Home

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit

1. Hinweis Das Kreuzreaktivit tsmuster kann bei DNA Proben anders ausfallen beispielweise bei in Paraffin eingebetteten DNA Proben Das K RAS Kit ist f r die Detektion einer Mutation in einer DNA Probe ausgelegt Wenn bei einem zweiten Mutationsassay ein positives Ergebnis auftritt handelt es sich dabei wahrscheinlich um eine Kreuzreaktivit t In seltenen F llen wurden jedoch auch Doppelmutanten festgestellt Wenn das Muster nicht zum Kreuzreaktivit tsmuster passt sind m glicherweise weitere Untersuchungen erforderlich Seite 27 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 11 Assay Leistungsmerkmale Die Beurteilung der Assay Leistung erfolgte fur das K RAS Kit auf dem ABI7500 und dem LightCycler 480 System unter Einsatz der LightCycler Adapt Software zur Ermittlung der Ct Werte Auf jedem System wurden zahlreiche verschiedene Tests durchgef hrt Die Ergebnisse dieser Tests sind nachfolgend zusammengefasst Validierung des 1 Cut off Werts LightCycler 480 System Die Detektion von 1 Mutationen in einem Hintergrund aus K RAS mutationsnegativer Zelllinien DNA wurde ber einen Bereich aus drei verschiedenen Konzentrationen von Zelllinien DNA bestimmt um jedem Mutationsassay einen ACt Cut off Wert zuzuordnen F r jedes Assay wurden 1 Standards in 3 separaten Testl ufen dreifach getestet und zwar sowohl f r den Kontrollassay als auch den Muta
2. setzen Wenn diese Detektoren nicht bereits vorhanden sind auf die Schaltflache New Detectors klicken und einen FAM und einen JOE Detektor mit der Quencher Einstellung none einrichten Die Einstellung Passive Reference auf None setzen und auf die Schaltflache Next klicken Die ganze Platte auswahlen und die Kontrollkastchen fur die FAM und JOE Detektoren aktivieren um sicherzustellen dass beide Farbstoffe in jeder Kavitat Uberwacht werden Auf die Schaltflache Finish klicken Auf der Registerkarte Instrument den Zyklus wie in Tabelle 4 ange geben einrichten Tabelle 4 ABI7500 Zyklusbedingungen 8 Temperatur Datenerfassung Phase 1 95 C Phase 2 95 C 60 C FAM JOE Auf die Schaltflache Start klicken um die Analyse zu speichern und den Zyklus zu starten Seite 12 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 9 Nach Abschluss des Laufs sicherstellen dass die passive Referenz im Bildschirm Well Inspector auf none gesetzt ist Auf der Registerkarte Amplification Plot alle benutzten Kavit ten ausw hlen und im Listenfeld f r den Detektor den Farbstoff JOE ausw hlen 10 Das JOE Signal von jeder Probe berpr fen und mit dem JOE Signal in der NTC Kavit t vergleichen Es ist auf Proben zu achten die im Vergleich zur NTC eine sp tere Amplifikationskurve oder fehlge schlagene Amplifikat
3. G Finocchiaro F Cappuzzo P A Janne K Bencardino C Carnaghi W A Franklin M Roncalli L Crino A Santoro M Varella Garcia 2007 Journal of Clinical Oncology 25 18S 4021 F Di Fiore F Blanchard F Charbonnier F Le Pessot A Lamy M P Galais L Bastit A Killian R Sesboue J J Tuech A M Queuniet B Paillot J C Sabourin F Michot P Michel T Frebourg 2007 British Journal of Cancer 96 1166 1169 Shirin Khambata Ford Christopher R Garrett Neal J Meropol Mark Basik Christopher T Harbison Shujian Wu Tai W Wong Xin Huang Chris H Takimoto Andrew K Godwin Benjamin R Tan Smitha S Krishnamurthi Howard A Burris III Elizabeth A Poplin Manuel Hidalgo Jose Baselga Edwin A Clark David J Mauro 2007 Journal of Clinical Oncology 25 22 3230 3237 Newton CR Graham A Heptinstall LE Powell SJ Summers C et al 1989 Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system ARMS Nucleic Acids Res 17 7 2503 16 Whitcombe D Theaker J Guy S P Brown T Little S 1999 Detection of PCR products using self probing amplicons and fluorescence Nature Biotech 17 804 807 Seite 38 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Thelwell N Millington S Solinas A Booth J and Brown T 2000 Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mut
4. Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 7 Die PCR Platte verschlie en und kurz schwenken um die Reagenzien unten in den Kavit ten anzusammeln 8 Die Platte sofort in das LightCycler 480 System einsetzen LightCycler 480 Systemeinrichtung 1 Auf das Symbol der LightCycler 480 Software auf dem Desktop der mit dem System verbundenen Workstation klicken Den Anmeldevorgang durchf hren und auf der Seite Overview die Option New Experiment from Template ausw hlen Aus der angezeigten Liste der Test Templates den Eintrag K RAS LC480II Run Template ausw hlen weitere Informationen hierzu siehe Kapitel Probenauswertung f r das LightCycler 480 System Auf die Registerkarte Sample Editor klicken und unter Step 1 Select Workflow das Kontrollk stchen Abs Quant aktivieren Unter Select Filter Combinations sicherstellen dass beide Filter 465 510 nm und 533 580 nm ausgew hlt sind Die Probennamen unter Step 2 und Step 3 einrichten In Spalte 1 muss der Probenname Mixed Standard lauten In Spalte 2 muss der Probenname NTC lauten In die Spalten 3 12 m ssen Probennamen eingegeben werden Seite 15 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 4 Die Namen m ssen f r alle Kavit ten in Spalte 1 identisch sein Die Option Quantification Sample Type auf unknown s
5. Standard Gemischter Standard ACt Zul ssiger Bereich f r gemischten Standard 1 ACt der Probe 0 70 2 70 bis 1 30 6 5 1 04 3 04 bis 0 96 0 02 2 02 bis 1 98 0 98 2 98 bis 1 02 0 02 1 98 bis 2 02 0 19 2 19 bis 1 81 1 12 3 ACt Werte der Probe 3 12 bis 0 88 3 1 Wenn der ACt Wert der Probe h her als der 1 Wert ist gem Angabe in Tabelle 5 dann wird die DNA Probe als mutationsnega tiv oder unter dem Grenzwert des K RAS Kits liegend klassifiziert 3 2 Ist der ACt Wert der Probe niedriger als der 1 Wert dann wird die DNA Probe als mutationspositiv klassifiziert 3 3 Mutations Ct Werte von 38 oder h her m ssen als negativ oder unter den Grenzwerten des Kits liegend beurteilt werden 10 Einschr nkungen des Tests Der Kontrollassay Ct der Probe muss auf dem ABI7500 lt 29 und auf dem LightCycler 480 System 28 9 betragen um 1 Mutation in einem Hinter grund aus Wildtyp DNA zu erkennen In Proben mit h heren Kontroll Ct Werten k nnen mit Hilfe der Assays 1 Mutationen nicht erkannt werden Die Empfindlichkeit der Mutationsdetektion sinkt mit zunehmendem Anstieg des Kontroll Ct ber diese Werte hinaus Seite 26 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Der Kontroll Ct Wert der Proben DNA basiert auf der mittels PCR ermittel ten Konzentration Auf optischen Dichtemessungen b
6. AC Werte die den Interquartilbereich dreimal berschritten wurden als Ausrei er betrachtet und aus der Analyse entfernt Mittelwerte Standardfehler und Standardabweichungen wurden berechnet und die Daten wurden nach Kit Charge System oder Bediener gruppiert um die durch diese Variablen hervorgerufene Variation auszuwerten Die gesamte Wiederholbarkeit der Assays wurde ebenfalls beurteilt Seite 30 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Die Daten lassen erkennen dass die Gesamtvariabilitat zwischen den Assays niedrig ist und 2 Standardabweichungen Uber oder unter dem Mittelwert bei dem Assay mit der gr ten Standardabweichung einen Bereich von 1 4 Zyklen vom Mittelwert abdecken Der ACt Mittelwert f r jeden Bediener war bei jedem Test maximal 0 15 Zyklen vom gesamten Mittelwert des ganzen Datensatzes entfernt Die Unterschiede zwischen den Bedienern betrugen nicht mehr als 0 2 Ct was zeigt dass die Variation zwischen den Bedienern nicht gr er als die Variation innerhalb des gesamten Datensatzes war und die Assays stabil genug sind um Variabilit t zwischen Bedienern zu tolerieren Bei jedem Test lag die Differenz der Mittelwerte der einzelnen Systeme und der gesamte Mittelwert bei 0 097 wobei die Differenz zwischen den Mittelwerten einzelner Systeme nicht schlechter als 0 186 war Dies zeigt dass die Variation zwischen Systemen nicht gr er als die Variation innerhalb des ganzen Dat
7. Das K RAS Kit enth lt acht Assays e Ein Kontrollassay e Sieben Mutationsassays Alle Reaktionsgemische enthalten ein exogenes Kontrollassay interne Kontrolle mit der Beschriftung HEX Erkennung durch den JOE Detektor auf dem ABI7500 Damit wird berpr ft ob Inhibitoren vorhanden sind die zu falsch negativen Ergebnissen f hren k nnen Kontrollassay Das mit FAM gekennzeichnete Kontrollassay dient der Auswertung der gesamten DNA in einer Probe Dieses Kontrollassay amplifiziert eine Region von Exon 4 des K RAS Gens Bekannte K RAS Polymorphien werden aufgrund der Konzeption von Primer und Sonde vermieden Seite 5 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Mutationsassays Jedes mit FAM beschriftete Mutationsassay enthalt einen Scorpions und einen ARMS Primer zur Unterscheidung zwischen der Wildtyp DNA und der in einem Echtzeit PCR Assay erkannten mutierten DNA 4 Reagenzien Dieses K RAS Kit enth lt je nach Gr e ausreichend Reagenzien fur die qualitative Probenauswertung und die Durchf hrung der K RAS Assays f r maximal 20 bzw 80 Reaktionen Kit Umfang DxS Produktcode Roche Diagnostics Bestellnummer 20 Reaktionen KR 21 05366216190 80 Reaktionen KR 22 05366224190 Wie viele Proben getestet werden k nnen richtet sich nach der Chargen gr e der Proben Tabelle 2 Inhalt des K RAS Kits Enthaltene Reagenzien 20 Reaktionen 80 Reaktionen
8. Getting at MYC through RAS Clin Cancer Res 11 12 4278 4281 Sae Won Han Tae You Kim Yoon Kyung Jeon Pil Gyu Hwang Seock Ah Im Kyung Hun Lee Jee Hyun Kim Dong Wan Kim Dae Seog Heo Noe Kyeong Kim Doo Hyun Chung Yung Jue Bang 2006 Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation K ras Mutation and AKT Phosphorylation Clin Cancer Res 12 8 2538 2544 William Pao Theresa Y Wang Gregory J Riely Vincent A Miller Qiulu Pan Marc Ladanyi Maureen SF Zakowski Robert T Heelan Mark G Kris Harold E Varmus 2005 KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib PloS Medicine 2 1 57 61 Astrid Lievre Jean Baptiste Bachet Delphine Le Corre Valerie Boige Bruno Landi Jean Francois Cote Gorana Tomasic Christophe Penna Michel Ducreux Philippe Rougier Frederique Penault Llorca Pierre Laurent Puig 2006 KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer Cancer Res 66 8 3992 3995 Silvia Benvenuti Andrea Sartore Bianchi Federica Di Nicolantonio Carlo Zanon Mauro Moroni Silvio Veronese Salvatore Siena Alberto Bardelli 2007 Cancer Res 67 6 2643 2648 W De Roock J De Schutter G De Hertogh M Jannsens B Biesmans N Personeni K Geboes C Verslyp E Van Cutsem S Tejpar 2007 Journal of Clinical Oncology 25 18S 4132
