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MiSeqDx 139-Varianten-Assay für zystische - Support

1. Stand Stand Mis lt h ne le i A P ort ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 calls i i A F508del 12 11 12 798 797 798 an 97 22 99 96 99 92 W1282X HET A F508del 12 12 12 798 798 798 100 100 100 3849 10kbC gt T HET 13 E60X 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 F508del HET gt 15 M1101K 810 804 804 804 100 100 100 HOM 40 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl a e gt N E x Pa der Uberein Uberein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro der nn i fi ne r No s ung stimmung stimmung Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis r n an an an an n an s Calls O ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 A F508del 12 12 12 3659delC HET A 621 1G gt T 12 12 12 711 1G gt T HET 21 A455E 810 12 12 12 798 798 798 100 100 F508del HET 23 F508del 810 12 12 12 798 798 798 100 100 Y1092X C gt A HET 41 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl a e gt N E x Pa der Uberein Uberein b
2. 353 1ml Gepufferte w ssrige L sung PR2 CF 139 Varianten Assay MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Karton 5 Tabelle 9 Karton 5 Voramplifikationsreagenzien Menge i 3 i Komponente DX102 1003 DX 102 1004 llmenge Wirkstoffe Filterplatte 20 Platten 2 Platten Nicht Polypropylen Mikrotiterplatte zutreffend mit einer modifizierten Polyethersulfonmembran Tabelle 10 Karton 5 Nachamplifikationsreagenzien Komponente r F llmenge Wirkstoffe Elutionspuffer 10 R hrchen 1 R hrchen 48ml Gepufferte w ssrige L sung Bibliothek 10 R hrchen 1 R hrchen 3 5 ml Gepufferte w ssrige L sung Lagerungspuffer Erforderliche jedoch nicht bereitgestellte Reagenzien Voramplifikationsreagenzien e 10 N NaOH aus Tabletten herstellen oder Standardl sung verwenden e TE Puffer e DNase und RNase freies Wasser Nachamplifikationsreagenzien e 10N NaOH aus Tabletten herstellen oder Standardl sung verwenden e Ethanol absolut f r die Molekularbiologie TE Puffer e DNase und RNase freies Wasser Lagerung und Handhabung 1 Die Raumtemperatur ist mit 15 C bis 30 C definiert Lagerung 2 C bis 8 C Lagerung 15 C bis 30 C Lagerung 15 C bis 30 C 15 C bis 30 C 2 Die folgenden Reagenzien werden gefroren ausgeliefert und sind stabil wenn sie bis zum angegebenen Verfallsdatum bei 25 C bis 15 C gelagert werden CF 139 V arianten Oligo Pool Hybridisierungspuf
3. 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Variante allgemeiner Name G178R P2055 1078delT R334W 1154insTC 1548delG 27 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Positive Calls Varianten Summe Positive Negative Gesamt x Negative Anzahl Anzahl FE 5 N Varianten Calls ns berein berein berein cDNA Name Va Klini Zelllinien Synthe Calls der der No 7 a ro Vari x stimmun stimmun stimmun typ P sche tische Wildtyp Miscalls Calls 5 ante proben Proben Proben DIV c 1022_1023 500 1 499 100 100 insIC m 00 Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten Variante Sume Negative Anzahl Anzahl aa Negative Geram R Varianten Calls a Uberein Uberein berein allgemeiner yp cDNA Name Va Klini Zelllinien Synthe Calls der der No 7 pro Vari 5 y i stimmung stimmung stimmung h tisch il 1 lls Name KEN sche Stuben sche Wildtyp Miscalls Calls o amp Proben Proben 1507del DIV c 1519_1521 500 4 2 0 494 100 100 100 delATC 1677delTA DIV c 1545_1546 500 1 499 100 100 delTA 1717 1G gt A SNV c 1585 1G 500 4 1 495 100 100 100 gt A m 00 gt A 28 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 29 Variante i Varianten allgemeiner i Name 2143delT 2184insA 2307insA
4. Tabelle 1 Allgemeine Tr gerh ufigkeit von Mukoviszidose Mutationen in den verschiedenen ethnischen Gruppen in den USA Ethnische Gruppe Beobachtete Tr gerh ufigkeit Afroamerikanisch 1 aus 84 Aschkenasi J disch 1 aus 29 Asiatisch 1 aus 242 Wei 1 aus 28 Hispanoamerikanisch 1 aus 59 J disch 1 aus 32 Nah stlich 1 aus 91 Ureinwohner 1 aus 70 Nordamerikas S dasiatisch 1 aus 118 Sonstige ethnische 1 aus 111 Gruppe gt 1 ethnische Gruppe 1 aus 34 Teilweise 1 aus 56 afroamerikanisch Teilweise wei 1 aus 32 Teilweise 1 aus 51 hispanoamerikanisch Keine Angabe 1 aus 37 Alle Personen 1 aus 38 berblick ber das CFTR2 Projekt Das CFTR2 Projekt ist eine internationale Initiative die von einem Team aus Forschern und rzten geleitet und vom National Institute of Health sowie der U S Cystic Fibrosis Foundation gef rdert wird 412 CFTR2 soll umfassende und von Experten gepr fte funktionale und klinische Informationen zu CFTR Varianten liefern In dem Bem hen alle CF Varianten mit einer Allelh ufigkeit von mindestens 0 01 klinisch zu validieren b ndelten 25 CF Register und Kliniken weltweit 3 ihre Ressourcen mit dem Ziel die klinischen Informationen von ber 39 000 CF Patienten mit den nahezu 1 900 CF Varianten abzugleichen die im Laufe der Jahre in der CFTR1 Datenbank im Kinderkrankenhaus SickKids Hospital in Toronto aufgezeichnet wurden 1 13 Klinische Merkmale z B Kochsalzgehalt im Schwei Lungenfunktion prognostizie
5. 4 ul der ausgew hlten Index Primer 1 A701 12 A712 zur entsprechenden Reihe der AMP Platte hinzu Die Spitzen m ssen nach jeder Reihe ausgetauscht werden um eine Index Kreuzkontamination zu vermeiden d Entsorgen Sie die urspr nglichen orangefarbenen Verschl sse und bringen Sie neue orangefarbene Verschl sse an Bereiten Sie die PCR Gebrauchsl sung aus PCR Master Mischung PCR Polymerase wie folgt vor a F gen Sie f r 96 Proben 56 ul PCR Polymerase zu 2 8 ml PCR Master Mischung hinzu b Invertieren Sie die vorbereitete PCR Gebrauchsl sung zum Mischen 20 mal Die PCR Gebrauchsl sung ist bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stabil Verfahren 1 Entnehmen Sie die FPU aus dem Inkubator und entfernen Sie die Aluminiumfolieversiegelung Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 17 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose m O N Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 2400 x g und 20 C F gen Sie 25 ul 0 05 N NaOH zu jedem Probe Well der Filterplatte hinzu Pipettieren Sie das NaOH f nf bis sechsmal auf und ab Decken Sie die Filterplatte ab und inkubieren Sie sie f nf Minuten lang bei Raumtemperatur bertragen Sie w hrend der Inkubation der Filterplatte 22 ul der PCR Gebrauchsl sung in jeden Well der AMP Platte mit Index Primern bertragen Sie die vom Filter eluierten Proben wie folgt zur AMP Platte a Pipettieren Sie die Proben i
6. Geben Sie 45 ul universellen Wasch Puffer in jeden Probe Well Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie zehn Minuten lang bei 2400 x g und 20 C ANMERKUNG Stellen Sie sicher dass die gesamte Fl ssigkeit nach dem Zentrifugieren abgelaufen ist Wiederholen Sie das Zentrifugieren bei Bedarf Extension Ligation von gebundenen Oligonukleotiden Verfahren 1 F gen Sie 45 ul Extension Ligation Mischung zu jedem Probe Well der Filterplatte hinzu 2 Verschlie en Sie die Filterplatte mit klebbarer Aluminiumfolie und decken Sie sie dann mit dem Deckel zu 3 Inkubieren Sie die FPU im vorab erw rmten Inkubator 45 Minuten lang bei 37 C PCR Amplifikation Vorbereitung 1 2 Bereiten Sie frisches 0 05 N NaOH vor Ermitteln Sie anhand des Plattengrafikausdrucks von Illumina Worklist Manager die zu verwendenden Index Primer Bringen Sie die PCR Master Mischung und die entsprechenden Index Primer auf Raumtemperatur Mischen Sie mit dem Vortexer alle aufgetauten R hrchen und zentrifugieren Sie sie anschlie end kurz Stellen Sie eine neue 96 Well PCR Platte nachstehend als AMP Platte bezeichnet bereit F gen Sie Index Primer wie folgt zur AMP Platte hinzu a F gen Sie 4 ul der ausgew hlten Index Primer A A501 H A508 zum entsprechenden Well in einer Spalte der AMP Platte hinzu b Entsorgen Sie die urspr nglichen wei en Verschl sse und bringen Sie neue wei e Verschl sse an c F gen Sie
7. P Berg JS Brown KK Deignan JL et al 2013 ACMG clinical laboratory standards for next generation sequencing Genetics in Medicine Genetics in Medicine 15 9 733 747 Patente und Marken Dieses Dokument und dessen Inhalt sind Eigentum von Illumina Inc und verbundenen Unternehmen Illumina und ausschlie lich f r den bestimmungsgem en Gebrauch durch den Kunden in Verbindung mit dem Gebrauch des hier beschriebenen Produkts der hier beschriebenen Produkte und f r keinen anderen Bestimmungszweck ausgelegt Dieses Dokument und dessen Inhalt d rfen ohne schriftliches Einverst ndnis von Illumina nicht verwendet und zu keinem anderen Zweck verteilt bzw anderweitig bermittelt offengelegt oder auf irgendeine Weise reproduziert werden Illumina bertr gt mit diesem Dokument keine Lizenzen unter seinem Patent Markenzeichen Urheberrecht oder b rgerlichem Recht bzw hnlichen Rechten an Drittparteien Die Anweisungen in diesem Dokument m ssen von qualifiziertem und entsprechend ausgebildetem Personal genau befolgt werden damit die in diesem Dokument beschriebene Anwendung der Produkte sicher und ordnungsgem erfolgt Vor der Verwendung dieser Produkte muss der Inhalt dieses Dokuments vollst ndig gelesen und verstanden worden sein FALLS NICHT ALLE HIERIN AUFGEF HRTEN ANWEISUNGEN VOLLST NDIG GELESEN UND BEFOLGT WERDEN K NNEN PRODUKTSCH DEN VERLETZUNGEN DER BENUTZER UND ANDERER PERSONEN SOWIE ANDERWEITIGER SACHSCHADEN EINTR
8. W846X Q890X Teile Nr 15038347 Rev A DEU cDNA Name Positive Calls Varianten Summe Ei Klini Zelllini Synthe g elllinien pro ni sche b tische roben a Proben P Proben Negative Calls Wildtyp Anzahl der Miscalls Anzahl der No Calls Positive berein stimmung Negative berein stimmung DIV c 2052_2 500 3 1 496 100 100 053insA DIV c 2175_21 500 3 2 495 100 100 76insA Gesamt berein stimmung 00 00 100 100 Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 30 Positive Calls Varianten Variante 5 Suim Negative Anzahl Anzahl a Negativ R Varianten Calls ER berein berein allgemeiner yp cDNA Name gt Klini Zelllinien Synthe Calls der der No 7 pro Vari x stimmung stimmung h tisch il ll lls Name Tie sche proben sche Wildtyp Miscalls Calls o Proben Proben gt A 191C gt T Teile Nr 15038347 Rev A DEU Gesamt berein stimmung 100 100 100 100 100 100 m 00 100 Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Variante i Varianten allgemeiner en Name W1282X CFTR dele22 235 457TAT gt G DIV c 325_327 500 1 499 100 100 delTATinsG Positive Calls Varianten Summe Negative Anzahl Anzahl a Negativ Gesamt Calls P berein berein berein cDNA Name Var Klini Zelllinien Synthe Calls der d
9. berfl ssige Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer zu entfernen Entfernen Sie die LNP Platte vom Magnetstativ und f gen Sie 30 ul 0 1 N NaOH zu jedem Well hinzu Versiegeln Sie die LNP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler f nf Minuten lang bei 1 800 rpm Stellen Sie w hrend der f nfmin tigen Elution eine neue 96 Well PCR Platte nachstehend als SGP Platte bezeichnet bereit F gen Sie 30 ul Bibliothek Lagerungspuffer zu jedem Well hinzu der in der SGP Platte verwendet werden soll Stellen Sie nach Beendigung der f nfmin tigen Elution sicher dass alle Proben in der LNP Platte vollst ndig resuspendiert sind Falls die Proben nicht vollst ndig resuspendiert sind pipettieren Sie diese Proben behutsam auf und ab oder klopfen Sie die Platte leicht gegen den Labortisch um die Beads zu resuspendieren und sch tteln Sie sie f r weitere f nf Minuten Platzieren Sie die LNP Platte mindestens zwei Minuten lang auf dem Magnetstativ bertragen Sie den berstand von der LNP auf die SGP Platte Pipettieren Sie leicht f nfmal auf und ab um zu mischen Verschlie en Sie die SGP Platte und zentrifugieren Sie sie anschlie end eine Minute lang bei 1 000 x g und 20 C SICHERER HALTEPUNKT Wenn Sie nicht gleich mit dem Bibliotheks Pooling und der anschlie enden Sequenzierung auf dem I MiSeqDx fortfahren bewahren Sie die versiegelte SGP Platte bis zu 3 Tage bei 25 C bis 15 C auf 20 Teile Nr 15038347 Rev A D
10. die Reads f r jede Probe sowie die Qualit ts Scores ausgenommen Reads von Clustern die den Filter nicht passiert haben e Alignment Beim Alignment werden Sequenzen mit der Referenz verglichen um eine Beziehung zwischen den Sequenzen zu identifizieren Au erdem wird ein Score basierend auf hnlichkeitsregionen zugewiesen Ausgerichtete Reads werden in Dateien im BAM Format gespeichert MiSeq Reporter verwendet einen banded Smith Waterman Algorithmus der lokale Sequenz Alignments durchf hrt um hnliche Regionen zwischen zwei Sequenzen zu ermitteln e Varianten Calling Bei diesem Schritt werden einzelne Nukleotidvarianten SNVs Insertionen und Deletionen Indels und weitere strukturierte Varianten in einer standardisierten Textdatei mit dem Namen MiSegDxCF139V ariantAssay txt aufgezeichnet Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt Analyseberichtsdatei im MiSeq Reporter Benutzerhandbuch Teile Nr 15038356 Einschr nkungen des Verfahrens 1 F r In Vitro Diagnostik Die mit dem Illumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose erzielten Ergebnisse sollten im Kontext einer vollst ndigen klinischen Bewertung verwendet und interpretiert werden 2 Der Assay wurde entwickelt um eine spezifische Untergruppe bekannter Varianten im CFTR Gen zu identifizieren umfasst jedoch nicht alle Varianten die im CFTR Gen identifiziert wurden Wenn eine Variante nicht identifiziert wird ist dies jedoch keine Garanti
