Simplexa™ CMV - Focus Diagnostics
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1. 023 0 037 QS MagNA Pure 2 15E 04 4 333 a 0 047 0 000 0 079 0 100 REPRO 4 1 87E 04 easy MAG 1 91E 04 4 282 oa 0 000 0 000 0 047 0 055 MagNA Pure 4 25E 03 3 629 oa 0 000 0 000 0 138 0 138 REPRO 5 4 74E 03 easy MAG 5 13E 03 3 710 E 0 000 0 022 0 088 0 095 MagNA Pure 1 47E 04 4 168 ooo 0 085 0 000 0 069 0 142 REPRO 10 7 10E 03 easy MAG 4 08E 03 3 611 0 060 0 071 0 093 0 348 MagNA Pure 5 97E 03 3 776 oa 0 069 0 000 0 101 0 157 VOLLBLUT REPRO 11 2 84E 03 easy MAG 2 23E 03 3 348 0 126 0 118 0 117 0 264 MagNA Pure 1 22E 08 8 087 a 0 083 0 068 0 038 0 132 REPRO 9 5 00E 07 easy MAG 3 78E 07 7 578 oa 0 137 0 000 0 016 0 269 NTC negatives Plasma negatives Vollblut und ein Quantifizierungsstandard wurden als Teil des Probenpanels zur Ermittlung der Reproduzierbarkeit analysiert Alle Tests mit diesen Proben waren reproduzierbar wenngleich nicht im Messbereich des Assays und wurden daher nicht bei der quantitativen Reproduzierbarkeit ber cksichtigt ANALYSEEMPFINDLICHKEIT NACHWEISGRENZE Die f r diese Studie verwendeten LoD Proben setzten sich aus einem Stamm mit bekannter Bestandskonzentration der einer klinisch negativen Plasma bzw Vollblutmatrix zugesetzt wurde zusammen Das Probenpanel umfasste eine Negativprobe nicht beimpfte Probenmatrix und Proben mit unterschiedlicher CMV Konzentration im Bereich der ungef hren Nachweisgrenze ermittelt im Rahmen von Verifizierungstests Die Studie bestand aus mehreren Analysen2. Reaktionsgemisch bei 2 C bis 8 C lagern bis die PCR angesetzt werden kann Nach dem ersten Auftauen k nnen Primer Mix Master Mix und DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle maximal 30 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden Primer Mix Master Mix DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle und Positivkontrollen nicht wieder einfrieren Keine Reagenzien aus verschiedenen Kitchargen kombinieren WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1 10 11 12 13 14 15 16 17 Alle Humanmaterialien sollten als potenziell infekti s behandelt werden Das Ursprungsmaterial dieses Produktes und der Kontrollen ist mit US FDA anerkannten Methoden auf HBs Antigen Hepatitis C Antik rper und HIV 1 2 AIDS Antik rper untersucht und f r negativ befunden worden Dennoch gew hrleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie daf r dass Produkte die aus menschlichem Blut gewonnen wurden die genannten oder andere infekti se Krankheiten nicht bertragen k nnen Alle Kontrollen Serumproben und Ger te die in Kontakt mit den Proben kommen sollten daher als potenziell infekti s angesehen und durch entsprechende biologische Sicherheitsma nahmen dekontaminiert oder entsorgt werden Die amerikanischen CDC und National Institutes of Health empfehlen dass potenziell infekti se Materialien mit biologischer Sicherheitsstufe 2 gehandhabt werden Beim Umgang mit den Kit Reagenzien pers nliche Schutzausr
3. im Bereich des Real Time PCR Ger ts verbleiben e Auch die pers nliche Schutzausr stung wie z B Laborkittel und Einmalhandschuhe sollten bereichsspezifisch gehandhabt werden Die Kontamination von Reagenzien bzw Patientenproben kann zu einer Verf lschung der Testergebnisse f hren Unter aseptischen Bedingungen arbeiten Die Reagenzien vorsichtig pipettieren und handhaben um eine Kontamination mit Material aus benachbarten Kavit ten zu verhindern Geeignete Pipettiertechniken anwenden und f r die Dauer des Tests das gleiche Pipettierschema einhalten um optimale und reproduzierbare Werte zu erhalten Die Reagenzien nicht gegen Reagenzien anderer Kit Chargen oder anderer Hersteller austauschen oder mit diesen mischen Die Verschlusskappen der Reagenzr hrchen nicht vertauschen Dies k nnte zur Kontamination f hren und die Testergebnisse beeintr chtigen Nur das in diesem Beipackzettel beschriebene Protokoll verwenden Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der angegebenen Zeiten sowie Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C erfolgen Beim Mischen der Reagenzien die Enzyme durch einen K hlblock gek hlt halten Universal Discs die bereits in Kontakt mit Patientenproben oder Reagenzien gekommen sind nicht wieder verwenden Gebrauchte Discs ohne Abnehmen der Abdeckfolie entsorgen Wenn verschiedene Simplexa Kits auf der
4. stung wie jedoch nicht beschr nkt auf Handschuhe und Laborkittel tragen H nde nach der Durchf hrung des Tests gr ndlich waschen Nicht mit dem Mund pipettieren In Bereichen in denen Kit Reagenzien und oder Humanproben gehandhabt werden darf nicht geraucht getrunken und gegessen werden In diesen Bereichen sollten auch keine Kontaktlinsen eingesetzt herausgenommen und kein Make up aufgetragen werden Nicht verwendete Kit Reagenzien bzw Humanproben gem den rtlichen und nationalen Bestimmungen entsorgen Der Arbeitsablauf im Labor sollte nur in einer Richtung erfolgen ausgehend von den Pr Amplifikationsbereich en in Richtung Amplifikations Detektionsbereich Im folgenden Abschnitt wird der Ablauf der Arbeitsschritte von der Probenextraktion bis zur Amplifikation mittels Real Time PCR beschrieben e Am Anfang steht die Probenextraktion gefolgt von der Einstellung des Ger ts zur Durchf hrung der Real Time PCR der Zubereitung der Reagenzien und schlie lich der Amplifikation mittels Echtzeit PCR e Verbrauchsmaterial oder Ger te sollten nicht zwischen den verschiedenen Bereichen ausgetauscht werden e Veerbrauchsmaterial und technische Ausstattung f r die Probenvorbereitung d rfen nicht f r die Reagenzienzubereitung oder zum Bearbeiten amplifizierter DNA oder anderer Quellen der Zielnukleins ure verwendet werden e S mtliches Verbrauchsmaterial und s mtliche technischen Vorrichtungen f r die Amplifikation m ssen immer
