Elucigene® CF30v2 Mode d`emploi
Contents
1. Thermocycleur capable de contenir les fioles de 0 5ml ou 0 2m1l avec une temp rature pr cise de 1 0C entre 33 C et 100 C et une uniformit de temp rature statique de 1 C couvercle chauffant optionnel Electrophor se cuve pour gels horizontaux bloc d alimentation four micro ondes bain marie pour refroidir la g lose transilluminateur UV appareil photo CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 5 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Collecte et stockage des chantillons Des chantillons de sang total sur EDTA ou de taches de sang s ch es peuvent tre utilis s Il a t observ dans certains cas que la m thode de collecte et de traitement des chantillons pouvait avoir une influence sur la qualit des r sultats Il est recommand que chaque utilisateur s assure que le mat riel et la technique choisis soient utilis s conform ment aux instructions du fabricant et que le mat riel de pr l vement et la technique de pr paration de l ADN soient compatibles avec le test Les chantillons de sang doivent tre conserv s 20 C avant la pr paration de l ADN Eviter les cycles de cong lation d cong lation Echantillons de sang EDTA Pr paration de l ADN des chantillons de sang entier EDTA 1 Pipeter 80uL de chaque chantillon de sang dans un microtube bouchon vis 2 Pipeter 320UL de 170mM 9 09 g L de solution NHACI dans chaque tube 3 M langer pendant 20 minutes en remuant et inv2. de sang les mettre dans des tubes 1 5ml bouchon vis Ces disques doivent provenir d une partie de la carte qui est compl tement satur e de sang Poin onner plusieurs disques sur une carte vierge entre chaque chantillon afin d viter toute contamination inter chantillon Ajouter 1ml de NaCI EDTA 10mM 0 58g L 3 72g L dans chaque tube et m langer sur un mixeur rotatif pendant 15 20 minutes S il ny a pas de mixeur rotatif les lavages doivent tre prolong s jusqu 30 minutes chacun Pr lever et jeter la solution de lavage R p ter les tapes 2 et 3 une fois de plus ce point la plupart des pigments de l h me doit tre lu e du disque Une faible coloration marron rouge des poin ons de buvard n est pas anormale ce stade Micro centrifuger rapidement 3 secs pour collecter ce qu il reste de la solution de lavage au fond du tube Utiliser une pipette pour enlever et jeter le maximum de solution de lavage Cette br ve tape de micro centrifugeuse permet normalement de retirer ce qu il reste des pigments de l h me Ajouter 150uL de 50mM 2g L NaOH chaque tube Remuer gentiment Incuber dans un bloc chauffant 100 C pendant 10 minutes Micro centrifuger bri vement 2s pour r colter le surnageant pr sent dans le bouchon Ajouter 3OuL de Tris HCI 1M pH 7 5 dans chaque tube pour neutraliser et m langer soigneusement Ajouter 420uL d eau d min ralis e st rile chaque chantillon d A
3. des h t rozygotes composites en utilisant le kit Elucigene CF30v2 Figure 1 Marquer de Poids Moleculaire A B C D echelle a50 paires de base D 550 O Q O TE END CSP D 550 EE ESS D 500 3272 26A gt G 450bp NT 450 Apo B 423bp 394delTT 442bp 2183AA gt G 425bp EE 400 Y1092X 357bp 621 1G gt T 383bp 2789 5G gt A 370bp NT 5350 1717 1G gt A 329bp S1251N 328bp SC C CROP 3120 1G gt A 320bp EE 500 G551D 290bp G542X 279bp 1078delT 272bp 711 1G gt T 261bp W1282X 240bp A 1507 222bp G85E 224bp N1303K 200bp R1162X 200bp C 200 Y122X 185bp R347P 184bp A F508 M 160bp A F508 N 160bp R553X 150bp W846X 155bp BE 150 R334W 140bp 3849 10kbC gt T 132bp E60X 121bp ODC 117bp EH 100 ODC 97bp ODC 97bp ODC 97bp ODC Controle Inferieur ApoB Controle Superieur CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 11 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Validation du Test CF30 Version 1 30 chantillons assortis de sang entier et taches de sang s ch es dont les g notypes taient connus ont t test s en tude interne L ADN a t pr par en utilisant la m thode fournie dans ces Instructions d Utilisation Parmi les trente chantillons test s six chantillons taient normaux pour les 30 mutations test es par le kit chacun des 24 autres chantillons visualisait au moins une des mutations d tect es par CF30 Des h t rozygotes compos s taient d tect s et tous les r sultats taient conformes au g notype connu obtenu pa