11. h chster Geschwindigkeit Zentrifugieren Sie das DAL R hrchen eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C Inkubieren Sie das DAL R hrchen bei 96 C zwei Minuten lang auf einem Hitzeblock Invertieren Sie das DAL R hrchen nach der Inkubation ein bis zweimal um es gut zu mischen und legen Sie es dann sofort in das Eiswasserbad Belassen Sie das DAL R hrchen f nf Minuten lang im Eiswasserbad Laden der Probenbibliotheken in eine Kartusche 1 Verwenden Sie eine separate saubere und leere 1 ml Pipettenspitze um die Verschlussfolie ber dem mit Load Samples Proben laden auf der Reagenzienkartusche bezeichneten Beh lter zu durchstechen 22 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 2 Geben Sie mit der Pipette 600 ul der Probenbibliotheken in den Beh lter Load Samples Proben laden Achten Sie beim Zuf hren der Probe darauf die Verschlussfolie nicht zu ber hren berpr fen Sienach dem Laden der Probe ob sich Luftblasen im Beh lter befinden Falls Luftblasen vorhanden sind klopfen Sie die Kartusche vorsichtig auf den Tisch damit die Blasen entweichen 3 Fahren Sie mit den Schritten zum Einrichten des Laufs unter Verwendung der MiSeq Operating Software MOS Benutzeroberfl che fort Interpretation der Ergebnisse 1 Der Ilumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose dient dem Nachweis von 139 CFTR Varianten darunter den vom ACMG empfohlenen Varianten la
12. lang gelagert werden Versiegeln Sie vor dem Lagern der Platte bei 2 C bis 8 C den Platten Well 9 Frieren Sie die Bibliothek Beads nicht ein bzw vermischen Sie sie nicht mit dem Bibliotheksnormalisierungsverd nner Reagenz wenn sie nicht sofort verwendet werden 10 Die vollst ndige Bibliotheksnormalisierungsplatte kann bei 25 C bis 15 C bis zu 3 Tage lang gelagert werden 11 Die Pooled Amplicon Library PAL kann bei 25 C bis 15 C bis zu 3 Tage lang gelagert werden Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 9 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 12 Laden Sie den frisch vorbereiteten verd nnten Amplikon Pool sofort in die Reagenzienkartusche Die Lagerung des verd nnten Amplikon Pools kann zu einer signifikanten Verringerung der Clusterdichte f hren Ger te und Materialien Bereitgestellte separat erh ltliche Ger te und Materialien 1 2 3 4 MiSeqDx Ger t Katalognummer DX 410 1001 TruSeg Indexplattenvorrichtungs Kit Katalognummer FC 130 1005 TruSeg Indexplattenvorrichtungs und Kranz Kit Katalognummer FC 130 1007 Ersatzverschl sse f r Indexadapter Katalognummer DX 502 1003 Erforderliche jedoch nicht bereitgestellte Ger te und Materialien Ger te und Materialien f r die Voramplifikation 1 Hitzeblock Es wird ein Hitzeblock f r eine 96 Well Platte ben tigt Der Hitzeblock muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Hitzebl cke mit beheizten Deckeln sind
13. zu denaturieren 6 Geben Sie das folgende Volumen von vorgek hltem Bibliothek Verd nnungspuffer in das R hrchen mit denaturierter Interne PhiX Kontrolle Bibliothek um eine 20 pM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek zu erhalten Denaturierte Interne PhiX Kontrolle Bibliothek 20 ul Vorgek hlter Bibliothek Verd nnungspuffer 980 ul Vorbereiten der Reagenzienkartusche 1 Tauen Sie die MiSegDx Reagenzienkartusche CF 139 Varianten Assay in einem Wasserbad auf das ausreichend raumtemperiertes deionisiertes Wasser enth lt um die Basis der Reagenzienkartusche bis zur auf der Reagenzienkartusche aufgedruckten Wasserlinie einzutauchen Das Wasser darf die maximale Wasserlinie nicht bersteigen 2 Lassen Sie die Reagenzienkartusche im raumtemperierten Wasserbad etwa eine Stunde oder so lange auftauen bis sie vollst ndig aufgetaut ist 3 Nehmen Sie die Kartusche aus dem Wasserbad und klopfen Sie sie vorsichtig auf dem Tisch ab um das Wasser von der Basis der Kartusche zu entfernen Trocknen Sie die Basis der Kartusche ab Stellen Sie sicher dass kein Wasser auf die Oberseite der Reagenzienkartusche gespritzt ist berpr fen der Reagenzienkartusche 1 Invertieren Sie die Reagenzienkartusche zehnmal um die aufgetauten Reagenzien zu mischen und berpr fen Sie anschlie end visuell ob alle Positionen aufgetaut sind Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 21 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 4 HINWEIS Es ist u
14. 4X E92K 1341 1G gt A R709X R1158X Q98X PolyTG PolyT K710X R1162X 457TAT gt G 1461ins4 2183delAA gt G 3659delC D110H A455E 2184insA S1196X R117C 1525 1G gt A 2184delA W1204X c 3611G gt A R117H S466X C gt A 2307insA W1204X c 3612G gt A Y122X S466X C gt G L732X 3791delC 574delA L467P 2347delG 3849 10kbC gt T 621 1G gt T 1548delG R764X G1244E 663delT 5489X 2585delT 3876delA G178R 5492F E822X S1251N 711 1G gt T Q493X 2622 1G gt A 3905insT 7114 3A gt G 1507del E831X W1282X 71145 G gt A F508del W846X 4005 1G gt A 712 1G gt T 1677delTA R851X N1303K H199Y V520F 2711delT 4016insT P2055 Q525X 2789 5G gt A Q1313X L206W 1717 8G gt A Q890X 4209TGTT gt AA Q220X 1717 1G gt A 1927P CFTRdele22 23 852del22 G542X S945L 4382delA Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev A DEU 3 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 1078delT S549R c 1645A gt C 3007delG 1506V G330X S549R c 1647 T gt G G970R 1507V R334W S549N 3120G gt A F508C 1336K G551D 3120 1G gt A t In der CFTR2 Datenbank als eine CF verursachende Variante klassifiziert w hrend das Sosnay Papier die Variante als unbestimmt klassifiziert Die Datenbankklassifizierung ist aktueller und spiegelt die Ergebnisse der Funktionstests wider die zum Zeitpunkt der Sosnay Ver ffentlichung noch nicht verf gbar waren Verfahrensprinzipien Der Illumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose umfasst zwei Hauptverfahren Das erste Verfahren die Bibliotheksvorbe
15. 8 Proben m ssen mindestens die Index Primer Kombinationen enthalten die in Tabelle 12 aufgef hrt sind Um kleinere L ufe pr zise zu verarbeiten m ssen mindestens acht Proben vorhanden sein Wenn keine sechs eindeutigen Proben ausgenommen die positiven und negativen Kontrollen verf gbar sind ist es akzeptabel den Lauf mit Probenreplikaten von humangenomischen DN A Proben aufzuf llen Siehe Tabelle 12 f r den minimalen Satz an Indizes mit Farbbalance die f r Sequenzierungsl ufe mit acht Proben zu verwenden sind Tabelle 12 Index Primer Kombinationen f r 8 Proben Sequenzierungsl ufe Index Primer 1 A701 Index Primer 2 A702 Index Primer 10 A710 Index Primer C A503 Probe 1 Probe 2 Probe 3 Index Primer D A504 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Index Primer E A505 Probe 7 Probe 8 Index Primer Sequenzen Tabelle 13 Sequenzen f r Index Primer A A501 H A508 Index Primer Sequenz Index Primer A A501 TGAACCTT Index Primer B A502 TGCTAAGT Index Primer C A503 TGITCTCT Index Primer D A504 TAAGACAC Index Primer E A505 CTAATCGA Index Primer F A506 CTAGAACA Index Primer G A507 TAAGTICC Index Primer H A508 TAGACCTA Tabelle 14 Sequenzen f r Index Primer 1 A701 12 A712 Index Primer Sequenz Index Primer 1 A701 ATCACGAC Index Primer 2 A702 ACAGTGGT 14 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Index Primer Sequenz Index Primer 3 A703 CAGATC
16. CA Index Primer 4 A704 ACAAACGG Index Primer 5 A705 ACCCAGCA Index Primer 6 A706 AACCCCTC Index Primer 7 A707 CCCAACCT Index Primer 8 A708 CACCACAC Index Primer 9 A709 GAAACCCA Index Primer 10 A710 TGTGACCA Index Primer 11 A711 AGGGTCAA Index Primer 12 A712 AGGAGIGG Gebrauchsanweisung MiSeqDx Probenblattvorbereitung 1 W hlen Sie im Begr ungsbildschirm von Illumina Worklist Manager IWM die Option Create Worklist Arbeitsliste erstellen 2 W hlen Sie im Feld Test Type Testtyp die Option CF 139 Varianten Assay aus 3 Geben Sie im Feld Worklist Name Name der Arbeitsliste einen Namen f r das Probenblatt ein Wenn f r den Namen des Probenblatts die alphanumerische Barcode ID der Reagenzienkartusche verwendet wird findet die MiSeq Operating Software MOS das Probenblatt automatisch Wenn ein anderer Name f r das Probenblatt verwendet wird kann die Schaltfl che Browse Durchsuchen in der MiSeq Operating Software MOS verwendet werden um das entsprechende Probenblatt zu finden 4 Optional Geben Sie eine Beschreibung f r den Lauf ein 5 Stellen Sie sicher dass das Datum mit dem Startdatum des Laufs bereinstimmt 6 W hlen Sie Next Weiter Eingeben von Probeninformationen 1 Geben Sie auf der Registerkarte Table Tabelle oder Plate Platte f r jeden Probenwell folgende Informationen ein a Sample ID Proben ID Geben Sie eine eindeutige Proben ID ein b Index 1 an
17. ETEN ILLUMINA BERNIMMT KEINERLEI HAFTUNG F R SCH DEN DIE AUS DER UNSACHGEM SSEN VERWENDUNG DER HIERIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE EINSCHLIESSLICH TEILEN HIERVON ODER DER SOFTWARE ENTSTEHEN ODER JEDER ANDEREN ART DER VERWENDUNG DER PRODUKTE AUSSERHALB DES G LTIGKEITSBEREICHS DER AUSDR CKLICHEN SCHRIFTLICHEN LIZENZEN ODER DER DURCH ILLUMINA GENEHMIGTEN ZULASSUNGEN IN VERBINDUNG MIT DEM ERWERB DER PRODUKTE DURCH DEN KUNDEN F R IN VITRO DIAGNOSTIK 2012 2014 Illumina Inc Alle Rechte vorbehalten Illumina und MiSeqDx sind Marken oder eingetragene Marken von Illumina Inc Alle anderen hierin enthaltenen Marken und Namen sind Eigentum der jeweiligen Eigent mer AMPure Beckman und Beckman Coulter sind Marken oder eingetragene Marken der Beckman Coulter Inc Kontaktinformationen wd Ilumina Emergo Europe San Diego Kalifornien 92122 USA Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH Den Haag 1 858 202 4566 au erhalb von Nordamerika Niederlande techsupport illumina com www illumina com Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 52 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Produktkennzeichnungen Der mit jedem Kit versendete Symbolschl ssel enth lt eine vollst ndige Referenz der Symbole die auf der Produktverpackung und beschriftung verwendet werden 53 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014
18. EU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Bibliotheks Pooling Vorbereitungen f r Bibliotheks Pooling 1 Erhitzen Sie einen f r 1 5 ml Zentrifugenr hrchen passenden Hitzeblock auf 96 C 2 Bereiten Sie in einem Eisk bel ein Eiswasserbad vor K hlen Sie den Bibliothek Verd nnungspuffer im Eiswasserbad 3 Beginnen Sie mit dem Auftauen der MiSegDx Reagenzienkartusche Vorbereiten einer frischen Verd nnung von NaOH ACHTUNG y Die Verwendung von frisch verd nntem NaOH ist notwendig um die Proben f r die Clusterbildung auf dem MiSeqDx vollst ndig zu denaturieren 1 Mischen Sie die folgenden Volumina in einem Mikrozentrifugenr hrchen Wasser in Laborqualit t 900 ul Stock 1 0 N NaOH 100 ul 2 Invertieren Sie das R hrchen zum Mischen mehrmals Interne PhiX Kontrolle denaturieren und verd nnen 1 Mischen Sie folgende Volumina um die Interne PhiX Kontrolle Bibliothek auf 2 nM zu verd nnen 10 nM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek 2 ul 1X TE Puffer 8 ul 2 Mischen Sie folgende Volumina um eine 1 nM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek zu erhalten 2 nM Interne PhiX Kontrolle Bibliothek 10 ul 0 1 N NaOH 10 ul 3 Mischen Sie die L sung mit 1 nM Interne PhiX Kontrolle kurz mit dem Vortexer 4 Zentrifugieren Sie die Matrizenl sung eine Minute lang bei 280 x g und 20 C 5 Inkubieren Sie die L sung 4 5 Minuten lang bei Raumtemperatur um die Interne PhiX Kontrolle Bibliothek in Einzelstr nge
19. Platte bezeichnet bereit 2 F gen Sie 5 ul Probe oder Kontrolle bei 50 ng ul 250 ng insgesamt zu den entsprechenden Wells in der HYB Platte hinzu Folgen Sie dem generierten Plattenlayout um eine korrekte Well Auswahl vorzunehmen 3 F gen Sie 5 ul CF 139 V arianten Oligo Pool zu allen Wells hinzu die genomische DNA enthalten 4 F gen Sie 40 ul Hybridisierungspuffer zu jeder Probe in der HYB Platte hinzu Pipettieren Sie drei bis f nfmal leicht auf und ab um zu mischen 5 Verschlie en Sie die HYB Platte und zentrifugieren Sie 1000 x g eine Minute lang bei 20 C 6 Legen Sie die HYB Platte in dem mit 95 C vorgeheizten Block ab und inkubieren Sie sie eine Minute lang 7 Verringern Sie die Temperatur des Hitzeblocks auf 40 C und fahren Sie mit der Inkubation fort bis der Hitzeblock 40 C erreicht etwa 80 Minuten Die allm hliche Abk hlung ist f r eine ordnungsgem e Hybridisierung kritisch Deshalb werden PCR Thermocycler mit aktiver K hlung z B Peltier thermoelektrisch gek hlt f r diesen Vorgang nicht empfohlen SICHERER HALTEPUNKT Nachdem der Hitzeblock 40 C erreicht hat bleibt die HYB Platte zwei Stunden lang bei 40 C stabil Entfernen von ungebundenen Oligonukleotiden Vorbereitung 1 Bringen Sie die Extension Ligation Mischung stringenten Wasch Puffer und universellen Wasch Puffer auf Raumtemperatur und mischen Sie sie dann kurz mit dem Vortexer 2 F gen Sie die Filterplatten Assembly Ein
