m thode de typage l ADN ont d montr une concordance de 97 4 La sensibilit et la sp cificit du produit en lui m me ne peuvent tre d termin es par contre la sensibilit et la sp cificit de chaque antis rum inclus dans la plaque sont fournies sur le tableau d analyse des antis rums Une r activit positive correspond une lyse cellulaire de 50 ou plus caus e par les anticorps contenus dans l antis rum Les parenth ses indiquent les sp cificit s pouvant tre prises en compte pour une r activit positive La sp cificit de chaque antis rum t confirm e avec un panel de 50 cellules congel es par un laboratoire ind pendant accr dit par l American Association of Blood Banks et l American Society for Histocompatibility Immunogenetics ASHI ainsi qu avec un panel 75 chantillons frais repr sentant divers groupes ethniques ou un panel d environ 125 chantillons frais repr sentant divers groups ethniques Le tableau d analyse des antis rums est un r sum de ces r sultats REFERENCES 1 Histocompatibility Testing 1980 Report of an International Workshop and Conference Los Angeles 1980 Ed Terasaki P I Los Angeles CA UCLA Tissue Typing Laboratory UCLA 2 Histocompatibility Testing 1984 Report of the Ninth International Histocompatibility2. Edda Tai 4 PERFORMANCES an aKa 2 a ie a in 5 R F RENCES 5 LIFECODES Typing Tray B27 1 303390 IFUFR REV INTRODUCTION Les plaques de typage sont utilis es pour d terminer la pr sence ou l absence d antig nes HLA la surface des lymphocytes en technique de microlymphocytotoxicit compl ment d pendante COMPOSITION DU COFFRET SOMMAIRE La caract risation des antig nes B 27 peut tre utilis e pour l valuation des patients applicable pour les tudes d association avec les maladies Tous les antis rums sont identifi s par des tests s rologiques utilisant des panels de cellules fra ches et congel es connues B27 deux tests par plaque peuvent tre ex cut s B27 contient 2 x 22 puits d antis rums sp cifiques d origine humaine ainsi qu un contr le n gatif et un contr le positif Le contr le positif puits et 9 est un anticorps de lapin anti lymphocyte humain Le contr le n gatif puits 1B et est un pool de s rum d hommes sains de groupe et transfus s Ce puits ne donne aucune r activit cytotoxique PRINCIPE DU TEST Les lymphocytes viables tester sont incub s en pr sence d antis rums sp cifiques et de compl ment de lapin Si les antig nes pr sents la surface la cellule correspondent aux anticorps pr sents dans l antis rum il aura une lyse cellulaire La mort des cellules sera observ
3. Workshop Munich and Vienna 1984 Eds Albert E D Baur Mayr W R 3 Topics Clinical Histocompatibility Testing Vol 1 Schacter B In Chief 1979 American Association for Clinical Histocompatibility Testing 4 Manual of Tissue Typing Techniques 1979 Ed Ray J G NIAID National Institutes of Health Bethesda MD 20205 Publ 80 545 5 Miller W V and Rodey G 1981 Without Tears Chicago Educational Products Division ASCP 6 Mittal K K Standardization of the HLA Typing Methods and Reagents Vox Sang 34 58 63 1978 7 Microdroplet Testing for HLA A B and D Antigens American Journal of Clinical Pathology Volume 69 Number 2 February 1978 pages 103 120 8 Rodey G E 2000 HLA Beyond Tears 274 edition Colorado De Novo Inc Immucor GTI Diagnostics Inc Immucor Medizinische Diagnostik GmbH 20925 Crossroads Circle Adam Opel Strasse 26 Waukesha WI 53186 USA Rodermark 63322 Germany US and International Contact Information Technical Support waukeshatechsupport immucor com wWww immucor com 1985 2015 Immucor GTI Diagnostics Inc 303390 IFUFR Rev 2015 06 01 Typing Tray B27 5 303390 1 0 REV F
