Isolement automatisé d`ADN génomique à partir d`échantillons de
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1. chantillons compatibles Les m thodes pr sent es dans ce document sont pr vues pour le traitement d chantillons de couches leucocytaires pr par s partir de 2 5 10 ml de sang total Le sang peut tre pr lev en pr sence de la plupart des anticoagulants couramment utilis s Les chantillons peuvent tre frais ou congel s mais les chantillons de couches leucocytaires doivent tre pr par s partir de sang non congel pour maximiser le rendement en leucocytes Des chantillons pr par s partir de sang de qualit non optimale peuvent tre trait s cependant la quantit et la qualit de l ADN isol peuvent tre compromises selon les conditions sp cifiques Veuillez contacter le service technique de Promega pour toute question au sujet des types d chantillons compatibles l adresse suivante techserv promega com 3 B Options de traitement des chantillons Les chantillons sont trait s l aide de tubes coniques standard de 50 ml pr charg s dans l appareil HSM Si vous ne souhaitez pas transf rer les chantillons manuellement le syst me peut les transf rer automatiquement partir de tubes de 2 ml bouchons viss s par ex Sarstedt R f 72 609 Le temps de traitement total est prolong d environ 20 minutes quand le transfert automatis des chantillons est s lectionn Les chantillons peuvent au besoin tre trait s la RNase A r actif facultatif achet s par ment 3 C Op2. ses besoins 2 Composants du produit et conditions de stockage PRODUIT R F ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System A1751 R serv la recherche Chaque syst me contient assez de r actifs pour 96 purifications chacune partir d un maximum de 10 ml Comprend 23ml Solution de prot inase K PK 130 ml Prot ase alcaline Alkaline Protease APA e 1020ml Tampon de lyse cellulaire Cell Lysis Buffer CLD e2x765ml Tampon de liaison Binding Buffer BBA 115ml R sine ReliaPrep 3x815ml Tampon de lavage Wash Buffer WBA e2x150ml Eau sans nucl ases PRODUIT R F ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System A2751 R serv la recherche Chaque syst me contient assez de r actifs pour 96 purifications chacune partir d un maximum de 10 ml Comprend 23ml Solution de prot inase K PK 130 ml Prot ase alcaline Alkaline Protease APA e 1400ml Tampon de lyse cellulaire Cell Lysis Buffer CLD e 1600ml Tampon de liaison Binding Buffer BBA 115 ml R sine ReliaPrep e 3500mI Tampon de lavage pr par Prepared Wash Buffer WBC e4x150ml Eau sans nucl ases Conditions de stockage stocker le ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System temp rature ambiante 15 30 C Ne pas r frig rer ou congeler les r actifs Entre utilisations stocker les r actifs de la plateforme recouverts ou ferm s temp rature ambiante Remarque po
3. EP049 R vis 8 13 4 C tapes de purification Facultatif transfert des chantillons partir de tubes V rification automatique du volume des chantillons et calcul du volume des r actifs Le HSM agite les chantillons 500 tours min lorsque chaque r actif est ajout De la prot inase K 60 ul est ajout e chaque tube Facultatif de la RNase A 60 ul est ajout e chaque chantillon De la Prot ase alcaline 375 ul est ajout e chaque chantillon Du Tampon de liaison 3 ml est ajout chaque chantillon D S ON ED RE Se ES Apr s l ajout de Tampon de lyse les chantillons sont incub s 65 C pendant 30 minutes sous agitation 500 tours min suivi par une p riode de 10 minutes d agitation 500 tours min sans chaleur Pendant ce temps la r sine ReliaPrep est maintenue en suspension par m lange intermittent avec un c ne 9 Du Tampon de liaison 3 6 ml est ajout chaque chantillon 10 La r sine ReliaPrep est compl tement remise en suspension et un volume de 300 ul de r sine est ajout chaque chantillon La liaison des acides nucl iques la r sine s effectue en incubant les chantillons pendant 20 minutes sous agitation 550 tours min puis la r sine est recueillie l aide d un aimant pendant 20 minutes 11 Les d chets provenant de la lyse et de la liaison sont retir s de chaque tube Apr s limination des d chets 1 ml de Tampon de lavage pr