4. 1066 1073 1989 4 Rommens JM et al Identification of the Cystic Fibrosis Gene Chromosome Walking and Jumping Science 245 1059 1065 1989 5 Le site internet des donn es de mutation de la fibrose cystique httb wwvw genet sickkids on ca 6 Newton CR et al Analysis of any point mutation in DNA The Amplification Refractory Mutation System ARMS Nucleic Acids Res 17 2503 2516 1989 Estivill X et al Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations Hum Mut 10 135 154 1997 8 Le Consortium de l analyse g n tique de la fibrose cystique Hum Mutat 4 167 177 1994 Informations galement disponibles sur Attp www genet sickkids on ca 9 Satsangji J et al Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 343 1509 1510 1994 10 de Vries HG et al Validation of the determination of AF508 mutations of the CF gene in over 11000 mouthwashes Hum Genet 97 334 336 1996 11 Riley J et al Rapid determination of DNA concentration in multiple samples Nucleic Acids Res 17 8383 1989 12 Leoni GB et al The Cystic Fibrosis Mutation Database website at httbp www genet sickkids on ca Elucigene est une marque d pos e de Delta Diagnostics UK Ltd ARMS est une marque d pos e d AstraZeneca UK Ltd NUSIEVE est une marque d pos e de Lonza AMPLITAQ GOLD est une marque d pos e de Roche Molecular Systems Inc Copyright 2014 Delta Diagnostics UK L
5. D c 1652G gt A o Glv551As0 R553X c 1657C gt T D Argq553 1811 1 6kbA gt G c 1680 886A gt G 2183AA gt G c 2051 2052delAAinsG o Lyvs684Serfs 38 W846X C 2538G gt A D Trp846 2789 5G gt A c 2657 5G gt A 3120 1G gt A C 2988 1G gt A r 3272 26A gt G c 3t40 26 gt 6 ooo d R1162X 3849 10kb C gt T_ 68748 24770 ooo d Lo Trp 282 ooo W1282X c 3846G gt A D Tro1282 N1303K c 3909C gt G o Asn1303Lvs 1 en reference Mutation Nomenclature in Practice Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme Berwouts S Morris M Girodon G Schwarz M Stuhrmann M and Dequeker E Human Mutation Vol 00 No 0 1 7 2011 CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 2 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi A noter que les mutations vont tre exprim es en nomenclature traditionnelle dans le reste de ce document La nomenclature HGVS est fournie dans ce tableau comme r f rence et devra tre utilis e dans les rendus des r sultats Principes de proc dure La m thode employ e par le kit CF30v2 ELUCIGENET fait appel la technique d amplification sp cifique d all les ARMS qui d tecte des mutations ponctuelles ou de petites d l tions dans l acide d soxyribonucl ique ADN Cette technologie est bas e sur le fait que les oligonucl otides pr sentant un r sidu en 3 mal appari ne fonctionneront pas comme amorces de la Polymerase Chain Reaction PCR dans les conditions sp cifi es ce qui est expli
6. DN pour obtenir un volume total de 600uL Bien m langer les chantillons et les micro centrifuger pour collecter Transf rer le surnageant dans un tube capuchon vissant propre et tiquet Conserver l ADN extrait 20 C La surface totale de l chantillon de sang utilis doit tre au moins quivalente des taches circulaires de sang de 2 x 3mm Par exemple des taches de 1x 6mm peuvent tre utilis es si cela convient La IsoCode Card le dispositif d isolation d ADN pour le kit d amplification Schleicher et Schuell Inc a t utilis e pour la pr paration de l ADN partir des taches de sang et est galement capable de produire des r sultats interpr tables CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 7 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Autres m thodes de pr paration de l ADN Les m thodes de pr paration de l ADN d crites ci dessus sont recommand es par Elucigene Diagnostics et sont reconnues pour produire des r sultats constants et fiables L ADN pr par avec d autres m thodes ou types d chantillons risque de ne pas tre optimal pour le test Elucigene CF30v2 et peut donner des r sultats inf rieurs Les crit res essentiels pour les m thodes alternatives de pr paration de l ADN sont une concentration optimale en ADN et une absence d inhibiteurs de PCR Il est recommand d valuer soigneusement les m thodes alternatives et les types d chantillons avec le test Elucigene CF30v2 avant d utili