9. Kits vertraut Zur effizienten Nutzung des K RAS Kits sollten die Proben in Chargen mit jeweils 10 Proben aufgeteilt werden um eine Platte mit 96 Kavit ten zu f llen Bei kleineren Chargengr en k nnen weniger Proben mit dem K RAS Kit getestet werden LightCycler 480 System Analyseeinrichtung Die Kontroll und Mutationsassays m ssen f r jede DNA Probe auf denselben PCR Lauf bezogen analysiert werden um Variationen zwischen den einzelnen L ufen zu vermeiden 1 Die Reaktionsgemische und den gemischten Standard aus dem K RAS Kit bei Raumtemperatur auftauen Nach dem Auftauen jede L sung durch 10 maliges Umschwenken gr ndlich mischen um Salzkonzentra tionen zu vermeiden Gen gend Gemische f r die DNA Proben den gemischten Standard und Nicht Template Kontrollen sowie f r 2 zu s tzliche Reaktionen pro Gemisch anfertigen siehe Tabelle 5 Tabelle 5 Volumina f r K RAS Master Mixes Master Mixes Assay Reaktions Tag ul x1 eaktionsgemisch ul Taq ul pro gemisch ul x1 q H pro Platte x14 Platte x14 Kontrollassay 19 8 0 2 277 2 2 8 Mutations 19 8 0 2 277 2 2 8 assays 2 Die Taq oder andere Reaktionsgemische die Taq enthalten nicht im Vortexer mischen da das Enzym dadurch inaktiviert werden kann 3 Vor Gebrauch daf r sorgen dass die Taq auf Raumtemperatur erw rmt ist Das Fl schchen schwenken um sicherzustellen dass sich die gesamte Taq am Flaschenboden ansammelt An
10. Log Skala f r die Y Achse die Schwelle manuell auf die Mitte der Exponentialphase setzen siehe Beschreibung im ABI7500 Benutzerhandbuch Die Daten analysieren und den ACt Wert wie folgt berechnen Proben Mutationsassay Ct Proben Kontrollassay Ct ACt Zur besseren Analyse k nnen die Daten in Microsoft Excel exportiert werden ABI7500 Dateninterpretation 1 Kontroll Ct Werte 1 1 Der Kontroll Ct Wert muss gt 24 sein um eine berlastung des Assays zu vermeiden 1 2 Kontroll Ct lt 29 Mit dem K RAS Kit kann bereits 1 einer Mutation in diesen Proben nachgewiesen werden Seite 25 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 1 3 In Proben mit einem Kontroll Ct von 29 k nnen 1 Mutationen mit dem Kit zwar nicht erkannt werden h here Mutationsgrade werden jedoch erkannt 1 4 Kontroll Ct 2 35 In der Probe sind nur wenige amplifizierbare DNA Kopien vorhanden und Mutationen werden wahrscheinlich nur sichtbar wenn die meisten Kopien mutiert sind 1 5 Kontroll Ct 2 38 Die DNA ist beschr nkt und die Daten d rfen nicht verwendet werden 2 ACt Werte f r gemischten Standard 2 1 Die ACt Werte f r gemischten Standard sollten den Angaben in Tabelle 14 entsprechen es k nnen jedoch aufgrund verschiedener Schwelleneinstellungen auf unterschiedlichen Systemen Abwei chungen von 2 vorkommen Tabelle 14 ABI7500 ACt Werte und 1 Cut off Werte f r gemischten
11. Platte wurde bei einer Annealing Temperatur von 59 C 60 C und 61 C getestet 60 C ist die optimale Temperatur fur die Ausfuhrung des Assays doch aufgrund der Variation zwischen PCR Bl cken muss der Assay Uber den angegebenen Bereich hinweg stabil sein Jede Platte wurde bei jeder Temperatur dreifach getestet Ct Werte wurden mit der LightCycler Adapt Software ermittelt und die Berechnung der ACt Werte erfolgte anhand aller Kombinationen von Kontroll und Mutations Ct Werten fur jede Probe Alle Assays erf llten das Akzeptanzkriterium gem dem die Werte bei 59 C und 61 C sich nicht von dem Mittelwert bei 60 C der Standard abweichung bei 60 C unterscheiden durfen Das bedeutet dass die Assays stabil genug sind um eine Abweichung der Annealing Temperatur von 1 C zu tolerieren ABI7500 Drei identische PCR Platten die jeweils alle 3 Reagenzienchar gen des Kits enthielten wurden bei jeder Annealing Temperatur getestet Der gemischte Standard sowie 50 ng gepoolter mutationsnegativer Zelllinien DNA wurden getestet Da 60 C die empfohlene Annealing Temperatur ist wurden die Platten bei 58 C 60 C und 62 C getestet Sind die Assays ausreichend stabil f r Versuchstemperaturen d rften die ACt Werte des gemischten Standards 1 5 von den Sollwerten f r den gemischten Standard abweichen und die ACt Werte der gepoolten Zell linien DNA m sste ber den 1 Cut off Werten liegen 12ASP zeigte die gr te Anf lligkeit f r
12. Probe ein mutationsnegatives Resultat ergeben ACt ber den 1 Cut off Werten Die Ergebniszusammenfassung ist in Tabelle 19 dargestellt Tabelle 19 ABI7500 Ergebnisse der Genauigkeitsvalidierung Die geringere Genauigkeit beim 12ALA Assay ist auf die Variation zwischen Replikaten bei einem DNA Niveau zur ckzuf hren Linearit tsvalidierung LightCycler 480 System Die Linearit t wurde mit synthetischen Standards mit einem Mutationsniveau von 100 1 und 0 f r jeden Assay bewertet Bei jedem Mutationsprozentsatz wurde eine Verd nnungs reihe durchgef hrt um das Mutationsniveau beizubehalten aber die DNA Gesamtmenge zu verringern Durch dreifache Ausf hrung jeder Verd nnung auf 3 Replikatplatten f r den Kontrollassay und den relevanten Mutationsassay wurden Standardkurven erstellt Ct Werte wurden mit der LightCycler Adapt Software ermittelt Seite 32 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Fur jede Mutation wurde ein Diagramm erstellt Daten nicht gezeigt in dem der Kontrollassay Ct und der Mutationsassay Ct gegeneinander aufgetragen und eine Regression fur jedes Mutationsniveau vorgenommen wurde Die 95 Konfidenzintervalle wurde ebenfalls f r jedes Mutationsniveau aufgetragen Aus den 0 Tests wurden keine Mutations Ct Werte gewonnen Die 100 und 1 Diagramme haben gezeigt dass deutliche Unterschiede zwischen den Datens
13. Temperaturvariationen Jedoch war das Verhalten der Assays allen 3 Temperaturen akzeptabel was zeigt dass die Assays bei Ausf hrung mit 2 C ber oder unter der optimalen Temperatur stabil sind Validierung der Taq Toleranz LightCycler 480 System Bei diesen Studien wurde die Toleranz der Mutationsassays gegen ber Abweichungen des Tag Polymerase Niveaus ermittelt Dies ist eine potenzielle Quelle f r vom Anwender verursachte Abweichungen da die Taq vom Anwender hinzugef gt wird Die Toleranz der Assays in Bezug auf verschiedene Tag Niveaus wurde mit 1 synthetischen Standards in 3 verschiedenen DNA Niveaus bewertet Jede Probe wurde dreifach bei einem hohen normalen und niedrigen Tag Niveau getestet hoch bedeutet 20 Taq mehr niedrig bedeutet 20 Taq weniger als normalerweise Au erdem wurden zweifache gemischte Standard und einfache NTC Reaktionen ausgef hrt um sicherzustellen dass die Assays innerhalb der Spezifikationen lagen F r jede Platte wurden dreifache Testl ufe durchgef hrt und es wurden 3 verschiedene Tag Chargen getestet Ct Werte wurden mit der LightCycler Adapt Software ermittelt und die Berechnung der ACt Werte erfolgte anhand aller Kombinationen der Ct Werte von Replikaten auf einer Platte Seite 35 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Alle Assays erf llten das Akzeptanzkriterium gem dem die Mittelwerte der hohen und niedrigen Tag Proben sich von dem
14. die Analyse zu speichern und den Zyklus zu starten Seite 11 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 5 6 Nach Abschluss des Laufs auf die Registerkarte Analysis klicken und im Fenster Create New Analysis die Option Abs Quant 2nd Derivative Max ausw hlen Die vorgegebenen Einstellungen im Bildschirm Create New Analysis bernehmen Sicherstellen dass Filter Comb auf 465 510 eingestellt ist und auf die Schaltfl che Calculate klicken In der Tabelle Samples werden die Ct Werte angezeigt Auf Filter Comb klicken und die Filtereinstellung auf 533 580 nm ndern Auf die Schaltfl che Calculate klicken und die Ct Werte der exogenen Kontrolle der Tabelle Samples entnehmen Protokoll zur Probenauswertung ABI7500 Systemeinrichtung 1 2 Die Platte sofort in das ABI7500 System einsetzen Auf das Symbol der 7500 Software auf dem Desktop der mit dem System verbundenen Workstation klicken Eine neue Datei im Datei men der 7500 Sequence Detection Software Version 1 4 ffnen Unter Assay die Option Standard Curve Absolute Quantification auswahlen Unter Run Mode die Option Standard 7500 auswahlen Durch Klicken auf die Schaltfl che Next zum Fenster f r die Einrich tung des Detektors navigieren Der Liste der Detektoren einen FAM und einen JOE Detektor hinzufugen und die Quencher auf none
15. von AstraZeneca UK Limited LIGHTCYCLER und ROCHE sind Markenzeichen von Roche ABI7500 ist ein Markenzeichen von Applied BioSystems Dieses Produkt ist ein mit dem CE Zeichen versehenes Diagnostikum das der Richtlinie 98 79 EG der Europ ischen Union ber In vitro Diagnostika entspricht Mit dem Kauf dieses Produkts wird eine beschr nkte und nicht bertragbare Lizenz f r die Verwendung von ARMS und Scorpions Technologien ausschlie lich f r die In vitro Diagnostik erworben ARMS ist durch die US Patente 5 595 890 und EP 332435 und Scorpions durch die US Patente 6 326 145 und EP1088102 gesch tzt Die Informationen in diesem Dokument k nnen ge ndert werden DxS bernimmt keine Haftung f r m gliche Fehler in diesem Dokument DxS Limited haftet keinesfalls f r Anspr che die im Zusammenhang mit oder durch die Verwendung dieses Produkts entstehen ganz gleich ob vertraglich durch unerlaubte Handlung einschlie lich Fahrl ssigkeit oder auf andere Weise Durch keine Aussage in diesem Dokument wird Haftung aus geschlossen oder beschr nkt deren Ausschluss oder Beschr nkung durch DxS Limited ungesetzlich w re Copyright 2009 DxS Limited Alle Rechte vorbehalten DxS Limited 48 Grafton Street Manchester M13 9XX UK www dxsdiagnostics com Seite 40 von 40
16. 1 Cut off Werte 1 Delta Ct 6 25 7 72 6 83 6 95 8 95 6 5 9 09 7 3 Falls ein ACt Wert der Mutation einer Probe unter dem entspre chenden 1 Cut off Wert f r ACt liegt wird die Probe als muta tionspositiv bezeichnet Die LightCycler Adapt Software gibt an welche Mutation vorliegt zeigt jedoch nur eine einzelne Mutation an Wenn es 2 positive ACt Werte gibt wird der kleinste Wert ausgegeben Es wird davon ausgegangen dass der zweite Wert durch Kreuzreaktivit t eines Mutationsprimers entsteht der Bin dung und Priming von einer anderen Mutation ausf hrt In den seltenen F llen des Vorliegens einer doppelten Mutation stimmt die klinische Entscheidung mit dem Fall berein in dem eine einzelne Mutation vorliegt 7 4 Wenn die ACt Werte der Probe gr er als die 1 ACt Werte sind wird die Probe als mutationsnegativ gemeldet kann eine Mutation enthalten deren Grad jedoch die Grenzwerte des Kits unterscheidet 7 5 Markierungen Warnungen 7 5 1 Die LightCycler Adapt Software zeigt in der Tabelle Sample Result verschiedene Markierungen Warnungen f r die Proben an siehe Tabelle 10 Tabelle 10 LightCycler Adapt Software Probenmarkierungen warnungen Markierung Warnung Bedeutung REP_DILUTION Der Kontroll Ct liegt unter 24 CONF LEVEL Der Kontroll Ct ist gr er als 28 9 und es wird keine Mutation T angezeigt LIMITED Der Kontroll Ct liegt ber 35 EXO FAIL De