5. unter Verwendung der entsprechenden Reagenzien extrahiert Das Probenpanel von DNA Extrakten wurde dann in vierfacher Ausf hrung auf dem Integrated Cycler Ger t getestet Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst Simplexa CMV Seite 10 Gous Quantitative Reproduzierbarkeit QCMV Standardabweichung Komponenten Erwarteter Erwarteter Beobachteter Probenty Probenbez Extraktionsverfa Konzentration Konzentration geometrischer n en ee System zu Von Tag Von Lauf 2 P eichnung h spegel spegel Log Mittelwert g lU mI HE F y zu Tag zu Lauf ur IU ml IU mi IU mi MagNA Pure 2 00E 06 6 300 ooo 0 060 0 000 0 029 0 087 HPC 2 00E 06 6 301 easy MAG 2 53E 06 6 402 E 0 022 0 039 0 016 0 064 KONTROLLEN MagNA Pure 2 00E 04 4 301 E 0 000 0 000 0 066 0 112 LPC 2 00E 04 easy MAG 2 14E 04 4 330 E 0 000 0 024 0 037 0 063 MagNA Pure 1 05E 08 8 021 ooo 0 048 0 034 0 023 0 090 REPRO 6 5 00E 07 easy MAG 3 19E 08 8 504 0 000 0 053 0 026 0 077 MagNA Pure 9 72E 03 3 988 E 0 094 0 033 0 063 0 133 PLASMA REPRO 7 7 10E 03 easy MAG 3 42E 04 4 534 oa 0 000 0 033 0 036 0 084 MagNA Pure 3 11E 03 3 493 E 0 121 0 042 0 150 0 197 REPRO 8 2 84E 03 easy MAG 1 26E 04 4 099 E 0 000 0 000 0 036 0 075 MagNA Pure 2 18E 07 7 338 ooo 0 000 0 000 0 020 0 059 REPRO 2 2 05E 07 easy MAG 2 02E 07 7 305 E 0 011 0 018 0 015 0 035 MagNA Pure 2 24E 05 5 351 ao 0 000 0 000 0 025 0 053 REPRO 3 2 10E 05 easy MAG 2 06E 05 5 313 oa 0 013 0 000 0
6. INSTELLUNG DES GER TS F R DIE REAL TIME PCR 1 Einzelheiten dar ber wie die Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist um eine Assaydefinition hinzuzuf gen einen Lauf einzustellen und die L ufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen Hinweis Vor Durchf hrung eines Vorhersagelaufes muss eine valide Standardkurve Kalibrierungslauf eingerichtet werden REAGENZIENZUBEREITUNGSBEREICH Ein f r die Vorbereitung des Reaktionsgemisches f r den Simplexa CMV Assay reservierter Bereich 1 Primer Mix und Master Mix bei Raumtemperatur etwa 18 C bis 25 C auftauen Jedes R hrchen im Kit enth lt eine f r 50 Reaktionen ausreichende Reagenzienmenge Vor jedem Gebrauch Primer Mix und Master Mix Komponenten vorsichtig durchmischen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 2 In ein Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen entsprechender Gr e jede Komponente in dem in der folgenden Tabelle angegebenen Volumen pipettieren um das erforderliche Volumen des Reaktionsgemisches zuzubereiten Reaktionsgemischvolumen Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Reagens Volumen 1 Volumen 10 Reaktion Reaktionen SimplexaT Master Mix 4 0 ul 40 ul Simplexa CMV Primer Mix 1 0 ul 10 ul Gesamtvolumen 5 0 yl 50 ul G Simplexa CMV Seite 6 FOCUS 3 Das Reaktionsgemisch durch 8 bis 10 maliges Pipettie
7. Simplexa CMV MOL2200 Rev D Ein Real Time PCR Assay zur quantitativen n vitro O l S Bestimmung des Cytomegalovirus CMV Diagnostics In vitro Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Der SimplexaT CMV Assay von Focus Diagnostics dient der quantitativen In vitro Bestimmung der Nukleins uren des Cytomegalovirus CMV im Vollblut und oder Plasma mit dem Integrated Cycler von 3M Dieser Assay ist f r die Verwendung in Verbindung mit dem klinischen Bild sowie anderen Laborparametern des Krankheitsverlaufs als Hilfsmittel zur Behandlung und Kontrolle von mit CMV infizierten Patienten bestimmt Dieser Assay ist nicht zum Screening auf das Vorliegen von CMV in Blut oder Blutprodukten gedacht Der Assay darf nur fachgerecht eingesetzt werden ZUSAMMENFASSUNG UND ERL UTERUNG Das menschliche Cytomegalovirus CMV wird den menschlichen Herpesviren zugeordnet und ist ein Beta Herpes Virus CMV Infektionen kommen in allen Bev lkerungen vor Mindestens etwa 70 aller Erwachsenen sind seropositiv auf CMV Antik rper was auf eine Infektion mit dem Virus in der Vergangenheit hinweist Prim re CMV Infektionen sind bei ansonsten gesunden Personen asymptomatisch oder f hren zu einer leichten unspezifischen Erkrankung Bei Schwangeren kann eine prim re CMV Infektion dagegen eine kongenitale Infektion des Fetus oder Neugeborenen zur Folge haben und bei Empf ngern von Organtransplantaten kann eine Prim rinfektion zu ernsten Erkrankungen