7. Elucigene CF30v2 Mode d emploi Elucigene Diagnostics Elucigene CF30v2 Mode d emploi No de catalogue CF030B1 25 tests avec AmpliTaq Gold Dispositif de diagnostic in vitro al par Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Pour joindre le service des ventes le service la client le et le service technique T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiries elucigene com E techsupport elucigene com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics UK Limited a company registered in England and Wales registration number 8696299 CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 1 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Elucigene CF30v2 Usage pr vu D tection qualitative simultan e in vitro des mutations suivantes du g ne CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator responsable de la mucoviscidose dans de l ADN extrait partir d chantillons de sang total pr serv par EDTA et de spots de sang s ch Guthries Traditional HGVS Nomenclature ns O G8SE Giv85GIU J4delTT gt Leu88llefs 22 Y122X 366T gt A o Tyr122 621 1G gt T 489 1G gt T SE ES EE 1078delT c 948del c 948delT o Phe316Leufs 12 R334W 1000C gt T o Ara334Trp R347P D Ara347Pro A455E 1864 y O oAaG 507de gt 1e507de F508del c i521 1523del c 1521 1523delCTT o Phe508del 1717104 c 1585 1G gt A G542X C 1624G gt T o Gly542 G551
8. F29v2 s appliquent et sont incluses dans ces instructions Les mutations suivantes rares ont t valu es par r activit crois e et n ont pas t d tect es par le kit Elucigene CF29v2 R1283M 1717 2A gt G R117C 621 2T gt C R117L I506V De plus les polymorphismes suivants n ont pas t d tect s par le test 3617G T 1655T G F508C 1651A G L valuation des mutations et polymorphismes connus dans le g ne CFTR a mis en relief les effets suivants sur les r sultats du kit Elucigene CF30v2 1 1507del en combinaison avec le dup1716 51 61 donnera un produit de PCR de 233pb dans le tube C plut t que les 222pb attendues 2 Une r activit crois e l g re de l amorce R347P dans le tube C avec les mutations rares R347H a t observ e avec les r sultats dans un produit de PCR faible visible la position de R347P dans le tube C 3 Une mutation r cemment report e 2184insG peut en th orie r agir avec l amorce 2183AA gt G dans le tube C Une bande correspondant la mutation 2183AA gt G peut indiquer la pr sence de la mutation 2184insG 4 Une mutation r cemment report e F316L 2 peut en th orie r agir avec l amorce de la mutation 1078delT dans le tube C Une bande de diagnostic 1078delT peut indiquer que la mutation F316L est pr sente 5 Les mutations suivantes qui n ont pas t test es du fait de l absence d chantillons pourraient galement pr senter une r cativit crois e 621 2T
9. de gel horizontal de 15 x 12cm avec des puits de 1 5mm x 5mm suspendus 1mm au dessus de la base 3 D poser 15ul de la dilution du marqueur de taille et 15ul des produits de PCR obtenus Chacun des tubes A B C et D doivent tre plac s dans des puits contigus pour une meilleure interpr tation 4 Un Marquer de taille 50bp 1 5ug 15uL a t pr par e dans le colorant de charge fourni 80uL d eau distill e 10uL de colorant de charge 10uL de l chelle 50 paires de base Il faut noter que le m lange peut prendre une couleur orange avant d tre plac sur le gel 5 Effectuer l lectrophor se 5 6 V cm entre les lectrodes jusqu ce que le front color ait migr de 5cm des puits vers l anode 1 5 2 heures 6 Apr s l lectrophor se placer le gel sur un transilluminateur d UV 260nm pour visualisation et photographies d Calculer en utilisant la distance en centim tres entre les lectrodes CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 9 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Interpr tation des r sultats 1 Le r sultat du test ne sera interpr table que si les deux bandes t moins sup rieure et inf rieure sont clairement visibles pour chaque chantillon voir figure 1 Leur position doit indiquer la taille mol culaire correcte 97 pb pour la bande inf rieure des fioles B C et 117 pb pour la fiole D 423 pb 526 pb respectivement pour les bandes sup rieures des fioles A et B et 633 pb pour
