Simplexa™ EBV - Focus Diagnostics
Contents
1. 2 9 10 11 12 Die Personen die die Analyse durchf hren sollten sich vor Durchf hrung des Assays eingehend mit den Testverfahren und der Ergebnisinterpretation vertraut gemacht haben Zur Quantifizierung unbekannter Patientenproben speichert die 3M Integrated Cycler Studio Software die letzte g ltige Kalibrierungsdatei Die Quantifizierungsstandards und Patientenproben m ssen mit der identischen Methodik extrahiert werden da es ansonsten zu fehlerhaften Testergebnissen kommen kann Bei der berwachung eines Patienten muss das f r die Erstbestimmung der Probe verwendete Extraktionsverfahren f r alle weiteren Bestimmungen verwendet werden Alle Testergebnisse aus diesen und anderen Tests m ssen im Zusammenhag mit der klinischen Anamnese den epidemiologischen Daten und allen anderen Daten die dem zust ndigen Arzt vorliegen gesehen werden Die Pr valenz der Infektion beeinflusst den pr diktiven Wert des Assays Wie bei anderen Tests auch schlie t ein negatives Ergebnis eine EBV Infektion nicht aus Falls der die Infektion verursachende Organismus Genmutationen Insertionen Deletionen oder Rearrangements aufweist oder wenn die Testung im Fr hstadium der Erkrankung erfolgt kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen Falsch negative Ergebnisse k nnen auftreten wenn in der Probe aufgrund von Fehlern bei Entnahme Transport oder Verarbeitung zu wenig Erreger vorhanden sind Wie bei anderen Testverfahren kann es au2. 1 9 7 Simplexa EBV Seite 5 Das magnetische Silica Gemisch w hrend der Lyse Inkubation vorbereiten Silica mischen und mit nukleasefreiem Wasser verd nnen indem 1 Teil magnetisches Silica zu 1 Teil nukleasefreiem Wasser gegeben wird z B 540 ul magnetisches Silica 540 ul nukleasefreies Wasser Je Probe mindestens 135 ul magnetisches Silica Gemisch vorbereiten Zum bertragen des Silica Gemisches in die Kavit ten der ELISA Teststreifen das magnetische Silica Gemisch anmischen und 1 Spitze sowie den Betriebsmodus P2 der Biohit Pipette verwenden Auf Start dr cken um 1050 ul des magnetischen Silica Gemisches anzusaugen und nochmals auf Start dr cken um das erste Volumen zur ck in das R hrchen mit Silica Gemisch auszuwerfen Auf Start dr cken um 125 ul des magnetischen Silica Gemisches in 8 einzelne Kavit ten des ELISA Teststreifens zu pipettieren Bedarfsweise f r weitere ELISA Teststreifen wiederholen Nach der 10 min tigen Lyseinkubation 8 Spitzen je ELISA Teststreifen und den Betriebsmodus P3 der Biohit Pipette verwenden um jeder Probe in dem Probengef 100 ul des magnetischen Silica Gemisches zuzusetzen Die Spitzen in die Kavit ten der ELISA Teststreifen geben und Start dr cken um das magnetische Silica Gemisch zu mischen und anzusaugen Das magnetische Silica Gemisch in das jeweilige Probengef geben und die Pipettenspitze n in die Proben eintauchen Sie sollten sich unterhalb des Fl ssi
3. 0 8920 n 56 Korrelationskoeffizient R 0 96 Ko O O x hu D O N gt CD UI Y x Oo Q E N 4 5 LDT EBV Konz Log10 Kopien ml Simplexa EBV Konz Log10 Kopien ml P B Anpassung dentit tskurve Ref Test 95 CL G Simplexa EBV Seite 8 FOCUS REPRODUZIERBARKEIT Die Untersuchung zur Reproduzierbarkeit wurde auf zwei Systemen durchgef hrt mit einem Operator je System vier Kopien jeder Panelprobe je Lauf und zwei L ufen pro Tag ber f nf Tage Die Probengruppe zur Reproduzierbarkeit umfasste eigens hergestellte Vollblutproben denen ein EBV Stamm in unterschiedlicher Konzentration zugesetzt worden war Die Gruppe enthielt Kontrollen NTC HPC und LPC einen negativen Pool Vollblut ohne Zusatz einen schwach positiven Pool Zusatzkonzentration von etwa der zwei bis vierfachen Nachweisgrenze LoD Limit of Detection einen mittelstark positiven Pool etwa die 8 bis 10 fache LoD und einen stark positiven Pool obere Nachweisgrenze des Assays Weiterhin umfasste die Probengruppe f r jeden Quantifizierungspegel einen EBV Quantifizierungsstandard Satz QS n 5 aus einer einzigen Charge Die Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit jeder Panelprobe sind in der nachstehenden Tabelle aufgelistet Simplexa EBV Reproduzierbarkeit Standardabweichung Innerha Erwartungswert Geometrischer Log Anzahl der Zwisch Zwisch Zwisch Ib Probenbez Konzentration Mittelwert Mittelwert messbaren en