8. Streifenplatte 0 Ein Mehrkanalmikropipette n und oder Repetiermikropipette n mit einem Genauigkeitsbereich von 1 10 ul 10 100 ul und 100 1000 ui 11 Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Kit Komponenten 12 K hlschrank mit 2 C bis 8 C f r Proben und aufgetaute Kit Komponenten 13 Biologische Sicherheitswerkbank Laminarflow Haube f r die Durchf hrung der Extraktionen 14 Mikrozentrifuge 15 Vortex Mischer 16 Sterile RNase DNase freie Einmalpipettenspitzen mit Aerosolbarriere 17 1 5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen und St nder RNase DNase freie R hrchen werden empfohlen sind aber nicht vorgeschrieben 18 Einweg Schutzhandschuhe ungepudert 19 Nukleasefreies Wasser zur Extraktion und als Leerwert Kontrolle No Template Control NTC 20 K hlst nder f r 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen Zur Verwendung beim Roche MagNA Pure LC Extraktionsverfahren Zur Verwendung beim bioMerieux easyMAG Extraktionsverfahren ze e NND PBPWwN gt Focus Simplexa CMV Seite 3 HALTBARKEIT UND HANDHABUNG D Reagenzien bei 10 bis 30 C aufbewahren keine Gefrierger te mit Abtauautomatik verwenden Reagenzien vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden Das Reaktionsgemisch innerhalb einer Stunde nach Zubereitung verwenden Das
9. e die Analyse durchf hren sollten sich vor Durchf hrung des Assays eingehend mit den Testverfahren und der Ergebnisinterpretation vertraut gemacht haben 4 Zur Quantifizierung unbekannter Patientenproben speichert die 3M Integrated Cycler Studio Software die letzte g ltige Kalibrierungsdatei Die Quantifizierungsstandards und Patientenproben m ssen mit der identischen Methodik extrahiert werden da es ansonsten zu fehlerhaften Testergebnissen kommen kann 5 Bei der berwachung eines Patienten muss bei allen Bestimmungen dasselbe Extraktionsverfahren verwendet werden da die Ergebnisse sonst nicht vergleichbar sind 6 Alle Testergebnisse aus diesen und anderen Tests m ssen im Zusammenhang mit der klinischen Anamnese den epidemiologischen Daten und allen anderen Daten die dem zust ndigen Arzt vorliegen gesehen werden Die Pr valenz der Infektion beeinflusst den pr diktiven Wert des Assays Wie bei anderen Tests auch schlie t ein negatives Ergebnis eine CMV Infektion nicht aus 9 Ein falsch negatives Ergebnis kann dadurch zustande kommen dass beim Erreger neue Genommutationen Insertionen Deletionen oder Rearrangements aufgetreten sind 10 Falsch negative Ergebnisse k nnen auftreten wenn in der Probe aufgrund einer niedrigen Viruslast aufgrund eines erst fr hen Stadiums der Erkrankung oder aufgrund von Fehlern bei Entnahme Transport oder Handhabung zu wenig Erreger vorhanden sind 11 Wie bei anderen Testverfahren kann es auch
10. enproben und Assaykontrollen erfolgt mit dem Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation Kit und dem Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Ger t Hinsichtlich der Nukleins ureextraktion mit diesem Kit die Gebrauchsanweisungen des Herstellers beachten 2 Im Dropdownmen Protocol Protokoll des MagNA Pure LC Systems die Optionen Total NA Gesamtzahl der Nukleins uren und anschlie end Total NA Variable_elution_volume bik w hlen Damit werden die passenden Einstellungen f r den Lauf geladen Das Probenprotokoll sollte Total NA Variable_elution_volume sein Als Probenvolumen sollte 200 ul und als Elutionsvolumen 50 ul eingestellt sein Das Verd nnungsvolumen sollte f r alle Proben auf Null eingestellt sein Das Post Elution Protocol muss auf None Keine eingestellt sein Darauf achten dass Proben und Kontrollen sich auf der Probenkartusche an der richtigen Position befinden Jede Probe Niedrigpositiv und Hochpositiv Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 9 200 ul von jeder Probe Niedrig und Hochpositiv Kontrolle sowie Leerwert Kontrolle in die entsprechende Position der Probenkartusche pipettieren 10 Den F llpegel der Proben und Kontrollen in der Probenkartusche einer Sichtpr fung unterziehen um sicherzustellen dass Probe n zugegeben wurde n 11 Die DNA zur Extraktions und Amplifikationskontro
11. ere ELISA Streifen wiederholen 13 Nach der 10 min tigen Lyseinkubation 8 Spitzen je ELISA Streifen und den Betriebsmodus P3 der Biohit Pipette verwenden um jeder Probe in dem Probengef 100 ul des magnetischen Silica Gemisches zuzusetzen Die Spitzen in die Kavit ten der ELISA Streifen geben und Start dr cken um das magnetische Silica Gemisch zu mischen und anzusaugen 14 Das magnetische Silica Gemisch in das jeweilige Probengef geben und die Pipettenspitze n in die Proben eintauchen Sie sollten sich unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels befinden Auf Start dr cken um das magnetische Silica anzusaugen zu pipettieren und mit den Proben zu mischen 3x Die Pipettenspitzen m ssen unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels bleiben damit der Mischvorgang korrekt ausgef hrt wird 15 F r jedes weitere Probengef Schritt 13 und 14 wiederholen 16 Nach Zugabe des magnetischen Silica Gemisches zu allen Probengef en den Extraktionslauf starten 17 Nach Abschluss des Laufs das die Probengef e aus dem Ger t nehmen Werden die Proben nicht sofort weiterverarbeitet sind sie in individuelle R hrchen zu berf hren um das Risiko dass magnetisches Silica zur ck in die Probe f llt zu minimieren Die extrahierte DNA bis zum Gebrauch bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitlagerung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Beschicken der Disc auf einem K hlblock aufbewahren E