17. DNA Kopien vorhanden sind kann etwa 1 Mutation in einem Hintergrund aus genomischer Wildtyp DNA erkannt werden Mit dem K RAS Kit lassen sich sieben K RAS Mutationen im Codon 12 und 13 des K RAS Onkogens nachweisen siehe Tabelle 1 Seite 3 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Tabelle 1 Mit dem DxS Kit nachgewiesene K RAS Mutationen Die COSMIC IDs wurden dem Catalogue of Somatic Mutations in Cancer entnommen http www sanger ac uk genetics CGP cosmic Mutation Basenver nderung Cosmic ID Gly12Ala GGT gt GCT 522 Gly12Asp GGT gt GAT 521 Gly12Arg GGT gt CGT 518 Gly12Cys GGT gt TGT 516 Gly12Ser GGT gt AGT 517 Gly12Val GGT gt GTT 520 Gly13Asp GGC gt GAC 532 3 Technologische Grundlagen Das K RAS Kit weist Mutationen in Echtzeit PCR Assays mit Hilfe der Kombination zweier Technologien nach ARMS und Scorpions 11 12 13 ARMS Die ARMS Technologie dient zur allel oder mutationsspezifischen Amplifi kation Die Tag DNA Polymerase kann zwischen einer bereinstimmung und einer Nicht bereinstimmung am 3 Ende eines PCR Primers u erst effektiv unterscheiden Spezifische mutierte Sequenzen k nnen aus folgen den Gr nden selbst in Proben bei denen die Mehrzahl der Sequenzen die Mutation nicht aufweist selektiv amplifiziert werden e Wenn der Primer vollst ndig bereinstimmt erfolgt die Amplifikation mit voller Effizienz
18. Mittelwert des normalen Tag Niveaus nicht um mehr als eine 1 Standardabweichung von den normalen Tag Daten unterscheiden d rfen ABI7500 Mit einer Menge an Tag Polymerase von 10 und 10 von der empfohlenen Menge wurden drei identische PCR Platten die jeweils 3 Reagenzienchargen enthielten f r jeden Mutationsassay getestet Au erdem wurde ein Test mit der empfohlenen Menge durchgef hrt Der gemischte Standard wurde ebenso getestet wie 1 Standards in DNA mit zwei verschiedenen Niveaus und in 50 ng mutationsnegativer Zelllinien DNA Die Assaydaten wurden mit Hilfe der mittleren Abweichung der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten analysiert Die Ergebnisse zeigten geringe Variationen quivalente Standard abweichung zwischen Assays Variationskoeffizient lt 10 in den Assay Resultaten wenn das Tag Niveau um 10 ver ndert wurde Das bedeutet dass die Assays Abweichungen der Tag Polymerase Niveaus von bis zu 10 tolerieren k nnten 12 Technische Unterst tzung Technische Unterst tzung und weitere Informationen sind ber den zust ndigen Roche Vertriebshandler zu beziehen Kapitel 13 enth lt eine Liste mit den Kontaktdaten der Hauptdistributoren von Roche Seite 36 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung 13 Hersteller und Handlerangaben TheraScreen K RAS Mutation Kit ical DxS Limited 48 Grafton Street Manchester M13 9XX Gro britannien D Roche Molecular Systems I
19. Schaltflache Finish klicken Seite 24 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 6 Auf der Registerkarte Instrument den Zyklus wie in Tabelle 13 angegeben einrichten Tabelle 13 ABI7500 Zyklusbedingungen Temperatur Datenerfassung Phase 1 95 C Phase 2 95 C 60 C 7 Auf die Schaltflache Start klicken um die Analyse zu speichern und den Zyklus zu starten ABI7500 Probenanalyse 1 Sicherstellen dass die passive Referenz im Bildschirm Well Inspector auf none gesetzt ist berpr fen dass jede Kavit t ein JOE Signal vom exogenen Kontrollassay abgibt a Ergibt der exogene Kontrollassay ein positives Resultat kann die Analyse fortgesetzt werden b Wenn der exogene Kontrollassay fehlgeschlagen ist die FAM Reaktion jedoch stark amplifiziert hat die Analyse fortsetzen da die FAM Reaktion Vorrang vor der exogenen Kontrollreaktion hat c Wenn sowohl die FAM Reaktion als auch die exogene Kontrollreaktion fehlgeschlagen sind m ssen die Daten verworfen werden da Inhibitoren vorliegen k nnen Diese Inhibitoren k nnten falsch negative Ergebnisse hervorrufen Auf der Registerkarte Amplification Plot alle benutzten Kavitaten ausw hlen und im Listenfeld f r den Detektor den Farbstoff FAM ausw hlen Die automatische Grundlinien und manuelle Ct Einstellung verwenden und anschlie end unter Verwendung der
20. TheraScreen molecular diagnostics for personalised medicine TheraScreen K RAS Mutation Kit F r den Nachweis von sieben 7 Mutationen im K RAS Gen Zur Verwendung mit dem Roche LightCycler 480 Real Time PCR System System Il Katalognr 05015278001 und dem Applied BioSystems 7500 Real Time PCR System Artikelnummer 4351105 Enth lt das Benutzerhandbuch f r die LightCycler Adapt Software v1 1 von Roche Diagnostics Katalognr 05474914001 f r das TheraScreen K RAS Mutation Kit CE IVD Gebrauchsanleitung Produktcodes Kit Umfang DxS Produktcode Roche Diagnostics Bestellnummer 20 Reaktionen KR 21 05366216190 80 Reaktionen KR 22 05366224190 Dokumentversion DUOO1g Datum der berarbeitung Mai 2009 Bei 18 C bis 25 C aufbewahren Diagnostic Innovations Seite 1 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Inhalt 1 Verwendungszweck Anwendungsgebiete uunnssnnnsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 3 2 Zusammenfassung und Erkl rung des Tests uunuuununennnnnnnnnnnn 3 3 Technologische Grundlagen ccccccsseceeseeeeeeeeeeeeeeeaeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeenes 4 Du 2427 1o gt 1 gt PRRHRBSEEISOREERRERE a A E T 6 5 WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 2 ceeeeee 7 6 Lagerung Haltbarkeit und Transportbedingungen zuuuuneeeennennnnnnn 9 BOYS EN ee ee er EEEE 9 SPN sisirain arai aaa teat decacocieisentcatameech
21. Volumen Volumen Kontrollreaktionsgemisch 1300 ul 5200 ul 12ALA Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul 12ASP Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul 12ARG Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul 12CYS Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul 12SER Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul 12VAL Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul 13ASP Reaktionsgemisch 650 ul 2600 ul Gemischter Standard 300 ul 1000 ul Tag DNA Polymerase 60 ul 240 ul Im K RAS Kit nicht enthaltene Gerate und Reagenzien Der Anwender ben tigt folgende Ger te und Verbrauchsmaterialien e LightCycler 480 System oder ABI7500 Real time PCR System zur Durchf hrung des Testzyklus gem Definition in Kapitel 9 K RAS Mutationsnachweisprotokoll e LightCycler Adapt Software v1 1 von Roche Diagnostics Katalognr 05474914001 e 0 2 ml DNAse freie PCR Platten LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96 Katalognummer 04729692 001 oder ABI MicroAmp Optical 96 Well Reaction Plate Artikelnummer 4306737 mit MicroAmp Optical Adhesive Film Artikelnummer 4311971 Sterile R hrchen zum Ansetzen von Master Mixes Spezielle Pipetten zur Erstellung des PCR Gemischs Spezielle Pipetten zum Dispensieren von DNA Template Steriles nukleasefreies H20 Seite 6 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 5 WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 7 In vitro Diagnostikum Das K RAS Kit ist nicht f r das Scre
22. Wenn der exogene Kontrollassay in einer der 8 Kavit ten einen Ct Wert von lt 30 aufweist wird die Markierung Warnung EXO_FAIL angezeigt und der Status ist ung ltig M glicherweise hat in diesem Assay eine PCR Produktkontamination stattgefunden Die LightCycler 480 Testlaufdatei kann berpr ft werden um die m gliche Ursache f r fehlgeschlagene exogene Kontrollassays festzustellen Wenn alle exogenen Kontrollreaktionen in einer Spalte fehlge schlagen sind k nnte dies auf Inhibitoren hinweisen Ist der Assay nur in einer Kavit t fehlgeschlagen kann dies auf ein Problem bei der Plattenanordnung hinweisen 7 5 2 5 FAIL Die Markierung Warnung FAIL wird angezeigt wenn die Software eine Amplifikationskurve nicht als positiv oder negativ bewerten kann weil beispielsweise die Kurvenform anomal ist Seite 22 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 7 5 3 Die LightCycler Adapt Software berpr ft ob der Probenname innerhalb einer Spalte identisch ist um sicherzustellen dass die zur Berechnung der ACt Werte verwendeten Mutations und Kontrollassay Ct Werte aus derselben Probe stammen Die Probennamen werden aus dem LightCycler 480 Softwarebildschirm Sample Editor in der Testlaufdatei der Analyse Ubernommen Falls in der Spalte eine Nichtubereinstimmung vorliegt wird in der Spalte Sample Name der Tabelle Sample Result SAMPLE MISMATCH angezeigt In der Plattenanordnung zeig
23. asierende Werte stimmen nicht mit Ct Werten von Kontrollassays in fragmentierten DNA Proben berein Im Lieferumfang ist ein zus tzliches Kontrollreaktions gemisch enthalten welches die Auswertung der Ct Werte der Proben vor dem Gebrauch des Kits erm glicht Wenn eine Probe bei einem Mutations Ct von 2 38 ein mutationspositives Ergebnis ergibt muss das Assay als negativ oder unter den Grenzwerten des Kits liegend beurteilt werden Dies erfolgt in der LightCycler Adapt Software automatisch Zwischen Mutationsreaktionen kann eine gewisse Kreuzreaktivitat auf treten Wenn beispielsweise eine 12ALA Mutation mit hohem Niveau festgestellt wird liefern auch einige der anderen Mutationsreaktionen ein positives Ergebnis Die ist auf die ARMS Primer zur ckzuf hren die andere wenige Basen voneinander entfernte Mutationen erkennen Bei synthetischem Kontrollmaterial bildet diese Kreuzreaktivit t auf dem ABI7500 ein erkennbares Muster mit dem die echt positiven unter mehreren Signalen bestimmt werden k nnen siehe Tabelle 15 Tabelle 15 Kreuzreaktivit tsmuster auf dem ABI7500 mit synthetischem Kontrollmaterial Ja gibt das echte Signal an Zahlen geben die ann hernde Zyklenzahl nach dem echten Signal an nach der ein Kreuzreaktivit tssignal angezeigt werden kann Werte ber 9 Zyklen wurden nicht aufgef hrt da diese sich im negativen Bereich befinden Positive Probe 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP
24. assay Ct von 2 38 Probe verwerfen da DNA nur minimal pr sent ist und Mutationen mit dem K RAS Kit nicht nachgewiesen werden k nnen Bei Proben mit einem sp ten Kontrollassay Ct ist zu beachten dass der Ct der exogenen Kontrolle f r die Probe mit der exogenen Kontrolle der NTC verglichen werden sollte Ist die exogene Kontrolle der Probe im Vergleich zur NTC verz gert oder negativ ist m glicherweise ein Inhibitor vorhanden Es besteht die M glichkeit die Auswirkungen eines Inhibitors durch Verd nnung zu verringern allerdings wird dadurch auch die DNA verd nnt Probenverd nnung Bei einem Kontroll Ct von lt 24 werden die Muta tionsassays berlastet Proben mit einem Kontroll Ct von lt 24 m ssen verd nnt werden Seite 13 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Beim LightCycler 480 System ist zu beachten dass mit der zweiten derivativen Methode ermittelte Ct Werte geringf gig von denen mit der LightCycler Adapt Software ermittelten abweichen k nnen Es empfiehlt sich konzentrierte Proben auf einen Bereich zwischen gt 24 und lt 29 zu verd nnen Ct Werte auf Basis der 7500 Sequence Detection Software oder LightCycler 480 Instrument Software und zwar auf der Grundlage dass eine Verd nnung von den Ct um 1 erh ht 9 K RAS Mutationsnachweisprotokoll Lesen Sie diese Gebrauchsanweisung aufmerksam durch und machen Sie sich vor dem Gebrauch mit allen Komponenten des K RAS