4. luat final L ADN tait d grad avant la proc dure de purification Si l ADN tait d grad avant la purification l ADN r sultant le sera galement Les solutions concentr es d ADN peuvent tre visqueuses Il peut tre n cessaire de prolonger le temps de capture de la r sine ReliaPrep pour ces solutions visqueuses liminez la r sine r siduelle de l ADN lu en effectuant la centrifugation comme indiqu M diocre puret de l ADN Une m diocre puret de l ADN observ e par les rapports spectroscopiques ou dans les analyses en aval est souvent le r sultat d un retrait incomplet du lysat Tout ajustement physique du syst me robotique peut influencer l efficacit du retrait du lysat Contactez le service technique l adresse techserv promega com avant de tenter d ajuster le syst me robotique Message d erreur de l appareil Si le syst me signale un volume insuffisant dans un bac de r actif v rifiez que le type de bac utilis est ad quat et ajoutez du r actif au bac Si vous observez d autres erreurs contactez le service technique de Promega Notez le message d erreur pr cis et l heure Vous aurez besoin des fichiers de rapport d taill s EVOware enregistr s sous C ProgramData Tecan EVOware AuditTrail log Les fichiers de rapport utilisent la convention de d nomination suivante EVO_aaaammjj_hhmmss log la date et l heure correspondent la cr ation du fichier Prome
5. nucl ases est ajout chaque tube Les chantillons sont agit s 500 tours min pendant 3 minutes puis 400 tours min pendant 15 minutes 70 C Une capture magn tique est effectu e pendant 5 minutes puis les luats sont transf r s la plaque interm diaire Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 EP049 R vis 8 13 www promega com 4 C tapes de purification suite Promega 17 Si l option de transf rer les chantillons dans une plaque ou des tubes finaux a t s lectionn e un message s affiche pour demander l utilisateur de centrifuger la plaque interm diaire 2 500 x g pendant 20 minutes afin d liminer les particules r siduelles 18 La plaque interm diaire est replac e dans l appareil puis les luats sont transf r s aux tubes finaux ou la plaque finale 19 La m thode est termin e 5 R sultats du d veloppement Les donn es d crites ci dessous sont repr sentatives de plusieurs groupes de donn es obtenues au cours du d veloppement Le traitement de tous les chantillons pr sent s a t d marr dans des tubes de 50 ml Les luats obtenus ont t laiss s sur la plaque interm diaire pour l analyse 5 A Rendement de la purification automatis e La quantit d ADN obtenue avec le syst me de purification automatis de l ADN ReliaPrep pr sent
6. par est ajout aux tubes Cette tape est r p t e jusqu ce que tous les d chets aient t limin s de tous les tubes et le tampon de lavage ajout 12 Les chantillons sont agit s 500 tours min pendant 2 minutes 13 Apr s agitation les chantillons sont m lang s en pipetant pour disperser compl tement la r sine Ensuite l appareil ajoute sous agitation un volume suppl mentaire 4 3 ml de Tampon de lavage pr par Les chantillons sont agit s 500 tours min pendant 2 minutes puis 700 tours min pendant 2 minutes de plus Apr s cette tape la r sine est captur e pendant 3 minutes 14 Les d chets du premier lavage sont limin s de chaque tube puis 1 ml de Tampon de lavage pr par est ajout aux chantillons Ensuite l appareil ajoute sous agitation un volume suppl mentaire 4 3 ml de Tampon de lavage pr par Les chantillons sont agit s 500 tours min pendant 2 minutes puis 700 tours min pendant 2 minutes de plus Les chantillons sont ensuite soumis une capture magn tique pendant 3 minutes 15 Les d chets du deuxi me lavage sont limin s de chaque tube puis un volume de 4 3 ml d thanol 50 est ajout aux chantillons Les chantillons sont agit s 500 tours min pendant 4 minutes Les chantillons sont ensuite soumis une capture magn tique pendant 3 minutes 16 Tous les d chets sont limin s colonne par colonne et le volume calcul d eau sans