4. action 12 Laisser les cellules s dimenter pendant 5 10 minutes avant de couvrir les puits avec une lamelle de 75 x 50 mm 13 S ils ne sont pas lues imm diatement ranger les plaques dans le r frig rateur avant de les lire pour r duire la formation de bulles 14 Placer la plaque sur un microscope contraste de phase et examiner chaque puits Lire la plaque de gauche droite et de droite gauche suivant le sch ma du tableau de r sultats B27 de de 2F 2 etc Typing Tray B27 3 303390 1 0 REV F 15 Noter les r actions observ es dans le tableau de r sultats B27 fourni CONTROLE QUALIT a Le contr le positif se trouve dans les puits 1A et 9A pour la plaque B27 Le test est valid s il y a plus de 51 de cellules mortes par rapport au contr le n gatif b Le contr le n gatif se trouve dans les puits 1B et 9B pour la plaque B27 Les lymphocytes ne doivent pas tre d truits par le s rum dans ce puits afin que la limite de viabilit de la pr paration lymphocytaire puisse tre d termin e par la r action La viabilit doit tre comprise entre 0 et 20 pour que le test soit valid Les autres r actions de la plaque sont enregistr es par l valuation de la viabilit en comparaison avec ce contr le n gatif RESULTATS INTERPRETATION La lyse cellulaire doit se produire dans les puits pour lesquels l antig ne de surface pr sent sur les lymphocytes tester e
5. gard temp rature ambiante avant tout isolement des lymphocytes qui doit tre effectu rapidement dans les 24 48 heures suivant le pr l vement Pr l vement l ACD Le sang ACD doit tre gard temp rature ambiante avant tout isolement des lymphocytes qui doit tre effectu rapidement dans les 24 48 heures suivant le pr l vement Une contamination excessive par des plaquettes peut masquer la r action lymphocytaire ou causer de fausses r actions n gatives La proc dure d crite est le protocole recommend L utilisateur peut tablir des variations de la proc dure fluorescence temps d incubation concentration cellulaire cependant l utilisateur est responsable pour d terminer que ces protocoles sont acceptables avec les plaques de typage des antig nes HLA Mat riel n cessaire fourni Plaque de typage des antig nes HLA Typing Tray Tableaux de r sultats A copier si n cessaire Tableau d analyse des antis rums Microtubes de compl ment de lapin ABC Complement Materiel n cessaire non fourni 1 S rum de veau foetal 5 Dans un milieu de culture de lymphocytes 2 Seringue de 0 05 permettant de distribuer en r p tition un volume de 1 ul 3 Seringue de 0 25 ml permettant de distribuer en r p tition un volume de 5 ul 4 Seringue de 1 avec 6 embouts permettant de distribuer en r p tition un volume de 3 3 5 Lame
6. MODE D EMPLOI IMMUCOR LIF CODES LIFECODES Typing Tray Plaque de typage des antig nes HLA B27 B27 B27 IVD 0088 4 65 TABLE DES 5 annee entente ne ae Eee te ie 2 COMPOSITION DU COFFRET 5 2 PRINCIPE DU TEST 2 44 722 2 CONSERVATION PRECAUTIONS 2 PRECAUTIONS arrora 2 EEE 2 MODE 3 Mat riel n cessaire fourni ii 3 Materiel n cessaire non eee ect en 3 POC A 3 CONTROLE QUALIT rer e 4 RESULTATS ET INTERPRETATION asioinnin nnna AAE AENEA 4 LIMITES D LA TECHNIQUE Eed aaa aaa
7. e sous microscope contraste de phase apr s ajout d osine colorant La capacit de d tection des antig nes de chaque antis rum est pr cis e sur le tableau d analyse inclus dans chaque lot de r actif Un individu ayant des antig nes de surface HLA B27 devrait r agir de fa on positive avec l antis rum anti B27 Quelques antis rums r agissant commun ment de fa on crois e sont inclus et devraient tre n gatifs moins que cet individu exprime galement un de ces antig nes Cw1 Cw2 peuvent tre positifs cause du d s quilibre de la liaison avec B27 Une r action n gative pour Cw1 ou 2 n limine pas la pr sence de 27 Des patrons de r actions typiques sont inclus dans le