10. ent Ne pas ajouter d ADN le tube PCR de contr le n gatif CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 8 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi 9 Centrifuger les tubes pendant 10 secondes 12 000g 10 Placer toutes les tubes dans le bloc du thermocycleur Commencer le cycle unique d activation 94 C suivi du programme de cycle d amplification 11 Jeter toutes les dilutions d AmpliT aq restantes non utilis es 12 Une fois le programme de cycle d amplification fini les chantillons peuvent tre conserv s dans une pi ce temp rature de 2 8 C pendant 7 jours au plus avant l analyse par lectrophor se en gel Pour les amplifications effectu es dans des tubes de PCR de 0 5ml ou un thermocycleur sans couvercle chauffant Electrophor se en gel Il est recommand que chaque utilisateur s assure que l quipement choisi est utilis en conformit avec les instructions donn es par le fabricant et est compatible avec ce test Dans ce contexte les param tres cl s sont les dimensions du peigne formant les puits et de la matrice gel Les r sultats ont t obtenus en utilisant les conditions d lectrophor se suivantes 1 Pr parer un gel d agarose NuSieve 3 1 3 dans du tampon TBE contenant du bromure d thidium Le TBE EtBr a t pr par avec 134mM 16 2g L de la base Tris 4 9mM 4 63g L d acide borique et un tampon d EDTA 2 55mM 0 95g L avec 0 1ug ml de bromure d thidium 2 Vers s dans un plateau
11. ersant doucement Eviter d agiter fort et de former de la mousse 4 Centrifuger chaque tube pendant 2 minutes 12 000g jusqu ce qu un culot de cellules se forme 5 Utiliser une pipette pour enlever et jeter le liquide surnageant 6 Pipeter 300UL de solution de NaCI EDTA 10mM 0 58g L 3 72g L dans chaque tube et vortexer afin de remettre les cellules en suspension Centrifuger chaque tube pendant 1 minute 12 000g jusqu ce qu un culot de cellules se forme 8 R p ter les tapes 5 7 au moins deux fois jusqu ce que le surnageant soit clair 9 Utiliser une pipette pour enlever et jeter le liquide surnageant 10 Pipeter 200uL de solution de NaOH 50mM 2g L dans chaque tube et vortexer afin de remettre les cellules en suspension 11 Incuber dans un bloc chauffant 100 C pendant 10 minutes 12 Pipeter 40uL de Tris HCI 1M pH7 5 dans chaque tube et vortexer 13 Ajouter 1ml d eau d min ralis e st rile dans chaque tube afin d obtenir un volume total d chantillon d ADN de 1 24mil 14 Centrifuger chaque tube pendant 1 minute 12 000g jusqu ce qu un culot de d bris cellulaires soit visible L ADN est contenu dans le surnageant CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 6 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Pr paration de l ADN partir de taches de sang s ch es i 8 9 10 11 12 13 14 A l aide d un poin on d couper des disques de 2mm x 3 mm dans le carton imbib
12. gt G R553G R553Q R347L 15067 1506S et la combinaison rare de 150 7del avec le polymorphisme 1651A G Limites de la proc dure 1 Les r sultats obtenus partir de ce kit de diagnostic ou tout autre diagnostic de r actif doivent tre utilis s et interpr t s seulement dans un contexte clinique Elucigene Diagnostics Elucigene diagnostics n est pas responsable des d cisions cliniques qui peuvent tre prises 2 L absence des 29 mutations d tect es par ce kit ne garantit pas que d autres variants du g ne CFTR ne soient pas pr sentes Beaucoup d autres mutations non d tectables par ce kit peuvent tre pr sentes 3 Les mutations pr sentent