7. promega com 4 A Mat riaux suppl mentaires En plus des r actifs fournis par Promega d autres mat riaux et r actifs doivent tre pr par s et fournis par l utilisateur thanol 50 combiner un volume gal d thanol 95 100 de qualit USP ACS ou biologie mol culaire de l eau de qualit biologie mol culaire M langer Remarque l utilisation d alcool d natur contenant du m thanol ou de l isopropanol peut r duire le rendement en ADN et sa qualit e WBA pr par pour R f A1751 ajouter 150 ml d thanol 50 pr par ci dessus chaque bouteille enti re de Tampon de lavage WBA Bien m langer avant l emploi Remarque si la configuration de votre kit R f A2751 comporte du Tampon de lavage pr par WBC ne pas ajouter d thanol avant utilisation 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 EP049 R vis 8 13 www promega com Promega 4 A Mat riaux suppl mentaires suite Hydroxyde de sodium 100 mM pr parer au moins 300 ml d hydroxyde de sodium 100 mM dans de leau d ionis e pour chaque s rie d chantillons Ce r actif est utilis pour nettoyer le syst me par ex Fisher R f ss276 4 RNase A facultatif pr parer un stock de RNase A 4 mg ml Promega propose de la RNase A R f A7974 pr par e la concentrati
8. 5 4 C tapes de purification iii 6 5 R sultats du d veloppement ses Rss sssnsns ete s s sesn nest tien ssnsss eide 7 5 A Rendement de la purification automatis e 7 5 B Contr le de contamination crois e 6 D pannage ssssssessosssssosssssssssssssossssscssessossossosee EE R EE 8 7 Produits associ s E I I T 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com EP049 R vis 8 13 Promega 1 Description L appareil Tecan Freedom EVO HSM workstation permet d automatiser l isolement d ADN g nomique ADNg partir d chantillons de couches leucocytaires et utilise la formulation chimique du ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System Le protocole automatis est pr configur tout en offrant la flexibilit n cessaire pour r pondre aux besoins des applications g nomiques haut d bit Le syst me est capable de traiter nimporte quelle combinaison de volumes d chantillons dans la gamme enti re de volume de d part pour cette m thode Les r actifs sont automatiquement ajust s en fonction du volume des chantillons individuels L utilisateur n a qu pr ciser le nombre d chantillons traiter et le volume d lution souhait Des options suppl mentaires permettent l utilisateur de personnaliser la proc dure de purification de l ADN pour r pondre
9. PROTOCOLE AUTOMATIS Isolement automatis d ADN g nomique partir d chantillons de couches leucocytaires l aide de l appareil Tecan Freedom EVO HSM Workstation Mode d emploi des produits A1751 et A2751 Isolement automatis d ADN g nomique partir d chantillons de couches leucocytaires l aide de l appareil Tecan Freedom EVO HSM Workstation Toute la documentation technique est disponible l adresse www promega com protocols Veuillez consulter ce site Internet pour v rifier que vous utilisez la version la plus jour de ce protocole automatis Si vous avez des questions sur l utilisation de ce syst me veuillez contacter le service technique de Promega l adresse techserv promega com 1 Description essences PE LIMIT ART 2 2 Composants du produit et conditions de stockage ssssssssssssssossosssssossssssscssossossossoseoe 2 3 Avant de commencer I ET 3 3 A Types d chantillons compatibles 3 3 B Options de traitement des chantillons sd 3 C OPDHONS T UHON inner E TEE EE E Rene 3 3 D Quantification et valuation de l ADN rene rrrrnrrresresrnesseesneennee 4 4 Traitement automatis ssssesssseseeseoseee RE le LE LL TS 4 4 A Mat riaux suppl mentaires ss sssscsssrreersseessessesenessencrnrisssssretessnse te ataia n EaD Sea kastaa in 4 4 B Proc dure de purification de VPADN sissssisssisressscsssrsiccsnaaiessssisiisisieassassssiraenaniasta sosiaa oenas