12. ert Kontrolle in Probengef e pipettieren 7 Die interne Kontrolle zweimal 2x pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 8 In jede Proben und Kontroll Kavit t 5 ul interne Kontrolle pipettieren Zwischen den Proben die Pipettenspitze wechseln 9 Nach den Angaben im Benutzerhandbuch das die Probengef e neue Verbrauchsmaterialien f r den Aspirator und die Reagenzien in das easyMAG Ger t laden 10 Die Lyse im Ger t starten und die Iysierten Proben 10 Minuten inkubieren bevor das magnetische Silica Gemisch zugegeben wird 11 Das magnetische Silica Gemisch w hrend der Lyse Inkubation vorbereiten Silica mischen und mit nukleasefreiem Wasser verd nnen indem 1 Teil magnetisches Silica zu 3 Teilen nukleasefreiem Wasser gegeben wird z B 270 l magnetisches Silica 810 ul nukleasefreies Wasser Je Probe mindestens 135 ul magnetisches Silica Gemisch vorbereiten 12 Zum bertragen des Silica Gemisches in die Kavit ten der ELISA Streifen das magnetische Silica Gemisch anmischen und 1 Spitze sowie den Betriebsmodus P2 der Biohit Pipette verwenden Auf Start dr cken um 1050 ul des magnetischen Silica Gemisches anzusaugen und nochmals auf Start dr cken um das erste Volumen zur ck in das R hrchen mit Silica Gemisch auszuwerfen Auf Start dr cken um 125 ul des magnetischen Silica Gemisches in 8 einzelne Kavit ten des ELISA Streifens zu pipettieren Bedarfsweise f r weit
13. f hren Wie alle Herpesviren ruft auch das CMV nach der akuten Infektion eine latente Infektion des Wirts hervor Nach Immunsuppression oder anderen Erkrankungen kann es zu einer Reaktivierung des Virus kommen Bei immungeschw chten Patienten ist das CMV eine anerkannte Ursache f r Morbidit t und Mortalit t Voraussetzung f r eine Pr ventivbehandlung bei Hochrisikopatienten ist eine Fr herkennung der CMV Replikation durch Messung des Virustiters Wenn im Blut oder Plasma ein bestimmter Virustiter erreicht ist bevor klinische Symptome auftreten k nnen eine antivirale Therapie oder Ver nderungen der immunsuppressiven Behandlung indiziert sein Ausschlaggebend f r die effiziente und effektive Behandlung einer CMV Infektion bei solchen Patienten nach der Diagnosestellung ist ein Test mit dem sich das Vorhandensein von CMV in Blut und Plasma kontrollieren und quantifizieren l sst Der Simplexa CMV Assay entspricht dem CMV Standard der WHO Die Viruslast im Simplexa CMV Assay wird in internationalen Einheiten Units pro Milliliter IU ml angegeben GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Bei dem Test handelt es sich um ein Real Time PCR System zur Amplifikation und Detektion Der DNA Nachweis des Cytomegalovirus in Vollblut und Plasma erfolgt durch eine bifunktionelle fluoreszierende Primersonde Der Test besteht im Wesentlichen aus zwei Schritten 1 Extraktion von DNA aus Patientenproben 2 Amplifizierung eines spezifischen Zielmo
14. f Cytomegalovirus Plasma DNA Load Measurement and Definition of Treatment Criteria by Analysis of Correlation to Antigen Detection S 1498 1504 Vol 42 Nr 4 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 6 Baldanti F Lilleri D Gerna G Monitoring human cytomegalovirus infection in transplant recipients J Clin Virol 2008 41 3 237 41 7 Fryer JF Heath AB Anderson R Minor PD and the collaborative study group Collaborative study to evaluate the proposed 1st WHO International Standard for human cytomegalovirus HCMV for nucleic acid amplification NAT based assays WHO ECBS Report 2010 WHO BS 10 2138 8 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2 Auflage 1999 9 CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4 Aufl und National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A Die Anwendung von Scorpions Sonden f r Zwecke in Zusammenhang mit der n vitro Diagnostik beim Menschen ist durch eine Lizenz gesch tzt die Focus Diagnostics Inc von DxS Ltd erworben hat Die Farbstoffe Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar sind Marken der Biosearch Technologies Inc BTI Die Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar Farbstofftechnologie ist im Rahmen eines Vertrags mit BTI lizenziert und diese P
15. gleichen Disc angesetzt werden m ssen die Positiv und Leerwert Kontrollen aus jedem verwendeten Kit getestet werden Der Master Mix enth lt gt 1 Glycerin welches bei Einatmen oder Hautkontakt zu Reizungen f hren kann Nach Einatmen oder Ber hrung sollten Erste Hilfe Ma nahmen eingeleitet werden Bei der Handhabung von Chemikalien allgemeine 18 19 Simplexa CMV Seite 4 Sicherheitsrichtlinien befolgen Dieses Produkt ist nach der Gefahrenstoffverordnung keinen Kennzeichnungsrichtlinien unterworfen Eine l ngere Aufbewahrung extrahierter Proben bei 2 C bis 8 C wird nicht empfohlen die Leistung wurde unter diesen Bedingungen nicht gepr ft Das Kit bei offensichtlich angebrochener oder besch digter Verpackung bzw angebrochenem oder besch digtem Inhalt nicht verwenden und Focus Diagnostics kontaktieren Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments GEBRAUCHSANWEISUNG A PROBENGEWINNUNG Als Probe kommt durch Venenpunktion gewonnenes Vollblut oder Plasma zum Einsatz Keine Probenr hrchen mit Heparin als Antikoagulans verwenden Heparin inhibiert die PCR PROBENEXTRAKTIONSBEREICH In einem speziellen der Extraktion von Proben und Kontrollen vorbehaltenen Bereich arbeiten Die Vorbereitung der Proben f r die Extraktion wird auf einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgef hrt Extraktion mit dem MagNA Pure LC Extraktionsverfahren von Roche 1 Die Extraktion von Nukleins uren aus Patient