des fr quences diff rentes selon les populations Ces donn es de fr quences sont disponibles au Consortium d analyse g n tique de la mucoviscidose 8 L utilisateur de ce kit doit insister sur ces points lorsqu il pr sente les r sultats un clinicien de diagnostic ou un consultant g n tique CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 13 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi R f rences 1 Welsh MJ et al In Scriver CR et al eds The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease McGraw Hill New York 3799 3876 1995 2 Elborn JS et al Cystic Fibrosis current survival and population estimates to the year 2000 Thorax 46 881 885 1991 3 Riordan JR et al Identification of the Cystic Fibrosis Gene Cloning and Characterization of Complementary DNA Science 245
13. ion et le colorant de charge fournis dans l eau distill e st rile pour le nombre d chantillons et de contr les tester Pour 10 chantillons ou contr les pipeter 85uL d eau d min ralis e st rile 25uL du tampon de dilution 125uL de colorant de charge et 15uL d d AmpliTaq Gold dans un tube de micro centrifugeuse M langer minutieusement la dilution d enzyme en la faisant doucement monter et descendre dans une pipette 5 Pr parer un m lange de r actions en ajoutant le volume n cessaire de m lange d amorce la dilution d enzyme de l tape 4 Pour 10 chantillons ou contr les pipeter s par ment 165uL de chaque m lange d amorces A B C et D dans 55uL de dilution d enzyme pr par dans l tape 4 dans des tubes tiquet s M langer minutieusement en faisant doucement monter et descendre le liquide dans une pipette 6 Pipeter 20uL de chaque m lange de r action au fond de chacune des fioles PCR n cessaires paroi mince Fermer les tubes Remarque des tubes PCR de couleurs diff rentes permettent de faire la distinction entre les 4 m langes d amorces TA TB TC et TD Etiquet un tube de PCR de chaque couleur pour chaque chantillon et contr le 8 En changeant de pointe de pipette entre chaque chantillon ajouter 5uL de l chantillon de test dans chacune des 4 tubes PCR de couleur correspondante Ajouter une goutte d huile de vaseline blanche Sigma si n cessaire et refermer le capuchon fermem
14. les fioles C et D cf figure 4 Le contr le n gatif ne devra pr senter aucune bande Le r sultat d un test de diagnostic ne doit pas tre interpr t si une bande similaire appara t galement dans le contr le n gatif pour la s rie de PCR car ceci est une indication de contamination par un g nomique d ADN ou de produits de PCR Si un des points d crits ci dessus n est pas observ les r sultats ne doivent pas tre interpr t s et il faut proc der un autre test 1 Un individu a deux copies du g ne CFTR Lorsque ces copies ont la m me s quence une position donn e l individu est alors d crit comme tant homozygote pour cette position Lorsque les copies diff rent en s quence une position donn e l individu est alors d crit comme tant h t rozygote pour cette potition 2 La pr sence de produit de PCR g n r e partir de l amorce normale F508del dans le tube B indique que l chantillon contient la s quence normale pour ce site Le produit de PCR normal sera observ dans la migration du tube B du gel 160pb et est identifi par comparaison de position avec celles du marqueur de taille voisin 3 Les produits de PCR des individus qui portent n importe laquelles des mutations Y1092X 1717 1G gt A G542X W1282X N1303K F508del et 3849 10kbC gt T sont observ s dans la migration du tube A et sont identifi s par comparaison de taille avec celles du marqueur Les tailles attendues des produit de PCR so