10. e un rapport lin aire avec le volume initial de l chantillon tout au long de la plage recommand e de volume de d part Les chantillons pr sent s la Figure 1 proviennent d un seul donneur Chaque chantillon a t trait l aide du syst me automatis ReliaPrep Rendement moyen pg 300 250 4 200 4 150 100 4 50 Rendement moyen pg Rapport 260 280 moyen a Rapport 260 230 moyen 4 6 8 Volume initial de sang ml 10 12 2 0 1 0 Rapport d absorbance 11880MA Figure 1 Rendement en ADN par la proc dure automatis e en fonction du volume de d part Les chantillons de couches leucocytaires ont t pr par s partir d un seul donneur Chaque point est la moyenne de quatre r plicats et les barres d erreur repr sentant un cart type Rendements en ADN d termin l aide du spectrophotom tre NanoDrop Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com EP049 R vis 8 13 Promega 5 B Contr le de contamination crois e Ce syst me int gr utilise une s rie d tapes de nettoyage pour faire en sorte que les constituants entrant en contact avec les chantillons et partag s entre ceux ci ne pr sentent pas de risque de contamination crois e Pour une description d taill e des m thodes utilis e
11. eliaPrep_Buffy_HSM_2_0_v1 0 et suivez les instructions de l interface graphique TouchTools pour s lectionner tous les param tres du traitement L interface vous guidera tout au long de la configuration du syst me avant le d marrage du traitement Une fois toutes les informations saisies le syst me commencera la proc dure de purification Il n y aura plus d autres informations saisir jusqu la fin de la m thode sauf en cas de probl me au cours du transfert de la d tection des chantillons ou de l aspiration sous vide En cas de probl me reportez vous la section Traitement des erreurs du Manuel technique de l appareil Tecan Freedom EVO HSM Workstation n TM402 Apr s l lution il vous sera demand de centrifuger la plaque interm diaire Cette tape est n cessaire afin d liminer les particules de r sines r siduelles pr sentes dans les luats Si vous avez choisi de laisser vos chantillons dans la plaque interm diaire ce message ne s affichera pas et la m thode sera alors termin e La plaque doit tre centrifug e avant toute manipulation suppl mentaire l issue de la purification le syst me vous demandera de retirer vos chantillons d teindre la pompe vide et de stocker les r actifs restants de la plateforme Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis 5 Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 wWww promega com
12. ga Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com EP049 R vis 8 13 Promega 7 Produits associ s PRODUIT CONDITIONNEMENT R F Appareil HSM 2 0 1 pi ce A2715 Solution de RNase A 5 ml A7974 Solution tampon TE 20X pH 7 5 25 ml A2651 Tecan Freedom EVO HSM Workstation Contacter Promega Prot ase alcaline Alkaline Protease APA 130 ml A1721 Tampon de lyse cellulaire Cell Lysis Buffer CLD 1 400 ml A1731 Tampon de liaison Binding Buffer BBA 1 600 ml A1741 R sine ReliaPrep 115 ml A1752 Tampon de lavage Wash Buffer WBA 130 ml A2681 Solution de prot inase K PK 23 ml A5051 Eau sans nucl ase 500 ml P1197 1 000 ml P1199 Tampon de lyse tissulaire Tissue Lysis Buffer TLA 500 ml A5091 Bouteille pour thanol 50 1 pi ce A2691 2013 Promega Corporation Tous droits r serv s QuantiFluor et ReliaPrep sont des marques de commerce de Promega Corporation TouchTools est une marque d pos e de Tecan AG Corporation EVOware et Freedom EVO sont des marques d pos es de Tecan AG Corporation NanoDrop est une marque d pos e de Thermo Fisher Scientific Tous les prix et toutes les caract ristiques sont sujets modification sans avis pr alable Les d clarations relatives aux produits sont sujettes modification Veuillez contacter le se