20. Probenblatt entsprechen Abweichungen zwischen dem Probenblatt und dem Plattenlayout f hren zu einem Verlust der positiven Probenidentifikation und fehlerhaften Ergebnisberichten Bereiten Sie stets frisches 80 iges Ethanol f r die Schritte des Waschlaufs zu Ethanol kann Wasser aus der Luft aufnehmen was die Ergebnisse verf lscht Stellen Sie sicher dass w hrend der Waschschritte das gesamte Ethanol vom Boden der Wells entfernt wird Ethanolreste k nnen die Ergebnisse beeintr chtigen Halten Sie nach dem Magnetstativ Schritt die angegebene Trockenzeit ein um eine vollst ndige Evaporation sicherzustellen Ethanolreste k nnen den Ablauf nachfolgender Reaktionen beeintr chtigen Mischen Sie den CF 139 Varianten Oligo Pool und den Hybridisierungspuffer nicht zum Lagern Wenn diese vermischt werden wird der CF 139 V arianten Oligo Pool selbst bei Gefrierlagerung instabil Die Verwendung von Thermocyclern mit aktiver Abk hlung z B Peltier thermoelektrisch gek hlt wird f r den Hybridisierungsschritt nicht empfohlen Der Schritt der passiven Abk hlung ist f r eine ordnungsgem e Hybridisierung ausschlaggebend 12 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 19 20 21 22 23 24 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose F gen Sie PCR Polymerase immer erst direkt vor dem Gebrauch zur PCR Master Mischung hinzu Bewahren Sie die kombinierte Gebrauchsl sung niemals auf W hrend des Bibliotheksnormalisieru
21. adaptern PCR Primer mit Indexsequenzen und Sequenzierungsadaptern Propriet re DNA Polymerase Gepufferte w ssrige L sung mit Salzen und dNTPs Lagerung 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Tabelle 4 Karton 1B Nachamplifikationsreagenzien Menge Komponente DX 102 1003 DX 102 1002 F llmenge Wirkstoffe Lagerung Bibliotheks 10 R hrchen 1 R hrchen 4 6 ml Gepufferte w ssrige L sung mit 25 C bis 15 C normalisierungs Salzen 2 Mercaptoethanol und verd nner Formamid Bibliothek 10 R hrchen 1 R hrchen 4 5 ml Gepufferte w ssrige L sung 25 C bis 15 C Verd nnungs puffer Interne PhiX 1 R hrchen 1 R hrchen 10 ul Gepufferte w ssrige L sung mit 25 C bis 15 C Kontrolle genomischer PhiX DNA MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Karton 2 Tabelle 5 Karton 2 Nachamplifikationsreagenzien Menge Komponente DX 102 1008 DX 102 1008 Inhalt Lagerung MiSegDx 20 Kartuschen 2 Kartuschen Einweg Kartusche mit Clusterbildungs 25 C bis 15 C Reagenzienkartusche und Sequenzierungsreagenzien f r die CF 139 V arianten Verwendung mit dem MiSegqDx Ger t Assay einschlie lich Formamid 2 Mercaptoethanol und 2 DMSO MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Karton 3 Tabelle 6 Kar
22. al 30 Tage lang oder gefroren bei 25 C bis 15 C maximal 30 Tage lang Beim Transport von Vollblut m ssen die l nderspezifischen Bundes staatlichen und regionalen Vorschriften f r den Transport von Krankheitserregern eingehalten werden Nach dem sechsmaligen Einfrieren und Auftauen von genomischer DNA wurden keine negativen Auswirkungen auf die Assay Leistung beobachtet Bei Vollblutproben mit erh hten Bilirubin Cholesterin H moglobin Triglycerid bzw EDTA Werten wurden keine negativen Auswirkungen auf die Assay Leistung beobachtet Warn und Vorsichtshinweise 1 h ACHTUNG y Gem geltender Gesetze ist der Verkauf oder die Nutzung dieses Ger ts nur ber einen Arzt bzw ii im Auftrag eines Arztes oder einer anderen Fachperson mit entsprechender Lizenz zul ssig Einige Komponenten dieses Assays enthalten Formamid ein aliphatisches Amid das in Verdacht steht ein fortpflanzungsgef hrdendes Toxin zu sein Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Reagenzien auf Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 11 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Seite 6 Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen Beh lter und nicht verwendeter Inhalt m ssen gem den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden Wenn Sie weitere Informationen ben tigen w
23. alisierung Vorbereitung 1 Bereiten Sie frisches 0 1N NaOH vor 2 Bringen Sie Bibliotheksnormalisierungsverd nner Bibliothek Beads und Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer auf Raumtemperatur 3 Mischen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverd nner kr ftig mit dem Vortexer und stellen Sie sicher dass alle Ausf llungen vollst ndig aufgel st wurden 4 Mischen Sie die Bibliothek Beads kr ftig eine Minute lang mit dem Vortexer zeitweilig mit Inversion bis die Beads resuspendiert sind und sich kein Pellet im unteren Bereich des R hrchens befindet wenn das R hrchen invertiert wird Verfahren 1 Mischen Sie den Bibliotheksnormalisierungsverd nner und die Bibliothek Beads wie folgt in einem frischen konischen 15 ml R hrchen 4 ANMERKUNG Wenn Sie weniger als 24 Proben verarbeiten verwenden Sie ein frisches 1 5 ml R hrchen a F gen Sie f r 96 Proben 4 4 ml Bibliotheksnormalisierungsverd nner hinzu b Pipettieren Sie die Bibliothek Beads zehnmal auf und ab um zu resuspendieren Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 19 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 10 11 12 13 14 15 16 4 ANMERKUNG Es ist u erst wichtig das Bibliothek Bead Pellet im unteren Bereich des R hrchens vollst ndig zu resuspendieren Durch die Verwendung einer P1000 wird sichergestellt dass die Beads homogen resuspendiert werden und sich keine Bead Masse im unteren Bereich des R hrchens befindet Dies ist un
24. ammenfassung und Erl uterung des Assay Klinische Beschreibung Die Mukoviszidose oder zystische Fibrose ZF ist eine der h ufigsten genetischen Erkrankungen der westlichen Welt und die am h ufigsten auftretende lebensbedrohliche autosomal rezessive Erkrankung in der nicht hispanischen wei en Bev lkerung3 ZF wirkt sich auf die Viskosit t der Schleimsekrete aus und bef llt die Epithelien der Atemwege die Bauchspeicheldr se den Darm das hepatobili re System den m nnlichen Genitaltrakt und die Schwei dr sen was zu einer komplexen Multiorgan Multisystemerkrankung f hrt 6 wobei die Lunge das prim re Organ bez glich Morbidit t und Mortalit t ists In vielen F llen sind eine Mangelern hrung oder Verdauungsst rungen Vorboten von durch ZF verursachten Lungenerkrankungen Ein Schwerpunkt der aktuellen interventionellen Anstrengungen liegt daher in der Fr herkennung der Erkrankung durch ein Neugeborenen Screening wodurch die fr hzeitige lebenswichtige medizinische Versorung sichergestellt und f r Menschen mit dieser Erkrankung das bestm gliche Ergebnis erzielt werden soll47 Obwohl es bei der Lebenserwartung geschlechtliche Unterschiede gibt die mittlere Lebenserwartung ist bei M nnern h her als bei Frauen liegt die allgemeine Lebenserwartung in den USA bei 38 3 Jahren CFTR Varianten und Inzidenz Das Gen Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR wurde 1989 identifiziert Es befindet sich am l
25. angen Arm des Chromosoms 7 und enth lt 27 kodierende Exons verteilt ber 230 kb Eine 6 5 kb mRNA die von dem normalen Allel produziert wird kodiert CFTR ein 1490 Aminos ure haltiges Membranprotein das als regulierter Chlorid Kanal in den Epithelzellen mehrerer Organe fungiert Derzeit sind ber 1 900 Varianten des CFTR Gens beschrieben wobei die Mehrheit davon Punktmutationen sind Die h ufigste CFTR Variante ist das F508del Allel Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev A DEU 1 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose das fast 70 aller CFTR Varianten ausmacht Allerdings resultieren die anderen h ufig auftretenden CFTR Varianten oft in einem CF Ph notyp und anderen auf CFTR zur ckzuf hrenden Erkrankungen gt Die Mukoviszidose hat eine gesch tzte Erkrankungsh ufigkeit von einer in 2 000 bis 4 000 Lebendgeburten und eine Pr valenz von rund 30 000 Personen in der US Bev lkerungt Sie tritt in allen ethnischen Gruppierungen mit unterschiedlicher H ufigkeit auf 1 3 000 bei Wei en 1 9 200 bei Hispanoamerikanern 1 10 900 bei amerikanischen Ureinwohnern 1 15 000 bei Afroamerikanern und 1 31 000 bei der asiatisch amerikanischen Bev lkerung Aktuelle Sch tzwerte der H ufigkeit der Tr ger der CFTR Mutation nach Ethnizit t in den USA auf Basis einer Kohorte von 364 890 Personen die zum Tr gertest berwiesen wurden und bez glich Mukoviszidose nicht famili r vorbelastet sind werden in Tabelle 1 angegeben
26. aus Synthe Calls der p Ubereinstim Ubereinstim 5 Vari Zelllinien j j No Calls stimmung Name nt sche oben tische Wildtyp Miscalls mung mung mr Proben P Proben K e 36 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Genauigkeit des MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose f r PolyTG PolyT Varianten PolyTGPolyT Genot ee end S EA h der ahl der ENG y y yP Zelllinienproben y Miscalls Calls Genauigkeit Proben Proben TG 9 T 7 TG 11 T 7 2 0 0 0 1 50 37 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose PolyTGPolyT Genotyp Di Aare al A ge a An a ERS 2 en Proben Zelllinienproben Proben Miscalls Calls Genauigkeit TG 11 T 7 TG 11 T 9 2 1 0 3 0 0 TG 11 T 7 TG 12 T 5 2 0 0 0 0 100 TG 11 T 7 TG 12 T 7 37 3 0 0 0 100 TG 11 T 9 TG 12 T 7 3 0 0 0 0 100 TG 12 T 7 TG 12 T 7 2 2 0 0 0 100 Summe 448 4 3 98 44 Proben wurden nicht erneut getestet Eines der diskordanten Ergebnisse stammte aus der Reproduzierbarkeitsstudie Das PolyTG PolyT Ergebnis der Probe war bei allen 18 Replikaten konkordant bei der bidirektionalen Sanger Sequenzierung jedoch diskordant Die Gesamtprobenanzahl f r die PolyTG PolyT Variante betr gt 448 da alle synthetischen Proben n 52 durch Mischen linearisierter Plasmide mit einer von zwei Zelllinienproben die Teil der Reproduzierbarkeitsstudie war
27. belle 2 2 Der Assay Bericht listet die Probennamen und den Genotyp f r jede in einer Probe nachgewiesene Variante auf Alle Proben werden auf 134 CF verursachende Varianten und die vom ACMG empfohlene R117H Variante untersucht Nur nachgewiesene Mutantenallele werden im Assay Bericht aufgef hrt Die PolyTG PolyT Variante wird nur gemeldet wenn die R117H Variante in einer Probe identifiziert wird Bei Patienten mit einer R117H Variante sollten weitere Tests durchgef hrt werden um festzustellen ob sich eine PolyTG PolyT Variante die den klinischen Ph notyp z B 12 13 TG oder 5T beeinflussen kann in cis trans Ausrichtung zur R117H Variante befindet j HINWEIS Der PolyTG PolyT Genotyp wird vom MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose auf Basis der Readanzahl der h ufigsten Genotypen bestimmt Aufgrund der digitalen Natur der Sequenzierung der n chsten Generation ist der Assay im Vergleich zu anderen sequenzierungsbasierten Technologien die nur wenige Beobachtungen verwenden in der Lage eine hohe Genauigkeit aus vielen Beobachtungen zu erzielen Wenn eine Probe bei Entdeckung eines oder mehrerer der gutartigen Polymorphismen 1506V I507V und F508C den homozygoten F508del oder 1507del Genotyp aufweist wird dies f r die Probe gemeldet Wenn es sich bei allen drei gutartigen Polymorphismen um den Wildtyp handelt gibt der Bericht an dass in der Probe keine I506V I507V und F508C Varianten vorhanden sind 4 HINWEIS Da dies e
28. cfconference org art plenaryarchives 2011 Cutting pdf Online Im Namen des CFTR2 Projekts von Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Garry Cutting bei der 25th Annual North American Cystic Fibrosis Conference NACFC pr sentiert und von der Cystic Fibrosis Foundation gesponsert 04 November 2011 Anaheim CA 13 Sosnay PR Siklosi KR Van Goor F Kaniecki K Yu H et al 2013 Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene Nat Genet 25 August zuerst elektronisch ver ffentlicht 14 Grody WW Cutting GR Klinger KW Richards CS Watson MS Desnick RJ M rz April 2001 Laboratory standards and guidelines for population based cystic fibrosis carrier screening Genetics in Medicine 3 2 149 154 15 Castellani C Cuppens H Macek H Jr Cassiman JJ Kerem E et al 2008 Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice J Cystic Fibrosis 7 179 196 16 Pratt VM Caggana M Bridges C Buller AM DiAntonio L et al Mai 2009 Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing Journal of Molecular Diagnostics 11 3 186 193 17 Amos J Feldman GL Grody WW Monaghan K Palomaki GE et al 2008 Edition Revised 03 2011 American College of Medical Genetics Standards and Guidelines for Clinical Genetic Laboratories 18 Rehm HL Bale SJ Bayrak Toydemir
29. d Index 2 Index 1 und Index 2 Geben Sie den Indexadapter an der f r jedes Index Read verwendet werden soll Optional Um detailliertere Informationen zu den Proben aufzuzeichnen geben Sie einen Probennamen und eine Beschreibung ein Optional W hlen Sie zum Angeben von Kontrollen auf der Platte im Dropdown Men Control Kontrolle Negative Negativ bzw Positive Positiv aus Wechseln Sie zur Registerkarte Plate Graphic Plattengrafik und verwenden Sie die Option Copy to Clipboard In Zwischenablage kopieren oder Print Drucken um ein Bild der Probenplatte zu erfassen W hlen Sie Finish Fertig stellen Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 15 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Hybridisierung des Oligonukleotid Pools Vorbereitung 1 Bringen Sie den CF 139 V arianten Oligo Pool den Hybridisierungspuffer die genomischen DNA Proben und die positive Kontrollprobe auf Raumtemperatur 2 Mischen Sie den CF 139 Varianten Oligo Pool und den Hybridisierungspuffer kr ftig um sicherzustellen dass sich alle Ablagerungen vollst ndig aufgel st haben Zentrifugieren Sie dann kurz die R hrchen um Fl ssigkeit zu sammeln 3 Erhitzen Sie einen 96 Well Hitzeblock auf 95 C 4 Erw rmen Sie einen Inkubator auf 37 C 5 Erstellen Sie die Probenplatte entsprechend der von IWM ausgedruckten Plattengrafik Verfahren 1 Stellen Sie eine neue 96 Well PCR Platte nachstehend als HYB