25. ation Detection Nucleic Acids Research 28 19 3752 3761 De Roock W Piessevaux H De Schutter J Janssens M De Hertogh G Personeni N Biesmans B Van Laethem JL Peeters M Humblet Y Van Cutsem E Tejpar S KRAS wild type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab Ann Oncol 2007 Nov 12 Li vre A Bachet JB Le Corre D Boige V Landi B Emile JF C t JF Tomasic G Penna C Ducreux M Rougier P Penault Llorca F Laurent Puig P KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer Cancer Res 2006 66 3992 5 Li vre A Bachet JB Boige V Cayre A Le Corre D Buc E Ychou M Bouch O Landi B Louvet C Andr T Bibeau F Diebold MD Rougier P Ducreux M Tomasic G Emile JF Penault Llorca F Laurent Puig P KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab J Clin Oncol 2008 26 374 9 C Bokemeyer et al K RAS status and efficacy of first line treatment of patients with metastatic colorectal cancer mCRC with FOLFOX with or without cetuximab The OPUS experience J Clin Oncol 26 2008 May 20 suppl abstr 4000 E Van Cutsem et al K RAS status and efficacy in the first line treatment of patients with metastatic colorectal cancer mCRC treated with FOLFIRI with or without cetuximab The CRYSTAL experience J Clin Oncol 26 2008 May 20 su
26. ay fehl wenn eine FAM Reaktion in einer der Kavit ten mit dem gemischten Standard fehlschl gt wird die Markierung Warnung EXO_FAIL ebenfalls angezeigt Dies bedeutet dass ein Problem mit diesem Assay vorliegt was zu falsch negativen Ergebnissen f hren k nnte Der gemischte Standard ist bereits aufgrund des FAM Fehlers ung ltig 6 4 1 3 DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Wenn die ACt Werte des gemischten Standards um 2 00 von den in Tabelle 7 angegebenen Werten abweichen gibt die Software den Status Valid aus Wenn der ACt Wert au erhalb des erwarteten Bereichs liegt ist der Status ung ltig und diese Markierung Warnung wird ange zeigt Seite 18 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung 7 6 5 6 6 TheraScreen K RAS Mutation Kit Dies bedeutet dass ein Problem mit einem Assay vorliegt das zu falschen Ergebnissen f hren k nnte 6 4 1 4 EXO_CONTROL_INVALID In den Kavit ten der Nicht Template Kontrolle muss der exogene Kontroll assay ein positives Ergebnis in allen 8 Kavit ten aufweisen Ct lt 41 Bei negativem Ergebnis wird diese Markierung Warnung angezeigt und der Status wird als ung ltig angezeigt Dies bedeutet dass ein Problem mit einem Assay vorliegt das zu falschen Ergebnissen f hren k nnte 6 4 1 5 TARGET_CHANNEL_INVALID In den 8 Kavit ten mit der Nicht Template Kontrolle muss das FAM Ergebnis negativ sein Ct gt 38 Jegliche Amplifikation weist auf eine Kontamination hin Ein po
27. ch einzustufen Proben sind potenziell infekti s und m ssen entsprechend gehandhabt werden Das K RAS Kit darf nur von Personen verwendet werden die in den einschl gigen Labortechniken ausgebildet wurden Bei der Arbeit mit den Komponenten dieses K RAS Kits sind stets ein geeigneter Laborkittel Einweghandschuhe und eine Schutzbrille zu tragen Nach dem Gebrauch m ssen die Komponenten des K RAS Kits wie klinischer Abfall entsorgt werden Seite 8 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 6 Lagerung Haltbarkeit und Transportbedingungen Lagerung Der gesamte Inhalt des K RAS Kits muss unmittelbar nach dem Empfang lichtgeschutzt bei 18 C bis 25 C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufbewahrt werden Unn tiges Einfrieren und Auftauen des K RAS Kit Inhalts ist zu vermeiden Haltbarkeit Das K RAS Kit nach dem angegebenen Verfallsdatum nicht mehr verwen den Der Inhalt des K RAS Kits ist bei Aufbewahrung gem den empfohle nen Lagerungsbedingungen und in der Originalverpackung bis zum Ver fallsdatum haltbar Der Inhalt des K RAS Kits kann ohne negative Auswirkungen auf den Assay maximal 8 mal eingefroren und wieder aufgetaut werden Die K RAS Kit Reagenzien KEINESFALLS mehr als 8 mal einfrieren und wieder auftauen Transportbedingungen Der Inhalt des K RAS Kits wird auf Trockeneis versandt und sollte beim Empfang immer noch gefroren sein Wenn das K RAS Kit beim E
28. dass die ACt Analyse methode geeignet ist Die Linearit t blieb im Bereich von 0 4 ng bis 50 ng DNA stets akzeptabel Validierung der Kreuzreaktivit t LightCycler 480 System Es wurde keine Validierung der Kreuzreakti vit t vorgenommen da die LightCycler Adapt Software nur eine einzelne Mutation mit dem kleinsten ACt Wert ausgibt ABI7500 Da alle vom K RAS Kit erkannten Mutationen innerhalb eines Bereichs von 5 Basenpaaren auftreten ist zu erwarten dass eine gewisse Kreuzreaktivit t zwischen den Primern auftritt Mit dieser Studie wurde das Kreuzreaktivit tsmuster des K RAS Kits bestimmt Seite 33 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Die Tests wurden unter Verwendung von synthetischen Mutationskon trollen durchgef hrt um zu ermitteln wie viele Zyklen nach einem echten positiven Kreuzreaktivit tssignal erkannt werden k nnen Jedes Mutations reaktionsgemisch wurde mit sechs Replikaten der sieben einzelnen 100 Mutationskontrollen getestet Dar ber hinaus wurde jede Kontrolle mit dem passenden Reaktionsgemisch und allen anderen Reaktionsgemischen im gleichen Testlauf untersucht Das Kreuzreaktivit tsmuster wurde durch Berechnung des Unterschieds zwischen dem tats chlichen Amplifikations Ct Wert von der angeglichenen Kassette und dem Kreuzreaktivit tssignal jedes anderen Primers ermittelt Das erwartete Kreuzreaktivit tsmuster ist nachfolgend in Tabelle 20 zu sehen Es ha
29. des Master Mix sind die in Tabelle 3 angegebenen Mengen an Reagenzien pro Reaktion zu verwenden Tabelle 3 Volumina f r Kontrollassay Master Mix Master Mix Reaktionsgemisch ul x1 Taq ul x1 Assay Kontrollassay 19 8 0 2 3 Die Tag oder andere Reaktionsgemische die Tag enthalten nicht im Vortexer mischen da das Enzym dadurch inaktiviert werden kann 4 Vor Gebrauch daf r sorgen dass die Tag auf Raumtemperatur erw rmt ist Das Fl schchen schwenken um sicherzustellen dass sich die gesamte Tag am Flaschenboden ansammelt Seite 10 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Anschlie end zum Pipettieren die Pipettenspitze knapp unter die Oberfl che der Tag eintauchen damit die Spitze m glichst nicht mit zu viel Tag benetzt wird Den Master Mix durch vorsichtiges Auf und Abpipettieren mischen Sofort 20 ul der Kontroll Master Mix in jedes der Reaktionskavit ten geben Sofort 5 ul der Probe des gemischten Standards oder Wasser f r die Nicht Template Kontrollen in die Reaktionskavit ten geben Die Platte muss so angeordnet sein dass der gemischte Standard in Position A1 und die Nicht Template Kontrolle Wasser in A2 gegeben wird Alle anderen benutzten Kavit ten m ssen die Proben enthalten Die PCR Platte verschlie en und kurz schwenken um die Reagenzien unten in den Kavit ten anzusammeln 10 Die nachstehenden Anweisungen f r die entsprechende Plat
30. e Wenn die 3 Base nicht bereinstimmt wird die Amplifikation nur im Hintergrund auf niedrigem Niveau durchgef hrt Scorpions Die Detektion der Amplifikation wird mit Hilfe der Scorpions Technologie durchgef hrt Scorpions sind bifunktionelle Molek le die einen PCR Primer enthalten der kovalent mit einer Sonde verbunden ist Das Fluorophor in dieser Sonde interagiert mit einem Quencher der auch in die Sonde eingebunden ist und die Fluoreszenz reduziert Wenn sich w hrend einer PCR Reaktion die Sonde an das Amplifikat bindet wird das Fluorophor vom Quencher getrennt Dies f hrt zu einem Anstieg der Fluoreszenz im Reaktionsr hrchen Datenanalyse ACt Methode Bei den Scorpions Echtzeitassays werden die zu Reaktionsbeginn vorhandenen Zielmolek le anhand der Anzahl von PCR Zyklen gemessen die zur Detektion eines fluoreszierenden Signals ber einem Hintergrund signal erforderlich sind Der Punkt an dem das Signal ber der Hinter grundfluoreszenz erkannt wird ist der so genannte Zyklusschwellenwert Cycle Threshold Ct Seite 4 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Die ACt Werte der Probe werden als Differenz zwischen dem Mutations assay Ct und dem Kontrollassay Ct derselben Probe berechnet Proben werden als positiv eingestuft wenn das ACt Ergebnis unter dem 1 ACt Wert des Assays liegt Uber diesem Wert besteht die M glichkeit dass die Probe weniger als 1 Mutation
31. ening oder die Diagnose von Krebs gleich welcher Art einschlie lich Kolorektalkrebs vorgesehen Das Kit soll in Erg nzung zu anderen gegenw rtig eingesetzten Prognose faktoren f r die Auswahl von Patienten dienen die auf eine Anti EGFR Therapie nicht ansprechen w rden Therapieentscheidungen f r Krebspatienten d rfen nicht ausschlie lich auf dem Mutationsstatus des K RAS Gens beruhen Der Mutations status des Patienten muss zusammen mit anderen Krankheitsfaktoren von einem Arzt beurteilt werden Der Inhalt des K RAS Kits kann ohne negative Auswirkungen auf den Assay maximal 8 mal eingefroren und wieder aufgetaut werden Die K RAS Kit Reagenzien KEINESFALLS mehr als 8 mal einfrieren und wieder auftauen Es ist zu beachten dass Tumorproben nicht homogen sind und die Daten einer Tumorprobe nicht unbedingt mit anderen Abschnitten desselben Tumors bereinstimmen Tumorproben k nnen auch nicht tumor ses Gewebe enthalten Bei DNA aus nicht tumor sem Gewebe ist davon auszugehen dass es keine der mit dem K RAS Kit detektierten K RAS Mutationen enth lt Alle Assays im K RAS Kit erzeugen kurze PCR Produkte Das K RAS Kit funktioniert jedoch nicht bei stark fragmentierter DNA Die DNA Auswertung sollte auf Grundlage der PCR erfolgen und kann von der auf optischen Dichtemessungen basierenden Quantifizierung abweichen Ein zus tzliches Kontrollreaktionsgemisch ist enthalten mit dem vor Gebrauch des K RAS Kits die Qualit t und Quant