13. llez discuter des r cipients finaux requis avec le technicien 3 D Quantification et valuation de l ADN La qualit et la concentration de l ADN peuvent tre d termin es de diverses mani res notamment par spectrophotom trie l aide de colorants fluorescents par lectrophor se sur gel et par PCR quantitative Des rapports font tat du fait que diff rentes m thodes de quantification de l ADN donnent souvent des valeurs absolues in gales Nous vous recommandons d utiliser une m me m thode pour d terminer la qualit et la quantit de l ADN tout au long de votre proc dure c d utiliser une m me m thode pour quantifier l ADN purifi et pour d terminer la quantit d ADN utiliser dans vos applications d aval Tout au long de ce document des r sultats de la m thode de spectrophotom trie NanoDrop sont pr sent s 4 Traitement automatis L appareil Tecan Freedom EVO HSM Workstation offre plusieurs options de traitement des chantillons Ces options sont contr l es sur l interface TouchTools Toutes les options d crites la section 3 sont accessibles sur cette interface Consultez le Manuel technique de l appareil Tecan Freedom EVO HSM Workstation n TM402 pour obtenir les instructions concernant l interface TouchTools Pour assistance compl mentaire concernant l interface de l utilisateur et les options de traitement veuillez contacter le service technique de Promega l adresse techserv
14. on recommand e Solution concentr e de Tris EDTA TE facultatif Promega propose une solution tampon TE concentr e 20X pH 7 5 R f A2651 Un stock de TE concentr peut galement tre pr par selon la m thode pr f r e de votre laboratoire Le stock doit avoir une concentration 10 20 fois plus lev e que la concentration finale souhait e Il est important de s lectionner le facteur de concentration au cours de l installation initiale de l appareil pour faire en sorte que la dilution appropri e soit appliqu e au cours du traitement des chantillons Les fournitures Tecan suivantes sont n cessaires pour l extraction de 32 chantillons Nous recommandons d utiliser uniquement des c nes jetables filtre pour minimiser le risque de contamination crois e Description de l article Qt R f Tecan C nes jetables LiHa 1 000 pl avec filtre 176 c nes 10 612 513 Bacs r actif jetables gris 6 10 613 049 Bacs jetables de 25 ml 3 30 055 743 4 B Proc dure de purification de l ADN L interface principale de la m thode de purification de l ADN est le logiciel Tecan TouchTools Paide des crans interactifs vous pouvez s lectionner toutes les options configurables par l utilisateur pour la purification Pour obtenir les instructions du syst me consultez le Manuel technique de l appareil Tecan Freedom EVO HSM Workstation n TM402 Dans la liste des programmes disponibles s lectionnez R
15. rvice technique de Promega ou consulter le catalogue en ligne de Promega pour obtenir les informations les plus r centes sur les produits Promega 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 EP049 R vis 8 13 www promega com
16. s pour v rifier l int grit des chantillons sur l appare l Tecan Freedom EVO HSM Workstation veuillez vous reporter la note d application Verification of Sample Integrity for the Tecan Freedom EVO HSM Workstation n AN204 l adresse www promega com 6 D pannage Pour toute question qui ne serait pas trait e ci dessous veuillez consulter une succursale ou un distributeur Promega local Les coordonn es de ceux ci sont disponibles au site www promega com Adresse lectronique techserv promega com Sympt mes Causes possibles et commentaires Faible rendement en ADN La r sine ReliaPrep n a pas t remise en suspension de fa on ad quate avant l emploi Resuspendez la r sine ReliaPrep avec soin dans le flacon de r actif avant de la transf rer pour la purification des chantillons L chantillon contenait trop peu de leucocytes Le rendement en ADN d pend de la quantit de mat riel de d part Les chantillons avec un faible taux en leucocytes ou les couches leucocytaires o seule une partie des leucocytes a t r cup r e pr senteront un moindre rendement en raison de la quantit r duite au d part Le volume initial de l chantillon d passe la capacit de traitement du syst me Le ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System a t optimis pour purifier de l ADN d chantillons de couches leucocytaires pr par s partir de 2 5 10 ml de sang total Le traitemen