4. Gajl Peczalska KJ et al Epstein Barr virus induced B cell lymphoma after renal transplantation Acyclovir therapy and transition from polyclonal to monoclonal B cell proliferation N Engl J Med 1982 306 913 8 8 Borisch B Gatter KC Tobler A et al Epstein Barr virus associated anaplastic large cell lymphoma in renal transplant recipients Am J Clin Pathol 1992 98 312 8 9 Cinque P Brytting M Vago L et al Epstein Barr virus DNA in cerebrospinal fluid from patients with AIDS related primary lymphoma of the central nervous system Lancet 1993 342 398 401 10 Arribas JR Clifford DB Fichtenbaum CJ et al Detection of Epstein Barr virus DNA in cerebrospinal fluid for diagnosis of AIDS related central nervous system Iymphoma J Clin Microbiol 1995 33 1580 1583 11 Gaillard F Mechinaud Lacroix F Papin S et al Primary Epstein Barr virus infection with clonal T cell Ilymphoproliferation Am J Clin Pathol 1992 98 324 33 12 Jones JF Shurin S Abramowsky C et al T cell lymphomas containing Epstein Barr viral DNA in patients with chronic Epstein Barr virus infections N Engl J Med 1988 318 733 41 13 Telenti A Epstein Barr virus and Iymphoproliferative disorders basic concepts and diagnostic approach Clin Immunol Newsl 1991 11 81 88 14 Au W Y et al Quantification of circulating Epstein Barr virus EBV DNA in the diagnosis and monitoring of natural killer cell and EBV positive lymphomas in immunocompetent patients Blood 1 J
5. Hilfe Ma nahmen eingeleitet werden Eine l ngere Aufbewahrung extrahierter Proben bei 2 C bis 8 C wird nicht empfohlen die Leistung wurde unter diesen Bedingungen nicht gepr ft Das Kit bei offensichtlich angebrochener oder besch digter Verpackung bzw angebrochenem oder besch digtem Inhalt nicht verwenden und Focus Diagnostics kontaktieren Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments GEBRAUCHSANWEISUNG A PROBENGEWINNUNG Als Probe kommt durch Venenpunktion gewonnenes Vollblut zum Einsatz Keine Probenr hrchen mit Heparin als Antikoagulans verwenden Heparin inhibiert die PCR PROBENEXTRAKTIONSBEREICH In einem speziellen der Extraktion von Proben und Kontrollen vorbehaltenen Bereich arbeiten Die Vorbereitung der Proben f r die Extraktion wird auf einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgef hrt Extraktion mit dem MagNA Pure LC Extraktionsverfahren von Roche 1 Die Extraktion von Nukleins uren aus Patientenproben und Assaykontrollen erfolgt mit dem Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Kt und dem Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Ger t Hinsichtlich der Nukleins ureextraktion mit diesem Kit die Gebrauchsanweisungen des Herstellers beachten 2 Im Dropdownmen Protocol des MagNA Pure LC Systems die Optionen Total NA und anschlie end Total NA Variable_elution_volume bik w hlen Damit werden die passenden Einstellungen f r den Lauf geladen 3 Das Probenprotok
6. anderen Assays f r das Ger t und die Universal Disc ermittelt Die Studien zielten darauf ab Kontaminationen in hoch negativen Proben festzustellen Bei jeder Studie wurde auf jeder Disc abwechselnd eine hoch positive und eine hoch negative Probe platziert Der Verschleppungseffekt wurde durch Vergleich der gemessenen Negativrate f r die hoch negative Probe mit dem Erwartungswert f r Normalbedingung der Reproduzierbarkeit bestimmt In den bisherigen Untersuchungen wurde keine Kontamination durch Verschleppung festgestellt LITERATUR 1 Zur Hausen H Schulte Holthausen H Klein G et al EBV DNA in biopsies of Burkitt s tumors and anaplastic carcinomas of the nasopharynx Nature 1970 228 1056 8 2 Weiss LM Movahed LA Warnke RA et al Detection of Epstein Barr virus genomes in Reed Sternberg cells of Hodgkin s disease N Engl J Med 1989 320 502 6 3 Herbert H Steinbecher E Niedobitek G et al Distribution and phenotype of Epstein Barr virus harboring cells in Hodgkin s disease Blood 1992 80 484 91 Khan G Norton AJ Slavin G Epstein Barr virus in Hodgkin s disease Relation to age and subtype Cancer 1993 1 3124 9 Young LS Dawson CW Clark D et al Epstein Barr virus gene expression in nasopharyngeal carcinoma J Gen Virol 1988 69 1051 69 6 Hanto DW Frizzera G Gajl Peczalska KJ et al The Epstein Barr virus in the pathogenesis of post transplant lymphoma Transplant Proc 1981 13 756 60 7 Hanto DW Frizzera G
7. en en eines eichnung Kopien ml Kopien ml Kopien ml Ergebnisse Ger ten Tagen L ufen Laufes me 2 etinmin und 2 Merzmsimins e torlari a e taten as eeo seeni es s0 o2 oor 0o00 02 om ase saxo assi eee s ois oo o0 002 ons ass sox soo arw s o2 o o0 o0 0o21 CO mM TEE EEE MA mE HK m C konzentrie 1 0 x 10 1 99X 10 rter Pool a o 90x1 0 x 10 Bere 41 x 10 er a Schwach konzentrie 3 6 x 10 423x 10 Per Pool Nicht ANALYSEEMPFINDLICHKEIT NACHWEISGRENZE Die Nachweisgrenze LoD errechnete sich aus k nstlichen Proben eines EBV Stammes mit bekannter Bestandskonzentration der einer klinisch negativen Vollblutmatrix zugesetzt wurde Die Probengruppe umfasste eine Negativprobe Matrix ohne Zusatz und seriell verd nnte Proben mit unterschiedlicher Konzentration um die ungef hre Nachweisgrenze herum 24 Kopien aus drei 3 unterschiedlichen Extraktionen und PCR L ufen f r jeden Konzentrationsspiegel wurden mittels Probit Analyse ausgewertet um die geringste Konzentration zu ermitteln die sich mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 noch genau detektieren lie Die Nachweisgrenze wurde f r jedes der beiden Extraktionsverfahren ermittelt Die einzelnen Werte f r die Nachweisgrenze sind in der folgenden Tabelle aufgef hrt Basierend auf der h chsten f r beide Extraktionsverfahren ermittelten Nachweisgrenze wurde f r den EBV Assay eine Nachweisgrenze von 900 Kopien