32. ensatzes war und die Assays stabil genug sind um Variabilit t zwischen Systemen zu tolerieren Bei jedem Test betrug die gr te Differenz zwischen einer einzelnen Charge und dem gesamten Mittelwert 0 195 wobei die schlechteste Differenz zwischen zwei Chargen bei 0 38 lag Dies zeigt dass die Variation zwischen Chargen nicht gr er als die Variation innerhalb des ganzen Datensatzes war und die Assays stabil genug sind um Variabilit t zwischen Chargen zu tolerieren ABI7500 Es wurden Analysen durchgef hrt um die Pr zisionsleistung jedes Assays zu bestimmen indem eine PCR Platte f r jede der 3 Reagen zienchargen mit einem Bereich von Proben hoher und niedriger DNA Konzentration und hohem und niedrigem Mutationsgrad innerhalb eines Tages an unterschiedlichen Tagen mit unterschiedlichen Bedienern und Systemen wiederholt wurde Zur Bestimmung der Variation zwischen Replikaten Reagenzienchargen Testl ufen Testtagen Systemen und Bedienern wurde eine einfache ANOVA angewendet Die Nullhypothese lautete dass die Mittelwerte ber die Kategorien hinweg gleich sind Au erdem wurden Gesamtmittelwert Standardabweichung und ein prozentualer Variationskoeffizient f r die Ct Werte berechnet Keiner der Assays zeigte beim Niveau p 0 05 eine signifikante Abwei chung von der Nullhypothese gem der die Mittelwerte ber die Kate gorien hinweg gleich sind Das zeigt dass die Assays stabil genug sind um Variationen zwischen S
33. enth lt au erhalb der Assay Grenzwerte oder mutationsnegativ ist Bei Verwendung von ARMS Primern kann m glicherweise ineffizientes Priming erfolgen das bei DNA die keine Mutation enth lt einen sehr sp ten Hintergrund Ct ergibt Alle aus der Hintergrundamplifikation berechneten ACt Werte liegen ber den 1 ACt Werten die Probe wird demnach als mutationsnegativ eingestuft Das K RAS Kit ist mit der CE Kennzeichnung f r die Anwendung als n vitro Diagnostikum auf dem Roche Diagnostics LightCycler 480 Real Time PCR System System Il LightCycler 480 System mit 96 Kavit ten Roche Artikelnummer 05015278001 und dem Applied BioSystems 7500 Real Time PCR System Artikelnummer 4351105 ABI7500 versehen Beim LightCycler 480 System muss das K RAS Kit in Verbindung mit der LightCycler Adapt Software v1 1 fur das TheraScreen K RAS Mutation Kit CE IVD LightCycler Adapt Software verwendet werden Diese Software wurde entwickelt um die Ausgabe eines positiven oder negativen Amplifikationsplots zu automatisieren Dar ber hinaus berechnet sie eine geeignete Schwelle f r die Ermittlung von Ct Werten Daraus werden die ACt Werte der Proben berechnet und anschlie end mit den 1 Cut off Werten verglichen Die Software meldet ein positives oder negatives Mutationsergebnis und erm glicht eine Analyse und Interpretation der mit dem K RAS Kit erhaltenen Daten unter Ausschluss jeglicher Subjektivit t Format des K RAS Kit
34. etzen Die Spalte Replicate muss leer bleiben da Replikate von der LightCycler Adapt Software nicht ber cksichtigt werden Auf die Schaltfl che Experiment und danach auf die Schaltfl che Start Run klicken um die Analyse zu speichern und den Zyklus zu starten LightCycler 480 System Probenanalyse 1 Nach Abschluss des Laufs auf dem LightCycler 480 System mit Hilfe des Navigatorfensters die Analyse ixo Datei in ein geeignetes Verzeichnis exportieren auf das die LightCycler Adapt Software zugreifen kann WICHTIG Die LightCycler Adapt Software ist f r den Einsatz auf einem Einzelcomputersystem validiert der Definition nach ist das eine Control Unit Workstation von Roche Diagnostics zur Verwendung mit einem LightCycler 480 System Il Diese Validierung der LightCycler Adapt Software gilt derzeit nur f r die Control Unit die ein unabh ngiger Computer ist d h nicht in ein Netzwerk eingebunden Der Einsatz anderer Computer ist untersagt da sonst eine einwandfreie Funktionsweise der Software nicht gew hrleistet werden kann Die LightCycler Adapt Software durch Klicken auf das Symbol der LightCycler Adapt Software auf dem Desktop der Workstation ffnen und den Benutzernamen in das entsprechende Feld eingeben Dieser Name wird als Berichtsverfasser eingegeben Im Hauptfenster die Browser Schaltfl che bet tigen und eine einzelne LightCycler 480 Testdatei ausw hlen Zum Aufheben eine
35. gt jedoch ein bekanntes Muster Ct Werte und ACt Werte wurden ermittelt und mit den 1 Cut off Werten verglichen Die Daten der Zelllinien DNA und FFPE Proben ergaben ACt Werte die alle ber den 1 Cut off Werten lagen mit Ausnahme einer FFPE Probe deren ACt Wert knapp unter dem Cut off Wert von 7 5 lag 6 84 Da 6 84 innerhalb des Bereichs der ermittelten 1 Cut off Daten lag wurde der 1 ACt Wert f r den 12VAL Assay von 7 5 auf 6 5 ge ndert um die M glichkeit eines falsch positiven Resultats auszuschlie en In Tabelle 18 sind die aktuellen 1 ACt Werte auf Basis der Breakthrough Validierungs ergebnisse aufgef hrt Tabelle 18 Breakthrough Validierungsergebnisse 1 ACt Werte Pr zisionsvalidierung LightCycler 480 System Die Pr zision wurde mit 1 synthetischen Kontrollen in 3 verschiedenen Niveaus von K RAS mutationsnegativer Zelllinien DNA getestet Jede Kontrolle wurde dreifach f r den relevanten Assay auf einer Platte getestet die auch zweifache gemischte Standard und einfache NTC Reaktionen enthielten um sicherzustellen dass die Reaktionen innerhalb der Spezifikationen lagen Dieselbe Platte wurde 54 mal ber 6 Tage wiederholt An dieser Matrix aus Testl ufen waren 3 Systeme 3 Reagenzienchargen und 3 Bediener beteiligt Ct Werte wurden mit der LightCycler Adapt Software ermittelt und die Berechnung der ACt Werte erfolgte anhand aller Kombinationen von Ct Werten Alle
36. ionskurve bei der exogenen Kontrolle aufweisen 11 Auf der Registerkarte Amplification Plot alle benutzten Kavitaten ausw hlen und im Listenfeld f r den Detektor den Farbstoff FAM ausw hlen Die automatische Grundlinien und manuelle Ct Einstellung verwenden und anschlie end unter Verwendung der Log Skala f r die Y Achse die Schwelle manuell auf die Mitte der Exponentialphase setzen siehe Beschreibung im ABI7500 Benutzerhandbuch 12 Auf die Schaltfl che Analyse klicken um die Ct Werte zu ermitteln Interpretation der Probenauswertung Die Ct Werte der NTC auswerten um sicherzustellen dass keine Kontaminierung vorliegt die eine positive Amplifikation im FAM Kanal ergibt Ct unter 40 oder die exogene Kontrollreaktion im HEX Kanal nicht fehlgeschlagen ist kein Ct Wert was auf ein Einrichtungsproblem hinweist Der gemischte Standard m sste auf dem ABI7500 System f r den Kontrollassay Ct FAM Kanal einen Wert von 26 29 und auf dem LightCycler 480 System einen Wert von lt 29 ergeben Die Daten d rfen nicht verwendet werden wenn eine dieser beiden Testkontrollen fehlgeschlagen ist Kontrollassay Ct von 29 35 Mit Vorsicht interpretieren da sehr niedrige Mutationswerte m glicherweise nicht erkannt werden Kontrollassay Ct von 35 38 In diesen Proben sind nur wenig amplifizier bare DNA Kopien vorhanden und Mutationen werden wahrscheinlich nur sichtbar wenn die meisten Kopien mutiert sind Kontroll
37. it t der DNA in Proben beurteilt werden kann Die Reagenzien f r das K RAS Kit wurden optimal verd nnt Eine weitere Verd nnung der Reagenzien ist nicht empfehlenswert da dies zu einer Leistungsbeeintr chtigung f hrt Die Verwendung von weniger als 25 ul Reaktionsvolumen wird nicht empfohlen da dies das Risiko von falsch negativen Werten erh ht Alle Reagenzien im K RAS Kit wurden speziell f r die Anwendung mit den angegebenen Tests formuliert Um eine optimale Leistung zu gew hrleisten d rfen die Reagenzien des K RAS Kits nicht ausge tauscht werden Scorpions Primer m ssen ebenso wie alle fluoreszenzmarkierten Molek le vor Licht gesch tzt werden um Photobleichung zu vermei den und optimale Aktivit t und Leistung sicherzustellen u erste Vorsicht ist geboten um die Kontamination von PCR Reak tionen mit synthetischem Kontrollmaterial zu vermeiden Seite 7 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Es empfiehlt sich zum Ansetzen von Reaktionsgemische und zum Hinzuf gen von DNA Template separate spezielle Pipetten zu verwenden Die Vorbereitung und Dispensierung der Reaktionsgemische sollte nicht in dem Bereich durchgefuhrt werden in dem die Template Zugabe erfolgt Die R hrchen d rfen nach einer PCR Reaktion keinesfalls ge ffnet werden Jedes Assay im K RAS Kit weist charakteristische Eigenschaften auf Die Berechnung des Ergebnisses muss mit Bezug auf die korrekten A
38. mpfang nicht gefroren ist die Umverpackung w hrend des Transports ge ffnet wurde die Lieferung keinen Packzettel keine Gebrauchsanleitung oder keine Reagenzien enth lt wenden Sie sich an die zust ndige Roche Diagnostics Niederlassung Die Kontaktdaten finden Sie in Kapitel 12 Technische Unterst tzung 7 System Vollst ndige Anleitungen f r die Installation und Bedienung des Echizeit PCR Systems sind dem Benutzerhandbuch des Systems zu entnehmen 8 Proben Das Probenmaterial muss humangenomische DNA sein die aus formalin fixierten in Paraffin eingebetteten kolorektalen Tumorproben extrahiert wurde Entnahme und Vorbereitung der Proben 1 Probentransport gem Pathologie Standardverfahren zur Sicherstel lung der Probenqualit t 2 Empfohlenes Verfahren f r die Probenextraktion DNA Extraktion mit dem Qiagen QlAamp DNA FFPE Tissue Kit Katalognummer 56404 Das Qiagen Protokoll ist mit folgenden Ab nderungen anzuwenden e FFPE Gewebe muss auf Objekttr ger aus Glas aufgebracht werden e bersch ssiges Paraffin muss mit einem frischen sterilen Skalpell um die Gewebeabschnitte herum entfernt werden Seite 9 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit e Das Gewebematerial fur jede zu extrahierende Probe mit einem frischen Skalpell in ein Mikrozentrifugenr hrchen streichen e Die Proteinase K Verdauung muss bis zum Abschluss fortge setzt werden Dies kann bis zu 48 S
39. nc Branchburg NJ 08876 USA Ein Unternehmen der Roche Gruppe Distributed by GROSS Roche Diagnostics DEUTSCHLAND Roche Diagnostics GmbH BRITANNIEN Charles Avenue Sandhoferstr 116 Burgess Hill Abt VM G West Sussex Mannheim D 68298 Gro britannien RH15 9RY FRANK Roche Diagnostics S A SCHWEIZ Roche Diagnostics REICH 2 Avenue du Vercors Schweiz AG BP 59 Meylan Cedex Industriestr 7 38240 Rotkreuz CH 6343 SPANIEN Roche Diagnostics S L ITALIEN Roche Diagnostics Italy Av de la Generalitat s n Sant Cugat del Valles Barcelona E 08190 V le G B Stucchi 110 Monza MI I 20052 Wenn Sie dieses Kit in einem Land erworben haben das in der Adressliste der Roche Diagnostics Niederlassungen oben nicht aufgefuhrt ist wenden Sie sich bitte an die Roche Diagnostics GmbH in Mannheim unter der unten aufgefuhrten Adresse HAUPTVERTRIEBSZENTRUM Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Stra e 116 68305 Mannheim 14 Datum der letzten berarbeitung Datum der letzten Version Februar 2009 nderungs bersicht Ge nderter Wert in den Tabellen 5 und 11 Seite 37 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 15 Literatur 1 2 3 10 11 12 R A Hilger M E Scheulen D Strumberg 2002 The Ras Raf MEK ERK Pathway in the Treatment of Cancer Onkologie 25 511 518 Pavan Bachireddy Pavan K Bendapudi Dean W Felsher 2005