16. hier zu falsch positiven Ergebnissen kommen Eine Wiederholung des Tests oder die Durchf hrung des Tests mit einem anderen Ger t k nnte in manchen F llen indiziert sein 12 Die Leistung dieses Assays wurde nicht f r das Screening von Blut oder Blutprodukten auf das Vorliegen von CMV bestimmt 13 Dieser Assay kann keine Erkrankung ausschlie en die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird ON Simplexa CMV Seite 8 fous SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN METHODENVERGLEICH Anhand einer linearen Regressionsanalyse nach Passing Bablok im gesamten Linearit tsbereich wurde ein Vergleich mit einem Pr dikatstest mit CE Zeichen durchgef hrt Die Berechnung der Parameter der linearen Regression Steigung amp Achsenschnittpunkt mit einem 95 Konfidenzintervall erfolgte nach dem Passing Bablok Verfahren Simplexa CMV Assay Kit zur Quantifizierung Methodenvergleichsstudie PROBEN Matrix Plasma Extraktionsmethode MagNA Pure Regressionsanpassung nach Passing Bablok mit Konfidenzgrenze P B Reg Kurve 0 12 1 09 X 95 CI f r Achsenschnittpunkt 0 1422 0 3686 95 Clf rSteigung 1 0265 1 1573 7 4In 73 Korrelationskoeffizient R 0 97 Einfache CMV Konz Log10 1U ml an 3 4 5 6 CMV Konz Log10 1U ml im Pr dikats Kit mit CE Zeichen o Einfache CMV Konz Log10 1U mI P B Anpassung Identit tskurve Ref Test 95 CL Simplexa CMV Seite 9 fous Simplexa CMV Assay Kit zur Quant
17. ifizierung Methodenvergleichsstudie PROBEN Matrix Whole Blood Extraktionsmethode MagNA Pure Regressionsanpassung nach Passing Bablok mit Konfidenzgrenze P B Reg Kurve 0 4 0 92 X 95 CI f rAchsenschnittpunkt 0 1285 0 8178 95 Cl f r Steigung 0 8304 1 0217 7 4 n 97 Korrelationskoeffizient R 0 88 Einfache CMV Konz Log10 1uU ml nn 3 4 5 6 CMV Konz Log10 1uU ml im Pr dikats Kit mit CE Zeichen e Einfache CMV Konz Log10 1U mI P B Anpassung Identit tskurve Ref Test REPRODUZIERBARKEIT Mit einem Panel aus k nstlichen Plasma und Vollblutproben denen verschiedene Konzentrationen eines CMV Stammes zugesetzt worden waren wurden Reproduzierbarkeitsstudien durchgef hrt Das Probenpanel umfasste in jeder Matrix eine negative nicht beimpfte eine schwach positive ca 2 4x Nachweisgrenze eine m ig positive ca 8 10x Nachweisgrenze und eine hoch positive nahe an der oberen Nachweisgrenze des Assays Probe Weiterhin umfasste die Probengruppe f r jeden Quantifizierungspegel einen CMV Quantifizierungsstandard Satz QS n 5 aus einer einzigen Charge der als unbekannt zu testen war Dasselbe Probenpanel n 13 enthielt die Niedrigpositiv Kontrolle LPC die Hochpositiv Kontrolle HPC und die Leerwert Kontrolle NTC und wurde einmal t glich von jedem Anwender mit dem MagNA Pure LC Ger t und dem MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation Kit sowie dem NucliSENS easyMAGTM System
18. it Konzentrationen oberhalb des linearen Bereiches werden als gt 3 96 x 10 IU ml ausgewiesen und Proben unterhalb des linearen Bereiches als lt 713 IU ml ANALYTISCHE REAKTIVIT T KREUZREAKTIVIT T Es wurde eine Untersuchung der analytischen Spezifit t Kreuzreaktivit t des Simplexa Y Assays durchgef hrt Den Studien zufolge sind die Primer CMV spezifisch und sind mit anderen Viren oder Bakterien die hliche klinische Symptome hervorrufen oder in der normalen Flora der relevanten Probentypen vorkommen nicht kreuzreaktiv kreuzreaktiven Erreger wurden Dreifachbestimmungen durchgef hrt Erreger Erreger Plasma Ergebnis Vollblut Elson HBV unverd nntes Not Detected Nicht detektiert N Z N Z Kontrollmaterial HCV unverd nntes Not Detected Nicht detektiert N Z N Z Kontrollmaterial Adenovirus Not Detected Nicht detektiert Adenovirus Not Detected Nicht detektiert HIV 1 Not Detected Nicht detektiert HIV 1 Not Detected Nicht detektiert HIV 2 Not Detected Nicht detektiert HIV 2 Not Detected Nicht detektiert HSV 1 Not Detected Nicht detektiert HSV 1 Not Detected Nicht detektiert HSV 2 Not Detected Nicht detektiert HSV 2 Not Detected Nicht detektiert HHV 6 Not Detected Nicht detektiert HHV 6 Not Detected Nicht detektiert JCV Not Detected Nicht detektiert JCV Not Detected Nicht detektiert HHV 7 Not Detected Nicht detektiert HHV 7 Not Detec
19. lek ls in jedem Analyt und der internen Kontrolle mithilfe eines bifunktionellen fluoreszierenden Sondenprimers und eines R ckw rts Primers Der Assay liefert ein Ergebnis die virale DNA in der Probe wird ber eine gut konservierte Zielregion im UL83 Gen des CMV Genoms identifiziert Zur berpr fung der Extraktion und zur Erkennung einer Hemmung der PCR wird eine interne Kontrolle mitgef hrt Das aus jeder Probe gewonnene Amplifikationssignal wird mit einer Kalibrierkurve verglichen und quantifiziert Simplexa CMV Seite 2 MITGELIEFERTES MATERIAL Das Simplexa CMV Kit von Focus Diagnostics enth lt ausreichend Reagenzien f r 100 Bestimmungen Beschreibung des Kits Bezeichnung der Komponente EG SYMBOL Kurzbezeich Deckelfa Anzahl Reaktionen Volume AUF ETIKETT Fl schch pro en Gef Kit Simplexa CMV Primer Mix MOL2201 A PM Braun 2 50 100 50 ul Simplexa Master Mix MOL2000 BI MM Gr n 2 50 100 200 ul Simplexa Extraction amp Amplification Control MOL9001 CONTROL er ern 50 150 250 ul DNA Simplexa CMV Low Positive Control MOL2202 CONTROL LPC wer 6 16 200 1 Simplexa CMV High Positive Control MOL2203 HPC Rot 6 1 6 200 ul Beschreibung der Komponente Komponente Beschreibung Mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Primer die CMV und die Interne DNA Kontrolle spezifisch quantifizieren Sonden Target Fluorophor Exzi