8. ggf exportieren QUALIT TSKONTROLLE Jedes Labor sollte ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen Bestimmungen und der blichen guten Laborpraxis eigene Qualit tskontrollbereiche wie auch die H ufigkeit der Qualit tskontrollen ermitteln ERSTELLUNG VON ERGEBNISBERICHTEN 1 Laufvalidit t Durch berpr fung der EBV und IC Ergebnisse f r die Niedrigpositiv Kontrolle LPC Hochpositiv Kontrolle HPC und Leerwert Kontrolle die Validit t des Laufs ermitteln Damit der Lauf als valide gilt m ssen alle drei Kontrollen die Akzeptanzkriterien erf llen Bei ung ltigem Lauf m ssen alle Patientenproben erneut getestet werden Akzeptanzkriterien EBV DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle IC No Template Control NTC Nicht detektiert Detektiert Low Positive Control LPC Innerhalb des Toleranzwertes auf dem nicht zureiend chargenspezifischen Etikett High Positive Control HPC Innerhalb des Toleranzwertes auf dem nicht zutreffend chargenspezifischen Etikett e Der Leerwert NTC entspricht den Akzeptanzkriterien falls kein EBV detektiert und die Interne Kontrolle IC nachgewiesen wurde Die Detektion von EBV in der Leerwert Kontrolle zeigt an dass die Proben m glicherweise w hrend der Verarbeitung kontaminiert wurden e Die Niedrigpositiv Kontrolle LPC erf llt die Akzeptanzkriterien falls die in der LPC detektierte EBV Konzentration innerhalb der Toleranzgrenzen wie auf dem chargenspezifischen Etike
9. Abschnitt C beachten 1 2 3 4 5 6 T 8 9 1 0 In jede Kavit t 5 0 ul des Reaktionsgemischs pipettieren 5 0 ul der extrahierten Positivkontrollen in die Kavit t HPC und LPC pipettieren 5 0 ul der extrahierten Patientenprobe in die entsprechende Kavit t S pipettieren 5 0 ul der extrahierten Leerwert Kontrolle in die Kavit t NTC pipettieren Die Disc mit dem Universal Disc Cover Tape abdecken Den Deckel des Integrated Cycler ffnen Die verschlossene Universal Disc auf die Platte legen Den Deckel vorsichtig schlie en Auf Run Lauf klicken Auf Start klicken G Simplexa EBV Seite 6 Focus F DATENANALYSE 1 Nach Beendigung des Laufs auf Analyze Analysieren klicken 2 Die Farbstoffe einzeln pr fen oder durch Anklicken des Markierungsfeldes neben jedem Farbstoff alle Farbstoffe Kan le ausw hlen 3 Durch Anklicken von Print Preview Druckvorschau unten rechts wird eine Zusammenfassung der pr diktiven Werte ausgegeben Zur Vorschau der Amplifikationskurven das H kchen im Markierungsfeld Include Graphs Mit Kurven setzen Durch Setzen des H kchens im Markierungsfeld Include Calibration Result Mit Kalibrierungsergebnis wird dem Vorhersagelauf der Kalibrierungsbericht hinzugef gt Die Seiten mithilfe der Pfeiltasten links oben im Fenster Print Preview Druckvorschau durchbl ttern 4 Den Bericht nach Bedarf Print Ausdrucken oder Save Abspeichern 5 Die pr diktiven Werte
10. Simplexa EBV MOL2400 Rev F Ein Echtzeit PCR Assay zur quantitativen n vitro Bestimmung des Epstein Barr Virus EBV OCUS Diagnostics In vitro Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Der Simplexa EBV Assay von Focus Diagnostics dient der quantitativen In vitro Bestimmung der Nukleins uren des Epstein Barr Virus im Vollblut mit dem Integrated Cycler von 3M Die klinische Behandlung der mit EBV infizierten Patienten st tzt sich auf diesen Assay im Kontext mit der Klinik des Patienten sowie weiteren Laborparametern des Krankheitsverlaufes Der Assay ist nicht zum Screening von Spendern vorgesehen ZUSAMMENFASSUNG UND ERL UTERUNG Das Epstein Barr Virus EBV ein ubiquit rer B Iymphtroper Herpesvirus ist urs chlich f r die infekti se Mononukleose verantwortlich und steht in engem Zusammenhang mit verschiedenen Malignomen des Menschen Infektionen mit dem EBV sind h ufig und verlaufen meist blande bzw in Form einer selbstlimitierenden Erkrankung von zwei bis drei Wochen Dauer Als Mitglied der Herpesfamilie kann das EBV ber lange Zeitr ume schlummern um zu einem sp teren Zeitpunkt reaktiviert zu werden Die Erstinfektion kann als relativ benignes Syndrom verlaufen w hrend bei einem immunkompromittierten Patienten die Reaktivierung durchaus zu schwereren Folgen f hren kann EBV Nukleins uren und Proteine wurden im Gewebe bei folgenden Erkrankungen nachgewiesen Burkitt Lymphom M Hodgkin 24 Karzinome des Nasenrachenr