40. ng weiter unten Seite 28 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit ACt Bestimmung des gemischten Standards LightCycler 480 System Die ACt Werte des gemischten Standards sind Mittelwerte aus 50 Testlaufen bei denen der gemischte Standard getestet wurde Ct Werte wurden mit der LightCycler 480 Adapt Software ermittelt Die erwarteten ACt Werte fur den gemischten Standard sind im Kapitel Dateninterpretation aufgef hrt ABI7500 Die gemischten Standardwerte wurden anhand des Mittelwerts von 422 ACt Werten festgelegt Die Berechnung erfolgte f r zahlreiche verschiedene Kit Chargen und Testl ufe Die erwarteten ACt Werte f r den gemischten Standard sind im Kapitel Dateninterpretation aufgef hrt Breakthrough Validierung Breakthrough ist definiert als nichtspezifische Amplifikation in den Mutationsassays eines in einer bestimmten Probe vorhandenen Wildtyp DNA Target Dabei entsteht ein messbares Hinter grundrauschen Der Breakthrough von Wildtyp DNA wurde f r jeden Mutationsassay bewertet Mit dieser Breakthrough Studie wurde sicherge stellt dass die zuvor festgestellten 1 Cut off Werte unter dem Break through Niveau lagen was die Anzeige eines falsch positiven Ergebnisses verhindert LightCycler 480 System Zehn K RAS mutationsnegative Zelllinien DNA Proben und f nf FFPE K RAS mutationspositive Proben wurden zweifach auf 5 Platten getestet Die mutationspositiven Pr
41. ngen Warnungen werden fur die Testlaufkon trollen in den Spalten 1 und 2 angegeben Tabelle 8 LightCycler Adapt Software Markierungen Warnungen fur die Testlaufkontrollen Markierung Warnung Bedeutung CT OUT OF RANGE FAM Ct f r Kontrollassay liegt au erhalb des u 7 OT zul ssigen Bereichs EXO FAIL Beim gemischten Standard betr gt der exogene Kontroll Ct lt 30 oder ist negativ wenn das FAM Ergebnis negativ ist DELTA CT OUT OF RANGE Mutations ACt Werte liegen au erhalb des Sollwertbereichs EXO_CONTROL_INVALID Die exogene Kontrollreaktion in einer NTC ist fehlgeschlagen TARGET_CHANNEL_INVALID F r die FAM Reaktion liegt ein positiver Ct Wert in einer NTC vor 6 4 1 Die Bedeutungen der Markierungen Warnungen werden im Folgenden genauer erl utert 6 4 1 1 CT_OUT_OF_RANGE Der Kontrollassay f r den gemischten Standard muss einen Ct Wert von 26 60 2 aufweisen Liegt der Assay au erhalb dieses Bereichs wird diese Markierung Warnung f r alle Kavit ten mit gemischtem Standard angezeigt da keine ACt Werte berechnet werden und der gemischte Standard ist ung ltig Dies deutet auf eine Funktionsst rung des Kontrollassays hin 6 4 1 2 EXO_FAIL Diese Markierung Warnung wird ange zeigt wenn der exogene Kontrollassay in einer der Kavit ten mit dem gemischten Standard unter 30 liegt da dies auf eine PCR Kontamination in diesem Gemisch hinweisen kann Schl gt der exogene Kon trollass
42. nter die Oberfl che der Tag eintauchen damit die Spitze m glichst nicht mit zu viel Tag benetzt wird 4 Die Master Mixes durch vorsichtiges Auf und Abpipettieren mischen 5 Sofort 20 ul der Master Mixes in die Reaktionskavitaten f llen 6 Sofort 5 ul der Probe des gemischten Standards oder Wasser f r die Nicht Template Kontrollen in die Reaktionskavit ten geben Seite 23 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Jede DNA Probe muss sowohl mit den Kontroll als auch den Mutationsassays getestet werden Die Plattenanordnung ist in Tabelle 12 dargestellt Tabelle 12 ABI7500 K RAS Plattenanordnung Anordnung bei 96 Kavitaten Assay 1 374 5 6 7 Iso 0 11 Kontrolle Standard A Ben cher Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Probe 9 1 2A LA Standard B j Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Probe 9 12ASP Standard C Gemischter Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Probe 9 1 2ARG Standard D i Gemischter Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 7 Probe 8 Probe 9 1 2CYS Standard E Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Probe 9 12SER Standard F f Gomischter Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Probe 9 1 2VAL Standard G Gemisch
43. oben waren f r eine einzige Mutation positiv und die anderen Mutationen wurden zum Tes ten des Breakthrough verwendet Ct Werte wurden mit der LightCycler Adapt Software ermittelt und die Berechnung der ACt Werte erfolgte anhand aller Kombinationen von Ct Werten Die Ergebnisse von mutationsnegativen Assays in Zelllinien DNA und FFPE Proben ergaben ACt Werte die alle ber den 1 Cut off Werten lagen Das bedeutet dass die 1 Cut off Werte stabil sind In Tabelle 17 sind die schlechtesten Breakthrough Werte aus den 5 Testl ufen dargestellt Tabelle 17 Breakthrough Ergebnisse Schlechteste Breakthrough ACt Werte 12 35 11 36 Kein Breakthrough Kein Breakthrough 11 74 12 29 11 29 Seite 29 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit ABI7500 Der Breakthrough wurde mit Hilfe von gepoolter Zelllinien DNA aus K RAS mutationsnegativen Zelllinien mit 3 verschiedenen DNA Niveaus beurteilt Drei identische PCR Platten wurden getestet Jede Platte enthielt 3 Reagenzienchargen Der gemischte Standard wurde als positive Kontrolle eingesetzt Dar ber hinaus wurden positive FFPE Proben zweifach getestet Die meisten mutationspositiven Proben sind nur f r eine Mutation positiv Die anderen Mutationsassays k nnen zur Breakthrough Bewertung verwendet werden Allerdings wird eine gewisse Kreuzreakti vit t zwischen einigen Assays und positiven Mutationen erwartet Diese erzeu
44. ppl abstr 2 S Tejpar et al Relationship of efficacy with K RAS status wild type versus mutant in patients with irinotecan refractory metastatic colorectal cancer mCRC treated with irinotecan q2w and escalating doses of cetuximab q1w The EVEREST experience preliminary data J Clin Oncol 26 2008 May 20 suppl abstr 4001 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer Abstract 0 037 Presented June 27 2008 KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer Results from NCIC CTG CO 17 A phase Ill trial of cetuximab versus best supportive care Christos Karapetis et al Rafael G Amado Michael Wolf Marc Peeters Eric Van Cutsem Salvatore Siena Daniel J Freeman Todd Juan Robert Sikorski Sid Suggs Robert Radinsky Scott D Patterson and David D Chang Wild Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer J Clin Oncol 2008 26 1626 1634 Seite 39 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Hinweise fur den Kaufer Weder dieses Produkt das TheraScreen K RAS Mutation Kit noch zugeh rige Komponenten d rfen ohne die schriftliche Genehmigung von DxS Limited weiterverkauft oder anderweitig zum Wiederverkauf weitergegeben oder modifiziert werden TheraScreen und Scorpions sind eingetragene Markenzeichen von DxS Limited ARMS ist ein eingetragenes Markenzeichen
45. r Auswahl muss die Software geschlossen und erneut ge ffnet werden Einen Berichtstyp ausw hlen PDF oder CSV Bei Auswahl von CSV wird automatisch zus tzlich eine PDF Version erstellt Zum Erstellen des Ergebnisberichts die Option Analyse w hlen Der Bericht wird automatisch in dem Ordner der Testlaufdatei gespeichert und erh lt den gleichen Namen wie die Testlaufdatei Der Bericht wird automatisch angezeigt Das Berichtsergebnis wird in der Spalte Mutation Status der Tabelle Sample Result angezeigt LightCycler Adapt Software Berichtsinterpretation 1 Der LightCycler Adapt Software Bericht enth lt allgemeine Informatio nen ber die Analyse 1 1 Der Berichtsverfasser ist die Person die die Software ausgef hrt und den Bericht erstellt hat 1 2 Datum und Uhrzeit der Analyse werden angegeben Seite 16 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 2 Der Bericht enth lt eine Analyse bersicht in der der Name der Test laufdatei sowie die Algorithmusdefinitionsdatei und die Algorithmus sequenz aufgef hrt sind Die Algorithmusdetails sind vorgegeben und k nnen nicht ge ndert werden Im Ergebnisbereich sind der vollst ndige Name und der Dateipfad der Testlaufdatei des LightCycler 480 Systems sowie folgende Details aufgef hrt 3 1 Die Seriennummer des LightCycler 480 Systems 3 2 Instrument Name Die dem LightCycler 480 System in der LightC
46. r Kontroll Ct Uber 28 9 liegt und die Probe mutationsnegativ zu sein scheint wird diese Markierung Warnung angezeigt um darauf hinzu weisen dass Mutationen eines geringen Grades m g licherweise bersehen wurden Je mehr der Kontroll Ct ber 28 9 steigt desto mehr nimmt die Sensitivit t der Mutationsdetektion ab LIMITED Kontroll Ct gt 35 Damit wird angegeben dass wenig amplifizierbare DNA vorhanden ist so dass nur Mutationen mit einem hohen Prozentsatz erkannt werden k nnen Wenn bei Proben mit der Markierung Warnung LIMITED eine positive Mutation einen Ct von lt 38 erh lt wird der Mutationsstatus immer noch als g ltig gekenn zeichnet und die Mutation wird gemeldet Das Vorliegen von sehr geringen Mutationen in einer Probe mit negati vem Ergebnis und der Markierung Warnung LIMITED kann nicht dementiert werden EXO_FAIL Die Software berpr ft die Amplifikation des exogenen Kontrollassays um zu bestimmen ob ein Inhibitor vorhanden sein k nnte der zu einem falsch negativen Ergebnis f hren k nnte Folgende Logik wird angewendet a Die exogene Kontrollreaktion wird nur in den Mutationsreaktionskavit ten und nicht in den Kontroll assay Kavit ten ausgewertet ausgenommen sind die Spalten f r gemischten Standard und NTC siehe Punkt 6 oder exogene Kontrollen mit einem Ct Wert von lt 30 Seite 21 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit b Liegt ein positives Muta
47. r exogene Kontrollassay ist fehlgeschlagen wenn die FAM Reaktion in einer Mutationsreaktion ebenfalls fehlgeschlagen ist oder der exogene Kontroll Ct kleiner als 30 ist FAIL Die Software ist nicht in der Lage eine Kurve als positiv oder negativ zu bezeichnen 7 5 2 Die Bedeutungen der Markierungen Warnungen werden im Folgenden genauer erlautert 7 5 2 1 REP_DILUTION Kontroll Ct lt 24 Die Assays wurden in Bezug auf ein DNA Niveau validiert das einen Kontroll Ct von 24 oder mehr ergibt Seite 20 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 7 5 2 2 7 5 2 3 7 5 2 4 Wenn eine Probe einen niedrigeren Kontrollassay Ct ergibt sollte sie verdunnt werden damit sie dem zulassigen Wirkungsbereich entspricht CONF_LEVEL Kontroll Ct gt 28 9 Die Markierung War nung CONF_LEVEL wird bei einer negativen Kontrolle mit einem Kontroll Ct von gt 28 9 angezeigt Mutations Ct Werte werden als negativ oder au erhalb der Grenzen des Kits eingestuft wenn Sie gr er oder gleich 38 sind Der Kontroll Ct muss 28 9 oder weniger betragen damit angesichts der 1 Cut off Werte und des Ct Cut off Werts von 38 ausreichend DNA zur Detektion von 1 Mutation vorhanden ist Wenn der Kontroll Ct 28 9 bersteigt und eine Mutation nachgewiesen wird wird die positive Mutation angezeigt diese Markierung Warnung wird nicht ausgegeben da diese Probe eine konkrete Mutation enth lt Falls jedoch de