tableau de r sultats COMPOSITION DU COFFRET Plaque de typage B27 403969 44 antis rums plus contr les Compl ment 403945 compl ment de lapin non toxique pour les lymphocytes normaux 2 0 5 min rale Les antis rums de plaque sont recouverts d une huile min rale afin de pr venir l vaporation CONSERVATION ET PRECAUTIONS D EMPLOI Ne pas diluer de r actifs Aucune composante du coffret besoin d tre dilu plaques et le compl ment se conservent une temp rature lt 65 C jusqu la date de p remption indiqu e sur l tiquette Ne pas utiliser de r actifs ayant pass la date de p remption D congeler les plaques et le compl ment temp ratu
8. lles 75 x 50 mm 6 Eosine Y 5 g pour 100 d HBSS Filtrer travers du papier Whatman 1 7 Formald hyde ajouter 2 de rouge de ph nol 0 5 500 de formald hyde 10 Ajuster pH 7 2 avec de l acide chlorhydrique concentr 8 Microscope contraste de phase Proc dure 1 Pr parer les cellules selon les proc dures pour les tests de lymphocytotoxicit tablis dans le laboratoire utilisateur 2 D terminer si la viabilit cellulaire est acceptable pour le test La viabilit des lymphocytes doit tre au moins de 85 3 Ajuster la concentration de cellules 2 x 10 ml avec le de s rum foetal 5 4 Sortir la plaque du cong lateur et la laisser au moins 15 minutes la temp rature ambiante l utiliser dans les 30 minutes suivant le d but de la d cong lation 5 A l aide de la seringue de 0 05 d poser avec pr caution 1 ul d une suspension de 2 x 10 lymphocytes par ml juste en dessous de l huile Assurez vous que les cellules et les antis rums soient bien m lang s 6 Incuber la plaque 30 minutes 20 25 C 7 A l aide de la seringue de 0 25 ajouter 5 ul de compl ment de lapin dans chaque puits 8 Incuber la plaque 1 heure 20 25 C 9 A l aide de la seringue de 1 ajouter 3 3 ul 5 dans chaque puits 10 Incuber la plaque 5 minutes 20 25 11 Ajouter 6 6 ul de solution tamponn e de formald hyde dans chaque puits pour arr ter la r
9. n s peuvent appara tre plusieurs tapes Ceux ci sont rassembl s suivant les tapes du mode op ratoire a Identification cellulaire Lorsque plusieurs chantillons sont test s en m me temps les erreurs suivantes peuvent appara tre pendant l isolement le test 1 Interchanger les cellules 2 Tester une cellule 2 fois et en oublier une autre 3 M langer 2 chantillons pendant l isolement b Isolement cellulaire La pr paration des lymphocytes doit tre la plus pure possible Une contamination cellulaire peut causer les probl mes suivants 1 Une contamination rythrocytaire peut provoquer une lecture difficile au microscope suite une confusion avec les lymphocytes De plus les rythrocytes peuvent puiser le compl ment n cessaire la r action lymphocytotoxique 2 Une contamination plaquettaire peut absorber les anticorps ainsi que le compl ment provoquant de fausses r actions n gatives 3 Une contamination granulocytaire peut provoquer de fausses r actions positives dues au phagocytage de l osine 4 La concentration cellulaire est aussi importante car le test est standardis selon un certain rapport antig ne anticorps Une concentration cellulaire lt 2 x 10 lymphocytes peut produire de fausses r actions positives alors qu un exc s gt 2 10 lymphocytes peut induire de fausses r actions n gatives c Ajout de lymphocytes Etant donn que l ajout de lymphocytes dans les