11. Webseite www focusdx com Simplexa EBV Seite 11 CE PI MOL2400 0US DE Rev F rstellungsdatum 13 Dezember 2012 Focus Diagnostics Cypress Kalifornien 90630 USA
12. aumes Transplantations bedingte Iymphoproliferative CA AIDS bedingtes prim res Lymphom des zentralen Nervensystems 1 sowie weitere B und T Zelllymphome Die Abkl rung EBV bedingter Erkrankungen mittels konventioneller Diagnostik bei immunsupprimierten Patienten ist nur in den seltensten F llen erfolgreich F r klinische Zwecke sind Kulturen weder praktisch noch sinnvoll und die Serologie ist im Kontext der Immunsuppression schwierig einzuordnen Diagnostikverfahren auf der Grundlage der Polymerasekettenreaktion PCR bieten die M glichkeit des zweckdienlichen EBV Nachweises aus Blutproben Die Kontrolle der Viruslast kann dazu beitragen Iymphoproliferative Erkrankungen nach einer Transplantation aufzudecken und Patienten mit AIDS auf Lymphome zu kontrollieren GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Bei dem Test handelt es sich um ein Echtzeit PCR System zur Amplifikation und Detektion Der DNA Nachweis des Epstein Barr Virus im Vollblut erfolgt durch eine bifunktionelle fluoreszierende Primersonde Der Test besteht im Wesentlichen aus zwei Schritten 1 Extraktion von DNA aus Patientenproben 2 Amplifizierung eines spezifischen Zielmolek ls in jedem Analyt und der internen Kontrolle mithilfe eines bifunktionellen fluoreszierenden Sondenprimers und eines R ckw rts Primers Der Assay liefert eine Zahl als Ergebnis die virale DNA in der Probe wird ber eine gut konservierte Zielregion im Lmp2A Gen des EBV Genoms identifiziert Z
13. ch hier zu falsch positiven Ergebnissen kommen Eine Wiederholung des Tests oder die Durchf hrung des Tests mit einem anderen Ger t k nnte in manchen F llen indiziert sein Es liegt f r diesen Assay kein Leistungsnachweis zum Screening von Spendern vor Die Leistungsf higkeit dieses Assays bei Gabe von Medikamenten zur Behandlung der infekti sen Mononukleose mit denen sich potenzielle Wechselwirkungen ergeben k nnen ist nicht bekannt Dieser Assay kann keine Erkrankung ausschlie en die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN METHODENVERGLEICH An der Studie zur klinischen bereinstimmung nahm eine 1 interne Pr fstelle teil Die Referenzwerte wurden mit Hilfe eines im Labor entwickelten Hochleistungstests LDT Laboratory Developed Test erstellt Aus prospektiv entnommenen Proben welche die Entnahmestelle zur EBV Detektion bzw Quantifizierung entgegennahm wurden insgesamt 56 Vollblutproben ausgew hlt Die Probenextraktion erfolgte mit dem MagNa Pure Extraktionsverfahren Die in die Auswertung einflie enden Proben lagen innerhalb des kombinierten Messbereiches der Referenz LDT und des Simplexa EBV Assays Die Passing Bablok Regression ergab eine Steigung von 0 82 und einen systematischen Fehler von 0 44 Simplexa EBV Methodenvergleich Passing Bablok Regression P B Reg Kurve 0 44 0 82 X 95 CI f r Achsenschnittpunkt 0 1250 0 7401 95 CI f r Steigung 0 7507
14. en Untereinheit der Ribulose 1 5 biphosphat Amplifikationskontrolle Carboxylase Oxygenase der Pflanze Arabidopsis thaliana kodiert SimplexaTM EBV Positive Control LPC d i i Niedrigpositiv Kontrolle Inaktiviertes EBV in humaner Basismatrix Simplexa EBV High Positive Control HPC Hochpositiv Kontrolle Simplexa EBV Barcode Card Barcode Karte Test spezifische Parameter Inaktiviertes EBV in humaner Basismatrix ERFORDERLICHES JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Simplexa EBV Quantitation Standards MOL2410 3M Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio Software Version 3 0 oder h her Universal Discs zur Verwendung auf dem Integrated Cycler Universal Disc Abdeckfolie 2 Roche MagNA Pure LC und zugeh riges Verbrauchsmaterial 2 Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Kat Nr 03038505001 P NucliSENS easyMAG Ger t von bioM rieux und dazugeh rige s Verbrauchsmaterial und Reagenzien Biohit bioM rieux Mehrkanalpipette P ELISA Teststreifenplatte 0 Ein Mehrkanalmikropipette n und oder Repetiermikropipette n mit einem Genauigkeitsbereich von 1 10 ul 10 100 ul und 100 1000 ul 11 Gefrierschrank 10 C bis 30 C mit manueller Abtaufunktion f r die Lagerung der gefrorenen Kit Komponenten 12 K hlschrank mit 2 C bis 8 C f r Proben und aufgetaute Kit Komponenten 13 Biologische Sicherheitswerkbank Laminarflow Haube f r die Durchf hrung der Extraktionen 14 Mikr