30. den befinden Pr zisionspipetten Es wird ein Satz Pr zisionspipetten ben tigt Es wird ein separater Satz im Voramplifikationsbereich ben tigt Die Verwendung von Pr zisionspipetten ist notwendig um eine genaue Reagenz und Probenabgabe zu gew hrleisten Es k nnen Einzel oder Mehrkanalpipetten verwendet werden wenn sie regelm ig kalibriert werden und ihre Genauigkeit innerhalb von 5 des angegebenen Volumens liegt Verbrauchsmaterialien Die folgenden Verbrauchsmaterialien werden ben tigt 96 Well PCR Platten mit Rahmen 0 2 ml Polypropylen oder vergleichbar HINWEIS Stellen Sie sicher dass die 96 Well Platte zum Magnetstativ passt 96 Well Lagerungsplatten 0 8 ml MIDI Platten Konische 15 ml R hrchen Eppendorf Mikrozentrifugenr hrchen Schraubverschluss empfohlen PCR 8 fach R hrchenstreifen L sungsbecken PVC DNase RNase frei Bottich Klebende Aluminiumfolienversiegelung Klebende Plattenversiegelung Aerosol resistente Pipettenspitzen Sammeln Transportieren und Lagern von Proben 3 k ANMERKUNG Behandeln Sie alle Proben wie potenzielle Infektionserreger Vollblutproben die in K EDTA R hrchen gesammelt wurden k nnen verwendet werden Vollblutproben k nnen bei Raumtemperatur maximal sieben Tage bis zu 30 Tage bei 2 C bis 8 C oder gefroren bei 25 C bis 15 C bis zu 30 Tage lang gelagert werden Transportieren Sie Vollblut bei Raumtemperatur maximal sieben Tage lang bei 2 C bis 8 C maxim
31. die St rungen aufgrund der Blutentnahme geringe Menge zu untersuchen wurden die Blutproben mit EDTA versetzt und um die St rungen aufgrund der Probenvorbereitung zu untersuchen wurde der endg ltige Wasch Puffer aus einer Kieselgels uren Isolationsmethode zur bereinigten genomischen DNA zugef gt Der MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose erzielte mit und ohne st rende Substanzen eine Call Rate von 100 bei allen Proben und eine Reproduzierbarkeit von 100 in Genotyp Calls zwischen Proben Um die Auswirkungen der Multiplexierung von Index Primer St rungen zu untersuchen wurde eine Kreuzkontaminationsstudie mit zwei Proben von der jede eindeutige homozygote Genotypen an vier unterschiedlichen genomischen Positionen aufwies und zwei entsprechenden Index Primern durchgef hrt Es wurde keine nderung beim Varianten Calling bei Kontaminationsgraden von unter 40 beobachtet Der Probengenotyp wurde heterozygot wenn der Kontaminationsgrad mindestens 40 betrug Es wurden keine St rungen durch eine der endogenen oder exogenen St rsubstanzen beobachtet Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 50 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Im Blut getestete Im Blut getestete Testsubstanz Gesamtzahl der Konzentration Konzentration Call Rate Replikate Obergrenze Untergrenze Bilirubin 16 684 umol L 137 umol L 100 Cholesterin 16 13 mmol L 2 6 mmol L 100 H moglobin 16 2g L 0 4 g L 100 Triglycerid 16 37
32. dtyp Miscalls Calls 5 e 5 ante proben Proben Proben DIV ist ein Akronym f r Deletions Insertions Variante Im Sanger Bericht wurde die P205S Variante f r die klinische Probe als heterozygot gemeldet Eine Pr fung der Sanger Daten zeigte jedoch dass die Variante homozygot war und falsch gemeldet wurde Das MiSeqDx System meldete die Variante als homozygot 8 Eine synthetische f r Exon8 heterozygote Probe wurde f r die Variante CFTR dele22 23 als heterozygot gemeldet Weitere Untersuchungen ergaben dass dieses Ergebnis wahrscheinlich von einer geringf gigen Kontamination herr hrte Bei der urspr nglichen synthetischen heterozygoten Probe wurde festgestellt dass diese nicht korrekt vorbereitet wurde Als sie nach der erneuten Vorbereitung mit demselben Plasmid getestet wurde wurde sie nachgewiesen Wenn R117H positiv ist wird die PolyTG PolyT Variante zus tzlich gemeldet Y Im Fall einer homozygoten F508del Variante wurden drei weitere Wildtyp Basen d h die Varianten 1506V 1507V F508C die in der Probe nicht identifiziert wurden zus tzlich gemeldet Tabelle 16 Genauigkeit des MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose f r I506V 1507V und F508C Positive Calls Varianten Variante Summe Negative Anzahl Positive Negative Gesamt Calls pro sr Anzahl der RT ar berein allgemeiner i Klini
33. e daf r dass keine anderen CFTR Varianten in den analysierten Proben vorhanden sind Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 5 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose 3 Die H ufigkeit der von diesem Assay ermittelten Varianten ist je nach Bev lkerungsgruppe unterschiedlich 4 Wie bei jedem auf Hybridisierung basierenden Assay k nnen zugrundeliegende Polymorphismen oder Varianten in Oligonukleotid bindenden Regionen die untersuchten Allele und somit die Anzahl der Calls beeintr chtigen 5 Der Assay kann nicht feststellen ob die Ausrichtung der PolyTG PolyT Variante cis trans zur R117H Variante ist Bei Patienten mit einer R117H Variante sollten weitere Tests durchgef hrt werden um festzustellen ob sich eine PolyTG PolyT Variante die den klinischen Ph notyp z B 12 13 TG oder 5T beeinflussen kann in cis trans Ausrichtung zur R117H Variante befindet 6 PolyTG PolyT sind Homopolymer Regionen die bei sequenzbasierten Assays aufgrund des Verrutschens der DNA Polymerase Slippage bekannterma en schwer zu interpretieren sind Eine Miscall Rate von 0 9 4 448 wurde bei PolyTG PolyT Ergebnissen beobachtet was eine Diskrepanz von 1 TG im Vergleich zur bidirektionalen Sanger Sequenzierung zeigt Tabelle 17 Produktkomponenten Die Illumina MiSegDx Plattform umfasst folgende Komponenten e MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Katalognummer DX 102 1004 or DX 102 1003 e MiSegDx Ger t Katalognum
34. en erzeugt wurden Da die Meldung der PolyTG PolyT Variante f r diese zus tzlichen synthetischen Proben zu einer berm igen Meldung der Variante f hren w rde wurden die synthetischen Proben von dieser Analyse ausgeschlossen 38 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit des MiSegDx Systems f r zystische Fibrose wurde anhand einer Blindstudie an drei Teststandorten und mit zwei Bedienern an jedem Standort ermittelt Zwei gut charakterisierte Panels mit jeweils 46 Proben wurden an jedem Standort von beiden Bedienern getestet Daraus ergaben sich 810 Calls pro Standort Die Panels enthielten eine Mischung aus genomischer DNA aus Iymphoblastoiden Zelllinien mit bekannten Varianten im CFTR Gen sowie einige leukozytenbereinigte Blutproben die mit lymphoblastoiden Zelllinien bekannter Varianten im CFTR Gen versetzt wurden Die Blutproben wurden bereitgestellt um die Inkorporation der Extraktionsschritte zum Vorbereiten der DNA zu erm glichen die als prim re Zugabe f r den Assay Workflow dient Die Proben First Pass Rate definiert als die Anzahl der Proben die beim ersten Versuch den QOC Kennzahlen entsprechen betrug 99 9 Die positive bereinstimmung auf Genotypebene betrug bei allen Varianten 99 77 Die negative bereinstimmung f r alle WT Positionen betrug 99 88 und die allgemeine bereinstimmung f r alle gemeldeten Positionen betrug ebe
35. en an der physischen Struktur auftreten z B offensichtliche Ver nderungen der Reagenzienfarbe oder Eintr bung mit offenkundiger Keimkontamination 6 Die Reagenzien Hybridisierungspuffer Stringenter Wasch Puffer und Bibliotheksnormalisierungsverd nner k nnen sichtbare Ausf llungen oder Kristalle bilden Mischen Sie vor der Verwendung kr ftig mit dem Vortexer und stellen Sie anschlie end visuell sicher dass keine Ausf llungen vorhanden sind 7 Beachten Sie die folgenden Best Practices beim Umgang mit PCR Reinigungs Beads und Bibliothek Beads Die Beads d rfen niemals eingefroren werden Die Beads sollten Raumtemperatur haben Mischen Sie die Beads unmittelbar vor der Verwendung mit dem Vortexer bis sie gut suspendiert sind und die Farbe homogen erscheint Mischen Sie die Probe nach dem Hinzuf gen der Beads gr ndlich indem Sie zehnmal auf und abpipettieren Die Proben k nnen auch mit einem Sch ttler sorgf ltig gemischt werden Inkubieren Sie die Bead Probenmixtur bei Raumtemperatur f r die gesamte angegebene Dauer Folgen Sie den Anweisungen wenn Sie das Magnetstativ verwenden Warten Sie bis die L sung klar ist bevor Sie aspirieren Belassen Sie die Platte auf dem Magnetstativ wenn Sie den berstand langsam aspirieren Achten Sie dabei darauf dass die separierten Beads nicht durcheinandergebracht werden 8 Die PCR Amplifikationsplatte kann ber Nacht auf dem Thermocycler bleiben oder bei 2 C bis 8 C bis zu zwei Tage
36. en von A C Basen Um eine ordnungsgem e Registrierung sicherzustellen muss in jedem Zyklus mindestens eines der zwei Nukleotide f r jeden Farbkanal gelesen werden Es ist wichtig die Farbbalance f r jede Base des sequenzierten Index Reads zu halten Anderenfalls kann bei der Sequenzierung des Index Reads ein Registrierungsfehler auftreten Siehe Tabelle 11 f r die Auswahl von Index Primer Kombinationen f r 48 oder 96 Probenl ufe Tabelle 11 Index Primer Kombinationen f r 48 Proben oder 96 Proben Sequenzierungsl ufe Zeilen A H Spalten 1 6 Spalten 7 12 Index Primer A A501 Index Primer 1 A701 Index Primer 6 A706 Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 13 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Zeilen A H Spalten 1 6 Spalten 7 12 Index Primer B A502 Index Primer 2 A702 Index Primer 7 A707 Index Primer C A503 Index Primer 3 A703 Index Primer 8 A708 Index Primer D A504 Index Primer 4 A704 Index Primer 9 A709 Index Primer E A505 Index Primer 5 A705 Index Primer 11 A711 Index Primer F A506 Index Primer 10 A710 Index Primer 12 A712 Index Primer G A507 Index Primer H A508 Wenn Sie weniger als 48 Proben in einem Sequenzierungslauf sequenzieren w hlen Sie die entsprechenden Indizes anhand ihrer Sequenzen aus damit die Farbbalance in den gr nen und roten Kan len aufrechterhalten wird Weitere Informationen hierzu finden Sie in Tabelle 13 und Tabelle 14 L ufe mit 8 bis 4
37. enden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina Einige Komponenten dieses Assays enthalten das Reduktionsmittel 2 Mercaptoethanol Weitere Informationen hierzu finden Sie unter Reagenzien auf Seite 6 Es kann daher durch Inhalation oder orale Aufnahme Kontakt mit der Haut oder den Augen zu einer Verletzung von Personen kommen Die Verwendung muss in einem gut bel fteten Bereich stattfinden und alle Beh lter und nicht verwendeten Inhalte m ssen gem den geltenden Sicherheitsvorschriften Ihrer Region entsorgt werden Wenn Sie weitere Informationen ben tigen wenden Sie sich bitte an den technischen Support von Illumina Behandeln Sie alle Proben wie potenzielle Infektionserreger Wenn die beschriebenen Verfahren nicht eingehalten werden kann dies zu fehlerhaften Ergebnissen oder einer wesentlichen Abnahme der Probenqualit t f hren Wenden Sie die routinem igen Vorsichtsma nahmen f r das Labor an Pipettieren Sie nicht mit dem Mund Essen trinken oder rauchen Sie nicht in ausgewiesenen Arbeitsbereichen Tragen Sie bei der Handhabung von Proben und Assay Reagenzien Einweg Handschuhe und einen Laborkittel Waschen Sie sich nach der Handhabung von Proben und Assay Reagenzien gr ndlich die H nde Verwenden Sie Assay Komponenten nicht mehr nach ihrem auf dem Etikett des Assay Kartons angegebenen Verfallsdatum Tauschen Sie Assay Komponenten aus unterschiedlichen Assay Chargen nicht gegeneinander aus Beachten Sie dass die Assa
38. er No 7 a pro Vari y y stimmung stimmung stimmung sche tische Wild Miscall Calls ante proben typ ES SRT Proben Proben c 3964 78_ 4242 577del m 00 gt G 31 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten Variante Sume Negative Anzahl Anzahl aa Negative Gesamt R Varianten Calls a Uberein Uberein berein allgemeiner yp cDNA Name pro Vari Klini Zelllinien Synthe Calls der der No he ng stimmung i h tisch il iscall lls pmm Name KEN sche Graben sche Wildtyp Miscalls Calls amp o amp Proben Proben 1259insA DIV c 1127_1 500 2 498 100 100 128insA W401X SNV c 1203G gt A 500 1 499 100 100 c 1203G gt A m 00 m 00 32 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten Variante Sume Negative Anzahl Anzahl aa Negative Gesamt R Varianten Calls ER berein berein berein allgemeiner yp cDNA Name pro Vari Klini Zelllinien Synthe Calls der der No he ng stimmung i h tisch il iscall lls pmm Name ala sche Srobeh sche Wildtyp Miscalls Calls o amp Proben Proben 1461ins4 DIV c 1329_ 500 0 0 1 499 100 100 100 1330ins AGAT S549R SNV c 1645A gt C 500 1 499 100 100 c 1645A gt C m 00 33 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegD
39. erein l ben Proben Genotyp Varianten pro der N MR i fi ne No S un summun summun Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis Cu ai S a a gt ort ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 calls gt i amp A 27 G551D 810 12 12 12 798 798 798 100 100 R553X HET wm w o o oj w w mj oj ojm m 31 1717 1G gt A 810 804 804 804 100 100 HET A 33 R347P 810 12 12 12 798 798 798 100 100 G551D HET ss m aw e e e waww o 0 m m SEA NR P 00 m 00 42 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An m 4 N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl a e gt N E x Pa 1 der berein berein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro der N 3 t ne No Si un summun summun Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis Zum p S a gt ort ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 calls a i 100 A 39 F508del 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 3849 10kbC gt T HET A F508del 12 12 12 100 3659delC HET A G85E 12 12 12 621 1G gt T HET m m eo m 47 2789 5G gt A 810 804 804 804 100 100 HOM 43 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bere