20. lle zweimal pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 12 F r je 16 Proben 1 16 Proben 100 ul der IC in 6 ml Lysepuffer in ein konisches R hrchen pipettieren Kurz auf dem Vortex mischen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben o Werden beispielsweise mehr als 16 Proben 17 32 Proben extrahiert m ssen 200 ul der IC in 12 ml Lysepufferl sung in ein konisches R hrchen pipettiert werden Kurz auf dem Vortex mischen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben 13 Die Probenkartusche in das MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extraktionsger t berf hren und die Extraktion starten 14 Nach Abschluss der Nukleins ureextraktion kann die Kartusche mit den extrahierten Kontrollen und Patientenproben aus dem MagNA Pure Extraktor herausgenommen und verschlossen werden Die extrahierte DNA vor der Verwendung bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitlagerung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Laden der Disc auf einem K hlblock aufbewahren ONDARY Extraktion mit dem NucliSENS easyMAG Extraktionsverfahren von bioM rieux 1 Zur Bedienung von Ger t und Software ist das Benutzerhandbuch des NucliSENS easyMAG zu beachten 2 Inder NucliiSENS easyMAG Software die Vorlage Generic Allgemein mit folgenden Einstellungen w hlen Default Request Generic 2 0 1
21. olle HPC erf llt die Akzeptanzkriterien falls die in der HPC detektierte CMV Konzentration innerhalb der Toleranzgrenzen wie auf dem chargenspezifischen Etikett angegeben liegt Die IC sollte nachgewiesen werden dies ist aber nicht zwingend erforderlich 2 Interpretation der Ergebnisse Simplexa CMV Seite 7 Interpretation der Ergebnisse Beispiel CMV Wert IC Wert Interpretation Not Detected Nicht Detected Detektiert EMI nicht detektert lt 713 IU ml n zZ CMV detektiert unterhalb LLoQ quantitative Untergrenze X IU ml n zZ CMV Nachweis in der bestimmten Konzentration gt 3 96 x 10 IU mI N zZ CMV detektiert oberhalb ULoQ quantitative Obergrenze Not Detected Nicht Not Detected detektiert Nicht detektiert Ung ltig erneut extrahieren und Test wiederholen 3 Validit t der Probenergebnisse Eine Probe ist valide falls entweder 1 kein CMV detektiert und die IC nachgewiesen wurde oder 2 CMV detektiert wird Bei CMV positiven Ergebnissen muss die interne Kontrolle nicht unbedingt nachgewiesen werden 3 Die Amplifikationskurven aller Ergebnisse sind zu berpr fen insbesondere wenn eine Data Quality Meldung Datenqualit t vorliegt Eine g ltige Amplifikationskurve zeigt einen glatten exponentiellen Anstieg Weitere Einzelheiten dazu finden sich im Benutzerhandbuch EINSCHR NKUNGEN 1 In vitro Diagnostikum 2 Nur f r den Export bestimmt 3 Die Personen di
22. or equivalent oder quivalent Standardanfrage Run Name Prefix Anfangskode as appropriate beliebig der Laufbezeichnung Sample ID prefix Anfangskode as appropriate beliebig der Proben ID Sample Type Probentyp Primary Prim r Workflow Defaults On board Iysis Incubation Lyse Inkubation im Ger t Standardarbeitsabl ufe On board Silica Incubation Inkubation mit Silica im Ger t Sample Addition Guidance Off Hinweise zur Zugabe von Proben Aus Reagent Tracking Lysis Silica Internal Control reagent tracking disabled R ckverfolgung von R ckverfolgung der Reagenzien Lyse Reagenz Silica und interner Kontrolle deaktiviert 3 Die individuellen Probendaten in der Bildschirmmaske Extraction Request Extraktionsanforderung wie folgt eingeben Simplexa CMV Seite 5 FOCUS Sample ID Proben ID Enter sample name Probenbezeichnung eingeben Request Anfrage Generic 2 0 1 or equivalent oder quivalent Volume Volumen mL 0 200 Eluate Eluat L 50 Type Typ Primary Prim r Priority Priorit t Normal Matrix Other Sonstige 4 Nach den Angaben im Benutzerhandbuch in der NucliiSENS easyMAG Software einen Extraction Run Extraktionslauf erstellen 5 Jede Probe Niedrigpositiv und Hochpositiv Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 6 200 ul der Probe der Niedrig Hochpositiv und der Leerw
23. ren vorsichtig mischen 4 Kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 5 Mit der Vorbereitung der PCR fortfahren 6 Das Reaktionsgemisch innerhalb einer Stunde nach Zubereitung verwenden Sofern die PCR Vorbereitung nicht sofort nach dem Ansetzen des Reaktionsgemisches erfolgt sollte dieses bei 2 C bis 8 C gelagert werden E BEREICH F R DIE REAL TIME PCR AMPLIFIKATION In einem speziellen der Vorbereitung der Universal Disc mit 96 Kavit ten f r den Simplexa CMV Assay vorbehaltenen Bereich arbeiten 1 In jede Kavit t 5 0 ul des Reaktionsgemischs pipettieren 5 0 ul der extrahierten Positivkontrollen in die Kavit ten HPC und LPC pipettieren 5 0 ul der extrahierten Patientenprobe in die entsprechende Kayvit t S pipettieren 5 0 ul der extrahierten Leerwert Kontrolle in die Kavit t NTC pipettieren Die Disc mit dem Universal Disc Cover Tape abdecken Den Deckel des Integrated Cycler ffnen Die verschlossene Universal Disc auf die Platte legen Den Deckel vorsichtig schlie en Auf Run Lauf klicken 10 Auf Start klicken F DATENANALYSE 1 Einzelheiten zur Durchf hrung der Datenanalyse und zum Exportieren der Analysen sofern dies erforderlich ist sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen QUALIT TSKONTROLLE Jedes Labor sollte ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen Bestimmungen und der blichen guten Laborpraxis eigene Quali