15. erfolgung von Lyse R ckverfolgung der Reagenz Silica und interner Kontrolle deaktiviert Reagenzien Die individuellen Probendaten in der Bildschirmmaske Extraction Request Extraktionsanforderung wie folgt eingeben Sample ID Proben ID Probenbezeichnung eingeben Request Anfrage Generic 2 0 1 oder quivalent Volume Volumen ml 0 100 Eluate Eluat ul 25 Type Typ Primary Prim r Priority Priorit t Normal Matrix Other Andere Nach den Angaben im Benutzerhandbuch in der NucliSENS easyMAGT M Software einen Extraction Run Extraktionslauf erstellen Jede Probe Niedrigpositiv und Hochpositiv Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 100 ul der Probe der Niedrig Hochpositiv und der Leerwert Kontrolle in das die Probengef e pipettieren Die Interne Kontrolle zweimal 2x pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In jede Proben und alle Kontroll Kavit ten 5 ul Interne Kontrolle pipettieren Zwischen den Proben die Pipettenspitze wechseln Nach den Angaben im Benutzerhandbuch das die Probengef e neue Verbrauchsmaterialien f r den Aspirator und die Reagenzien in das easyMAGTM Ger t laden Die Lyse im Ger t starten und die Iysierten Proben 10 Minuten inkubieren bevor das magnetische Silica Gemisch zugegeben wird Focus 4 4 4
16. gkeitsspiegels befinden Auf Start dr cken um das magnetische Silica anzusaugen zu pipettieren und mit den Proben zu mischen 3x Die Pipettenspitzen m ssen unterhalb des Fl ssigkeitsspiegels bleiben damit der Mischvorgang korrekt ausgef hrt wird F r jedes weitere Probengef Schritt 13 und 14 wiederholen Nach Zugabe des magnetischen Silica Gemisches zu allen Probengef en den Extraktionslauf starten Nach Abschluss des Laufs das die Probengef e aus dem Ger t nehmen Werden die Proben nicht sofort weiterverarbeitet sind sie in individuelle R hrchen zu berf hren um das Risiko dass magnetisches Silica zur ck in die Probe f llt zu minimieren Die extrahierte DNA bis zum Gebrauch bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitlagerung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Beschicken der Disc auf einem K hlblock aufbewahren EINSTELLUNG DES GER TS F R DIE ECHTZEIT PCR 1 Einzelheiten dar ber wie die Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist um eine Assaydefinition hinzuzuf gen einen Lauf einzustellen und die L ufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen Hinweis Vor Durchf hrung eines Vorhersagelaufes muss eine valide Standardkurve Kalibrierungslauf eingerichtet werden REAGENZIENZUBEREITUNGSBEREICH Ein f r die Vorbereitung des Reaktionsgemischs f r den Simplexa EBV Assay
17. hen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben 13 Die Probenkartusche in das MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extraktionsger t berf hren und die Extraktion starten 14 Nach Abschluss der Nukleins ureextraktion kann die Kartusche mit den extrahierten Kontrollen und Patientenproben aus dem MagNA Pure Extraktor herausgenommen und verschlossen werden Die extrahierte DNA vor der Verwendung bei 2 C bis 8 C aufbewahren Die Langzeitaufbewahrung extrahierter Proben bei dieser Temperatur wird nicht empfohlen Extrahierte DNA Proben beim Laden der Disc auf einem K hlblock aufbewahren Extraktion mit dem NucliSENS easyMAGTN Extraktionsverfahren von bioM rieux 1 2 Zur Bedienung von Ger t und Software ist das Benutzerhandbuch des NucliSENS easyMAGTM zu beachten In der NucliSENS easyMAGTM Software die Vorlage Generic Allgemein mit folgenden Einstellungen w hlen Default Request Generic 2 0 1 oder quivalent Standardanfrage Run Name Prefix beliebig Anfangskode der Laufbezeichnung Sample ID prefix beliebig Anfangskode der Proben ID Sample Type Probentyp Primary Prim r Workflow Defaults On board Iysis Incubation Lyse Inkubation im Ger t Standardarbeitsabl ufe On board Silica Incubation Inkubation mit Silica im Ger t Sample Addition Guidance Off Hinweise zur Zugabe von Proben Aus Reagent Tracking Lysis Silica Internal Control reagent tracking disabled R ckv
18. ml festgelegt Vollblut LINEARIT T Die Bestimmung der Linearit t erfolge unter Verwendung von Proben f r die ein EBV Stamm mit bekannter Bestandskonzentration einer klinisch negativen Vollblutmatrix zugesetzt wurde Die Probengruppe umfasste mindestens 10 Pools bekannter Kopienzahl verteilt ber den erwarteten linearen Bereich Mindestens 3 Konzentrationen der Pools lagen an der Quantifizierungsuntergrenze LLOQ 2 lagen an der Quantifizierungsobergrenze ULOQ und die verbleibenden Pools verteilten sich etwa gleichm ig zwischen der LLOQ und der ULOQ Jede Probe wurde im Zufallsverfahren in mindestens 3 Replikaten getestet Die Linearit t wurde mit jedem der beiden Extraktionsverfahren ermittelt Die einzelnen Werte f r den Messbereich sind in der folgenden Tabelle aufgef hrt G Simplexa EBV Seite 9 FOCUS Vollblut Kopien mi 900 bis 8 07x10 900 bis 8 07x10 Simplexa EBV Linearit t MagNA Pure Extraktion Simplexa EBV Konz Log 10 Kopien ml 10 30 D so 60 Erwartete EBV Konz Log10 Kopien ml Regressionsgleichung Log_Simplexa_EBV 0 370351 0 965335 Log_Erwartete_BKV 80 70 60 so 0 30 20 10 DD i 00 10 20 30 0 so 60 70 80 90 10 Erwartete EBV Konz Log10 Kopien mi Simplexa EBV Konz Log 10 Kopien ml Regressionsgleichung Log_Simplexa_EBV 0 216626 0 969417 Log_Erwartete_BKV G Simplexa EBV Seite 10 FOCUS MESSBEREICH Beide Extraktionsverfahren waren bis zu einer Konzent