15. nt donn es dans la figure 1 4 Les produits de PCR des individus qui portent n importe laquelle des mutations 394delTT 621 1G3 gt T S1251N G551D R1162X et R334W sont observ s dans la migration du tube B et sont identifi s par comparaison avec le marqueur de taille 5 Les produits de PCR des individus qui portent n importe laquelle des mutations A455E 2183AA gt G 3659delC 1078delT 150 7del R347P R553X et E60X sont observ s dans la migration du tube C et sont identifi s par comparaison avec le marqueur de taille 6 Les produits de PCR des individus qui portent n importe laquelle des mutations 1811 1 6kKbG gt A 3272 26G gt A 3120 1G gt A 2789 5G gt A 711 1G gt T G85E Y122X et W846X sont observ s dans la migration du tube D et sont identifi es par comparaison avec le marqueur de taille Seules les bandes correspondant la taille attendue doivent tre interpr t es Remarque Etant donn e la complexit des m langes d amorces dans chaque tube des artefacts correspondant une taille de bande lt 97pb peuvent tre visualis s dans les chantillons tester et dans le contr le CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 10 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi La figure 1 illustre sur un diagramme les tailles attendues et l emplacement respectif des produits de PCR dans le gel g n r s par la pr sence d une mutation Bien que toutes les combinaisons de mutations n aient pas t valu es il est possible de d tecter
16. pour les mutations d tect es par l Elucigene CF30v2 25 fioles PCR de couleurs orange violet vert et bleu sont disponibles sur demande Le CN Mat riel n cessaire mais non fourni Pr paration d ADN une eau d min ralis e st rile de bonne qualit chlorure de sodium NaCl sel disodique d acide thyl ne diamine t tra ac tique EDTA pastilles d hydroxyde de sodium NaOH 2 amino 2 hydroxymethyl 1 3 propanediol cristallis base Tris acide chlorhydrique 36 d 1 18 HCI chlorure d ammonium NH CI Amplification PCR Huile de vaseline blanche Sigma eau distill e st rile de bonne qualit Pour des amplifications effectu es dans des fioles PCR de 0 5ml ou des thermocycleurs sans couvercles chauffants Electrophor se Mat riel et r actifs pour lectrophor se en gel incluant de l Agarose NuSieve 3 1 Lonza un marqueur de poids mol culaire 1 kb avec une chelle de 50 pb et du bromure d thidium Mat riel n cessaire G n rale Consommables de laboratoire gants tubes capuchon vissant pour micro centrifugeuse portoir tube pointes de pipette Equipement de laboratoire pipettes de pr cision 2 jeux 1 pour la manipulation avant amplification et 1 pour la manipulation apr s amplification des pipettes d placement positif v tements de protection agitateur vortex micro centrifugeuse balance Pr paration ADN Bloc chauffant 100 C Amplification PCR
17. qu sous forme sch matique sur la Figure 1 La s lection des oligonucl otides appropri s permet d amplifier et de d tecter des s quences d ADN mutantes ou normales sp cifiques Mise en garde et pr cautions 1 Le contr le d ADN normal fourni avec ce kit a t test ind pendamment et est n gatif pour le virus de l h patite B HBV le virus de l h patite C HCV et le virus d immunod ficience humaine VIH 1 et 2 2 Tout mat riel d origine humaine doit tre manipul avec pr caution Tous les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux Aucune m thode de test ne permet de garantir compl tement que les agents infectieux HBV HCV VIH ne sont pas pr sents 3 La manipulation des chantillons et des composants de test leur utilisation stockage et limination doivent tre ex cut s en conformit avec les proc dures d finies par les r gulations et directives nationales de s curit et de risques biologiques 4 Conform ment aux bonnes pratiques les laboratoires doivent traiter leurs propres chantillons internes de CQ de g notype connu avec chaque s rie de test de mani re valider de la proc dure 5 Si le carton du kit est endommag le contenu risque de l tre aussi endommag ne pas utiliser le kit et contacter le service client le CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 3 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Symboles utilis s sur les tiquettes Les symboles utilis