24. rodukte werden ausschlie lich f r klinische diagnostische oder Forschungs und Entwicklungszwecke verkauft Dieser Beipackzettel ist auf www focusdx com in Franz sisch Deutsch Italienisch Spanisch und brasilianischem Portugiesisch verf gbar Versionen in anderen Sprachen sind m glicherweise bei Ihrem lokalen Vertriebspartner verf gbar VERTRIEB DURCH C mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Deutschland 0344 BESTELLINFORMATIONEN PI MOL2200 0US Telefon 800 838 4548 nur USA 562 240 6500 International Rev D Fax 562 240 6510 Erstellungsdatum 22 April 2013 TECHNISCHE HILFE Telefon 800 838 4548 nur USA 562 240 6500 International Focus Fax 562 240 6526 Diagnosties Besuchen Sie unsere Webseite www focusdx com Cypress Kalifornien 90630 USA
25. stellen Die Studie bestand daraus eine hoch positive und eine hoch negative Probe abwechselnd auf jeder Disc zu platzieren Der Verschleppungseffekt wurde durch Vergleich der beobachteten Negativrate f r die hoch negative Probe mit der erwarteten Rate unter normalen Bedingungen der Testwiederholung bestimmt In den bisherigen Untersuchungen wurde keine signifikante Kontamination durch Verschleppung festgestellt G Simplexa CMV Seite 15 FOCUS LITERATUR 1 Mocarski E S 1993 Cytomegalovirus biology and replication p 173 226 In B Roizman R J Whitley and C Lopez ed the Human Herpesviruses Raven Press New York N Y 2 Fowler KB Stagno S Pass RF Britt WJ Boll TJ Alford CA The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status N Engl J Med 1992 Mar 5 326 10 663 7 3 Grundy JE Lui SF Super M Berry NJ Sweny P Fernando ON Moorhead J Griffiths PD Symptomatic cytomegalovirus infection in seropositive kidney recipients reinfection with donor virus rather than reactivation of recipient virus Lancet 1988 Jul 16 2 8603 132 5 4 Griffiths P D and Emery V C 2002 Cytomegalovirus S 433 461 In D D Richman R J Whitley und F G Hayden Hrsg Clinical Virology Zweite Auflage ASM Press Washington D C 5 Kalpoe J S et al oder A C M Kroes M D de Jong J Schinkel C S de Brouwer M F C Beersma und E C J Claas 2004 Validation of Clinical Application o
26. t tskontrollbereiche wie auch die H ufigkeit der Qualit tskontrollen ermitteln ERSTELLUNG VON ERGEBNISBERICHTEN 1 Laufvalidit t Durch berpr fung der CMV und IC Ergebnisse f r die Niedrigpositiv Kontrolle LPC Hochpositiv Kontrolle HPC und Leerwert Kontrolle NTC die Validit t des Laufs ermitteln Damit der Lauf als valide gilt m ssen alle drei Kontrollen die Akzeptanzkriterien erf llen Bei ung ltigem Lauf m ssen alle Patientenproben erneut getestet werden CO NDUIPWDMN Akzeptanzkriterien CMV DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle IC No Template Control NTC Not Detected Nicht detektiert Detected Detektiert Low Positive Control LPC Innerhalb des Toleranzwertes auf dem nicht zutreffend chargenspezifischen Etikett High Positive Control HPC Innerhalb des Toleranzwertes auf dem nicht zutreffend chargenspezifischen Etikett e Der Leerwert NTC entspricht den Akzeptanzkriterien falls kein CMV detektiert und die interne Kontrolle IC nachgewiesen wurde Die Detektion von CMV in der NTC zeigt an dass die Proben m glicherweise w hrend der Verarbeitung kontaminiert wurden e Die Niedrigpositiv Kontrolle LPC erf llt die Akzeptanzkriterien falls die in der LPC detektierte CMV Konzentration innerhalb der Toleranzgrenzen wie auf dem chargenspezifischen Etikett angegeben liegt Die IC sollte nachgewiesen werden dies ist aber nicht zwingend erforderlich e Die Hochpositiv Kontr
27. tation Emission Zielgen Farbstoff Simplexa CMV Primer Mix PM Primer Mix CMV FAM 495 nm 520 nm UL83 Gen Interne Kontrolle Q670 644 nm 670 nm A thaliana Gen Simplexa Master Mix MM Master Mix DNA Polymerase Puffer und dNTPs Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA Ein 577 Basenpaare umfassendes DNA Fragment aus dem Gen das die N IC DNA f r die Extraktions und Methyltransferase der gro en Uhntereinheit der Ribulose 1 5 bisphosphat Amplifikationskontrolle Carboxylase Oxygenase der Pflanze Arabidopsis thaliana kodiert Simplexa CMV Low Positive Control LPC Niedrigpositiv Kontrolle Inaktiviertes CMV in humaner Basismatrix Simplexa CMV High Positive Control HPC Hochpositiv Kontrolle Inaktiviertes CMV in humaner Basismatrix Simplexa CMV Barcode Card Barcode Karte Test spezifische Parameter ERFORDERLICHES JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Simplexa CMV Quantitation Standards MOL2210 3M Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio Software Version 5 0 oder h her Universal Discs zur Verwendung auf dem Integrated Cycler Universal Disc Cover Tape Roche MagNA Pure LC System und zugeh riges Verbrauchsmaterial Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Kat Nr 03038505001 P NucliSENS easyMAG Ger t von bioM rieux und dazugeh rige s Verbrauchsmaterial und Reagenzien P Biohit bioMerieux Mehrkanalpipette P ELISA