17. t d chantillons de sang en dehors de cette plage recommand e peut entra ner une r duction du rendement en ADN et de sa concentration Le ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System a t optimis pour des chantillons de sang normaux provenant d adultes en bonne sant qui contiennent en g n ral entre 4 5 x 106 et 1 x 107 leucocytes ml L utilisation r ussie du ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System d pend de l usage des r actifs appropri s dans l ordre voulu V rifiez si tous les r actifs ont bien t plac s dans la position ad quate de l appareil et s ils ont t dilu s correctement avant l emploi EP049 R vis 8 13 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 wWww promega com 6 D pannage suite Sympt mes Causes possibles et commentaires ADN d grad R sine ReliaPrep dans l luat final Des nucl ases ont t introduites au cours de la purification ou du maniement Utilisez des r cipients en plastique ou en verre sans nucl ases Utilisez des c nes filtre pour toutes les tapes de pipetage Portez des gants tout moment Les nucl ases ventuellement introduites apr s l lution d gradent l ADN Pour prot ger l ADN lu contre les nucl ases s lectionnez l option d ajouter du tampon TE concentr une concentration de 1X dans T
18. tions d lution L ADN doit tre lu l aide d eau sans nucl ases comprise Les utilisateurs peuvent choisir des volumes d lution compris entre 500 et 1 500 ul L lution de l ADN dans un volume bas augmente la concentration de l ADN purifi mais r duit le rendement total Des volumes finaux d lution inf rieurs 1 ml peuvent entra ner une resuspension incompl te de la r sine ReliaPrep pour les chantillons de volume lev ce qui diminue la performance et augmente la pr sence de r sine r siduelle dans les luats Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis 3 Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 wWww promega com EP049 R vis 8 13 Promega 3 C Options d lution suite Tous les ADN lu s sont transf r s du HSM une plaque interm diaire 96 puits profonds Si vous souhaitez stocker l ADN dans du tampon TE le syst me peut ajouter du Tris EDTA concentr la plaque interm diaire Apr s la centrifugation manuelle le syst me peut transf rer les chantillons aux r cipients finaux Ces derniers peuvent consister en tubes de 2 ml bouchons viss s par ex Sarstedt R f 72 609 ou en une plaque 96 puits profonds Si vous choisissez de transf rer les chantillons dans des tubes vous serez invit placer ceux ci sur la plateforme suite l lution Au moment de l installation du syst me veui
19. ur des renseignements sur les commandes en dehors des tats Unis adressez vous une succursale ou un distributeur Promega local Les coordonn es de ceux ci sont disponibles au site www promega com Adresse lectronique techserv promega com 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 USA Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 EP049 R vis 8 13 www promega com Promega Conventions de d nomination Tout au long de ce document les solutions fournies dans le ReliaPrep Large Volume HT gDNA Isolation System sont nomm es comme suit Solution de prot inase K PK Solution de prot inase K Prot ase alcaline Alkaline Protease APA Prot ase alcaline Tampon de lyse cellulaire Cell Lysis Buffer CLD Tampon de lyse cellulaire Tampon de liaison Binding Buffer BBA Tampon de liaison Tampon de lavage Wash Buffer WBA Tampon de lavage Tampon de lavage pr par Prepared Wash Buffer WBC Tampon de lavage pr par Remarque pour R f A1751 comportant le Tampon de lavage WBA il est n cessaire de pr parer ce dernier avant de le charger dans l appareil en ajoutant de l thanol 50 la bouteille de tampon de lavage WBA tel que d crit la section 4 A Pour R f A2751 comportant le Tampon de lavage pr par WBC aucune pr paration suppl mentaire n est requise 3 Avant de commencer 3 A Types d
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