40. erl sslich um eine einheitliche Clusterdichte auf der Flie zelle zu erzielen c Geben Sie f r 96 Proben mit einer Pipette 800 ul Bibliothek Beads in das R hrchen mit Bibliotheksnormalisierungsverd nner d Mischen Sie die L sung indem Sie das R hrchen 15 bis 20 mal invertieren Geben Sie 45 ul der kombinierten Bibliotheksnormalisierungsverd nner Bibliothek Beads Gebrauchsl sung in jeden Well der LNP Platte mit den Bibliotheken Versiegeln Sie die LNP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler 30 Minuten lang bei 1 800 rpm Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf einem Magnetstativ bis der berstand klar ist Lassen Sie die LNP Platte auf dem Magnetstativ entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Entfernen Sie die LNP Platte vom Magnetstativ und waschen Sie die Beads mit Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer wie folgt a Geben Sie 45 ul Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer in jeden Probe Well b Versiegeln Sie die LNP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler f nf Minuten lang bei 1 800 rpm c Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf dem Magnetstativ bis der berstand klar ist d Entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Wiederholen Sie den Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer Vorgang wie im vorherigen Schritt beschrieben Verwenden Sie eine auf 20 ul eingestellte P20 Mehrkanalpipette um
41. ersiegelung Aerosol resistente Pipettenspitzen Ger te und Materialien f r die Nachamplifikation 1 2 Thermocycler Es wird ein Thermocycler ben tigt Der Thermocycler muss einen beheizbaren Deckel besitzen und den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Temperatursteuerungsbereich 4 C bis 99 C Steuerungsgenauigkeit 0 25 C von 35 C bis 99 C Mikroplattensch ttler Es wird ein Mikroplattensch ttler im Nachamplifikationsbereich des Labors ben tigt Der Plattensch ttler muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Maximale Mischgeschwindigkeit 3 000 rpm Mischgeschwindigkeitsbereich 200 bis 3 000 rpm 10 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Tischzentrifuge Es wird eine Tischzentrifuge ben tigt die die Temperatur von 20 C halten kann Es wird eine separate Zentrifuge im Voramplifikationsbereich ben tigt Es kann jede Plattenzentrifuge verwendet werden die die vorgesehenen Geschwindigkeiten des Protokolls erreicht 280 bis 2400 x g Hitzeblock Es wird ein Hitzeblock f r R hrchen ben tigt Der Hitzeblock muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Temperaturbereich Umgebung 5 bis 99 C Temperatursteuerung 0 1 C bei 37 C 0 4 C bei 60 C Magnetstativ Es wird ein Magnetstativ f r eine 96 Well Platte ben tigt Die Leistung ist besser wenn sich die Magnete an der Seite des Stativs und nicht am Bo
42. erst wichtig dass die Reagenzien in der Kartusche vollst ndig aufgetaut und gemischt sind damit eine ordnungsgem e Sequenzierung sichergestellt werden kann berpr fen Sie visuell das Reagenz in Position 1 um sicherzustellen dass es vollst ndig gemischt ist und keine Ausf llungen enth lt Klopfen Sie die Kartusche vorsichtig auf dem Tisch ab um Luftblasen in den Reagenzien zu entfernen I ANMERKUNG Die MiSegDx Sipper R hrchen reichen bis zum Boden der einzelnen Beh lter um die Reagenzien zu aspirieren Deshalb ist es wichtig dass sich keine Luftblasen in den Beh ltern befinden Lagern Sie die Reagenzienkartusche auf Eis bzw lagern Sie sie bei 2 C bis 8 C bis zu sechs Stunden bis Sie den Lauf konfigurieren k nnen Die besten Ergebnisse erzielen Sie wenn Sie direkt mit dem Laden der Probe und dem Konfigurieren des Laufs fortfahren Vorbereiten von Proben f r die Sequenzierung 1 J A UO N 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Bringen Sie den Bibliothek Verd nnungspuffer auf Raumtemperatur Mischen Sie den Bibliothek Verd nnungspuffer kr ftig mit dem Vortexer und stellen Sie sicher dass alle Ausf llungen vollst ndig aufgel st wurden Wenn die SGP Platte gefroren gelagert wurde tauen Sie die SGP Platte bei Raumtemperatur auf Zentrifugieren Sie die SGP Platte eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C Stellen Sie ein neues Eppendorf Gef nachfolgend als PAL R hrchen bezeichnet bereit Suchen Sie die P
43. fer Extension Ligation Mischung Index Primer A A501 H A508 Index Primer 1 A701 12 A712 PCR Polymerase PCR Master Mischung Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Bibliotheksnormalisierungsverd nner Bibliothek Verd nnungspuffer Interne PhiX Kontrolle MiSegDx Reagenzienkartusche CF 139 Varianten Assay Mit Ausnahme der Reagenzienkartusche sind die Reagenzien f r maximal 6 vor dem angegebenen Verfallsdatum durchgef hrte Gefrier Auftau Zyklen stabil Frieren Sie die Reagenzienkartusche nicht mehr ein nachdem sie aufgetaut wurde Sie kann bei 2 bis 8 C bis zu sechs Stunden lang gelagert werden 3 Die folgenden Reagenzien werden gek hlt ausgeliefert und sind stabil wenn sie bis zum angegebenen Verfallsdatum bei 2 C bis 8 C gelagert werden Stringenter Wasch Puffer Universeller Wasch Puffer PCR Reinigungs Beads Bibliothek Beads Bibliotheksnormalisierungs Wasch Puffer MiSegDx SBS L sung PR2 CF 139 V arianten Assay MiSegDx Flie zelle CF 139 Varianten Assay 4 Die folgenden Reagenzien werden in Umgebungstemperatur ausgeliefert und sind stabil wenn sie bei Raumtemperatur bis zum angegebenen Verfallsdatum gelagert werden Elutionspuffer Filterplatte Bibliothek Lagerungspuffer 5 nderungen an der physischen Struktur der bereitgestellten Reagenzien kann auf eine Sch digung der Materialien hindeuten Verwenden Sie die Reagenzien nicht wenn Anderung
44. heit nachfolgend FPU bezeichnet in der entsprechenden Reihenfolge von oben nach unten zusammen Deckel Filterplatte Adapterkranz und MIDI Platte 3 Waschen Sie die Filterplattenmembran vorab wie folgt a F gen Sie 45 ul stringenten Wasch Puffer zu jedem Well hinzu b Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie f nf Minuten lang bei 2400 x g und 20 C Verfahren 1 Entfernen Sie die HYB Platte aus dem Hitzeblock und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 1 000 x g und 20 C 2 bertragen Sie das gesamte Volumen etwa 55 ul jeder Probe in die entsprechenden Wells der Filterplatte 3 Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie f nf Minuten lang bei 2400 x g und 20 C 16 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Waschen Sie die Filterplatte wie folgt a Geben Sie 45 ul stringenten Wasch Puffer in jeden Probe Well b Verschlie en Sie die Filterplatte mit dem Deckel und zentrifugieren Sie sie f nf Minuten lang bei 2400 x g und 20 C Wiederholen Sie den Waschvorgang wie im vorherigen Schritt beschrieben 5 ANMERKUNG Wenn der Wasch Puffer nicht vollst ndig abl uft zentrifugieren Sie erneut bei 2400 x g und 20 C bis die gesamte Fl ssigkeit durchgelaufen ist weitere f nf bis zehn Minuten Entsorgen Sie den gesamten Durchfluss der Formamid enth lt und setzen Sie dann die FPU wieder zusammen
45. hoden wurden von zwei verschiedenen Bedienern unabh ngig getestet von denen jeder drei L ufe pro Extraktionsmethode durchgef hrt hat Jede Extraktion wurde vom jeweiligen Bediener an unterschiedlichen Tagen durchgef hrt Die DNA Konzentration und das A260 A280 Verh ltnis der extrahierten sDNA Proben wurde mithilfe der Spektralfotometrie ermittelt Die Gesamtzahl der Proben f r jede 49 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Extraktionsmethode der Studie ist 168 14 Proben x 2 Bediener Extraktionsmethode x 3 L ufe Bediener x 2 Replikate extrahierte gSDN A Probe Anzahl der Proben First Extraktionsmethode getesteten Call Rate Genauigkeit x Pass Rate Proben Alkoholpr zipitation 168 100 100 100 Kiesels urefilters ulen Isolation 168 100 100 100 Extraktion des magnetischen Bead 168 100 100 100 Prozent der Proben mit einer Call Rate von ber 99 im ersten Lauf DNA Zugabe Der DNA Zugabebereich des Illumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose wurde untersucht indem eine Studie zur seriellen Verd nnung mit 14 repr sentativen DNA Proben durchgef hrt wurde die 16 eindeutige CF Varianten enthielt Jede Probe wurde bei 9 DNA Zugabestufen von 1250 ng bis 1 ng 1250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng und 1 ng doppelt getestet Zur Ermittlung der Genauigkeit wurden Genotyp Proben mit bidirektionalen Sequenzierungsdaten nach Sa
46. ichender Abdeckung zu einem No Call f hrte Ein Replikat der Proben 5 und 75 hatte eine Call Rate von 0 Die weitere Untersuchung deutet darauf hin dass vor der Bibliotheksvorbereitung m glicherweise keine Proben zur Negativ bereinstimmende Stand ort 1 798 798 810 798 804 804 804 Calls Wildtyp Stand ort 2 EN 798 810 798 804 804 804 221182 Stand ort 3 798 798 810 798 804 804 804 An Anzahl zahl d der i No Mis Calls calls 0 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 273 Positive berein stimmung 100 100 N A 100 100 100 100 99 77 Probenplatte hinzugef gt wurden da die in den R hrchen verbleibenden Probenvolumina konsistent waren und nichts von der F llmenge entfernt wurde Es gibt Hinweise darauf dass die Proben 9 und 10 vor der Bibliotheksvorbereitung wahrscheinlich vom Bediener vertauscht wurden 8 Die Position des Wildtyps entsprechend der M1V Variante f r ein Replikat von jeder der beiden Proben das aufgrund unzureichender Abdeckung zu einem No Call f hrte 47 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Negative berein stimmung 99 96 100 100 100 100 100 100 99 88 Gesamt berein stimmung 99 96 100 100 100 100 100 100 99 88 Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Tabelle 19 Erg nzende Informationen zu Varia
47. illumina MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose F RIN VITRO DIAGNOSTIK Katalognummer DX 102 1004 2 L ufe bis zu 96 Proben pro Kit Katalognummer DX 102 1003 20 L ufe bis zu 960 Proben pro Kit Verwendungszweck Der Illumina MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose ist ein qualitatives In vitro Diagnostiksystem das zum gleichzeitigen Erkennen von 139 klinisch relevanten CF verursachenden Mutationen und Varianten des CFTR Gens in genomischer aus menschlichen peripheren Blutproben isolierter DNA verwendet wird Zu den Varianten geh ren diejenigen die 2004 vom American College of Medical Genetics ACMG und 2011 vom American College of Obstetricians and Gynecologists ACOG empfohlen wurden Der Test wurde f r das Tr ger Screening bei Erwachsenen im geb rf higen Alter als Zweitdiagnose bei Neugeborenen und Kindern und als ein erster Test f r die Diagnose bei Personen mit Verdacht auf zystische Fibrose entwickelt Die Ergebnisse dieses Tests sollten von einem zertifizierten klinischen Molekulargenetiker oder einem gleichwertig qualifizierten Kollegen interpretiert werden und in Verbindung mit anderen verf gbaren Labor und klinischen Informationen verwendet werden Dieser Test ist nicht f r Tests im Bereich des Neugeborenen Screenings der pr natalen Diagnostik und der Pr implantation sowie f r unabh ngige Diagnosezwecke indiziert Der Test muss auf dem IluminaMiSeqDx Ger t durchgef hrt werden Zus
48. in sequenzierungsbasierter Assay ist wird die F508del oder 1507del Meldung aufgrund der drei gutartigen Polymorphismen nicht beeintr chtigt Daher werden keine Korrekturen am Nachweisergebnis vorgenommen Das Genotypergebnis wird als HET gemeldet wenn eine Probe als heterozygot identifiziert wird und sowohl Wildtyp als auch Mutantenallele in der Probe nachgewiesen werden Das Genotypergebnis wird als HOM gemeldet wenn eine Probe als homozygot identifiziert wird und nur das Mutantenallel in der Probe nachgewiesen wird Wenn keine Variante in einer Probe identifiziert wird gibt der Bericht No panel variants are detected Keine Panel Varianten nachgewiesen an 3 Der Assay Bericht enth lt Informationen zur Proben Call Rate f r jede Probe Die Call Rate wird berechnet als die Anzahl der Variantenpositionen regionen die einen vordefinierten Konfidenzschwellenwert erreichen geteilt durch die Gesamtzahl der untersuchten Positionen Regionen Bei Proben die bedingte Meldungen erfordern werden die zus tzlich untersuchten Varianten in der Call Raten Berechnung ber cksichtigt Jede Variante mit einem vordefinierten Konfidenzwert unter dem Schwellenwert wird als No Call gemeldet Es wird empfohlen die Probe zu wiederholen 4 Ein Probenergebnis wird nur dann als g ltig betrachtet wenn die Call Rate mindestens 99 betr gt Wenn die Call Rate unter 99 betr gt wird die Leistung als Fail Fehlgeschlagen angegeben und die P