18. r des m thodes alternatives Les chantillons de validation test s sont H terozygotes 2 x 3849 10kKbC gt T 711 1G gt T 3272 26A gt G s1251N R347P R117H R553X AF508 1811 1 6kbA gt G Y1092X 1717 1G gt A H terozygotes compos s Y122X AI507 R1162X AF508 G551D AF508 711 1G gt T AF508 AA455E AF508 1717 1G gt A AF508 R117H AF508 W846X AF508 R117H AF508 Homozygotes 6 x 2 x AF5O8 AF508 CF30 Version 2 Cette nouvelle version du kit apporte une modification au niveau du tube B Le nouveau design ne comporte plus la mutation R117H La validation a tait r alis e avec un panel de 30 chantillons de sang total et taches de sang s ch es sur le mix B Parmi les 30 chantillons test s 20 chantillons taient normaux pour les six mutations comprises dans le mix B les 10 autres contenaient au moins une des mutations d tect es dans le mix B du kit CF30v2 Les chantillons de validation test s sont H terozygotes 2 x 394delTT 621 1G gt T 2 x S1251N 3 x G551D R1162X R334W Homozygotes 10 x CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 12 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi R activit crois e Des tests de r activit crois e avec des polymorphismes et mutations d crites dans le g ne CFTR ont t r alis s durant le d veloppement du kit Le kit Elucigene CF30v2 est une extension d Elucigene CF29v2 et les informations de r activit crois e pour C
19. s sur toutes les tiquettes et les emballages sont conformes au standard harmonis 5015223 Fabricant Nombre de tests Voir instructions d utilisation X C Conserver en dessous de la temp rature donn e utiliser avant la date donn e REF Code du catalogue LOT Num ro du lot ou paquet IVD Dispositif m dical de diagnostic in vitro CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 4 of 14 Elucigene CF30v2 Mode d emploi Mat riel fourni Conserver tous les composants a 20C Apr s ouverture ne pas conserver plus de 3 mois les r actifs moins qu ils n aient t aliquot s 1 1 fiole x 500uL chacune de 4 m langes d amorces TA TB TC et TD 404466 404467 404468 et 404469 contenant les amorces pour d tecter les 29 mutations CFTR suivantes Y1092X 1717 1G gt A G542X W1282X N1303K F508del 3849 10kbC gt T 394delTT 621 1G gt T R553X G551D R1162X R334W A455E 2183AA gt G 3659delC 1078delT 1507del R347P S1251N E60X 1811 1 6kbG gt A 3272 26A gt G 3120 1G gt A 2789 5G gt A 711 1G gt T G85E Y122X et W846X Chaque m lange d amorces contient galement les amorces de contr le et les triphosphates d soxynucl otides dans un tampon Suffisant pour 25 fioles de tests 1 fiole x 200uL de tampon de dilution 404482 DB 1 fiole x 600uL de colorant de charge 404481 LD pour 25 tests 1 fiole x SOUL d AmpliTaq Gold 404490 AG suffisant pour 25 tests 1 x fiole 5OuL de contr le d ADN 404487 DC normal
20. ser les r sultats des fins de diagnostic Dans des conditions de PCR optimales des bons r sultats sont obtenus en utilisant des concentrations d ADN entre 10 et 100ng Bu II n est pas recommand d utiliser une solution d ADN une concentration inf rieure 10ng 5uL Protocole de test Proc dure d amplification Remarque Afin de minimiser les risques de contamination les tapes 4 7 doivent tre effectu s dans un lieu prot g de toute source d ADN Les m mes pr cautions doivent tre prises pour viter la contamination par des produits de PCR 1 Programmer le thermocycleur avec un cycle unique pour activer l AmpliTaq Gold 94 C pendant 20 minutes puis de 35 cycles d amplification de 30 secondes 94 C d naturation 2 minutes 58 C hybridation et 1 minute 72 C longation Terminer par une phase d longation finale de 20 minutes 72 C Remarque S lectionner l option m thode Block si elle est disponible sur le thermocycleur pour le PCR dans des fioles de 0 5ml 2 Un contr le n gatif doit tre inclus dans chaque s rie de PCR 3 D congeler et centrifuger les m langes d amorces TA TB TC TD l AmpliTaq Gold AG les tubes de colorant de charge et de tampon de dilution TP pendant 10 secondes 12 000g m langer doucement au vortex puis centrifuger nouveau les tubes pendant 10 secondes 4 Pr parer suffisamment de dilutions d AmpliTaq Gold avec le tampon de dilut
21. td CFO30BYFR 002 Dec 2014 Page 14 of 14
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