28. ted Nicht detektiert HHV 8 Not Detected Nicht detektiert HHV 8 Not Detected Nicht detektiert Rubella Not Detected Nicht detektiert Rubella Not Detected Nicht detektiert Parvovirus Not Detected Nicht detektiert Parvovirus Not Detected Nicht detektiert Toxoplasma gondii Not Detected Nicht detektiert Toxoplasma gondii Not Detected Nicht detektiert VZV Not Detected Nicht detektiert VZV Not Detected Nicht detektiert EBV Not Detected Nicht detektiert EBV Not Detected Nicht detektiert HTLV 1 Not Detected Nicht detektiert HTLV 1 Not Detected Nicht detektiert INTERFERENZ Von jedem m glicherweise Der SimplexaTY CMV Assay erkennt CMV DNA auch im Beisein m glicher St rsubstanzen spezifisch Als St rsubstanzen wurde solche Substanzen erachtet die in Patientenproben vorhanden sein k nnen exogene Stoffe die in Proben m glicherweise vorhanden sind oder Substanzen die bei der Probengewinnung verwendet werden F r den Zweck der Studie wurden der negativen Vollblut und Plasma Matrix CMV und St rsubstanzen zugesetzt Folgende St rsubstanzen wurden untersucht Azathioprin Cyclosporin Ganciclovir Hydroxychloroquin Prednison Abacavir Efavirenz und Darunavir Es wurde keine Interferenz beobachtet KONTAMINIERUNG DURCH VERSCHLEPPUNG Die Amplifikation von Verschleppungen wurde mit anderen Assays f r das Ger t und die Universal Disc ermittelt Die Studien zielten darauf ab Kontaminationen in hoch negativen Proben festzu
29. trug Die untere LLoQ lag bei 713 IU ml LINEARIT T Die Bestimmung der Linearit t erfolgte unter Verwendung von Proben die sich aus einem Stamm mit bekannter Bestandskonzentration der einer klinisch negativen Plasma bzw Vollblutmatrix zugesetzt wurde zusammensetzten Die Probengruppe umfasste mindestens 10 Pools bekannter Kopienzahl ber den erwarteten linearen Bereich Von den Pools lagen mindestens 3 Pools von der Konzentration her an der quantitativen Untergrenze Lower Limit of Quantitation LLoQ 2 lagen an der quantitativen Obergrenze Upper Limit of Quantitation ULoQ und die verbleibenden Pools verteilten sich gleichm ig zwischen der LLOQ und der ULOQ Jede Probe wurde im Zufallsverfahren in mindestens 3 Replikaten getestet Das Protokoll zur Bestimmung der Linearit t wurde f r jeden Probentyp mit jeder der beiden Extraktionsmethoden ausgef hrt Die einzelnen Werte f r den linearen Bereich sind in der untenstehenden Tabelle aufgef hrt Plasma Vollblut MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag IU ml 713 bis 3 96 x 10 396 bis 3 96 x 10 396 bis 3 96 x 10 396 bis 3 96 x 10 Kopien mi 180 bis 1 00 x 10 100 bis 1 00 x 10 100 bis 1 00 x 10 100 bis 1 00 x 10 Simplexa CMV Seite 12 Focus Linearit tskurve f r Plasma bei easyMAG Extraktion CMV Konz Log10 IU ml des Simplexa Kits 0 0 1 0 2 0 3 0 40 5 0 6 0 70 8 0 9 0 10 Erwartete CMV Konz Log10 1u ml Regressionsgleich
30. ung Log_Simplexa_CMV 0 6536 1 031096 Log_Erwartet_CMV Linearit tskurve f r Vollblut bei easyMAG Extraktion 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 B 20 CMV Konz Log10 IU mI des Simplexa Kits 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 70 8 0 9 0 10 Erwartete CMV Konz Log 10 IU mI Regressionsgleichung Log_Simplexa_CMV 0 193615 1 014454 Log_ Erwartet _CMV Simplexa CMV Seite 13 fous Linearit tskurve f r Plasma bei MagNA Pure Extraktion 10 9 0 1 8 0 70 5 0 40 3 0 B CMV Konz Log10 1u ml des Simplexa Kits a FT Ze 0 0 1 0 2 0 3 0 40 5 0 6 0 70 8 0 9 0 10 Erwartete CMV Konz Log10 1u ml Regressionsgleichung Log_Simplexa_CMV 0 07904 1 04182 Log_Erwartet_CMV Linearit tskurve f r Vollblut bei MagNA Pure Extraktion 6 0 zA 5 0 CMV Konz Log10 IU mI des Simplexa Kits 0 0 1 0 2 0 3 0 40 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 Erwartete CMV Konz Log 10 IU mI Regressionsgleichung Log_Simplexa_CMV 0 101316 1 032461 Log_Erwartet_CMV Simplexa CMV Seite 14 MESSBEREICH Alle Extraktionsmethoden und Probentypen waren bis lt 3 96 x 10 IU ml linear Die Untergrenze des Messbereichs des Assays basiert auf dem Probentyp und der Extraktionsmethode die den h chsten im linearen Bereich liegenden Wert f r die untere LLOQ in IU ml ergab Damit liegt der Messbereich des Assays zwischen 713 IU ml und lt 3 96 x 10 IU ml Proben m
31. zur Evaluierung der Nachweisgrenze des experimentellen Simplexa CMV Kits unter Verwendung von zwei Extraktionsmethoden Zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurden 3 getrennte Extraktionen und PCR L ufe durchgef hrt Jede extrahierte Probe wurde in achtfacher Ausf hrung eine Extraktion 8 Kavit ten zusammen mit Assaykontrollen Einzelbestimmungen getestet Von jedem Element des Panels wurden daher insgesamt 24 Replikate getestet Die Nachweisgrenze Limit of Detection LoD entspricht der niedrigsten Konzentration die eine Nachweisrate 2 95 ergibt Das Protokoll zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurde f r jeden Probentyp mit jeder der beiden Extraktionsmethoden ausgef hrt Die einzelnen LoD Werte sind in der untenstehenden Tabelle aufgef hrt Die LoD f r den CMV Assay entspricht der h chsten der f r alle Probentypen und Extraktionsmethoden ermittelten LoDs und betrug 711 IU ml Simplexa CMV Seite 11 Plasma Vollblut MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag IU ml 711 99 568 585 Kopien ml 180 25 145 148 Die Nachweisgrenze f r diesen Probentyp entspricht der niedrigsten Konzentration bei der gt 95 von 24 Replikaten positiv getestet wurden UNTERE QUANTIFIZIERUNGSGRENZE LLoQ Die untere Quantifizierungsgrenze LIoQ Lower Limit of Quantification wurde definiert als die niedrigste Konzentration bei der die Standardabweichung f r alle Probentypen und Extraktionsmethoden lt 0 3 log IU ml be
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