49. instimmende An m 4 N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl 3 N E x Pa der Uberein Uberein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro der nn i fi ne r No s ung stimmung stimmung Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis Calls ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 B F508del 12 12 12 100 1898 1G gt A HET B F508del 12 12 12 2143delT HET m 00 B 53 3905insT 810 804 804 804 100 100 HET ssn O o e e e a oo a s o ee e o jw w o o a sl m delel elolm wjw oj o m w w w 44 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl a e gt N E x Pa der Uberein Uberein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro der nn i fi ne r No s ung stimmung stimmung Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis r n an an an an n an s Calls O ort ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 calls m m 0 0 mm mo m m wm e wm wje ejoj w wj mjo ojm m B 65 1078delT 810 804 804 804 100 100 HET o wen O o e e e d a o o o 71 E92X 810 12 12 12 798 798 798 100 100 F508del HET p 00 45 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten As
50. mer DX 410 1001 Reagenzien Bereitgestellte Reagenzien Reagenzien f r den Illumina MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose werden von Illumina bereitgestellt Katalognummer DX 102 1003 wurde f r 20 L ufe mit maximal 48 Proben pro Lauf insgesamt bis zu 960 Proben konfiguriert Katalognummer DX 102 1004 wurde f r zwei L ufe mit maximal 48 Proben pro Lauf insgesamt bis zu 96 Proben konfiguriert MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Karton 1 Tabelle 3 Karton 1A Voramplifikationsreagenzien Menge Komponente CF 139 V arianten Oligo Pool Hybridisierungspuffer Extension Ligation Mischung Index Primer A A501 H A508 Index Primer 1 A701 12 A712 PCR Polymerase PCR Master Mischung DX 102 1003 10 R hrchen 10 R hrchen 10 R hrchen 10 R hrchen pro Primer 10 R hrchen pro Primer 10 R hrchen 10 R hrchen 6 Teile Nr 15038347 Rev A DEU DX 102 1004 1 R hrchen 1 R hrchen 1 R hrchen 1 R hrchen pro Primer 1 R hrchen pro Primer 1 R hrchen 1 R hrchen F llmenge 600 ul 4 32 ml 4 8 ml 192 ul 128 ul 56 ul 2 8 ml Wirkstoffe Gepufferte w ssrige L sung mit Oligonukleotiden die auf das CFTR Gen abzielen Gepufferte w ssrige L sung mit Salzen und Formamid Gepufferte w ssrige L sung mit einer propriet ren Mischung aus DNA Polymerasen DNA Ligasen und dNTPs PCR Primer mit Indexsequenzen und Sequenzierungs
51. mittelt dividiert wurde Die negative bereinstimmung wurde ber alle Wildtyp Positionen WT Positionen hinweg berechnet indem die Anzahl der konkordanten WT Positionen durch die Gesamtzahl der WT Positionen wie in den Referenzmethoden ermittelt dividiert wurde Die allgemeine bereinstimmung Overall Agreement OA wurde ber alle gemeldeten Positionen hinweg berechnet indem die Anzahl der konkordanten WT und Varianten Positionen durch die Gesamtzahl der gemeldeten Positionen wie in den Referenzmethoden ermittelt dividiert wurde Der Illumina MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose hatte einen PA Genotypgrad von 100 Der NA Wert f r alle WT Positionen war gt 99 99 und der OA Wert f r alle gemeldeten Positionen war ebenfalls gt 99 99 Alle Testergebnisse basieren auf anf nglichen Tests Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 25 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose lle 15 Gesamtgenauigkeit des MiSeqDx 139 V arianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten Variante N Summe Negative Anzahl Anzahl DIE Negativ Gesamt E Varianten Calls ER berein berein berein IEUSEMERNET typ IN NADE Vari Kiini Zelllinien Synthe E ger der yNo timm timm timm pro Vari s ung s ung s ung sche tische Wild Miscalls Calls Name ante proben m aca Gi Proben Proben CFTR DEL c 54 5940_ 500 4 1 0 495 100 100 100 273 10250 dele2 3 nn del21kb 26 Teile Nr
52. mmol L 7 4 mmol L 100 EDTA 16 7 0 mg ml 2 8 mg ml 100 Probenindizierung Proben Index Primer dienen im Assay dazu jeder Proben DNA einen eindeutigen Barcode zuzuweisen wodurch es m glich ist mehrere Proben in einem einzigen Sequenzierungslauf zusammenzufassen Es wurden insgesamt 96 Probenindizierungen mit acht eindeutigen DNA Proben getestet um die F higkeit des Assays zu berpr fen dauerhaft Genotypaufrufe f r eine angegebene Probe ber verschiedene Index Primer Kombinationen hinweg vornehmen zu k nnen Jede Probe wurde mit 12 unterschiedlichen Kombinationen an Index Primern getestet Die Probenergebnisse wurden f r alle Positionen Varianten mit Ausnahme der zwei gro en Deletionen die anhand eines Duplex PCR Assay best tigt wurden mit bidirektionalen Sequenzierungsdaten nach Sanger verglichen Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit betrug f r alle Proben Index Primer Kombinationen 100 Quellen 51 1 10 11 12 Watson MS Cutting GR Desnick RJ Driscoll DA Klinger K et al 2004 Cystic fibrosis population carrier screening 2004 revision of American College of Medical Genetics mutation panel Genetics in Medicine 665 387 391 Committee on Genetics April 2011 The American College of Obstetricians and Gynecologists Committee Opinion Update on Carrier Screening for Cystic Fibrosis 486 1 4 Bobadilla JL Macek Jr M Fine JP Farrell PM 2002 Cystic Fibrosis A Worldwide Analysis of CFTR Mutations Cor
53. n der ersten Spalte der Filterplatte f nf bis sechsmal auf und ab b bertragen Sie 20 ul von der Filterplatte zur entsprechenden Spalte der AMP Platte c Pipettieren Sie leicht f nf bis sechsmal auf und ab um die DNA mit der PCR Gebrauchsl sung gr ndlich zu mischen d bertragen Sie in hnlicher Weise die verbleibenden Spalten von der Filterplatte zur AMP Platte Die Spitzen m ssen nach jeder Spalte ausgetauscht werden um Index und Probenkreuzkontaminationen zu vermeiden Versiegeln Sie die AMP Platte und sichern Sie den Verschluss mit einer Gummiwalze Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C bertragen Sie die AMP Platte in den Nachamplifikationsbereich 0 F hren Sie mithilfe des folgenden Programms auf einem Thermocycler eine PCR durch 95 C f r 3 Minuten 25 Zyklen von 95 C f r 30 Sekunden 62 C f r 30 Sekunden 72 C f r 60 Sekunden 72 C f r 5 Minuten Halten Sie die Temperatur konstant bei 10 C SICHERER HALTEPUNKT Falls Sie nicht gleich mit der PCR Reinigung fortfahren kann die AMP Platte ber Nacht auf dem I Thermocy dler bleiben oder sie kann bei2 C bis 8 C bis zu 48 Stunden aufbewahrt werden PCR Reinigung Vorbereitung 1 Bringen Sie die PCR Reinigungs Beads auf Raumtemperatur 2 Bereiten Sie frisches 80 iges Ethanol aus reinem Ethanol zu Verfahren 1 Zentrifugieren Sie die AMP Platte eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C 2 Stellen Sie eine neue MIDI Platte
54. nachstehend als CLP Platte bezeichnet bereit 3 Invertieren Sie die PCR Reinigungs Beads zehnmal Mischen Sie kr ftig mit dem Vortexer und invertieren Sie erneut zehnmal Inspizieren Sie die L sung visuell um sicherzugehen dass die Beads resuspendiert sind 4 F gen Sie 45 ul PCR Reinigungs Beads zu jedem Well der CLP Platte hinzu 5 bertragen Sie das vollst ndige PCR Produkt von der AMP zur CLP Platte 6 Versiegeln Sie die CLP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler zwei Minuten lang bei 1800 rpm 7 Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne zu sch tteln 8 Platzieren Sie die Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf einem Magnetstativ bis der berstand klar ist 18 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Lassen Sie die CLP Platte auf dem Magnetstativ entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Lassen Sie die CLP Platte auf dem Magnetstativ und waschen Sie die Beads wie folgt a F gen Sie jedem Probe Well 200 ul frisch zubereitetes 80 iges Ethanol hinzu b Inkubieren Sie die Platte auf dem Magnetstativ mindestens 30 Sekunden bzw so lange bis der berstand klar ist c Entfernen Sie vorsichtig den berstand und entsorgen Sie ihn Wiederholen Sie den Waschvorgang wie im vorherigen Schritt beschrieben Verwenden Sie eine auf 20 ul eingestellte P20 Meh
55. nfalls 99 88 Alle Testergebnisse basieren auf anf nglichen Tests F r diese Reproduzierbarkeitsstudie wurden keine Wiederholungstests durchgef hrt Tabelle 18 Reproduzierbarkeit des MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An m i hl Anzahl Positive Negative Gesamt Pa Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp za der berein berein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro M d No immun min Simik i Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis i 5 8 5 8 Calls ort ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 calls 1 S549N HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 2 1812 1 G gt A 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 HET A 3 Q493X 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 F508del HET A 4 F508del 810 12 12 12 on 798 798 0 1 100 100 100 2184delA HET A 5A Y122X 810 12 10 12 798 665 798 0 1354 94 44 94 44 94 44 R1158X HET A 6 F508del 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 2183AA gt G HET 39 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl 3 N E x Pa l der Uberein Uberein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro der N MR i fi n n immun mmun j Nr Stand Stand Stand Stand Stand
56. nger und die Deletionen mit einem PCR Assay verglichen 1250 ng und 25 ng wurden als Ober und Untergrenze f r die DNA Zugabe identifiziert da sie eine Proben First Pass Rate von 2 95 ohne falsche Calls 100 Genauigkeit und Call Rate hatten Die DNA Zugaben von 1250 ng 250 ng und 100 ng wurden mit vier repr sentativen DNA Proben und mindestens 20 Replikaten pro DNA Zugabestufe f r jede Probe n 4 x 20 80 Proben weiter getestet w hrend die Untergrenze von 25 ng mit 14 Proben und 20 Replikaten f r jede Probe n 14x20 280 Proben getestet wurde Die Genauigkeit und die Proben First Pass Rate betrugen bei allen DNA Zugabestufen 100 Die Ergebnisse zeigen dass der Illumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose im DNA Zugabebereich von 25 ng bis 1250 ng verwendet werden kann um genaue Ergebnisse zu liefern St rende Substanzen Um die Auswirkungen st render Substanzen auf das Illumina MiSegqDx System f r zystische Fibrose zu untersuchen wurde die Leistung des Assays mit und ohne potenzielle St rsubstanzen berpr ft Es wurden acht Vollblutproben in der Studie getestet darunter drei CF positive Proben mit eindeutigen Genotypen Vier k rpereigene st rende Substanzen Bilirubin Cholesterin H moglobin und Triglycerid wurden getestet indem die Blutproben vor der DNA Extraktion mit diesen versetzt wurden Die Konzentrationsgrenzen f r jede Substanz sind in der nachfolgenden Tabelle aufgef hrt Um dar ber hinaus
57. ngsschritts ist es u erst wichtig das Bibliothek Bead Pellet vollst ndig zu resuspendieren Dies ist unerl sslich um eine konsistente Clusterdichte auf der MiSegDx Flie zelle zu erzielen Halten Sie beim Bibliotheksnormalisierungsschritt die angegebenen Inkubationszeiten ein Eine unsachgem e Inkubation kann die Bibliotheksdarstellung und die Clusterdichte beeintr chtigen Aufgrund der Anzahl an Platten bertragungen und dem sich daraus ergebenden Kontaminationspotenzial m ssen Sie u erste Vorsicht walten lassen um sicherzustellen dass der Well Inhalt vollst ndig im Well verbleibt Passen Sie auf dass der Inhalt nicht verspritzt wird Die Empfehlung zur Zugabe von 250 ng DNA erm glicht die DNA Mengenvariation Die Leistung des Assays wird durch diese Zugabestufe erh ht Probenvarianten mit einer No Call Angabe im Testbericht weisen darauf hin dass die Daten f r diese Variantenposition die definierten Sequenzierungsgrenzwerte nicht erreicht haben Probenvarianten mit einer No Call Angabe d rfen nicht gemeldet werden es sei denn bei Wiederholungstests werden die definierten Grenzwerte erreicht sodass die Probenvarianten nicht mehr als No Call eingestuft werden Verfahrenshinweise 1 Probend Illumina verlangt dass jeder Lauf der als parallel zu verarbeitender Satz an Proben definiert ist eine positive Kontroll DNA Probe und eine negative Kontrollprobe NTC oder No Template Control enth lt Die positi
58. nten aus Reproduzierbarkeitsstudien Variation CFTR allgemeiner Name nn Genregion PolyTG PolyT Zusammengesetzte DIV Intron 9 CFIR dele2 3 Intron1 Intron3 1507del DIV Exon 11 R75X SNV Exon 3 E92X SNV Exon 4 L206W SNV Exon 6 R334W SNV Exon 8 Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 48 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Variation Visier CFTR allgemeiner Name Genregion A455E SNV Exon 10 Q493X SNV Exon 11 1717 1G gt A SNV Intron 11 G542X SNV Exon 12 S549N SNV Exon 12 S549R c 1647T gt G SNV Exon 12 G551D SNV Exon 12 R553X SNV Exon 12 R560T SNV Exon 12 1812 1 G gt A SNV Intron 12 1898 1G gt A SNV Intron 13 W846X SNV Exon 15 2789 5G gt A SNV Intron 16 3120 1G gt A SNV Intron 18 3272 26 A gt G SNV Intron 19 Y1092X C gt A SNV Exon 20 M1101K SNV Exon 20 R1158X SNV Exon 22 R1162X SNV Exon 22 3849 10kbC gt T SNV Intron 22 W1282X SNV Exon 23 N1303K SNV Exon 24 DIV ist ein Akronym f r Deletions Insertions Variante DNA Extraktion Drei h ufig verwendete im Handel erh ltliche Extraktionsmethoden die magnetische Bead Extraktion die Alkoholpr zipitation und die Isolation mittels Kieselgels ule wurden unter Verwendung von mit EDTA antikoaguliertem Vollblut gepr ft Es wurden insgesamt 14 eindeutige Blutproben in der Studie verwendet die Wildtyp und drei Mutanten Genotypen umfassten drei Proben mit F508del eine Probe mit I506V und eine Probe mit D110H Die drei DNA Extraktionsmet