19. oll sollte Total NA Variable_elution_volume sein G Simplexa EBV Seite 4 FOCUS 4 Als Probenvolumen sollte 200 ul und als Elutionsvolumen 50 ul eingestellt sein 5 Das Verd nnungsvolumen sollte f r alle Proben auf Null eingestellt sein 6 Das Post Elution Protocol muss auf None eingestellt sein 7 Darauf achten dass Proben und Kontrollen sich auf der Probenkartusche an der richtigen Position befinden 8 Jede Probe Niedrigpositiv und Hochpositiv Kontrolle 2 4 Sekunden vortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 9 200 ul von jeder Probe Niedrig und Hochpositiv Kontrolle sowie Leerwert Kontrolle in die entsprechende Position auf der Probenkartusche pipettieren 10 Den F llpegel der Proben und Kontrollen in der Probenkartusche einer Sichtpr fung unterziehen um sicherzustellen dass Probe n zugegeben wurde n 11 Die DNA zur Extraktions und Amplifikationskontrolle zweimal pulsvortexen und kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen 12 F r je 16 Proben 1 16 Proben 100 ul der IC in 6 ml Lysepuffer in ein konisches R hrchen pipettieren Kurz auf dem Vortex mischen In das entsprechende Fach des MagNA Pure Extraktionsger tes geben o Werden beispielsweise mehr als 16 Proben 17 32 Proben extrahiert m ssen 200 ul der IC in 12 ml Lysepufferl sung in ein konisches R hrchen pipettiert werden Kurz auf dem Vortex misc
20. ozentrifuge 15 Vortex Mischer 16 Sterile RNase DNase freie Einmalpipettenspitzen mit Aerosolbarriere 17 1 5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen und St nder RNase DNase freie R hrchen werden empfohlen sind aber nicht vorgeschrieben 18 Einweg Schutzhandschuhe ungepudert 19 Nukleasefreies Wasser zur Extraktion und als Leerwert Kontrolle NTC No Template Control 20 K hlst nder f r 1 5 ml Mikrozentrifugenr hrchen a Zur Verwendung beim Roche MagNA Pure LC Extraktionsverfahren P Zur Verwendung beim bioMerieux easyMAG Extraktionsverfahren ZONOS wD nm HALTBARKEIT UND HANDHABUNG Reagenzien bei 10 bis 30 C aufbewahren keine Gefrierger te mit Abtauautomatik verwenden Reagenzien vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden Das Reaktionsgemisch nach Zugabe des Master Mix innerhalb einer Stunde verwenden Das Reaktionsgemisch bei 2 C bis 8 C lagern bis die PCR angesetzt werden kann 5 Nach dem ersten Auftauen k nnen Primer Mix Master Mix und DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle maximal 30 Tage bei 2 8 C aufbewahrt werden 6 Primer Mix Master Mix Positivkontrollen und DNA f r die Extraktions und Amplifikationskontrolle nicht wieder einfrieren 7 Keine Reagenzien aus verschiedenen Kitchargen kombinieren WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1 In vitro Diagno
21. ration von 8 07 x 10 Kopien ml linear Der Messbereich des Assays wurde ausgehend von der Extraktionsmethode mit dem h chsten Wert f r die Untergrenze des Linearbereichs festgelegt Proben unterhalb des Linearbereiches werden als lt 900 Kopien ml ausgewiesen und Proben oberhalb des Linearbereiches als gt 8 07 x 10 Kopien ml ANALYTISCHE REAKTIVIT T KREUZREAKTIVIT T Aus Studien ist bekannt dass die Primer EBV spezifisch sind und keine Kreuzreaktion mit anderen Viren und Bakterien aufweisen u a mit HBV HIV 1 HIV 2 HSV 1 HSV 2 HHV 6 HHV 7 HHV 8 HTLV 1 JCV Parvovirus Toxoplasma gondii VZV CMV und BKV Weiterhin ist auch aus den Datenbanken der Nukleins uresequenzen ersichtlich das die Primer EBV spezifisch sind und keine signifikante Homologie mit anderen Erregern oder menschlicher DNA aufweisen INTERFERENZ Die Leistungsf higkeit dieses Assays bez glich m glicherweise interferierender Substanzen wurde nicht ermittelt Der automatisierte Nukleins ureextraktionsprozess mit dem MagNA Pure System oder dem NucliSENS easyMAG entfernt Verunreinigungen effektiv aus den Proben da die Nukleins uren w hrend der Extraktion isoliert und gewaschen werden Die internen Kontrollen machen den Endnutzer auf eine m gliche Hemmung der PCR aufmerksam wenn keines der Targets und die interne Kontrolle nicht detektiert werden ist die Messung ung ltig KONTAMINIERUNG DURCH VERSCHLEPPUNG Die Amplifikation von Verschleppungen wurde mit