10. puits peut se faire rapidement plusieurs erreurs peuvent se produire Erreur dans le m lange des lymphocytes avec les antis rums cause fr quente de r actions n gatives 1 2 Saut d un puits ou d une rang es de puits 3 Transport d un antis rum d un puits l autre avec la seringue Typing Tray B27 4 303390 1 0 REV F d Lecture au microscope Cette tape est la source principale d erreurs d inattention telles que lire la plaque dans le mauvais sens encore erreurs lors de l enregistrements des r sultats Il est essentiel d avoir un microscope contraste de phase parfaitement adapt afin de bien diff rencier les cellules mortes et vivantes e Temp rature La lymphocytotoxicit est d pendante de la temp rature Une temp rature de 20 25 est requise pour effectuer l analyse Compl ment Le compl ment de lapin doit tre non toxique pour les lymphocytes normaux Il est recommand de le manipuler avec pr cautions doit tre compl tement d congel m lang doucement NE PAS recongeler le compl ment de lapin Une contamination bact rienne des r actifs ou des pr parations lymphocytaires peut provoquer de fausses r actions n gatives PERFORMANCES Lorsque bien conserv e et utilis e selon le mode op ratoire d crit ci dessus la plaque de typage HLA B27 d tectera les antig nes HLA B27 Des tudes de reproductibilit ont d montr la pr sence de moins
11. re ambiante pendant 15 minutes et les utiliser dans les 30 minutes suivant le d but de la d cong lation Ne pas recongeler pas conserver les plaques dans la glace s che une fois le sac herm tique ouvert PRECAUTIONS mat riel d origine humaine utilis dans la pr paration des plaques a t test et trouv n gatif concernant les anticorps anti VIH 1 2 l h patite C et l antig ne HBs mais doit cependant tre manipul comme un produit potentiellement infectieux Certains antis rums pr sents dans les plaques contiennent 0 1 d azide de sodium PRECAUTIONS L acide de sodium r agit avec le plomb et le cuivre de la plomberie pour former des m taux acides hautement explosifs Lorsque a coul dans l vier il est recommand de rincer avec beaucoup d eau pour viter la concentration d acide L acide de sodium est un poison toxique si ing r Disposer de toutes les composantes de la trousse selon les r glements locaux ECHANTILLONS Les chantillons de sang p riph rique pr lev s dans de l h parinate de sodium ou de ou bien des cellules ayant t cryopr serv es selon une technique acceptable peuvent tre utilis s pour ce test Typing Tray B27 2 303390 1 0 REV F Pr l vement l h parinate de sodium Pr lever 10 de sang dans 1000 unit s d h parinate de sodium ou dans un Vacutainer bouchon vert Le sang h parin doit tre
12. t les anticorps pr sents dans les antis rums correspondent En utilisant un microscope contraste de phase les cellules vivantes apparaissent brillantes et r fractiles alors que les cellules mortes peuvent appara tre un peu plus larges et tach es de noir par l osine L osine la concentration utilis e est efficace seulement avec un microscope contraste de phase Sans ce contraste de phase les cellules mortes ne peuvent pas appara tre suffisamment noires pour permettre une distinction correcte Parce que le gon flement des cellules mortes augmente avec l addition de l osine il est important de permettre au colorant de p n trer les cellules mortes pendant exactement 5 minutes avant l addition du formald hyde Les r sultats sont not s de 1 8 suivant le pourcentage de cellules mortes observ es larges noires et non r fractiles pr sentes dans chaque puits 8 81 100 de cellules mortes 6 51 80 de cellules mortes 4 21 50 de cellules mortes 21 1 0 O n 1 20 de cellules mortes 10 de cellules mortes on lisible Suite l enregistrement des r sultats comparer les r actions positives aux sp cificit s contenues dans chaque puits Les r actions positives se produisent lorsque les antig nes sur les lymphocytes correspondent aux anticorps pr sents dans les antis rums Identifier les antig nes pr sents dans la pr paration lymphocytaire test e LIMITES DE LA TECHNIQUE Des r sultats erro
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