59. nuar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Leistungsmerkmale Genauigkeit Die Genauigkeit des Illumina MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose ergab sich aus der Auswertung von 500 Proben die eine Vielzahl von CFTR Varianten aus vier verschiedenen Quellen repr sentieren Die prim re Quelle der Genauigkeitsdaten war eine klinische Genauigkeitsstudie die mit einem Panel aus 366 Proben durchgef hrt wurde Die Mehrzahl n 355 der Proben bestand aus archivierten anonymisierten klinischen gSDNA Proben die aus menschlichem Blut isoliert wurden Die restlichen 11 Proben wurden aus im Handel erh ltlichen Zelllinienproben gewonnen Die Daten dieser Studie wurden durch Genauigkeitsdaten von 68 Zelllinienproben die in der Reproduzierbarkeitsstudie untersucht wurden 14 klinischen Proben aus der analytischen Studie zur Auswertung der Extraktionsmethode sowie 52 synthetischen Plasmidproben erg nzt Die synthetischen Plasmide wurden so konstruiert dass sie den genomischen Kontext der seltenen Varianten enthielten und umfassten eine bis neun Varianten innerhalb desselben Konstrukts Sie wurden linearisiert auf der genomischen DNA mit entsprechenden Kopienzahlen verd nnt und mit menschlichen genomischen DNA Proben des Wildtyp Genotyps bei quivalenten Kopienzahlen gemischt um eine heterozygote Probe zu imitieren Die Genotypisierungsergebnisse f r 137 SNV kleine InDel Stellen einschlie lich der PolyTG PolyT Regi
60. on wurden mit der bidirektionalen Sanger Sequenzanalyse verglichen Zwei validierte PCR basierte Assays wurden als Referenzmethode f r die beiden gro en Deletionen im Panel verwendet Jeder doppelte PCR Assay nutzte zwei Primer S tze um zwischen Wildtyp heterozygoten und homozygoten Genotypen zu unterscheiden Einer der Primer S tze diente dazu die Deletionshaltepunkte zu flankieren w hrend der andere Satz eine in der Deletion befindliche Region amplifizierte Die zwei Produkte wurden anhand von Gr entrennung auf einem Agarosegel nachgewiesen Die PCR Assays wurden anhand eines Panels aus insgesamt 28 Proben 22 Proben f r jede Deletion validiert die aus aus Zelllinien und Blut gewonnenen genomischen DNA Proben sowie synthetischen Plasmiden bestanden die den WT HET und HOM Genotyp f r jede gro e Deletion umfassten Anhand der Untersuchung der PCR Produkte auf einem Agarosegel wurde best tigt dass die PCR Assays eine 100 ige Spezifit t und Reproduzierbarkeit f r alle getesteten Proben aufwiesen Die Genauigkeit der PCR Assays wurde anhand der Sanger Sequenzierung best tigt und f r 100 aller Proben nachgewiesen F r jeden Genotyp wurde die Genauigkeit anhand von drei statistischen Messgr en ermittelt Die positive bereinstimmung wurde f r jede Genotyp Variante berechnet indem die Anzahl der Proben mit bereinstimmenden Varianten Calls durch die Gesamtzahl der Proben mit dieser Variante wie anhand der Referenzmethoden er
61. r Konsequenz MVCC Mutation of Varying Clinical Consequence eine bedingt gemeldete modifizierende Variante PolyTG PolyT und drei bedingt gemeldete gutartige Varianten 1506V 1507V F508C 4 was zusammen 139 gemeldete Varianten ergibt Die 134 CF verursachenden Varianten entsprechen 129 CF verursachenden Varianten in der CFTR2 Datenbank Die CFTR2 Datenbank enth lt f nf CF verursachende Varianten bei denen dieselbe Proteingehalt nderung aus zwei unterschiedlichen Nukleotid nderungen heraus entstehen kann z B S466X C gt A und S466X C gt G Diese f nf Varianten sind gem dem Aminos uren Codon in der CFTR2 Datenbank z B S466X aufgef hrt w hrend der Assay jede einzelne Variante meldet z B S466X C gt A und S466X C gt G Die vom MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose gemeldeten 139 Varianten sind in Tabelle 2 aufgef hrt Tabelle 2 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Zusammenfassung der Varianten Aufgelistet in der Reihenfolge der genomischen Koordinaten Fett ACMG 23 Kursiv Bedingt gemeldet MIV T3381 Q552X 3121 1G gt A CFTR dele2 3 1154insTC R553X 3272 26 A gt G Q39X S341P A559T L1065P E60X R347H R560T R1066C P67L R347P R560K R1066H R75X R352Q 1811 1 6kb A gt G L1077P G85E 1213delT 1812 1 G gt A W1089X 394delTT 1248 1G gt A E585X Y1092X C gt A 405 1 G gt A 1259insA 1898 1G gt A Y1092X C gt G 406 1G gt A W401X c 1202G gt A 1898 3A gt G M1101K E92X W401X c 1203G gt A 2143delT E110
62. reitung besteht im manuellen Vorbereiten der Proben f r die Sequenzierung Die Bibliotheksvorbereitung besteht aus vier wichtigen Schritten Hybridisierung Extension Ligation PCR Amplifikation und Bibliotheksnormalisierung Das zweite Verfahren ist das Sequenzieren der vorbereiteten Probe mithilfe der SBS Chemie Sequencing by Synthesis auf dem MiSegDx Ger t Bibliotheksvorbereitung Anw spez Region von ANWSBEE Nun Sonde 1 Interesse ar en snnnnnnnnunnnnnnnnnnnnn A j a a Anw spez Anw spez ae Sonde 1 Sonde 2 5 P7 Index 1 Index 2 x D P7 Index 1 Index2 PS A Hybridisierung Im ersten Schritt der Hybridisierung wird ein Pool von Upstream und Downstream Oligonukleotiden der spezifisch f r den MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose ist in die genomische DNA Probe hybridisiert Am Ende des Vorgangs entfernt ein Waschlauf in drei Schritten anhand eines Filters der eine Gr enauswahl vornehmen kann ungebundene Oligonukleotide aus der genomischen DNA B Extension Ligation Im zweiten Schritt der Extension Ligation werden die hybridisierten Upstream und Downstream Oligonukleotide verbunden Eine DNA Polymerase erstreckt sich von den Upstream Oligonukleotiden ber die Zielregion hinaus gefolgt von der Ligation mit dem 5 Ende des Downstream Oligonukleotids mittels DNA Ligase Das Ergebnis besteht in der Bildung von Produkten die die CF spezifischen Oligonukleotide enthal
63. relation With Incidence Data and Application to Screening Human Mutation 19 575 606 Moskowitz SM Chmiel JF Sternan DL Cheng E Gibson RL et al 2008 Clinical practice and genetic counseling for cystic fibrosis and CFTR related disorders Genetics in Medicine 10 12 851 868 Moskowitz SM Chmiel JF Sternen DL Cheng E Cutting GR CFTR related disorders Pagon RA Bird TC Dolan CR Stephens K editors GeneReviews Seattle WA University of Washington 2008 Available at www ncbi nlm nih gov books NBK1250 Online Aktualisiert am 19 Februar 2008 Katkin JP 2012 Cystic fibrosis Clinical manifestations and diagnosis Verf gbar unter www uptodate com Online 07 Dezember 2012 Farrell PM Rosenstein BJ White TB Accurso FJ Castellani C et al 2008 Guidelines for diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults Cystic Fibrosis Foundation consensus report J Pediatr 153 2 S4 S14 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2010 Cystic Fibrosis Mutation Database CFTR1 Verf gbar unter www genet sickkids on ca app Online August 2013 Rohlfs EM Zhou Z Heim R Nagan N Rosenblum L et al 2011 Cystic fibrosis carrier testing in an ethnically diverse US population Clinical Chemistry 57 6 841 848 Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Verf gbar unter www cftr2 org Online August 2013 The Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Project Verf gbar unter www na
64. rkanalpipette um berfl ssiges Ethanol zu entfernen Entfernen Sie die CLP Platte vom Magnetstativ und lassen Sie die Beads 10 Minuten lang an der Luft trocknen F gen Sie 30 ul Elutionspuffer zu jeder Probe hinzu und mischen Sie dies dann kurz mit dem Vortexer Versiegeln Sie die CLP Platte und sch tteln Sie sie auf einem Mikroplattensch ttler zwei Minuten lang bei 1800 rpm berpr fen Sie nach dem Sch tteln ob die Proben resuspendiert sind Wiederholen Sie diesen Schritt wenn dies nicht der Fall ist Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur Platzieren Sie die CLP Platte mindestens zwei Minuten bzw so lange auf dem Magnetstativ bis der berstand klar ist Stellen Sie eine neue MIDI Platte nachstehend als LNP Platte bezeichnet bereit bertragen Sie 20 ul des berstands von der CLP Platte auf die LNP Platte Optional bertragen Sie die verbleibenden 10 ul berstand von der CLP Platte auf eine neue Platte und beschriften Sie diese Platte mit einem Laufnamen und Datum Lagern Sie diese Platte bis zum Ende des Sequenzierungslaufs und der Datenanalyse bei 25 C bis 15 C Die gereinigten PCR Produkte k nnen im Falle von Probenfehlern zur Fehlerbehebung verwendet werden SICHERER HALTEPUNKT Wenn Sie den Vorgang an diesem Punkt beenden versiegeln Sie die LNP Platte und zentrifugieren l Sie sie eine Minute lang bei 1000 x g und 20 C Die Platte ist bis zu drei Stunden lang bei 2 C bis 8 C stabil Bibliotheksnorm
65. robe muss wiederholt werden Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev ADEU 23 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose HINWEIS Wenn die Proben Call Rate weniger als 50 betr gt wird die Leistung als Fail Fehlgeschlagen angegeben und mit der Anmerkung Sample Failed Probe fehlgeschlagen im Bericht versehen Es werden keine Varianteninformationen angezeigt Diese Probe muss wiederholt werden Es wird empfohlen dass anhand von synthetischen Proben validierte Varianten siehe Genauigkeitstabelle vom Benutzer mithilfe einer validierten Referenzmethode verifiziert werden bevor ein Bericht ber das erste Patientenergebnis mit diesen Varianten erstellt wird Wenn mehr als zwei Varianten in einer Probe identifiziert werden sollte der Benutzer das Ergebnis verifizieren indem er die Probe unter Verwendung des Illumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose mit einem frischen gDNA Extrakt wiederholt um eine Kreuzkontamination der Probe auszuschlie en HINWEIS Es sollte eine Haplotyp Phasierung in Betracht gezogen werden wenn zwei oder mehr Varianten nachgewiesen werden Alle Varianteninterpretationen sollten von einem zertifizierten klinischen Molekulargenetiker oder einem quivalenten Spezialisten gem lokalen Verfahren und Richtlinien durchgef hrt werden Zu den potenziellen Interpretationsreferenzen geh ren unter anderem CFTR2 Datenbank Sosnay Papier ACMG Richtlinien von 2004 und die Commi
66. roben aus die f r die Sequenzierung zu einem Pool zusammengefasst werden sollen Es k nnen maximal 48 Proben f r die Sequenzierung zu einem Pool zusammengefasst werden Wenn die SGP Platte gefroren gelagert wurde mischen Sie jede zu sequenzierende Bibliothek indem Sie drei bis f nfmal auf und abpipettieren bertragen Sie 5 ul von jeder zu sequenzierenden Bibliothek von der SGP Platte Spalte f r Spalte auf einen PCR 8 fach R hrchenstreifen Verschlie en Sie die SGP Platte mit einer klebenden Plattenversiegelung und legen Sie sie beiseite 4 HINWEIS Bewahren Sie die versiegelte SGP Platte bei 25 C bis 15 C auf Die versiegelte SGP Platte kann maximal 3 Tage lang aufbewahrt werden Kombinieren und bertragen Sie den Inhalt des PCR 8 fach R hrchenstreifens in das PAL R hrchen Sch tteln Sie das PAL R hrchen gr ndlich Stellen Sie ein neues Eppendorf Gef nachfolgend als DAL R hrchen bezeichnet bereit Geben Sie 585 ul Bibliothek Verd nnungspuffer in das DAL R hrchen Geben Sie 6 ul von 20 pM Interne PhiX Kontrolle in das DAL R hrchen Pipettieren Sie drei bis f nfmal auf und ab um die Spitze zu sp len und eine vollst ndige bertragung sicherzustellen bertragen Sie 9 ul PAL in das DAL R hrchen das Bibliothek Verd nnungspuffer enth lt Pipettieren Sie drei bis f nfmal auf und ab um die Spitze zu sp len und eine vollst ndige bertragung sicherzustellen Mischen Sie das DAL R hrchen mit dem Vortexer bei
67. rter FEV 1 und Pankreasstatus wurden zusammen mit den CFTR Genotyp Informationen analysiert Der systematische Ansatz der gleichzeitigen Analyse dieser Varianten aus klinischer funktionaler und genetischer Perspektive heraus ergab 134 eindeutige CF verursachende Varianten bei 129 eindeutigen genomischen Positionen da bei f nf Positionen zwei Nukleotid nderungen an derselben Position auftreten die derzeit in der CFTR2 Datenbank Stand August 2013 enthalten sind Es wird erwartet dass die Verwendung eines Panels das alle diese Varianten umfasst 95 4 der Allele ausmacht die zystische Fibrose verursachen und die Identifikation der gef hrdeten Paare durch den Nachweis beider Allele auf ca 91 erh ht im Vergleich zu 72 mit dem vom ACMG empfohlenen Panel mit 23 Varianten 2 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose CFTR Varianten im Panel Die vom MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose gemeldeten Varianten wurden speziell ausgew hlt da sie den kompletten Satz an klinisch validierten Varianten darstellen die in der CFTR2 Datenbank der Johns Hopkins University einem Produkt der CFTR2 Initiative Clinical and Functional Translation of CFTR als Ausl ser f r zystische Fibrose klassifiziert sind Der Assay testet auf 134 CF verursachende Varianten eine vom ACMG empfohlene Panel Variante R117H von CFTR2 klassifiziert als eine Mutation von variierender klinische
68. say f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende Negativ bereinstimmende An N Anzahl Positive Negative Gesamt Pro Calls Calls Varianten Calls Wildtyp zahl a e gt N E x Pa der Uberein Uberein berein l ben Proben Genotyp Varianten pro der N MR i fi ne No S un summun summun Nr Stand Stand Stand Stand Stand Stand Stand Mis Cu ai S r gt ort ort 1 ort 2 ort 3 ort 1 ort 2 ort 3 calls i i gt oem mo oo o o o o om m w 77 621 1G gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 A455E HET wm mjo EICHE TEEN ma m B 81 F508del 810 12 12 12 798 798 798 100 100 G551D HET m 00 B R117H TG 10 T 816 18 18 18 798 798 798 100 100 F508del HET 9 TG 12 T 5 m 00 B 85 2789 5G gt A 810 804 804 804 100 100 HOM 46 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Summe Positiv bereinstimmende P Pro Calls Calls Varianten T ben Proben Genotyp Varianten pro S Nr Stand Stand Stand Stand ort ort 1 ort 2 ort 3 B 868 CFTR dele 2 810 1 112 12 3 F508del HET B 87 F508del 810 12 12 12 1898 1G gt A HET B 88 WT 810 0 0 0 B 89 F508del 810 12 12 12 2143delT HET B 90 3905insT 810 6 6 6 HET B 91 394delTT 810 6 6 6 HET B 92 F508del HET 810 6 6 6 Summe 74556 2209 Die Position des Wildtyps entsprechend der N1303K Variante f r ein Replikat das aufgrund unzure