22. reservierter Bereich i Eure Primer Mix und Master Mix bei Raumtemperatur etwa 18 C bis 25 C auftauen Jedes R hrchen im Kit enth lt eine f r 50 Reaktionen ausreichende Reagenzienmenge Vor jedem Gebrauch die Primer Mix und Master Mix Komponenten durch sechs bis achtmaliges vorsichtiges Umdrehen durchmischen und dann kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen In ein Polypropylen Mikrozentrifugenr hrchen entsprechender Gr e jede Komponente in dem in der folgenden Tabelle angegebenen Volumen pipettieren um das erforderliche Volumen des Reaktionsgemisches zuzubereiten Reaktionsgemischvolumen Reaktionsgemisch Reaktionsgemisch Reagens Volumen 1 Volumen 10 Reaktion Reaktionen Das Reaktionsgemisch durch Umdrehen des R hrchens oder durch 8 bis 10 maliges Pipettieren vorsichtig mischen Kurz zentrifugieren um die Inhaltsstoffe auf den Boden des R hrchens zu ziehen Mit der Vorbereitung der PCR fortfahren Das Reaktionsgemisch innerhalb einer Stunde nach Zubereitung verwenden Sofern die PCR Vorbereitung nicht sofort nach dem Ansetzen des Reaktionsgemisches erfolgt sollte dieses bei 2 C bis 8 C gelagert werden BEREICH F R DIE ECHTZEIT PCR AMPLIFIKATION In einem speziellen der Vorbereitung der Universal Disc mit 96 Kavit ten f r den Simplexa EBV Assay vorbehaltenen Bereich arbeiten Bei der Durchf hrung folgender Vorbereitungsschritte das beispielhafte Disc Layout in
23. rgebnisse f hren Unter aseptischen Bedingungen arbeiten Die Reagenzien vorsichtig pipettieren und handhaben um eine Kontamination mit Material aus benachbarten Kavit ten zu verhindern Geeignete Pipettiertechniken anwenden und f r die Dauer des Tests das gleiche Pipettierschema einhalten um optimale und reproduzierbare Werte zu erhalten Die Reagenzien nicht gegen Reagenzien anderer Kit Chargen oder anderer Hersteller austauschen oder mit diesen mischen Die Verschlusskappen der Reagenzr hrchen nicht vertauschen Dies k nnte zur Kontamination f hren und die Testergebnisse beeintr chtigen Nur das in diesem Beipackzettel beschriebene Protokoll verwenden Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der angegebenen Zeiten sowie Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur Temperaturbereich ca 18 C bis 25 C erfolgen Beim Mischen der Reagenzien die Enzyme durch einen K hlblock gek hlt halten Universal Discs die bereits in Kontakt mit Patientenproben oder Reagenzien gekommen sind nicht wieder verwenden Gebrauchte Discs ohne Abnehmen der Abdeckfolie entsorgen Wenn verschiedene Simplexa Kits auf der gleichen Disc angesetzt werden m ssen die Positiv und Leerwert Kontrollen aus jedem verwendeten Kit getestet werden Der Master Mix enth lt gt 1 Glycerin welches bei Einatmen oder Hautkontakt zu Reizungen f hren kann Nach Einatmen oder Ber hrung sollten Erste
24. stikum 2 Alle Humanmaterialien sollten als potenziell infekti s angesehen werden Das Ursprungsmaterial dieses Produktes einschlie lich der Kontrollen ist mit US FDA anerkannten Methoden auf HBs Antigen Hepatitis C Antik rper und HIV 1 2 AIDS Antik rper untersucht und f r negativ befunden worden Dennoch gew hrleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie daf r dass Produkte die aus menschlichem Blut gewonnen wurden die genannten oder andere infekti se gt al Focus 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Simplexa EBV Seite 3 Krankheiten nicht bertragen k nnen Alle Kontrollen Serumproben und Ger te die in Kontakt mit den Proben kommen sollten daher als potenziell infekti s angesehen und durch entsprechende biologische Sicherheitsma nahmen dekontaminiert oder entsorgt werden CDC und NIH empfehlen dass m glicherweise infekti ise Substanzen entsprechend Biosicherheitsstufe 2 gehandhabt werden Beim Umgang mit den Kit Reagenzien pers nliche Schutzausr stung wie jedoch nicht beschr nkt auf Handschuhe und Laborkittel tragen H nde nach der Durchf hrung des Tests gr ndlich waschen Nicht mit dem Mund pipettieren In Bereichen in denen Kit Reagenzien und oder Humanproben gehandhabt werden darf nicht geraucht getrunken und gegessen werden In diesen Bereichen sollten auch keine Kontaktlinsen eingesetzt herausgenommen und kein Make up aufgetragen werden Nicht
25. tt angegeben liegt und die IC zwar h tte nachgewiesen werden sollen dies aber nicht zwingend erforderlich war e Die Hochpositiv Kontrolle HPC erf llt die Akzeptanzkriterien falls die in der HPC detektierte EBV Konzentration innerhalb der Toleranzgrenzen wie auf dem chargenspezifischen Etikett angegeben liegt und die IC zwar h tte nachgewiesen werden sollen dies aber nicht zwingend erforderlich war 2 Interpretation der Ergebnisse Interpretation der Ergebnisse EBV Wert IC Wert Interpretation Nicht detektiert Detektiert EBV nicht detektiert lt 900 Kopien ml EBV detektiert unterhalb LLOQ Lower Limit of Quantitation X Kopien ml EBV Nachweis bei bestimmter Konzentration gt 8 07 x 10 Kopien ml EBV detektiert oberhalb ULOQ Upper Limit of Quantitation Nicht detektiert Nicht detektiert Ung ltig erneut extrahieren und Test wiederholen 3 Validit t der Probenergebnisse Eine Probe ist valide falls entweder 1 kein EBV detektiert und die IC nachgewiesen wurde oder 2 EBV detektiert wurde F r EBV positive Ergebnisse muss die Interne Kontrolle nicht unbedingt nachgewiesen werden 3 Die Amplifizierungsdiagramme aller Ergebnisse sind zu berpr fen inbesondere wenn eine Data Quality Meldung Datenqualit t vorliegt Eine g ltige Amplifizierungskurve zeigt einen glatten exponentiellen Anstieg Weitere Einzelheiten dazu finden sich im Benutzerhandbuch Focus Simplexa EBV Seite 7 EINSCHR NKUNGEN 1