48. schlie end zum Pipet tieren die Pipettenspitze knapp unter die Oberfl che der Taq eintau chen damit die Spitze m glichst nicht mit zu viel Taq benetzt wird 4 Die Master Mixes durch vorsichtiges Auf und Abpipettieren mischen Seite 14 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 5 Sofort 20 ul der Master Mixes in die Reaktionskavitaten f llen 6 Sofort 5 ul der Probe des gemischten Standards oder Wasser f r die Nicht Template Kontrollen in die Reaktionskavit ten geben Jede DNA Probe muss sowohl mit dem Kontroll als auch allen Mutations assays getestet werden Die Plattenanordnung ist in Tabelle 6 dargestellt Tabelle 6 K RAS Kit Plattenanordnung Anordnung bei 96 Kavitaten 1 3 4 5 6 7 8 9 10 Gemischter Py pP pP P Standard robe 1 robe 5 robe 6 Probe 7 robe 8 Gemischter Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Standard Gemischter Probe 1 Probe2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Standard Gemischter Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Standard Gemischter Py pP pP Standard robe 1 robe 5 robe 6 Probe 7 Gemischter Standard Probe 1 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Gemischter Standard Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Gemischter Standard Probe 1 Probe 2
49. sitives Ergebnis bewirkt die Anzeige dieser Markierung Warnung und macht die Template Kontrolle ung ltig Falls ein ung ltiger Status f r eine der Kavit ten mit gemischtem Standard oder Nicht Template Kontrollen ausgegeben wird steht in der bersicht Run Summary Result die Angabe Run Invalid In der Tabelle Sample Result werden Probennamen und Ct Werte ausgegeben der Mutationsstatus wird jedoch als invalid gekennzeichnet Der gemischte Standard gibt an ob alle Assays ordnungsgem funktionieren Wenn dies nicht der Fall ist kann ein falsch positives oder falsch negatives Mutationsergebnis die Folge sein Die Nicht Template Kontrolle gibt an dass keine Kontamination in den Master Mixes vorliegt und die exogene Kontrolle wie vorgesehen funktioniert F r den unwahrscheinlichen Fall dass in der LightCycler Adapt Software eine Fehlermeldung angezeigt wird wenden Sie sich an den technischen Support siehe Kapitel 12 Probenergebnisse 7 1 7 2 Die Tabelle Sample Result enth lt die aus der LightCycler 480 Software bernommenen Probennamen und Ct Werte von Kon trollassays Die LightCycler 480 Adapt Software berechnet die ACt Werte und ermittelt auf Grundlage der in Tabelle 9 aufgef hrten 1 Cut off Werte ob eine Probe mutationspositiv oder negativ ist Seite 19 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Tabelle 9 LightCycler Adapt Software
50. ssayparameter erfolgen siehe Kapitel Berichts Dateninterpretation Mutations Ct Werte von 38 oder h her m ssen als negativ oder unter den Grenzwerten des Kits liegend beurteilt werden Die Assays enthalten zus tzlich zur jeweiligen Reaktion eine exogene Kontrollreaktion interne Kontrolle siehe Kapitel Technologische Grundlagen Wenn beide Assays fehlschlagen m ssen die Daten verworfen werden da m glicherweise Inhibitoren vorhanden sind die zu falsch negativen Resultaten f hren k nnen Durch Verd nnung der Probe kann die Wirkung der Inhibitoren verringert werden allerdings ist zu beachten dass dadurch auch die DNA verd nnt wird Allgemeine Vorsichtsma nahmen f r Labors m ssen beachtet werden insbesondere folgende a Nicht mit dem Mund pipettieren b In Bereichen in denen Proben oder Kit Reagenzien verarbeitet werden nicht rauchen essen oder trinken c Nach der Durchf hrung des Tests die H nde waschen Nur die im Kit enthaltene Tag Polymerase Tag verwenden und nicht durch Tag aus anderen Kits des gleichen oder eines anderen Typs oder durch Tag anderer Hersteller ersetzen Nur die f r den jeweiligen Testlauf erforderlichen Reagenzien auftauen Nicht jedes Mal das gesamte Kit auftauen so dass die Anzahl der Einfrier Auftauzyklen auf ein Minimum beschr nkt wird Sicherheitsinformationen Vorsicht Alle chemischen und biologischen Materialien sind als potenziell gef hrli
51. t die Software den Probennamen mit dem Hinweis MISMATCH an M gliche Schreibfehler im Namen k nnen in der LightCycler 480 Testlaufdatei korrigiert und die Daten mit der LightCycler Adapt Software erneut analysiert werden ABI7500 Analyseeinrichtung Die Kontroll und Mutationsassays m ssen f r jede DNA Probe auf denselben PCR Lauf bezogen analysiert werden um Variationen zwischen den einzelnen L ufen zu vermeiden 1 Die Reaktionsgemische und den gemischten Standard aus dem K RAS Kit bei Raumtemperatur auftauen Nach dem Auftauen jede L sung durch 10 maliges Umschwenken gr ndlich mischen um Salzkonzentra tionen zu vermeiden Gen gend Gemische f r die DNA Proben den gemischten Standard und Nicht Template Kontrollen sowie f r 2 zus tzliche Reaktionen pro Gemisch anfertigen siehe Tabelle 11 Tabelle 11 Volumina f r K RAS Master Mixes Master Mixes Assay Reaktions Reaktionsgemisch Taq ul pro gemisch ul x1 ul pro Platte x14 Platte x14 Kontrollassay 19 8 0 2 277 2 2 8 Mutationsassays 19 8 0 2 277 2 2 8 Taq ul x1 2 Die Taq oder andere Reaktionsgemische die Tag enthalten nicht im Vortexer mischen da das Enzym dadurch inaktiviert werden kann 3 Vor Gebrauch daf r sorgen dass die Tag auf Raumtemperatur erw rmt ist Das Fl schchen schwenken um sicherzustellen dass sich die ge samte Tag am Flaschenboden ansammelt Anschlie end zum Pipettie ren die Pipettenspitze knapp u
52. t sich gezeigt dass das Kreuzreaktivit tsmuster konsistent ist und dem Anwender das Ablesen eines Amplifikationsmusters erm glicht um das korrekte Assay Ergebnis zu erhalten wenn mehr als ein Assay ein positives Resultat ergibt Die Zahlen in den einzelnen Zellen geben die ann hernde Zyklenzahl nach der Detektion des echten positiven Signals an nach der ein Kreuzreaktivit tssignal angezeigt werden kann Werte ber 9 Zyklen wurden nicht bernommen weil diese als mutationsnegative Ergebnisse klassifiziert werden Tabelle 20 ABI7500 Kreuzreaktivitat Validierungsergebnisse Positive Probe 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Validierung der Zyklustoleranz LightCycler 480 System Mit diesen Studien wurde die Toleranz der Mutationsassays fur Abweichungen der Zyklustemperatur ermittelt Da die Annealing Temperatur die ma geblichste Temperatur ist die die Leistung des Assays beeinflusst war die Annealing Temperatur der Parameter der variiert wurde Die Zyklustoleranz wurde auf 3 verschiedenen DNA Niveaus unter Verwen dung von 1 synthetischen Standards getestet Diese Proben wurden f r jede Mutation dreifach zusammen mit zweifachen gemischten Standards und einfachen NTC Reaktionen ausgef hrt um sicherzustellen dass die Assays innerhalb der Spezifikationen lagen Seite 34 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Jede
53. tcbiientinidetanea 9 9 K RAS Mutationsnachweisprotokolll cccccceeeeeeeeeeeeeeeeeeeseeseeeeees 14 10 Einschr nkungen des Tests esseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeenees 26 11 Assay Leistungsmerkmale uuunsssnnssnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn 28 12 Technische Unterst tzung uuunssunnesnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn 36 13 Hersteller und Handlerangaben uuusuussssnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 37 14 Datum der letzten berarbeitung 2 22u222202222222022000000nn0nnonnnnnn e 37 15s Literati un ae a aa aeaaea aai aa aar Et 38 Hinweise f r den K ufer nu nn 40 Seite 2 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit A WICHTIG Lesen Sie diese Gebrauchsanweisung aufmerksam durch und machen Sie sich vor dem Gebrauch mit allen Komponenten des K RAS Kits vertraut 1 Verwendungszweck Anwendungsgebiete Verwendungszweck Das DxS TheraScreen K RAS Mutation Kit K RAS Kit ist ein n vitro Diagnosetest zur Detektion von sieben somatischen Mutationen im K RAS Onkogen der eine qualitative Auswertung des Mutationsstatus erm glicht Das K RAS Kit darf nur von geschultem Fachpersonal in einer professio nellen Laborumgebung an DNA Proben verwendet werden die aus formalinfixiertem in Paraffin eingebettetem kolorektalen Gewebe extrahiert wurden Anwendungsgebiete Die Ergebnisse des K RAS Kits dienen der Unterst tzung
54. ter Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 Probe 8 Probe 9 T 8 1 3AS P Standard H Gemischter Probe 2 Probe 3 Probe 7 Probe 8 Die PCR Platte verschlie en und kurz schwenken um die Reagenzien unten in den Kavit ten anzusammeln Die Platte sofort in das ABI7500 System einsetzen ABI7500 Systemeinrichtung 1 Auf das Symbol der 7500 Software auf dem Desktop der mit dem System verbundenen Workstation klicken Eine neue Datei im Dateimen der 7500 Sequence Detection Software Version 1 4 ffnen Unter Assay die Option Standard Curve Absolute Quantification auswahlen Unter Run Mode die Option Standard 7500 auswahlen Durch Klicken auf die Schaltflache Next zum Fenster fur die Einrichtung des Detektors navigieren Der Liste der Detektoren einen FAM und einen JOE Detektor hinzuf gen und die Quencher auf none setzen Wenn diese Detektoren nicht bereits vorhanden sind auf die Schaltflache New Detectors klicken und einen FAM und einen JOE Detektor mit der Quencher Einstellung none einrichten Die Einstellung Passive Reference auf None setzen und auf die Schaltflache Next klicken Die ganze Platte auswahlen und die Kontrollkastchen fur die FAM und JOE Detektoren aktivieren um sicherzustellen dass beide Farbstoffe in jeder Kavitat Uberwacht werden Auf die