69. ten flankiert von Sequenzen die f r die Amplifikation ben tigt werden C PCR Amplifikation Im dritten Schritt der PCR Amplifikation werden die Extension Ligation Produkte unter Verwendung von Primern die Indexsequenzen f r die Proben Multiplexierung hinzuf gen sowie von g ngigen 4 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Adaptern die f r die Clusterbildung auf dem MiSegqDx Ger t erforderlich sind amplifiziert Am Ende dieses Vorgangs reinigt ein PCR Reinigungsverfahren die PCR Produkte die als Bibliothek bezeichnet werden D Bibliotheksnormalisierung Im letzten Schritt der Bibliotheksnormalisierung wird die Quantit t jeder Bibliothek normalisiert um eine einheitlichere Bibliotheksdarstellung in der endg ltigen Pool Bibliothek sicherzustellen Am Ende dieses Vorgangs wird die Pool Bibliothek zur Sequenzierung mit der SBS Chemie auf das MiSegDx Ger t geladen Sequenzierung Die SBS Chemie verwendet eine Methode mit reversiblen Terminatoren um einzelne Nukleotidbasen zu erkennen die in wachsende DNA Str nge eingebaut sind W hrend eines Sequenzierungszyklus wird ein einzelnes mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Desoxynukleotid Triphosphat dNTP zur Nukleotid S urekette hinzugef gt Die Nukleotid Kennzeichnung dient als Terminator f r die Polymerisation d h nach jeder dNTP Inkorporation wird der Fluoreszenzfarbstoff bildlich erfasst um die Base zu identifi
70. tiven Kontrollprobe keine Matrize keine DNA ist bei jedem Lauf erforderlich um m gliche Kontaminationsvorkommnisse zu entdecken Die Call Rate sollte bei der negativen Kontrollprobe weniger als 10 betragen Wenn eine negative Kontrollprobe eine Call Rate von mehr als 10 generiert ist w hrend der Assay Verarbeitung m glicherweise eine Kontamination aufgetreten Der Assay wird als fehlgeschlagen angesehen und der gesamte Assay muss wiederholt werden angefangen bei der Bibliotheksvorbereitung Wildtyp Kontrollprobe Die Wildtyp DNA Kontrollprobe wird bei jedem Lauf empfohlen Die Wildtyp Kontrollprobe muss eine gut charakterisierte Probe sein die keine CFTR Varianten enth lt Die Wildtyp Kontrollprobe muss den erwarteten Genotyp generieren Wenn die Wildtyp Kontrollprobe einen anderen als den erwarteten Genotyp generiert ist m glicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index Primern aufgetreten Der gesamte Assay muss wiederholt werden angefangen bei der Bibliotheksvorbereitung Vor der anf nglichen Verwendung dieses Produkts im Labor des Benutzers sollte die Leistung des Assays durch das Testen mehrerer positiver und negativer Kontrollproben mit bekannten Leistungsmerkmalen verifiziert werden Alle Qualit tskontrollen sollten in bereinstimmung mit den lokalen bundes und oder landesweiten Vorschriften oder Zulassungsanforderungen durchgef hrt werden 24 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Ja
71. ton 3A Voramplifikationsreagenzien Menge Komponente DX 102 1003 DX 102 1008 F llmenge Wirkstoffe Lagerung Stringenter Wasch 10 Flaschen 1 Flasche 24 ml Gepufferte w ssrige L sung mit 2 C bis 8 C Puffer Salzen 2 Mercaptoethanol und Formamid Universeller Wasch 10 R hrchen 1 R hrchen 4 8 ml Gepufferte w ssrige L sung mit 2 C bis 8 C Puffer Salzen Tabelle 7 Karton 3B Nachamplifikationsreagenzien Menge Komponente DX 102 1003 DX1021004 F llmenge Wirkstoffe Lagerung PCR Reinigungs 10 R hrchen 1 R hrchen 5ml Gepufferte w ssrige L sung mit 2 C bis 8 C Beads festphasigen paramagnetischen Beads und Polyethylenglykol Bibliotheks 20 R hrchen 2 R hrchen 4 8 ml Gepufferte w ssrige L sung mit 2 C bis 8 C normalisierungs Salzen 2 Mercaptoethanol und Wasch Puffer Formamid Bibliothek Beads 10 R hrchen 1 R hrchen 1 2 ml Gepufferte w ssrige L sung mit 2 C bis 8 C festphasigen paramagnetischen Beads MiSegDx Flie zelle 20 Beh lter 2 Beh lter 1 Flie zelle Glassubstrat mit kovalent 2 C bis 8 C CF 139 Varianten gebundenen Oligonukleotiden Assay Januar 2014 Teile Nr 15038347 Rev A DEU 7 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Karton 4 Tabelle 8 Karton 4 Nachamplifikationsreagenzien Menge u F Komponente DX 102 1003 DX 102 1008 F llmenge Wirkstoffe MiSegDx SBS L sung 20 Flaschen 2Flaschen
72. ttee Opinion des ACOG von 2011 Informationen zur Berechnung und Darstellung der Ergebnisse bzw zur Beschreibung des Inhalts in einem Bericht im Textdateiformat finden Sie im MiSeg Reporter Benutzerhandbuch Teile Nr 15038356 Verfahren zur Qualit tskontrolle Die guten Laborpraktiken schreiben vor dass Kontrollproben evaluiert werden m ssen um Unterschiede bei der Blutverarbeitung und bei technischen Verfahren im Labor des Benutzers zu erkennen die zu signifikanten Schwankungen bei den Ergebnissen f hren k nnen 1 Positive Kontrollproben Eine positive DNA Kontrollprobe ist bei jedem Lauf erforderlich Die positive DNA Kontrollprobe sollte eine gut charakterisierte Probe mit mindestens einer bekannten CFTR Variante sein 6 Illumina empfiehlt die Verwendung rotierender positiver Kontrollproben die den technischen Standards und Richtlinien des ACMG von 2008 f r CF Mutationstests und den klinischen Laborstandards f r die Sequenzierung der n chsten Generation des ACMG aus dem Jahr 2013 entsprechen Die positive Kontrollprobe muss den erwarteten Genotyp generieren Wenn die positive Kontrollprobe einen anderen als den erwarteten Genotyp generiert ist m glicherweise ein Fehler bei der Probenverfolgung oder eine fehlerhafte Aufzeichnung von Index Primern aufgetreten Der gesamte Assay muss wiederholt werden angefangen bei der Bibliotheksvorbereitung Negative Kontrollprobe Keine Matrize Keine DNA Die Verwendung einer nega
73. ve Kontroll DNA Probe muss eine gut charakterisierte Probe mit einer oder mehreren bekannten CFTR Varianten sein Illumina empfiehlt die Verwendung einer Wildtyp Kontrollprobe Die Wildtyp Kontrollprobe sollte als eine Probe ausgef hrt werden und nicht die positive oder negative Kontrollprobe ersetzen Bevor Sie mit dem MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose beginnen extrahieren und quantifizieren Sie die DNA Sie k nnen hierf r ein beliebiges validiertes DNA Extraktionsverfahren verwenden Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer Vergewissern Sie sich dass das A260 A280 Verh ltnis der DNA Probe gt 1 5 ist Normalisieren Sie die DNA Probe auf 50 ng ul Jede Probe muss 5 ul genomische DNA insgesamt 250 ng enthalten urchsatz und Indexdarstellung Beim Illumina MiSegDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose betr gt der Probendurchsatz pro MiSegDx Lauf zwischen 8 und 48 Proben Die w hrend der PCR Amplifikation verwendeten Index Primer m ssen auf Basis des gew nschten endg ltigen Probendurchsatzes ausgew hlt werden damit Diversit t in der Indexsequenz sichergestellt ist ANMERKUNG Um eine maximale Effizienz beim Durchsatz zu erzielen f hren Sie die Bibliotheksvorbereitung f r bis zu 96 Proben durch und teilen Sie die Proben dann in zwei Sequenzierungsl ufe mit maximal 48 Proben pro Lauf auf MiSeqDx verwendet eine gr ne LED zum Sequenzieren von G T Basen und eine rote LED zum Sequenzier
74. xT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten Variante Sume Negative Anzahl Anzahl aa Negative Gesamt R Varianten Calls a Uberein Uberein berein allgemeiner yp cDNA Name Va Klini Zelllinien Synthe Calls der der No 7 pro Vari 5 y g stimmung stimmung stimmung h tisch il 1 lls Nama KEN sche Srobeh sche Wildtyp Miscalls Calls o Proben Proben SNV c 2490 1G 500 2 498 100 100 gt T 2585delT 2622 1G gt A 100 gt A 34 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSegDxT 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten Variante Sume Negative Anzahl Anzahl aa Negative Gesamt R Varianten Calls a Uberein Uberein berein allgemeiner yp cDNA Name pro Vari Klini Zelllinien Synthe Calls der der No he ng stimmung i h tisch il iscall lls pmm Name KEN sche Graben sche Wildtyp Miscalls Calls amp o amp Proben Proben W1204X SNV c 3612G gt A 500 1 499 100 100 c 3612G gt A gt A m 00 35 Teile Nr 15038347 Rev A DEU Januar 2014 MiSeqDx 139 Varianten Assay f r zystische Fibrose Positive Calls Varianten R Summe g Positive Negative Gesamt Variante Negative Anzahl Anzahl Br Varianten Calls iu Uberein Uberein berein allgemeiner cDNA Name Vari Klini Zelllinien Synthe Calls der der No M t i ro Vari stimmun stimmun stimmun Name typ pro sche tische Wil
75. y Charge auf dem Etikett des Assay Kartons angegeben ist Lagern Sie die Assay Komponenten bei der angegebenen Temperatur in ausgewiesenen Voramplifikations und Nachamplifikationsbereichen Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen bis zu sechsmal der Komponenten aus Karton 1 beeintr chtigt die Integrit t des Assays nicht Um eine Zersetzung der Proben oder Reagenzien zu verhindern stellen Sie sicher dass alle Natriumhypochloritd mpfe vollst ndig abgef hrt wurden bevor Sie das Protokoll starten Ordnungsgem e Laborpraktiken und eine gute Laborhygiene sind unerl sslich um eine Kontamination von Reagenzien Instrumenten und genomischen DNA Proben durch PCR Produkte zu verhindern Eine Kontamination durch PCR Produkte kann zu falschen und unzuverl ssigen Ergebnissen f hren Stellen Sie zur Verhinderung einer Kontamination sicher dass die Voramplifikations und Nachamplifikationsbereiche ber eigene Ger te z B Pipetten Pipettenspitzen Vortexer und Zentrifuge verf gen Vermeiden Sie eine Kreuzkontamination Verwenden Sie nach jeder Probe und nach der Abgabe von Reagenzien jeweils frische Pipettenspitzen Mischen Sie Proben mit einer Pipette und zentrifugieren Sie die Platte wenn dies angegeben ist Mischen Sie die Platten nicht mit dem Vortexer Die Verwendung von Aerosol resistenten Spitzen verringert das Risiko einer Amplikon bertragung und einer Kreuzkontamination von Probe zu Probe Die Index Proben Paarung muss genau dem
76. zieren und dann enzymatisch gespalten um die Inkorporation des n chsten Nukleotids zu erm glichen Da alle vier an reversible Terminatoren gebundenen dNTPs A G T C als einzelne separate Molek le vorhanden sind werden Integrationsfehler durch nat rliche Wettbewerbsmechanismen minimiert Base Calls erfolgen bei jedem Sequenzierungszyklus direkt anhand von Signalst rkemessungen Das Endergebnis ist eine Base f r Base erfolgende Sequenzierung Datenanalyse MiSeq Reporter verarbeitet die im Rahmen der Prim ranalyse generierten Base Calls und liefert basierend auf den Angaben im Probenblatt Informationen zu jeder Probe Dieser Schritt wird Sekund ranalyse genannt Die Sekund ranalyse umfasst die Demultiplexierung die FASTQ Dateigenerierung das Alignment das Varianten Calling und das Generieren von VCF Dateien die Informationen zu CFTR Varianten enthalten die an speziellen Positionen im Referenzgenom gefunden wurden e Demultiplexierung Dies ist der erste Schritt der Sekund ranalyse wenn im Probenblatt mehrere Proben aufgelistet sind und der Lauf ber Index Reads verf gt Die Demultiplexierung trennt Daten aus zusammengefassten Proben auf der Basis der eindeutigen Sequenzindizes die w hrend der PCR Amplifikation hinzugef gt wurden e Generieren von FASTQ Dateien Nach der Demultiplexierung generiert MiSeq Reporter tempor re Dateien im FASTO Dateiformat dem Textformat f r die Darstellung von Sequenzen FASTO Dateien enthalten
77. zur Verwendung akzeptabel Temperaturbereich Umgebung 5 C bis 99 C Temperatursteuerung 0 1 C bei 37 C 0 4 C bei 60 C Probeninkubator Es wird ein Inkubator Hybridisierungsofen ben tigt Der Inkubator muss den folgenden Leistungsspezifikationen entsprechen Temperaturbereich 10 C bis 100 C Temperatursteuerung 0 2 C Tischzentrifuge Es wird eine Tischzentrifuge ben tigt die die Temperatur von 20 C halten kann Es wird eine separate Zentrifuge im Nachamplifikationsbereich ben tigt Es kann jede Plattenzentrifuge verwendet werden die die vorgesehenen Geschwindigkeiten des Protokolls erreicht 280 bis 2400 x g Pr zisionspipetten Es wird ein Satz Pr zisionspipetten ben tigt Es wird ein separater Satz im Nachamplifikationsbereich ben tigt Die Verwendung von Pr zisionspipetten ist notwendig um eine genaue Reagenz und Probenabgabe zu gew hrleisten Es k nnen Einzel oder Mehrkanalpipetten verwendet werden wenn sie regelm ig kalibriert werden und ihre Genauigkeit innerhalb von 5 des angegebenen Volumens liegt Verbrauchsmaterialien Die folgenden Verbrauchsmaterialien werden ben tigt 96 Well PCR Platten mit Rahmen 0 2 ml Polypropylen oder vergleichbar HINWEIS Stellen Sie sicher dass die 96 Well Platte zum Magnetstativ passt 96 Well Lagerungsplatten 0 8 ml MIDI Platten L sungsbecken PVC DNase RNase frei Bottich Klebende Aluminiumfolienversiegelung Entsprechende PCR Plattenv

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