26. uly 2004 _ Volume 104 Number 1 243 249 15 Cornelissen J Molecular monitoring of EBV positive lymphoma Blood 1 July 2004 _ Volume 104 Number 1 9 16 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2nd Ed 1999 17 CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th ed And National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A Se Die Anwendung von Scorpions Sonden f r Zwecke in Zusammenhang mit der In vitro Diagnostik beim Menschen ist durch eine Lizenz gesch tzt die Focus Diagnostics Inc von DxS Ltd erworben hat Die Farbstoffe Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar sind Marken der Biosearch Technologies Inc BTI Die Black Hole Quencher CAL Fluor und Quasar Farbstofftechnologie ist im Rahmen eines Vertrags mit BTI lizenziert und diese Produkte werden ausschlie lich f r klinische diagnostische oder Forschungs und Entwicklungszwecke verkauft Focus VERTRIEB DURCH mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Deutschland BESTELLINFORMATIONEN Telefon 800 838 4548 nur USA 562 240 6500 International Fax 562 240 6510 TECHNISCHE HILFE Telefon 800 838 4548 nur USA 562 240 6500 International Fax 562 240 6526 Besuchen Sie unsere
27. ur berpr fung der Extraktion und zur Erkennung einer Hemmung der PCR wird eine interne Kontrolle mitgef hrt Das aus jeder Probe gewonnene Amplifizierungssignal wird mit einer Kalibrierkurve verglichen und quantifiziert MITGELIEFERTES MATERIAL Das Simplexa EBV Kit von Focus Diagnostics enth lt ausreichend Reagenzien f r 100 Bestimmungen Beschreibung der Komponente Bezeichnung der Komponente EC ZEICHEN Kurzbez Deckelfar Anzahl Reaktionen Volumen AUF ETIKETT eichnu be en pro Gef pro ng Kit Fl schchen Simplexa EBV Primer Mix MOL2401 REAG A PM Braun 2 50 uL Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B MM Gr n 2 Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL IC IC Bau 3 50 150 250 uL SimplexaTM EBV Low Positive Control MOL2402 CONTROL LPC wei 6 200 uL Simplexa EBV High Positive Control MOL2403 CONTROL HPC Rot 6 200 uL dr Simplexa EBV Seite 2 Focus Beschreibung der Komponente Beschreibung Mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Primer die EBV und die Interne DNA Kontrolle spezifisch quantifizieren Sonden Fluorophor Simplexa EBV Primer Mix PM Primer Mix Farbstoff Simplexa T Master Mix MM Master Mix DNA Polymerase Puffer und dNTPs Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA Ein 577 Basenpaare umfassendes DNA Fragment aus dem Gen das die N IC DNA f r die Extraktions und Methyltransferase der gro
28. verwendete Kit Reagenzien bzw Humanproben gem den rtlichen und nationalen Bestimmungen entsorgen Der Arbeitsablauf im Labor sollte nur in einer Richtung erfolgen ausgehend vom von den Pr Amplifikationsbereich en in Richtung Amplifikations Detektionsbereich Im folgenden Abschnitt wird der Ablauf der Arbeitsschritte von der Probenextraktion bis zur Amplifizierung mittels Echtzeit PCR beschrieben e Am Anfang steht die Probenextraktion gefolgt von der Einstellung des Ger ts zur Durchf hrung der Echtzeit PCR der Zubereitung der Reagenzien und schlie lich der Amplifizierung mittels Echtzeit PCR e Die Verbrauchsmaterialien und Instrumente d rfen nicht bereichs bergreifend zwischen den speziellen Probenextraktions und Probenvorbereitungsbereichen verwendet werden Sie sollten auch nicht zwischen den verschiedenen Bereichen ausgetauscht werden e Veerbrauchsmaterial und technische Ausstattung f r die Probenvorbereitung d rfen nicht f r die Reagenzienzubereitung oder zum Bearbeiten amplifizierter DNA oder anderer Quellen der Zielnukleins ure verwendet werden e S mtliches Verbrauchsmaterial und s mtliche technischen Vorrichtungen f r die Amplifikation m ssen immer im Bereich des Echtzeit PCR Ger ts verbleiben e Auch die pers nliche Schutzausr stung wie z B Laborkittel und Einmalhandschuhe sollten bereichsspezifisch gehandhabt werden Die Kontamination von Reagenzien bzw Patientenproben kann zu einer Verf lschung der Teste
Download Pdf Manuals
Related Search