55. tform befolgen Protokoll zur Probenauswertung LightCycler 480 Systemeinrichtung A 2 3 4 Die Platte sofort in das LightCycler 480 System einsetzen Auf das Symbol der LightCycler 480 Software auf dem Desktop der mit dem System verbundenen Workstation klicken Den Anmeldevor gang durchf hren und auf dem Bildschirm Overview die Option New Experiment from Template ausw hlen Aus der angezeigten Liste der Testlauf Templates den Eintrag K RAS LC480Il Run Template ausw hlen Dieses Template verf gt ber folgende Parameter 1 Das Detektionsformat lautet DxS IVD Assays 2 Das Reaktionsvolumen betr gt 25 3 Eine erste Pause bei 95 C f r 4 Minuten 4 Eine 2 stufige Amplifikation f r 45 Zyklen mit Denaturie rung bei 95 C f r 30 Sekunden und Annealing bei 60 C f r eine Minute Die Fluoreszenzerfassung ist eine Einzel erfassung beim 60 C Schritt Auf die Registerkarte Sample Editor klicken und unter Step 1 Select Workflow das Kontrollk stchen Abs Quant aktivieren Unter Select Filter Combinations sicherstellen dass beide Filter 465 510 nm und 533 580 nm ausgew hlt sind Die Probennamen unter Step 2 und Step 3 einrichten Die Option Quantification Sample Type auf unknown setzen Die Spalte Replicate muss leer bleiben Auf die Schaltfl che Experiment und danach auf die Schaltfl che Start Run klicken um
56. tions assay Das Verfahren wurde von 3 verschiedenen Bedienern wiederholt Ct Werte wurden mit der LightCycler Adapt Software ermittelt Die 1 ACt Werte wurden anhand aller Kombinationen aus Mutations und Kontroll Ct Werten der Replikate innerhalb eines Testlaufs berechnet Die ACt Cut off Werte wurden als Durchschnittswert aus allen Testl ufen und Konzentrationen festgelegt Die Ergebnisse dieses Tests sind im Kapitel Dateninterpretation zusammengefasst ABI7500 F r jedes Assay wurden 1 Verd nnungen in 3 separaten Test laufen fur 3 Kit Chargen dreifach getestet und zwar sowohl f r den Kontrollassay als auch den Mutationsassay Der gemischte Standard wurde auf jeder Platte verwendet um sicherzustellen dass die Assays innerhalb der festgelegten Kriterien lagen Die 1 ACt Werte wurden aus den gemittelten Ct Werten der Replikate innerhalb eines Testlaufs und einer Charge berechnet Bei Konzentra tionen in denen alle Replikate einen Ct Wert ergaben wurden die ACt Cut off Werte als Durchschnittswert gerundet auf die n chsten 0 5 von allen Chargen Testl ufen und Konzentrationen festgelegt Die Ergebnisse dieses Tests sind nachfolgend in Tabelle 16 zusammengefasst Tabelle 16 ABI7500 1 Cut off Werte Validierungsergebnisse Durchschn 1 ACt Werte 6 5 8 8 7 9 7 5 9 Der 1 Cut off Wert f r 12Val wurde aufgrund der Breakthrough Studie auf 6 5 ge ndert Siehe Er rteru
57. tionsergebnis vor aber der exogene Kontrollassay ist in der mutationspositiven Kavitat fehlgeschlagen wird die Markierung Warnung EXO_FAIL nicht angezeigt weil eine kompetitive Hemmung aus der FAM Reaktion bestehen k nnte Der Mutationsstatus ist g ltig Wenn ein positives Mutationsergebnis f r eine Probe in einer Mutationskavit t und ein fehlgeschlagener exogener Kontrollassay in einer anderen Mutations kavit t derselben Probe vorliegen wird die Mutation in der ersten Kavit t ausgegeben und das Ergebnis ist g ltig Jedoch wird die Markierung Warnung EXO_FAIL angezeigt Damit wird angegeben dass ein Problem mit dem Assay in der Kavit t mit dem fehlgeschlagenen exogenen Kontrollassay vorliegt und in dieser Kavit t m glicherweise eine Mutation bersehen wurde Es besteht die M glichkeit dass die ausgegebene Mutation eher eine Kreuzreaktivit t zwischen den Assays als eine echte Mutation darstellt die Uber sehen wurde Der Mutationsstatus in dem Assay der das positive Mutationsergebnis ausgibt bleibt g ltig weil eine deutliche Mutation vorhanden ist die klinische Entscheidung bleibt dieselbe unabh ngig davon um welche Mutation es sich handelt Wenn die Probe als negativ eingestuft wird aber eine exogene Kontrollreaktion in einem der Mutations assays fehlgeschlagen ist wird die Markierung War nung EXO_FAIL angezeigt und der Status ist ung ltig Es besteht die M glichkeit dass eine Mutation ber sehen wurde
58. tunden dauern e Die Proben in 200 ul des ATE Puffers aus dem Qiagen Extraktionskit eluieren Der Endbenutzer muss alle alternativen Methoden zum Ansetzen der Proben validieren 3 Lagerung der extrahierten DNA Vor der Analyse bei 20 C aufbewahren Protokoll zur Probenauswertung Das im K RAS Kit enthaltene zus tzliche Kontrollassay wird zur Bestim mung der gesamten DNA in einer Probe verwendet Dieses Kontrollassay amplifiziert eine Region von Exon 4 des K RAS Gens Die Proben sollten so angesetzt werden dass nur das Kontrollassay den gemischten Standard als positive Kontrolle und Wasser als Nicht Template Kontrolle NTC verwendet Es ist zu beachten dass die Proben chargenweise zusammengefasst werden sollten um die Reagenzien im K RAS Kit optimal zu nutzen Alle Versuchsl ufe m ssen Kontrollen enthalten Werden die Proben einzeln getestet hat dies einen h heren Verbrauch an Reagenzien zur Folge und die Anzahl der mit dem K RAS Kit zu testenden Proben verringert sich Protokoll zur Probenauswertung Plattenanordnung 1 Das Reaktionsgemisch und den gemischten Standard aus dem K RAS Kit bei Zimmertemperatur auftauen Nach dem Auftauen jede L sung durch 10 maliges Umschwenken gr ndlich mischen um Salzkonzentra tionen zu vermeiden Ausreichend Gemische f r die DNA Proben eine Reaktion mit gemischtem Standard und eine Nicht Template Kontrolle sowie f r zwei 2 zus tzliche Reaktionen anfertigen 2 Zum Erstellen
59. tzen bestanden und die Kurvensteigungen im Wesentlichen quivalent war was auf eine hnliche Amplifikationseffizenz ber mehrere Mutationskonzentrationen hinweg schlie en l sst ABI7500 Diese Studie beurteilte ber mehrere DNA Konzentrationen hinweg den Wirkungsgrad der einzelnen Mutationsassays in einem Hinter grund aus Wildtyp DNA und in Wasser Jeder Mutationsassay m sste eine Effizienz von 90 bis 110 100 10 aufweisen Standardkurven wurden mit einer 5 fachen Verd nnungsreihe eingerichtet und eine PCR Platte mit drei Chargen der Kit Reagenzien wurde f r jeden Assay durchlaufen Die 100 Mutationsstandards wurden bei jedem der Mutationsassays durch Verd nnung in Wasser mit 50 ng 10 ng 2 ng und 0 4 ng DNA getestet Au erdem wurden die Mutationsassays mit einer 5 fachen Verd nnungsreihe in 10 ng ul Zelllinien DNA getestet um den Breakthrough Effekt zu bewerten Anhand der Versuchsdaten wurde f r jeden Mutationsassay eine Standard kurve generiert Die Berechnung der PCR Effizienz erfolgte mit Hilfe der folgenden Gleichung 100 10 teisuns _4 Das h here Breakthrough Niveau bei den 10 ng ul Zelllinien Verd nnun gen ergab Effizienzwerte von ber 100 Au erdem wurden die Gesamtwirkungsgrade quer ber die Reagenzien chargen berechnet Alle Werte waren hnlich und lagen innerhalb von 10 der Effizienz des Kontrollassays Parallele Standardkurven zwischen den Kontrollassays und Mutationsassays belegen
60. von rzten bei der Identifizierung von Patienten mit Kolorektalkrebs die von einer Anti EGFR Therapie Epidermal Growth Factor Receptor wie zum Beispiel mit Panitumumab oder Cetuximab m glicherweise nicht profitieren Das K RAS Kit ist nicht zur Diagnose von Kolorektalkrebs bestimmt sondern dient als Erg nzung zu anderen relevanten Prognosefaktoren anhand derer auf Grundlage des Mutationsstatus geeignete Patienten f r die Anti EGFR Therapie ausgew hlt werden Der Mutationsstatus des Patienten wird zusammen mit anderen Krankheitsfaktoren von einem Arzt beurteilt damit eine Therapieentscheidung getroffen werden kann Thera pieentscheidungen f r Krebspatienten d rfen keinesfalls ausschlie lich auf dem K RAS Mutationsstatus beruhen 2 Zusammenfassung und Erkl rung des Tests Das K RAS Kit ist ein mit dem CE Zeichen versehenes Diagnostikum das der Richtlinie 98 79 EG der Europ ischen Union ber In vitro Diagnostika entspricht In menschlichen Karzinomen treten h ufig Mutationen des K RAS Onkogens auf 4 Patienten mit metastasiertem Kolorektalkrebs bei denen eine Mutation des K RAS Gens vorliegt sprechen auf bestimmte Krebs therapien mit EGFR Blockern nicht an 6 19 14 21 Die Detektion von sieben Mutationen im K RAS Gen kann in einem Hintergrund aus Wildtyp DNA in einem Echtzeit PCR Assay unter Verwendung der DxS Scorpions Technologie erfolgen Diese Methode ist u erst selektiv Unter der Voraussetzung dass genug
61. ycler 480 Software zugeordnete Kennung 3 3 Run Date Datum und Uhrzeit des Testlaufs auf dem LightCycler 480 System 3 4 Run Operator Der Name der Person die zum Zeitpunkt der Versuchsdurchf hrung bei der LightCycler 480 Software angemeldet war 3 5 Experiment Name Name der Testlaufdatei 3 6 Software Version Version der auf dem LightCycler 480 System verwendeten Software 3 7 Lot Number bernommen aus dem Feld Lot No auf dem Bild schirm f r die Analyseeinrichtung in der LightCycler 480 Software Die Plattenanordnung wird angegeben wobei die Probennamen aus dem Bildschirm Sample Editor der LightCycler 480 Software ber nommen werden In der bersicht Run Summary Result ist angegeben ob der Lauf g ltig oder ung ltig war Dies richtet sich nach den Testlaufkontrollen in den Spalten 1 und 2 Testlaufkontrollen 6 1 Die LightCycler Adapt Software berechnet den ACt Wert f r den gemischten Standard automatisch anhand der folgenden Formel Mutations Ct Kontroll Ct ACt 6 2 Die LightCycler Adapt Software vergleicht die Werte mit den in Tabelle 7 angegebenen erwarteten Werten Tabelle 7 LightCycler Adapt Software Erwartete ACt Werte Assay Gemischter Standard ACt 6 3 Die Ct und ACt Werte werden im Bericht ausgegeben Seite 17 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit 6 4 Folgende Markieru
62. ystemen Bedienern Chargen Tagen und Testl ufen zu tolerieren Genauigkeitsvalidierung LightCycler 480 System Die Genauigkeit wurde unter Verwendung von 92 FFPE Proben und 28 mutationspositiven Zelllinien Verd nnungen bewertet Seite 31 von 40 Nur zur diagnostischen Anwendung TheraScreen K RAS Mutation Kit Diese wurden mit dem K RAS Kit getestet und auRerdem mit der Sanger Sequenzierung sequenziert Der Vergleich der K RAS Mutationswerte zwischen den beiden Methoden ergab 18 diskrepante Ergebnisse 5 FFPE und 13 Zelllinienproben wobei die Sequenzierung ein negatives Resultat angab die Probe bei Verwendung des DxS Assays jedoch positiv war Zur Bestatigung ob in diesen 18 Proben eine Mutation vorliegt wurde jeweils die Region um die Mutationen herum geklont Das Vorliegen eines mutationspositiven Klons diente der Aufl sung der Diskrepanz ABI7500 Die Genauigkeit wurde unter Verwendung synthetischer Kontrollen berpr ft die in 2 Konzentrationen von K RAS mutationsnega tiver Zelllinien DNA verd nnt wurden um 3 unterschiedliche Prozents tze Mutation zu erhalten die sowohl positive als auch negative Mutations niveaus abdeckten F r drei identische Platten die jeweils 3 Reagenzien chargen enthielten wurde f r jede Mutation ein Testlauf durchgef hrt Die Mutationsniveaus 25 5 und 0 5 wurden getestet Die 25 und 5 Proben sollten ein mutationspositives ACt unter den 1 Cut off Werten und die 0 5

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

TheraScreen&reg;: K-RAS Mutation Kit

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit