Epi proColon 2.0 proColon 2.0 CE
Contents
1. 0 240424002ssnsennnsnnnnennnnnnnnnnnn 25 Interpretation von Ergebnissen einzelner PCR Reaktionen LightCycler 480 Instrument Il 26 Beurteilung von Patientenproben u 27 QUalItacsKontroller 2 er einen 27 EXTeTNe Kon lollenne 2 Er Eee ER erst 27 Interne Kontrollen arena arbeiter E Aa rE ADEE SS 27 Grenzen des Verlahrens can ana nen E E AE 28 Spezifische Leistungsdaten a mm 28 Analytische Sensilivit t nssienessranser ee me sans T AE A RO 28 BEPTOQUZIETDArKE IE ansehe else 28 Kliniscn amp keistungsfanigkeit sr eigenes Ele 29 K nk rdanz der beiden Reak Time PCR Instrumente a i E AEEA A 29 EErEE a a a aA ATE 29 Bedeutung der Symbole aus 30 Referenzen neun lner anreisen 30 Kontakt nformationen au reines 31 Seite 2 von 31 1 Name und Verwendungszweck Epi proColon 2 0 CE ist ein qualitativer Test f r den real time PCR basierten Nachweis von methylierter SeptinG DNA in bisulfit konvertierter DNA aus humanen Plasmaproben Vorhandensein von methyliertem Septin9 und das Vorhandensein eines kolorektalen Karzinoms korrelieren miteinander und Septin9 kann zur Unterst tzung der Diagnose dieses Karzinoms hinzugezogen werden Epi proColon 2 0 CE besteht aus dem Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 dem Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 und dem Epi proColon Control Kit M5 02 003 2 Zusammenfassung und Erl uterung des Testverfahrens Epi proColon 2 0 CE ist ein in vitro T2. PCR Master Mix Au erdem wird dringend empfohlen einen Rotationsmischer der ein berkopf Mischen erm glicht und keinen Horizontalsch ttler zu verwenden Es wird weiterhin empfohlen extrahierte und Bisulfit behandelte DNA mit einer Referenzpipette zu pipettieren 9 1 Herstellung der Arbeitsl sungen 9 1 1 Verd nnung des Epi proColon Wash A Buffer e Geben Sie mit Hilfe eines sterilen Messzylinders oder einer serologischen Pipette 60 0 ml absolutes Ethanol f r die Molekularbiologie gt 99 5 in das Epi proColon Wash A Concentrate e Schlie en Sie den Deckel und mischen Sie gr ndlich indem Sie die Flasche vorsichtig f nfmal auf den Kopf stellen Vermeiden Sie Schaumbildung Beschriften Sie die Flasche mit dem Datum der Verd nnung und kreuzen Sie das K stchen Ethanol added an e Verd nnter Epi proColon Wash A Buffer kann bis zu 6 Wochen bei 15 bis 30 C aufbewahrt werden Seite 9 von 31 9 1 2 Verd nnung des Epi proColon Wash B Buffer e Geben Sie mit Hilfe eines sterilen Messzylinders oder einer serologischen Pipette 40 0 ml absolutes Ethanol f r die Molekularbiologie gt 99 5 in das EpiproColon Wash B Concentrate e Schlie en Sie den Deckel und mischen Sie gr ndlich indem Sie die Flasche vorsichtig f nfmal auf den Kopf stellen Beschriften Sie die Flasche mit dem Datum der Verd nnung und kreuzen Sie das K stchen Ethanol added an e _Verd nnter Epi proColon Wash B Buffer kann
3. 2 240s2s0 essennenennnnnnnnnn 20 Interpretation von Ergebnissen einzelner PCR Reaktionen Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx 20 Analyse mit dem Roche LightCycler 480 Instrument 000000000ss0000ssnnssssssnnnnnnnnsssssnnnnnnssnsnsnnnnnn 21 Herstellung der PCR Platte LightCycler 480 Instrument 0 04444004s0nnssnnsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnsennnnnnnsnnnnn 21 Laden der PCR Platte LightCycler 480 Instrument 0 0044404s40nennnnsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnsnnnnnnnsennnnnnsnnnnn 21 Ergebnisanalyse LightCycler 480 Instrument 0 s404440Besnnnennnennnnnnnnnnnnnsnnnsnonnnnnnssnnsnnnnssnnnnnnnssnnnn 21 Validit t der Epi proColon Kontrollen LightCycler 480 Instrument 0 44044400sssennnnnnennnnnnnnen nennen 23 Interpretation von Ergebnissen einzelner PCR Reaktionen LightCycler 480 Instrument 23 Analyse mit dem Roche LightCycler 480 Instrument Il 00000202000000000ssssssnnnnnnnnsssssnnnnnnnsnsnnnnnnnnn 24 Herstellung der PCR Platte LighCycler 480 Instrument Il 0 0 444004400nsnnnnsnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnsennnnnnnsnnnnn 24 Laden der PCR Platte LightCycler 480 Instrument l 0 44404440Besnnnnnnnnnnnnsnnnnnnnnnnnnennnnnensennnnsnnsnnnnn 24 Ergebnisanalyse LightCycler 480 Instrument E E EEE a 24 Validit t der Epi proColon Kontrollen LightCycler 480 Instrument II
4. Seite 15 von 31 10 3 Laden der PCR Platte Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Hinweis Der PCR Master Mix enth lt kein ROX oder einen anderen Referenzfarbstoff Daher muss die passive Referenz auf none gesetzt werden Hinweis Wir empfehlen eine Templat Datei sdt mit den angegebenen PCR Bedingungen abzuspeichern Starten Sie die Softwareversion SDS v1 4 Laden Sie die entsprechende Templat Datei oder erstellen Sie ein neues Plattendokument Klicken Sie auf Create New Document Definieren Sie die folgenden Einstellungen im Plattendokument o Assay Standard Curve Absolute Quantification o Container 96 Well Clear o Template Blank Document oder w hlen Sie die entsprechende Epi proColon 2 0 CE Templat Datei o Run Mode Standard 7500 Klicken Sie auf Next Klicken Sie auf New Detector Erstellen Sie einen neuen Detektor mit den folgenden Einstellungen o Name Septin9 o Description Epi proColon 2 0 CE o Reporter dye FAM o Quencher dye none o Color Red Klicken Sie auf Create Another mit den folgenden Einstellungen o Name ACTB o Description Epi proColon 2 0 CE o Reporter dye JOE o Quencher dye none o Color Green Klicken Sie auf ok W hlen Sie beide Detektoren an und klicken Sie Add gt gt um die Detektoren dem Plattendokument zuzuweisen W hlen Sie none im Drop down Men bei Passive Reference Klicken Sie auf Done Ge
5. Hinweis Wenn die PCR mit dem Applied Biosystems 7500 Fast PCR Instrument oder 7500 Fast Dx PCR Instrument mit der SDS v1 4 Software durchgef hrt wird folgen Sie den Anweisungen in Kapitel 10 und 13 Wenn die PCR mit dem Roche LightCycler 480 Instrument durchgef hrt wird folgen Sie den Anweisungen in Kapitel 11 und 13 Wenn die PCR mit dem Roche LightCycler 480 Instrument II durchgef hrt wird folgen Sie den Anweisungen in Kapitel 12 und 13 10 Analyse mit Applied Biosystems 7500 Fast und 7500 Fast Dx PCR Instrument 10 1 Softwareanforderungen Dieses Produkt wurde mit der SDS v1 4 Software mit 21 CFR Part 11 Modul validiert 10 2 Herstellung der PCR Platte Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx e Pipettieren Sie die PCR Platte entsprechend der empfohlenen Plattenbelegung siehe Tabelle 6 e berf hren Sie 15 ul PCR Master Mix in die entsprechenden Positionen der MicroAmp Fast Optical 96 Well Reaktionsplatte e Wenn notwendig zentrifugieren Sie die bisDNA Lagerplatte aus Abschnitt 9 2 13 f r 1 min bei 1 000 100 rcf in einer Plattenzentrifuge e F gen Sie 15 ul der bisDNA L sung in die entsprechenden Positionen der PCR Platte e Verschlie en Sie die PCR Platte mit einer MicroAmp 96 Well optischen Abdeckfolie e Zentrifugieren Sie die PCR Platte mit einer Plattenzentrifuge f r 1 min bei 1 000 100 rcf kurz an Hinweis Die beladene PCR Platte kann bis zu 4 h bei 2 bis 8 C im K hlschrank gelagert werden
6. 10 100 ul Eppendorf Katalog Nr 3122 000 035 oder gleichwertig Centrifuge 5804 R Eppendorf Katalog Nr 5804 000 013 mit Rotor A 2 DWP Eppendorf Katalog Nr 5804 740 009 oder gleichwertig Carl Roth Katalog Nr C177 2 oder gleichwertig oder Fischer Scientific Katalog Nr 11889181 oder gleichwertig 6 2 Allgemeine Verbrauchsmaterialien und Reagenzien Verbrauchsmaterialien und Reagenzien Absolutes Ethanol f r die Molekularbiologie 99 5 15 ml Polypropylen Zentrifugenr hrchen mit konischem Boden PP steril 2 0 ml Reaktionsgef e mit rundem Boden und Sicherheitsdeckel PP Pipettenspitzen mit Filter Spitzen f r repetitive Pipetten f r folgende Volumina 0 5 ml 1 ml 10 ml 25 ml Einmaltransferpipetten nicht steril lose 15 cm L nge 5 mm Halsdurchmesser 5 ml Saugvolumen Empfehlungen Merck KGaA Katalog Nr 1 08543 0250 oder gleichwertig Sarstedt Katalog Nr 62 554 502 oder gleichwertig Sarstedt SafeSeal Katalog Nr 72 695 400 oder Eppendorf Safe LockTM Katalog Nr 0030 120 094 oder gleichwertig ep Dualfilter T 1 P S Eppendorf 2 100 ul Katalog Nr 0030 077 547 oder gleichwertig 50 1000 ul Katalog Nr 0030 077 571 oder gleichwertig Combitips advanced Eppendorf 0 5 ml Katalog Nr 0030 089 421 oder gleichwertig 1 ml Katalog Nr 0030 089 430 oder gleichwertig 10 ml Katalog Nr 0030 089 464 oder gleichwertig 25 ml Katalog Nr 0030 089 472 oder gleichwertig VWR
7. Hinweis Um eine gute Ausbeute zu gew hrleisten ist es notwendig durch Mischen eine homogene Suspension der Epi proColon Magnetic Beads zu erreichen Abweichende Bead Mengen zu viel oder zu wenig k nnen zu falschen Ergebnissen f hren Um die richtige Konzentration d h homogene Suspension zu erreichen sollte die Flasche kurz vor dem Pipettieren mit den Epi proColon Magnetic Beads solange sorgf ltig gemischt werden bis das Sediment am Boden der Flasche vollst ndig resuspendiert ist Auch zwischen den Pipettierschritten muss immer auf eine homogene Suspension geachtet werden e Zentrifugieren Sie das 2 0 ml Reaktionsgef mit der Bisulfit Reaktion kurz an e F gen Sie die folgenden Reagenzien hinzu o 1000 ul Epi proColon Wash A Buffer O 20 ul Epi proColon Magnetic Beads frisch suspendiert e Mischen Sie mit dem Vortex f r 5 10 sec e Warten Sie bis der Thermoshaker 23 2 C erreicht hat e Stellen Sie das Reaktionsgef in den Thermoshaker und inkubieren Sie bei 23 2 C f r 45 5 min bei 1000 100 UPM e Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz an e Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder e Entnehmen Sie mit Hilfe einer frischen 15 cm Einmaltransferpipette so viel Fl ssigkeit wie m glich w hrend das Reaktionsgef noch immer im Magnetst nder steht Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren 9 2 9 Erster Waschschritt e Nehmen Sie zum Waschen die Pr
8. r Anwender die den Epi proColon 2 0 CE Test auf dem Applied Biosystems 7500 Fast oder 7500 Fast Dx PCR Ger t durchf hren e Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real Time PCR Instrument mit Sequence Detection Software v1 4 21 CFR Part 11 Modul Life Technologies Co Katalog Nr 4406984 or 4406985 oder Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR Instrument Life Technologies Co Katalog Nr 4351106 oder 4351107 mit Sequence Detection Software v1 4 21 CFR Part 11 Modul Life Technologies Co Katalog Nr 4377355 e MicroAmp Fast Optical 96 Well Reaktionsplatte mit Barcode 0 1 ml Applied Biosystems Life Technologies Co 20 Platten Katalog Nr 4346906 200 Platten Katalog Nr 4366932 e MicroAmp 96 amp 384 Well Optische Abdeckfolie Applied Biosystems Life Technologies Co 25 Folien Katalog Nr 4360954 oder 100 Folien Katalog Nr 4311971 F r Anwender die den Epi proColon 2 0 CE Test auf dem Roche LightCycler 480 Real Time PCR Ger t I und Il durchf hren e LightCycler 480 Instrument mit 96 Well Heizblock Roche Katalog Nr 05015278001 und mit Software Version 1 5 x oder LightCycler 480 Instrument Il mit 96 Well Heizblock Roche Katalog Nr 05015278001 und mit Software Version 1 5 x e LightCycler 480 Multiwell Platte 96 wei mit Abdeckfolie Roche Katalog Nr 04729692001 e LightCycler 480 optische Abdeckfolie Roche Katalog Nr 04729757001 Zus tzliche Laborger te die unabh ngig
9. 222 Fax 49 30 24345 555 Informationen f r den K ufer Epi proColon Epi proColon ist ein eingetragenes Warenzeichen der Epigenomics AG Alle anderen in diesem Dokument genannten Warenzeichen Marken und Namen sind Eigentum der jeweiligen Firmen LightCycler 480 System ist ein eingetragenes Warenzeichen der F Hoffmann La Roche Ltd Applied Biosystems MicroAmp sind eingetragene Warenzeichen der Life Technologies Corporation DynaMag ist ein Warenzeichen der Life Technologies Corporation BD Vacutainer ist ein eingetragenes Warenzeichen der Becton Dickinson Inc Corporation S Monovette ist ein eingetragenes Warenzeichen der Sarstedt AG amp Co ThermoMixer Research Reference Multipette ep Dualfilter T 1 P S Combitips advanced sind eingetragene Warenzeichen der Eppendorf AG Safe Lock Gef e ist ein Warenzeichen der Eppendorf AG HandyStep ist ein eingetragenes Warenzeichen der Brand GmbH Co KG Dem K ufer werden mit Erwerb des Produktes Rechte zur Benutzung bestimmter Roche Patente einger umt die jedoch ausschlie lich zur Bereitstellung von Diensten im Bereich der In Vitro Diagnostik beim Menschen zu verwenden sind Eine allgemeine Patent oder sonstige Lizenz welche ber vorgenanntes Nutzungsrecht des K ufers hinausgeht wird nicht einger umt Seite 31 von 31
10. 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder Entfernen Sie mit Hilfe einer frischen 15 cm Einmaltransferpipette so viel Fl ssigkeit wie m glich w hrend das Reaktionsgef noch immer im Magnetst nder steht Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz an Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder Entfernen Sie mit Hilfe einer 10 100 ul Referenzpipette so viel Fl ssigkeit wie m glich w hrend das Reaktionsgef noch immer im Magnetst nder steht Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren 9 2 12 Trocknen der DNA Hinweis Verl ngern Sie die Trocknungszeit bzw erh hen Sie die Temperatur nicht Ver nderte Bedingungen k nnen zu einer reduzierten bisDNA Ausbeute f hren Inkubieren Sie das Reaktionsgef mit ge ffnetem Deckel in einem Thermoshaker bei 23 2 C f r 10 1 min ohne zu sch tteln 9 2 13 Elution Stellen Sie das Reaktionsgef in ein nicht magnetisches Rack und f gen Sie folgendes Reagenz hinzu o 60 ul Epi proColon Elution Buffer Schlie en Sie den Deckel des Reaktionsgef es Mischen Sie die Magnetpartikel mit dem Vortex f r 5 10 sec Inkubieren Sie das Reaktionsgef in einem Thermoshaker bei 23 2 C unter Sch tteln bei 1000 100 rpm f r 10 1 min Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz Seite 13 von 31 e Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag
11. berf hren Sie das komplette Eluat 100 ul DNA L sung in ein frisches 2 0 ml Reaktionsgef w hrend das Reaktionsgef noch immer im Magnetst nder steht Verwerfen Sie das 2 0 ml Reaktionsgef mit den Magnetpartikeln Seite 11 von 31 9 2 6 Lagerung der extrahierten DNA Hinweis Wenn Sie die extrahierte DNA nicht sofort weiterverarbeiten k nnen Sie die DNA bei 2 bis 8 C bis zu 24 h lagern Extrahierte DNA darf nicht eingefroren werden 9 2 7 Bisulfit Konvertierung Hinweis Die Epi proColon Bisulfite Solution reagiert mit dem Luftsauerstoff Verwenden Sie daher nur unge ffnete R hrchen der Epi proColon Bisulfite Solution Die angebrochene L sung kann nicht gelagert werden sondern muss sofort entsorgt werden e Geben Sie die folgenden Reagenzien in das 2 0 ml Reaktionsgef mit dem Eluat 100 ul DNA L sung o 150 ul Epi proColon Bisulfite Solution o 25 ul Epi proColon Protection Buffer e Verschlie en Sie das Reaktionsgef und mischen Sie die Bisulfit Reaktionsmischung auf dem Vortex f r 5 10 sec e Das 2 0 ml Reaktionsgef kurz anzentrifugieren e Inkubieren Sie das Reaktionsgef ohne Sch tteln bei 80 2 C in einen Thermoshaker f r 45 5 min e _Entnehmen Sie das Reaktionsgef sofort nach Ablauf der Inkubationszeit von 45 5 min e Stellen Sie die Temperatur des Thermoshakers f r den sp teren Gebrauch auf 23 2 C oder benutzen Sie einen zweiten Thermoshaker 9 2 8 DNA Bindung
12. beschriftetes 2 0 ml Reaktionsgef Stellen Sie die Einmaltransferpipette zur ck in das 15 ml Zentrifugenr hrchen um restliche Magnetpartikel zu sammeln und berf hren Sie diese auch in das 2 0 ml Reaktionsgef Stellen Sie das 2 0 ml Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder Entfernen Sie mit einer 15 cm Einmaltransferpipette so viel Puffer wie m glich w hrend das 2 0 ml Reaktionsgef noch immer im DynaMag 2 Magnetst nder steht Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz an Stellen Sie das 2 0 ml Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder Entfernen Sie mit Hilfe einer 10 100 ul Referenzpipette so viel verbliebenen Puffer wie m glich w hrend das 2 0 mi Reaktionsgef noch immer im DynaMag Y 2 Magnetst nder steht 9 2 5 Elution berf hren Sie das Reaktionsgef in ein nicht magnetisches Rack Mischen Sie die Epi proColon Elution Buffer Flasche auf einem Vortex f r 5 10 sec Geben Sie 100 ul Epi proColon Elution Buffer in jedes Reaktionsgef Schlie en Sie das Reaktionsgef Resuspendieren Sie die Magnetpartikel durch Mischen auf dem Vortex f r 5 10 sec Stellen Sie das Reaktionsgef f r 10 1 min bei 1 000 100 UPM und 80 2 C in einen Thermoshaker Das Reaktionsgef kurz anzentrifugieren Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2 6 min in einen DynaMag 2 Magnetst nder
13. s 1 0 1 3 3 1 3 Detektionsmodus keine keine keine keine LightCycler 480 Instrument I W hlen Sie das Detektionsformat Dual Color Hydrolysis Probe UPL Probe aktivieren Sie die Filterkombination 483 533 nm und 523 568 nm und setzten Sie das Reaction Volume auf 30 11 3 Ergebnisanalyse LightCycler 480 Instrument I Hinweis Benutzer des LightCycler 480 Instrument m ssen die Color Compensation auf ON stellen und die entsprechende Epi proColon Color Compensation Datei f r die Filterkombination Filter Comb 483 533 und Filter Comb 523 568 laden Hinweis F hren Sie die Datenanalyse ausschlie lich auf belegten Well Positionen durch indem Sie ein entsprechendes sample sub set wie im Benutzerhandbuch des LightCycler 480 Instruments beschrieben definieren Seite 21 von 31 Klicken Sie auf Analysis in der LightCycler 480 Basic Software um das Analysis Overview Fenster zu ffnen W hlen Sie Abs Quant Fit Points f r alle Proben aus Aktivieren Sie die Epi proColon Color Compensation Aktivieren Sie die Filterkombination Filter Comb 483 533 Setzen Sie den ersten Zyklus First Cycle auf 1 und den letzten Zyklus Last Cycle auf 50 Stellen Sie den Hintergrund auf 5 22 klicken Sie auf den blauen background Knopf in dem Sie Min Offset auf 4 und Max Offset auf 21 im Fenster
14. unmethylierte genomische DNA 100 ng ml Bilirubin 0 20 mg ml Hamoglobin 1 mg ml Triglyzeride 12 mg ml Protein humanes Seite 29 von 31 Serumalbumin 120 mg ml rote Blutzellen 0 4 v v K EDTA 20 mg ml Cholesterin 5 mg ml Harnstoff 0 235 mg ml und Glukose 10 mg ml 17 18 Bedeutung der Symbole li Bitte Gebrauchsanleitung beachten Artikelnummer F r die diagnostische in vitro Untersuchung g o Chargennummer Verfallsdatum Hersteller Lagertemperatur Inhalt ausreichend f r x Tests Nicht wiederverwendbar OINEN E Referenzen deVos T et al Circulating methylated SEPT9 DNA in plasma is a biomarker for colorectal cancer Clinical Chemistry 55 7 1337 46 2009 Lofton Day C et al DNA methylation biomarkers for blood based colorectal cancer screening Clinical Chemistry 54 2 414 423 2008 Model F et al Identification and validation of colorectal neoplasia specific methylation markers for accurate classification of disease Mol Cancer Res 5 153 163 2007 Eads C A et al MethyLight a high throughput assay to measure DNA methylation Nucleic Acids Research Volume 28 Issue 8 e32 2000 Seite 30 von 31 19 Kontaktinformationen Epi proColon 2 0 CE wird hergestellt von Epigenomics AG Geneststr 5 10829 Berlin Germany F r weitere Informationen und Hilfestellungen senden Sie bitte eine Email oder rufen Sie an support products epigenomics com Phone 49 30 24345
15. 0 C 15 C bis 30 C Lagerungstemperatur 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C Lagerungstemperatur 25 C bis 15 C 25 C bis 15 C Bei der Arbeit mit Chemikalien m ssen immer ein Laborkittel und Einmalhandschuhe getragen werden Zur Reinigung kontaminierter Oberfl chen bitte Wasser benutzen Weitere Informationen finden Sie in den entsprechenden Sicherheitsdatenbl ttern MSDS auf unserer Webseite http www epiprocolon com de labore der septin9 test sicherheitsdatenblaetter html Epi proColon Lysis Binding Buffer und Epi proColon Wash A Concentrate enthalten TRITON X 100 und Guanidiniumthiocyanat H S tze Gefahrenhinweise EUHO32 Entwickelt bei Ber hrung mit S ure sehr giftige Gase H302 Gesundheitssch dlich bei Verschlucken H312 Gesundheitssch dliich bei Hautkontakt H318 Verursacht schwere Augensch den H332 Gesundheitssch dliich bei Einatmen H412 Sch dlich f r Wasserorganismen mit langfristiger Wirkung P S tze Sicherheitshinweise P261 Einatmen von Aerosol vermeiden P273 Freisetzung in die Umwelt vermeiden P301 P312 BEI VERSCHLUCKEN Bei Unwohlsein GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen P302 P352 BEI KONTAKT MIT DER HAUT Mit viel Wasser und Seife waschen P305 P351 P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN Einige Minuten lang behutsam mit Wasser sp len Vorhandene Kontaktlinsen nach M glichkeit entfernen Weiter sp len GEFAHR Seite 4 von 31 Epi proColon Bisulfite So
16. 03 sind bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar wenn sie laut Anweisung gelagert und gehandhabt werden Verwenden Sie kein Material nach Ablauf des Verfallsdatums Mischen Sie keine Komponenten von unterschiedlichen Kit Lots 5 1 Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Lagern Sie alle Reagenzien des Epi proColon Plasma Quick Kits bei 15 bis 30 C 30 C Epi proColon Bisulfite Solution reagiert mit dem Luftsauerstoff 15 C Verwenden Sie nur unge ffnete Fl schchen der Epi proColon Bisulfite Solution Entsorgen Sie gebrauchte L sungen Lagern Sie die Gebrauchsl sungen des Epi proColon Wash A Buffer und des Epi proColon Wash B Buffer bei 15 bis 30 C bis zu 6 Wochen Nach der ersten Benutzung sind die Reagenzien bis zu 6 Wochen bei 15 bis 30 C haltbar 5 2 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 Lagern Sie den Epi proColon PCR Mix und die Epi proColon Ar Polymerase bei 25 bis 15 C 25 A Jedes Epi proColon PCR Mix R hrchen kann einmal aufgetaut und wieder eingefroren werden Nach der ersten Benutzung sind die Reagenzien bis zu 6 Wochen bei 25 bis 15 C haltbar Seite 5 von 31 5 3 Epi proColon Control Kit M5 02 003 15 C ye A Lagern Sie den Epi proColon Control Kit bei 25 bis 15 C 6 Ben tigte aber nicht mitgelieferte Instrumente Verbrauchsmaterialien und Reagenzien 6 1 Allgemeine Laborausstattung Die folgende Laborausstattung wird ben tigt um den Epi proColon 2 0 CE Tes
17. 2 Magnetst nder e Transferieren Sie das komplette Eluat 60 ul DNA L sung mit einer 10 100 ul Referenzpipette in eine 96 Well Platte und verschlie en Sie die Platte mit einer Klebefolie Zum Verschlei en verwenden Sie einen Applikator f r das Aufkleben von Klebefolien e F r die bisDNA Platte wird folgende Plattenbelegung empfohlen Tabelle 4 Tabelle 4 Empfohlene Plattenbelegung f r die bisDNA Platte 112 3 14 Is 6 17 18 9 T1o m In ES ESS EZ BE HE DE EEE EEE y sde Eu ED EEE ejs js HE HE DE EEE y IE EZ fso f EEE T CESEN DESCO efs ssf 0 J l T S l EEE afs sa 0 0 0 0 T l l T Epi proColon Positive Control Epi proColon Negative Control S1 S14 Patientenproben 9 2 14 Lagerung der bisulfit konvertierten DNA Sollte die bisulfit konvertierte DNA bisDNA nicht unmittelbar verwendet werde k nnen Sie die DNA bei 2 bis 8 C f r bis zu 24 Stunden oder bei 25 bis 15 C f r bis zu 72 Stunden lagern 9 3 Vorbereitung der PCR Hinweis Jede bisDNA Patientenprobe oder Epi proColon Positive Control oder Epi proColon Negative Control muss als Triplikat untersucht werden Hinweis Zentrifugieren Sie die Epi proColon Polymerase vor ihrer Verwendung f r 10 20 sec bei 1 000 150 rcf mit einer Tischzentrifuge um Tropfen vom Deckel zu entfernen 9 3 1 Herstellung des PCR Master Mixes e je nach Anzahl von Patientenproben und Kontrollproben m ssen 1 oder 2 Epi proColon PCR Mix R hrchen aufgetau
18. CP lt 33 1 Septin9 Negativ kein CP bestimmt CP lt 33 1 Invalide jedes Ergebnis CP gt 33 1 Crossing Point Schwellenwertzyklus Seite 23 von 31 12 Analyse mit dem Roche LightCycler 480 Instrument Il 12 1 Herstellung der PCR Platte LightCycler 480 Instrument II Pipettieren Sie die PCR Platte entsprechend der empfohlenen Plattenbelegung sieh Tabelle 6 berf hren Sie 15 ul PCR Master Mix in die entsprechenden Positionen der LightCycler 480 Multiwell Plate 96 Reaktionsplatte Zentrifugieren Sie die bisDNA Platte aus Abschnitt 9 2 13 f r 1 min bei 1 000 100 rcf mit einer Plattenzentrifuge F gen Sie 15 ul der bisDNA L sung in die entsprechenden Positionen der PCR Platte Verschlie en Sie die PCR Platte mit einer LightCycler 480 optischen Abdeckfolie Zentrifugieren Sie die PCR Platte f r 1 min bei 1 000 100 rcf mit einer Plattenzentrifuge Hinweis Die beladene PCR Platte kann bis zu 4 h bei 2 bis 8 C im K hlschrank aufbewahrt werden 12 2 Laden der PCR Platte LightCycler 480 Instrument II Hinweis Wir empfehlen eine Templat Datei ixo mit den angegebenen PCR Bedingungen abzuspeichern Starten Sie die 1 5 x Software Erstellen Sie ein neues Experiment indem Sie auf New Experiment klicken Laden Sie die entsprechende Templat Datei oder erstellen Sie eine neue Datei entsprechend der Angaben zum PCR Programm in Tabelle 13 ffnen Sie die Ladeklappe Stellen Sie die PCR Plat
19. Cycle Range setzen Stellen Sie die Hintergrundkompensation im Noise Band Fenster auf Noise Band Fluoresc und setzen Sie den Grenzwert auf 1 6 Stellen Sie im Analysis Fenster den Threshold Manual Grenzwert auf 1 6 Stellen Sie im Analysis Fenster die Anzahl der Fit Points auf 2 ein Dr cken Sie auf Calculate Der Septin9 Crossing Point CP wird f r jede Probe automatisch berechnet und in der Ergebnistabelle angezeigt Exportieren Sie die CP Werte durch Anklicken der Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste W hlen Sie Export aus Speichern sie den Datensatz unter einem spezifischen f r Sie zweckm igen Namen W hlen Sie Filter Comb 523 568 aus Setzen Sie First Cycle auf 1 und Last Cycle auf 50 Legen Sie den Hintergrund nach Anklicken des blauen Background Knopfes auf 5 22 fest indem Sie Min Offset auf 4 und Max Offset auf 21 im Fenster Cycle Range setzen Stellen Sie die Hintergrundskompensation im Noise Band Fenster auf Noise Band Fluoresc und setzen Sie den Grenzwert auf 0 8 Stellen Sie im Analysis Fenster den Threshold Manual Grenzwert auf 0 8 Stellen Sie im Analysis Fenster die Anzahl der Fit Points auf 2 ein Dr cken Sie auf Calculate Die ACTB CP Werte f r jede Probe werden automatisch berechnet und in der Erg
20. Cycler 480 A Amplifikationskurven ohne signifikanten exponentiellen Anstieg sind als negativ zu werten B Passen Sie den Noise Band und den Threshold so an dass er kurz ber dem Hintergrund liegt C Passen Sie den Noise Band und den Threshold so an dass die Amplifikationskurven am Anfang der Exponentiellen Phase der PCR geschnitten werden Wenn entweder die Epi proColon Positive Control oder die Epi proColon Negative Control oder beide invalide sind k nnen die Patientenproben die zusammen mit den Kontrollen prozessiert wurden nicht bewertet werden Der Test muss f r alle Proben in solch einem Lauf wiederholt werden Tabelle 14 Validit tskriterien f r die Epi proColon Kontrollen LightCycler 480 Instrument II Ergebnis der Kontrollen Bestimmung Septin9 Ergebnis ACTB Ergebnis Valide Epi proColon PCR1 CP lt 40 5 CP lt 30 3 P PCR2 CP lt 40 5 CP lt 30 3 al PCR3 CP lt 40 5 CP lt 30 3 Valide Epi proColon PERI l CPS 37 1 PCR2 kein CP bestimmt CP 37 1 Negative Control PCR3 CP lt 37 1 Crossing Point Schwellenwertzyklus 12 5 Interpretation von Ergebnissen einzelner PCR Reaktionen LightCycler 480 Instrument II Die Interpretation einer einzelnen PCR erfolgt gem Tabelle 15 Wenn das Ergebnis der internen ACTB Kontrolle eine ausreichende DNA Menge in der Einzel PCR ausweist Wert f r Schwellenwertzyklus von ACTB siehe Tabelle 15 bestimmt das Ergebnis der Septin9 PCR das Ergebni
21. Sie sicher dass die Platte genau in den Rahmen passt Schlie en Sie die Ladeklappe Klicken Sie auf Start um die PCR zu starten Tabelle 7 Thermal Cycler Programm f r Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Datenerfassung data collection Program Parameter Denaturierung Zyklen Abk hlen PCR Phase stage Stage 1 Stage 2 Stage 3 Wiederholungen repetitions 1 45 1 Segment step 1 1 3 1 Zieltemperatur C target 94 62 93 40 Dauer mm ss hold 20 00 00 05 00 30 00 05 Auto Verl ngerung auto increment x Ey Heizrate ramp rate 40 80 zo 40 80 Stage 2 Step 2 55 5 0 35 Seite 17 von 31 Gebrauchsanleitung 2 7500 Fast System SDS Software Platei Standard Curve loj x B File view Tools Z1CFR11 Instrument Analysis Window Help l x e Ea R Setup _Instrument_y Results Y Audit Trail Y E Signatures Plate _ u E well Inspector l Wellls amp 1 H12 Sample Name use Detector Reporter aueneher Task auamity Color A nen a nm umen JOE none Unknown Passive Reference none Abbildung 1 Screenshot der SDS v1 4 Software nach Best tigung der Einstellungen im Well Inspector Window 17500 Fast System SDS Software Plate1 Standard Curve ioj x B Fie view Tools 21CFR11 Instrument Analysis Window Help 8 x DeuskrREi rd Setup Y Instrument Y Results Y Audit Trail Y E Signatures Instrument Control Estimated Time Rem
22. Transferpipette mit Graduierung nicht steril Katalog Nr 612 4520 oder gleichwertig Seite 6 von 31 Verbrauchsmaterialien und Reagenzien Empfehlungen Einmaltransferpipetten nicht steril lose 22 5 cm Carl Roth Katalog Nr EA61 1 oder gleichwertig L nge 5 mm Halsdurchmesser 5 ml Saugvolumen 96 Well Platten zur DNA Lagerung MicroAmp Fast 96 Well Reaktionsplatten 0 1 ml Applied Biosystems Life Technologies Co Katalog Nr 4346906 oder gleichwertig Klebefolien f r DNA Lagerungsplatten VWR Thermalseal PCR Sealing Film Katalog Nr 391 1254 oder Eppendorf Storage Foil selbstklebend Katalog Nr 0030 127 889 oder gleichwertig Applikator f r das Aufkleben von Klebefolien MicroAmp Adhesive Film Applicator Applied Biosystems Katalog Nr 4333183 Wiederverschlie bare Plastikt ten 10 x 15 cm f r Carl Roth Katalog Nr P279 2 oder gleichwertig das Entsorgen von benutzen PCR Platten Kryor hrchen 5 ml selbststehend VWR Katalog Nr 479 1218 oder gleichwertig Blutr hrchen BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tubes Becton Dickinson Katalog Nr 367525 oder S Monovette 9 ml K3E Sarstedt Katalog Nr 02 1066 001 oder S Monovette 8 5 ml CPDA Sarstedt Katalog Nr 01 1610 001 6 3 Ben tigte spezielle Laborger te und Verbrauchsmaterialien Die folgenden speziellen Laborger te und Verbrauchsmaterialien werden f r den Epi proColon 2 0 CE Test ben tigt und k nnen nicht durch andere ersetzt werden F
23. a Delta Rn vs Cycle ACTB Detector Color 25000 erscheint als 2 5e 004 10 422 o Detector o Line color o Manual Ct Threshold o Manual baseline Start cycle o Manual baseline End cycle e Klicken Sie auf Analyze e Klicken Sie auf Save e Septin9 Ct Werte und ACTB Ct Werte werden automatisch berechnet e W hlen Sie die Positionen aus die Sie analysieren wollen e Die Amplifikationskurven werden im Men Amplification Plot angezeigt e Die Ct Werte werden im Men Report angezeigt Hinweis Jede Amplifikationskurve sollte visuell untersucht werden Amplifikationskurven mit widerspr chlichen Datenpunkten noise peaks oder linearem Kurvenverlauf sollten als negativ bewertet werden Beispiele zeigt die Abbildung 3 Ey 5 000e 005 Himm er hH Delta Rn vs Cycle Delta Rn vs Cycle D5 p Data Delta Rn vs Cycle 7 Detector mSEPT3 Be Line Color Detector Color Data Delta Rn vs Cycle Detector msert3 Line Color Detector Color 5 000e 005 H 4 000e 005 H 4 000e 005 Analysis Settings Analysis Settings Auto Ct 3 000e 005 en 3 000e 005 H a E Manual Ct E Manual Ct 5 6 5 Threshold 50 004 Threshold 5 0e 004 amp 2000e 005 OOO Basi amp 2 000e 005 H Auto Baseline C Auto Baseline 1 000e 005 N A Ma
24. aining hh mm Stop Disconmect Status Extend Thermal Cycler Protocol Heat Sink Block Time mm ss State Thermal Profile Auto Increment Ramp Rate Stage 1 Stage 2 Add Cycle Add Hold Add Dissociation Stage Delete Help Settings Sample Volume pl a0 Run Mode Standard 7500 Data Collection Stage 2 Step 2 55 5 0 35 Ready Disconnected User anne i num 7 Abbildung 2 Screenshot der SDS v1 4 Software nach dem Erstellen des PCR Programms Seite 18 von 31 10 4 Ergebnisanalyse Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Hinweis Analysieren Sie die PCR L ufe ausschlie lich mit der SDS v1 4 Software Hinweis Unvollst ndige L ufe bzw L ufe mit angezeigten Fehlermeldungen d rfen nicht analysiert werden Der Lauf muss Fluoreszenzdaten f r 45 Zyklen enthalten e Nach Beendigung des PCR Laufs klicken Sie auf ok e Gehen Sie in das Men Results und w hlen Sie den Men punkt Amplification Plot e Definieren Sie folgende Einstellungen f r den Septin9 Detektor im Men Analysis Setting o Data Delta Rn vs Cycle Septing Detector Color 50000 erscheint als 5 0e 004 ug ser e Definieren Sie folgende Einstellungen f r den ACTB Detektor im Men Analysis Setting o Detector o Line color o Manual Ct Threshold o Manual baseline Start cycle o Manual baseline End cycle o Dat
25. aten 16 1 Analytische Sensitivit t Die analytische Sensitivit t wurde von drei Personen in jeweils vier unabh ngigen L ufen mit jeweils 2 x 7 technischen LoD Limit of Detection Proben unterschiedlicher HeLa DNA Konzentrationen untersucht Untersucht wurden LoD Proben ohne HeLa DNA 0 pg ml und gespikte LoD Proben mit einer HeLa DNA Konzentration von 6 12 18 25 35 und 50 pg ml Alle 168 Septin9 Testergebnisse mit dem Applied Biosystems 7500 Fast und der SDS v1 4 Software waren valide 133 von 144 LoD Proben mit gespikter HeLa DNA waren positiv und 24 von 24 Proben ohne HeLa DNA waren negativ Mittels logistischem Regressionsmodell ergab sich ein LoD von 14 pg ml 95 Konfidenzintervall Kl 9 pg ml 19 pg ml f r den Epi proColon 2 0 CE Test In einem analogen Experiment wurde die analytische Sensitivit t f r das LightCycler 480 Instrument bestimmt und ein vergleichbarer LoD wurde ermittelt 16 2 Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse wurde durch wiederholtes Testen von neun humanen EDTA Plasmapoolproben ermittelt Sechs der Plasmapools wurden aus gemischtem humanem EDTA Plasma von Patienten mit diagnostiziertem Darmkarzinom hergestellt Weitere drei Kontroll Pools enthielten humanes EDTA Plasma von Individuen ohne offensichtliche Krankheitssymptome Alle Plasmapools wurden in sechs Replikaten von drei Personen mit verschiedenen Chargen des Epi proColon Plasma Quick Kits M5 02 001 und des Epi
26. besteht aus einem Primerpaar das sich an zwei CpG Dinukleotid freie Regionen anlagert Ein Blocker wird zugef gt der spezifisch bisulfit konvertierte unmethylierte Sequenzen innerhalb der Region erkennt und deren Amplifikation blockiert so dass methylierte Sequenzen bevorzugt amplifiziert werden In der Reaktion wird eine methylierungsspezifische Septin9 Fluoreszenzsonde zur Detektion eingesetzt um ausschlie lich methylierte Sequenzen nachzuweisen die w hrend der PCR amplifiziert wurden Seite 3 von 31 4 Im Kit Enthaltene Reagenzien 4 1 Inhalt Tabelle 1 Inhalt des Epi proColon Plasma Quick Kits Reagenz Beh lter Volumen Epi proColon Lysis Binding Buffer 1 Flasche 125 ml Epi proColon Wash A Concentrate 1 Flasche 60 ml Epi proColon Magnetic Beads 1 Flasche 4 ml Epi proColon Wash B Concentrate 1 Flasche ml Epi proColon Elution Buffer 1 R hrchen 6 ml Epi proColon Bisulfite Solution 4 Flaschen je 1 9 ml Epi proColon Protection Buffer 1 R hrchen 1 ml Tabelle 2 Inhalt des Epi proColon Sensitive PCR Kits Reagenz Beh lter Volumen Epi proColon PCR Mix 2 R hrchen je 810 ul Epi proColon Polymerase 1 R hrchen 85 ul Tabelle 3 Inhalt des Epi proColon Control Kits Reagenz Beh lter Volumen Epi proColon Negative Control 6 R hrchen Je 3 65 ml Epi proColon Positive Control 6 R hrchen Je 3 65 ml 4 2 Warnhinweise Lagerungstemperatur 15 C bis 30 C 15 C bis 30 C 15 C bis 30 C 15 C bis 30 C 15 C bis 30 C 15 C bis 3
27. bis zu 6 Wochen bei 15 bis 30 C aufbewahrt werden 9 2 DNA Extraktion und Bisulfit Konvertierung von Patientenplasma Der Epi proColon 2 0 CE Test enth lt ausreichend Reagenzien um bis zu 32 Proben inklusive Kontrollen zu bearbeiten Eine Epi proColon Positive Control und eine Epi proColon Negative Control m ssen in jedem Lauf enthalten sein und mit analysiert werden Da der Kit 4 R hrchen mit Epi proColon Bisulfite Solution enth lt die nur einmal ge ffnet werden d rfen empfehlen wir bis zu vier unabh ngige L ufe durchzuf hren z B 4 L ufe mit jeweils 8 Proben Hinweis Ein kurzes Zentrifugieren von Reaktionsgef en im Text als anzentrifugieren bezeichnet wird bei verschiedenen Schritten im Arbeitsablauf ben tigt um Tropfen vom Deckel zu entfernen oder die Fl ssigkeit am Boden zu sammeln Daf r wird empfohlen die R hrchen 10 20 sec bei 1 000 150 rcf mit einer Tischzentrifuge zu zentrifugieren Vermeiden Sie l ngeres Zentrifugieren oder Zentrifugieren bei h herer rcf um das Verklumpen der Magnetpartikel bei bestimmten Arbeitsschritten zu vermeiden Hinweis Das Mischen der R hrchen mit dem Vortex wird bei mehreren Arbeitsschritten ben tigt um eine homogene Mischung der Fl ssigkeiten zu gew hrleisten Wir empfehlen den Vortex auf mittlere St rke einzustellen und f r 5 bis 10 Sekunden zu mischen 9 2 1 Auftauen von Plasma und Epi proColon Positive und Negative Kontrollen e Tauen Sie 30 min lang eine
28. dass die Amplifikationskurven am Anfang der Exponentiellen Phase der PCR geschnitten werden Wenn entweder die Epi proColon Positive Control oder die Epi proColon Negative Control oder beide invalide sind k nnen die Patientenproben die zusammen mit den Kontrollen prozessiert wurden nicht bewertet werden Der Test muss f r alle Proben in solch einem Lauf wiederholt werden Tabelle 11 Validit tskriterien f r die Epi proColon Kontrollen LightCycler 480 Instrument Ergebnis der Kontrollen Bestimmung Septin9 Ergebnis ACTB Ergebnis Valide Epi proColon PCRI CP lt 40 6 ep 295 PCR2 CP lt 40 6 CPF 29 5 oslive conoi PCR3 CP lt 40 6 CP lt 29 5 Valide Epi proColon PCRI CP lt 36 5 PCR2 kein CP bestimmt en 365 Negative Control PCR3 CP lt 36 5 Crossing Point Schwellenwertzyklus 11 5 Interpretation von Ergebnissen einzelner PCR Reaktionen LightCycler 480 Instrument I Die Interpretation einer einzelnen PCR erfolgt gem Tabelle 12 Wenn das Ergebnis der internen ACTB Kontrolle eine ausreichende DNA Menge in der Einzel PCR ausweist Wert f r Schwellenwertzyklus von ACTB siehe Tabelle 12 bestimmt das Ergebnis der Septin9 PCR das Ergebnis der Einzel PCR Ein ACTB Wert oberhalb des in Tabelle 12 definierten Werts kennzeichnet eine Invalide PCR Tabelle 12 Interpretation der Einzel PCR Ergebnisse LightCycler 480 Instrument Einzel PCR Ergebnis Septin9 Ergebnis ACTB Ergebnis Septin9 Positiv CP lt 50
29. ebnistabelle angezeigt Exportieren Sie die CP Werte durch Anklicken der Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste W hlen Sie Export aus Speichern sie den Datensatz unter einem spezifischen f r Sie zweckm igen Namen Hinweis Passen Sie den Noise Band und den Threshold so an dass er kurz ber dem Hintergrund liegt und dass die Amplifikationskurven am Anfang der Exponentiellen Phase der PCR geschnitten werden Amplifikationskurven ohne signifikanten exponentiellen Anstieg sind als negativ zu werten Seite 22 von 31 11 4 Validit t der Epi proColon Kontrollen LightCycler 480 Instrument I Ein Lauf ein oder mehrere Patientenproben die zusammen mit einer Epi proColon Positive Control und einer Epi proColon Negative Control prozessiert werden ist valide wenn die Kriterien aus Tabelle 11 f r ALLE DREI 3 PCR Replikate von jeder Kontrolle erf llt sind 2 AAESENHNRUERBRAZAEBADZAER OR MM A MB 50 ZDAKEEKNRT UERAZABEBLARAERUR MA ES 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 25 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 Cycles Cycles Cycles Abbildung 4 Screenshots einer Septin9 Amplifikationskurve auf einem LightCycler 480 A Amplifikationskurven ohne signifikanten exponentiellen Anstieg sind als negativ zu werten B Passen Sie den Noise Band und den Threshold so an dass er kurz ber dem Hintergrund liegt C Passen Sie den Noise Band und den Threshold so an
30. eitnehmer gegen Gef hrdung durch biologische Arbeitsstoffe bei der Arbeit oder anderen Vorschriften zur biologischen Sicherheit vorgeschrieben sind 8 _ Probenentnahme und Probenprozessierung 8 1 Blutentnahme und Blutlagerung Die Blutentnahme und Blutlagerung sollte wie folgt erfolgen e Vacutainer K EDTA 10 ml R hrchen oder S Monovette 9 mi K3E R hrchen sollen f r die Blutentnahme entsprechend der Herstellerangaben verwendet werden Das Plasma sollte sofort nach der Blutentnahme von den Blutzellbestandteilen getrennt werden Das Blut kann maximal bis zu 24 h bei 2 bis 8 C gelagert werden bevor das Plasma gewonnen wird Blutproben d rfen nicht eingefroren werden e Alternativ k nnen f r die Blutentnahme 5 Monovette 8 5 ml CPDA R hrchen entsprechend der Herstellerangaben verwendet werden Das Plasma sollte sofort nach der Blutabnahme von den Blutzellbestandteilen getrennt werden Das Blut kann in S Monovette 8 5 ml CPDA R hrchen f r maximal 48 h bei 15 bis 25 C gelagert werden Blutproben d rfen nicht eingefroren werden Seite 8 von 31 8 2 Plasmagewinnung und Plasmalagerung e Schalten Sie die Bremse Ihrer Zentrifuge aus um eine Vermischung der Zellschichten zu vermeiden e Zentrifugieren Sie das Blut im Blutr hrchen f r 12 min lang bei 1350 150 rcf Sollte die Zentrifuge Angaben in UPM Umdrehungen pro Minute haben muss der entsprechende Wert in der Umrechnungstabelle der Bedienungsanleitung des Zentrif
31. epl d Epi proColon 2 0 CE Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 Epi proColon Control Kit M5 02 003 Bitte diese Gebrauchsanleitung vor Gebrauch des Tests aufmerksam lesen und genauestens befolgen um die Zuverl ssigkeit der Testergebnisse sicher zu stellen li IFU O009DE rev 5 copyright Oktober 2014 Epigenomics AG M5 02 001 M5 02 002 M5 02 003 10829 Berlin Deutschland N Inhaltsverzeichnis 1 2 3 4 4 1 4 2 5 5 1 8 2 5 3 6 6 1 6 2 6 3 6 4 7 731 Name und Verwendungszweck nee RR 3 Zusammenfassung und Erl uterung des Testverfahrens 0000000000000000000snssssnnnnnnnnnsnnssnnnnnnnsnsnnnnnnnnn 3 Technologische Grundlagen des Testverfahrens 0000000020000000000sssssnnnnnnnnnsssssnnnnnnnsssssssnnnnnsssssnnnnnnnnn 3 Im Kit Enthaltene Reagenzien seen 4 DNA ee ee eisen een 4 WVATHNINWelse 2 renne er ae nee Mass een en ee 4 Lagerung und Stabilit t are se E AEE E EA 5 Epi proCo lon Plasma Quick Kit M5 0 2500 J as 5 Epi PrOCOlOm Sensitive PCR KE M02002 u 5 EBI BFOEOION Control KkiE EMS VZO ee ae 6 Ben tigte aber nicht mitgelieferte Instrumente Verbrauchsmaterialien und Reagenzien 6 Allgemeine baborausstattung saaan Re Reese 6 Allgemeine Verbrauchsmaterialien und Reagenzien i E R aai E E aE a E a 6 Ben tigte spezielle Laborger te und Verbrauchsmaterialien essenss
32. essesssessesseessesserssessesssrssesseessesserssessesseee 7 Gieratean orderne Ti rear usa O E E es EE E 7 Vorsichtsma nahmen courir ib 8 Vorsichtstna Hahmen im Labar sa Eee esse 8 Vorsichtsma nahmen zum Schutz vor Infektionen sssini aione aaa 8 Probenentnahme und Probenprozessierung 00 ssss00000000000008R800000 amp Erna nenennerennan nennen ns ersehen 8 Blutentnahme und Blutlager ung 2 sine een ehe ee 8 Plasmagewinnung und Plasmalagerung usss40sssnnsnnnnsonnnnnnnsnnnnnnnsennnsnnnnsnnnssnnsnnnnssensnnnnssnnnsnnnsnnnennen 9 Testverfahren za N 2 RE NEE EEE SEE IRRE IHRER siert 9 Herstellung der Arpeitsi sungena2e era 9 DNA Extraktion und Bisulfit Konvertierung von Patientenplasma u 0sss0ssssnsennnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnen 10 Vorbereitung der BER lee ee eisen es 14 Analyse mit Applied Biosystems 7500 Fast und 7500 Fast Dx PCR Instrument ssss000000000snsen0000 15 SOltWareantorder ngenn 2 22 een A N E 15 Herstellung der PCR Platte Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx 022240224002ssnnennnnnnnnennnnnnnnennnnnnnen 15 Laden der PCR Platte Applied Biosystems 7500 Fast Fast DX 0222004240 essnnnennnnnnnnennnnnnnnennnnnnnsnnnnnnnnnnn 16 Ergebnisanalyse Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx 002240 2s00nssnnnsnnnennnnnnnnennnnnnnssnnnnnensnnnnnnnnenn 19 Validit t der Epi proColon Kontrollen Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx
33. est f r den qualitativen Nachweis von methylierter Septin9 DNA aus 3 5 ml Patientenplasma basierend auf der Polymerasekettenreaktion PCR Cytosine der v2 Region des Septin9 Gens sind im Gewebe von Kolorektalkarzinomen KRK aber nicht in gesunder Darmmukosa methyliert Diese anomale Methylierung kann durch die spezifische Vervielf ltigung der DNA die aus Tumorzellen in den Blutstrom gelangt nachgewiesen werden Der erfolgreiche Nachweis von KRK DNA im Plasma mit Hilfe des Biomarkers Septin9 wurde in mehreren unabh ngigen Fall Kontroll Studien mit KRK Patienten und Kolonoskopie negativen Kontrollgruppen erbracht Der blutbasierte Epi proColon 2 0 CE Test bietet Patienten die eine Vorsorgekoloskopie vermeiden wollen eine sinnvolle nicht invasive Option zum Darmkrebs Screening 3 Technologische Grundlagen des Testverfahrens Der Epi proColon 2 0 CE Test umfasst zwei Schritte Im ersten Schritt der mit Hilfe des Epi proColon Plasma Quick Kits M5 02 001 durchgef hrt wird wird die DNA aus dem Plasma isoliert und anschlie end in einer Bisulfitreaktion konvertiert Im zweiten Schritt wird die in der Bisulfitreaktion konvertierte DNA bisDNA in einer real time Echtzeit Duplex Polymerasekettenreaktion PCR mit dem Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 analysiert Dabei werden gleichzeitig die methylierte Septin9 Ziel DNA und eine interne Kontrolle die ACTB R Aktin DNA gemessen Mit Hilfe der ACTB DNA Messung wird berpr ft ob d
34. gefrorene Epi proColon Positive Control und eine Epi proColon Negative Control bei 15 bis 30 C auf e Das gefrorene Plasma ebenfalls 30 min lang bei 15 bis 30 C auftauen e Beginnen Sie sp testens 60 min nach dem Auftauen mit der Lyse 9 2 2 Lyse Hinweis Epi proColon Lysis Binding Buffer kurz vor Gebrauch sch tteln um festzustellen ob sich ein Pr zipitat gebildet hat Sind Ablagerungen sichtbar erw rmen Sie den Epi proColon Lysis Binding Buffer im Wasserbad f r 60 min bei 37 C und schwenken Sie den Puffer vorsichtig bis sich alle Ablagerungen gel st haben Lassen Sie den Epi proColon Lysis Binding Buffer auf Raumtemperatur abk hlen bevor Sie fortfahren e Geben Sie die folgenden Reagenzien in ein beschriftetes 15 ml Zentrifugenr hrchen o 3 5 ml Plasma oder Epi proColon Positive Control oder Epi proColon Negative Control o 3 5 ml Epi proColon Lysis Binding Buffer e Schlie en Sie das R hrchen und mischen es auf dem Vortex f r 5 10 sec e Inkubieren Sie das R hrchen auf dem Labortisch f r 10 1 min bei 15 bis 30 C 9 2 3 DNA Bindung Hinweis Um eine gute DNA Ausbeute zu gew hrleisten ist es notwendig durch Mischen eine homogene Suspension der Epi proColon Magnetic Beads zu erreichen Abweichende Bead Mengen zu viel oder zu wenig k nnen zu falschen Ergebnissen f hren Um die richtige Konzentration d h homogene Suspension zu erreichen sollte die Flasche mit den Epi proColon Magnetic Beads kurz vor Seite 10 v
35. hen Sie auf das Men Setup und Plate W hlen Sie alle 96 Wells der Platte aus Gehen Sie in das Men View und ffnen Sie den Well Inspector W hlen Sie die Detektoren Septin9 und ACTB berpr fen Sie dass die passive Referenz auf none gesetzt ist siehe Abbildung 1 Klicken Sie auf Close Gehen Sie zum Men punkt Instrument um das PCR Programm wie in Tabelle 7 beschrieben zu programmieren ndern Sie die folgenden Einstellungen o Sample Volume 30 ul o Run Mode Standard 7500 Seite 16 von 31 o Data Collection Stage 2 Step 2 Erstellen Sie ein Thermal Profile mit drei Phasen stages Erstellen Sie Stage 2 mit drei Schritten steps und Stage 1 und Stage 3 mit jeweils einem Schritt step Tragen Sie die Anzahl der Wiederholungen repetitions die Zieltemperaturen target und die Wartezeiten hold entsprechend der Angaben in Tabelle 7 ein ndern Sie die Heizrate Ramp Rate wie in Tabelle 7 angegeben Stellen Sie den Wert Data Collection f r Stage 2 Step 2 auf 55 5 0 35 ein berpr fen Sie die Einstellungen f r das Thermal Cycler Protokoll mit den in Tabelle 7 angegebenen Werten siehe Abbildung 2 Speichern Sie die Templat Datei unter einem geeigneten Namen ffnen Sie die Ladeklappe Stellen Sie die PCR Platte in den Rahmen die Position Al muss sich in der oberen linken Ecke befinden und stellen
36. herzustellen Die Epi proColon Positiv Control und Negative Control m ssen innerhalb ihrer spezifizierten Validit tsbereiche liegen siehe Tabelle 8 oder Tabelle 11 oder Tabelle 14 Wenn eine Kontrolle au erhalb ihres Validit tsbereiches liegt sind die dazugeh rigen Testergebnisse invalide d rfen nicht berichtet werden und der Test muss wiederholt werden Wenn Ihre Laborqualit tsvorschriften einen h ufigeren Einsatz von Kontrollen vorschreiben folgen Sie diesen Anweisungen 14 2 Interne Kontrollen Die interne Kontrolle erm glicht den Nachweis von Bisulfit konvertierter ACTB Aktin DNA Diese gleichzeitig amplifizierte Kontrolle berpr ft die Qualit t der Probe der Probenvorbereitung sowie eine ausreichende DNA Menge der Probe Das Ergebnis der Septin9 PCR ist vom CP oder CT Wert der ACTB PCR abh ngig siehe Tabelle 9 oder Tabelle 12 oder Tabelle 15 CP oder CT Werte der ACTB PCR die au erhalb des spezifizierten Bereichs liegen f hren zu einem invaliden Einzel PCR Ergebnis Zu hohe CP oder CT Werte der ACTB PCR weisen auf sehr niedrige bisDNA Mengen oder Inhibition der PCR hin Seite 27 von 31 15 Grenzen des Verfahrens e Nur f r die in vitro Diagnostik geeignet e Dieses Produkt wurde ausschlie lich als Kombination von Epi proColon Plasma Quick Kit M5 02 001 Epi proColon Sensitive PCR Kit M5 02 002 und Epi proColon Control Kit M5 02 003 validiert Die einzelnen Komponenten d rfen nicht durch alter
37. ie Menge an Gesamt DNA ausreichend ist Der Epi proColon Control Kit M5 02 003 enth lt Kontrollen die als Positiv und Negativ Kontrolle f r jeden Lauf erforderlich sind Die Extraktion genomischer DNA aus Patientenplasma basiert auf der Bindung freizirkulierender genomischer DNA an Magnetpartikel die anschlie end durch einen Magneten vom Plasma getrennt werden Verbleibende Verunreinigungen werden durch Waschschritte von den Magnetpartikeln entfernt Bei der Elution wird die gereinigte DNA von den Magnetpartikeln im Elutionspuffer gel st Die genomische DNA im Eluat wird anschlie end mit Bisulfit behandelt Bei dieser Behandlung werden nicht methylierte Cytosine in der DNA spezifisch ver ndert Die Bisulfitreaktion ist die Methode der Wahl um die DNA Methylierung zu untersuchen Die Umwandlung basiert auf der nukleophilen Addition eines Sulfitions an ein Cytosin und einer anschlie enden Desaminierungsreaktion wobei Uracilsulfonat entsteht w hrend 5 Methylcytosin methyliertes Cytosin nicht desaminiert wird und somit unver ndert bleibt Die Blocker und Detektionssonden die in einer nachfolgenden PCR eingesetzt werden erkennen diese Basen nderungen und unterscheiden zwischen methylierten und nicht methylierten Sequenzen Mit dem Epi proColon 2 0 CE Test wird die an den CpG Positionen methylierte bisDNA Sequenz der v2 Region des Septin9 Gens und die Gesamt bisDNA einer Region des ACTB Gens nachgewiesen Der Septin9 Anteil der Duplex PCR
38. ie bisDNA Platte aus Abschnitt 9 2 13 f r 1 min bei 1 000 100 rcf mit einer Plattenzentrifuge e F gen Sie 15 ul der bisDNA L sung in die entsprechenden Positionen der PCR Platte e Verschlie en Sie die PCR Platte mit einer LightCycler 480 optischen Abdeckfolie e Zentrifugieren Sie die PCR Platte f r 1 min bei 1 000 100 rcf mit einer Plattenzentrifuge Hinweis Die beladene PCR Platte kann bis zu 4 h bei 2 bis 8 C im K hlschrank aufbewahrt werden 11 2 Laden der PCR Platte LightCycler 480 Instrument Hinweis Wir empfehlen eine Templat Datei ixo mit den angegebenen PCR Bedingungen abzuspeichern e Starten Sie die 1 5 x Software e Erstellen Sie ein neues Experiment indem Sie auf New Experiment klicken e Laden Sie die entsprechende Templat Datei oder erstellen Sie eine neue Datei entsprechend der Angaben zum PCR Programm in Tabelle 10 e ffnen Sie die Ladeklappe e Stellen Sie die PCR Platte in den Rahmen die Position Al muss sich in der oberen linken Ecke befinden und stellen Sie sicher dass die Platte genau in den Rahmen passt Schlie en Sie die Ladeklappe e Klicken Sie auf Start Run um die PCR zu beginnen Tabelle 10 Standard PCR Programm f r das LightCycler 480 Instrument on Denaturierung Zyklen Abk hlung Analyse Modus None Quantification Mode None Zyklen 1 50 1 Segment 1 1 3 1 Zieltemperatur C 94 62 93 40 Dauer hh mm ss 00 20 00 00 00 05 00 00 30 00 00 30 Heizrate C
39. l 7 W ee PCR2 Ct lt 41 1 Ct lt 29 8 Positive Control PCR3 Ct lt 41 1 Ct lt 29 8 Valide Epi proColon kein Ct bestimmt Negative Control PCR3 C Undetermined Ct lt 37 2 Cycle Threshold Schwellenwertzyklus 10 6 Interpretation von Ergebnissen einzelner PCR Reaktionen Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Die Interpretation einer einzelnen PCR erfolgt gem Tabelle 9 Wenn das Ergebnis der internen ACTB Kontrolle eine ausreichende DNA Menge in der Einzel PCR ausweist Wert f r Schwellenwertzyklus von ACTB siehe Tabelle 9 bestimmt das Ergebnis der Septin9 PCR das Ergebnis dieser Einzel PCR Ein ACTB Wert oberhalb des in Tabelle 9 definierten Werts kennzeichnet eine Invalide PCR Tabelle 9 Interpretation der Einzel PCR Ergebnisse Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Einzel PCR Ergebnis Septin9 Ergebnis ACTB Ergebnis Septin9 Positiv Ct lt 45 er 321 kein Ct bestimmt al DESEUN Undetermined CE 321 Ct gt 32 1 Invalide jedes Ergebnis oder Undetermined Cycle Threshold Schwellenwertzyklus Seite 20 von 31 11 Analyse mit dem Roche LightCycler 480 Instrument I 11 1 Herstellung der PCR Platte LightCycler 480 Instrument I e Pipettieren Sie die PCR Platte entsprechend der in Tabelle 6 empfohlenen Plattenbelegung e berf hren Sie 15 ul PCR Master Mix in die entsprechenden Positionen der LightCycler 480 Multiwell Plate 96 Reaktionsplatte e Zentrifugieren Sie d
40. lution enth lt w ssrige Ammoniumbisulfit L sung H S tze Gefahrenhinweise EUHO31 Entwickelt bei Ber hrung mit S ure giftige Gase H314 Verursacht schwere Ver tzungen der Haut und schwere Augensch den P S tze Sicherheitshinweise P264 Nach Gebrauch H nde gr ndlich waschen P271 Nur im Freien oder in gut bel fteten R umen verwenden P280 Schutzhandschuhe Schutzkleidung tragen P305 351 338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN Einige Minuten lang behutsam mit Wasser sp len Vorhandene Kontaktlinsen nach M glichkeit entfernen Weiter sp len P312 Bei Unwohlsein GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen Epi proColon Protection Buffer enth lt 6 Hydroxy 2 5 7 8 TetramethylIchroman 2 Carboxyls ure Tetrahydrofurfurylalkohol H S tze Gefahrenhinweise H319 Verursacht schwere Augenreizung P S tze Sicherheitshinweise P305 P351 P338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN Einige Minuten lang behutsam mit Wasser sp len Vorhandene Kontaktlinsen nach M glichkeit entfernen Weiter sp len GEFAHR Ei ACHTUNG x Epi proColon Wash B Concentrate Epi proColon Elution Buffer Epi proColon Magnetic Beads Epi proColon PCR Mix Epi proColon Polymerase Epi proColon Positive Control und Epi proColon Negative Control sind nicht gesundheitssch dlich 5 Lagerung und Stabilit t Alle Reagenzien des Epi proColon Plasma Quick Kits M5 02 001 des Epi proColon Sensitive PCR Kits M5 02 002 und des Epi proColon Control Kits M5 02 0
41. meiden Verhindern Sie w hrend der Extraktion das Einbringen von Nukleasen in die Proben Wir empfehlen ausschlie lich Einmal Pipetten und Einmal Spitzen zu verwenden um eine Kreuzkontamination zwischen Patientenproben zu vermeiden Dieser Test sollte nur von professionellen Laboren durchgef hrt werden die mit Methoden der DNA Extraktion und real time PCR vertraut sind Um die Kontamination durch Amplifikate vorheriger PCR L ufe zu verhindern empfehlen wir die strikte Trennung der pr PCR Arbeiten z B DNA Extraktion und Aufreinigung Ansetzen der PCR Reaktion und post PCR Arbeiten z B real time PCR Au erdem empfehlen wir PCR Platten so zu entsorgen dass keine PCR Produkte entweichen k nnen So sollten z B die PCR Platten sofort nach der PCR in einer verschlie baren Plastikt te verpackt und dann in einem daf r vorgesehenen M lleimer entsorgt werden Lagern Sie niemals benutze PCR Platten au erhalb des PCR Instruments ffnen Sie niemals benutzte PCR Platten 7 2 Vorsichtsma nahmen zum Schutz vor Infektionen Dieses Produkt enth lt keine infekti sen Substanzen oder human oder tierpathogene Erreger Humane Blut und Plasmaproben die mit diesem Test untersucht werden sollten grunds tzlich als potentiell infekti s behandelt werden und alle Vorsichtsma nahmen eingehalten werden wie sie in der Richtlinie f r mikrobiologische und biologische Sicherheit f r Laboratorien Direktive 2000 54 EC ber den Schutz der Arb
42. n Sie im Analysis Fenster den Threshold Manual Grenzwert auf 2 0 e Stellen Sie im Analysis Fenster die Anzahl der Fit Points auf 2 ein e Dr cken Sie auf Calculate Die ACTB CP Werte f r jede Probe werden automatisch berechnet und in der Ergebnistabelle angezeigt e Exportieren Sie die CP Werte durch Anklicken der Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste W hlen Sie Export aus Speichern sie den Datensatz unter einem spezifischen f r Sie zweckm igen Namen Hinweis Passen Sie den Noise Band und den Threshold so an dass er kurz ber dem Hintergrund liegt und dass die Amplifikationskurven am Anfang der Exponentiellen Phase der PCR geschnitten werden Amplifikationskurven ohne signifikanten exponentiellen Anstieg sind als negativ zu werten 12 4 Validit t der Epi proColon Kontrollen LightCycler 480 Instrument II Ein Lauf ein oder mehrere Patientenproben die zusammen mit einer Epi proColon Positive Control und einer Epi proColon Negative Control prozessiert werden ist valide wenn die Kriterien aus Tabelle 14 f r ALLE DREI 3 PCR Replikate von jeder Kontrolle erf llt sind Seite 25 von 31 Amplification Curves ae angepasster Threshold _ 1 080 pA 2 2 IEEHNRUERAZASBZBARAKROR AK A 5 2 IEEHDRUERAZAKBEDLZAER MR MA A 5 Cycles Cycles Abbildung 5 Screenshots einer Septin9 Amplifikationskurve auf einem Light
43. n Spezifit t von 97 KI 95 91 99 siehe Tabelle 17 Von den 98 Patienten mit diagnostiziertem Kolorektalkarzinom wurden 79 Proben Septin9 positiv gemessen was einer klinischen Sensitivit t von 81 entspricht KI 95 72 87 Von den 56 Patienten mit Darmkrebs im Fr hstadium wurden mit dem Epi proColon 2 0 CE Test 43 Patienten 18 Stadium 25 Stadium Il Septin9 positiv getestet 77 Die folgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen Tabelle 17 Zusammenfassung der Daten zur Leistungsf higkeit des Epi proColon 2 0 CE Tests Kontrollen Screenin Kontrollen Alle Darmkarzinom g Fall Kontroll Darmkarzinome Fr hstadien Kohorte rao 149 99 98 56 Ergebnisse Septin9 1 3 er a8 positiv Puia 148 96 19 13 negativ Positivrate 1 3 81 77 16 4 Konkordanz der beiden Real Time PCR Instrumente Die Konkordanz der Epi proColon 2 0 CE Testergebnisse erzielt mit dem LightCycler 480 Instrument und dem Applied Biosystems 7500 Fast Dx System wurde durch paralleles Testen von 48 klinischen Plasmaproben von Patienten mit histologisch best tigtem Darmkarzinom in allen Krankheitsstadien und 52 Individuen ohne bekannte Darmerkrankung untersucht In 93 93 100 der F lle wurden mit beiden Ger ten bereinstimmende Septin9 Ergebnisse erzielt 16 5 Interferenz Es wurde keine Interferenz mit den Kontrollen positiven und negativen Proben beobachtet wenn erh hte Konzentrationen folgender Substanzen zugef gt wurden
44. native DNA Extraktionsmethoden oder PCR Kits ersetzt werden e Dieses Produkt wurde f r die Analyse von Plasma entwickelt Es wurden ausschlie lich die folgenden Blutentnahmer hrchen validiert BD Vacutainer K EDTA 5 Monovette 9 ml K3E und S Monovette 8 5 ml CPDA Andere Arten von Patientenproben und andere Blutentnahmer hrchen wurden nicht validiert e Die Lagerung von Blut in 5S Monovette 8 5 ml CPDA R hrchen bei Temperaturen h her als 25 C kann zu einem falsch positiven Ergebnis f hren e Dieses Produkt darf nur von Personen mit Erfahrung und Training auf PCR Tests verwendet werden e Der Nachweis von Darmkrebs ist abh ngig von der Menge an zirkulierender Tumor DNA in der Blutprobe und kann durch die Blutentnahme die Blutlagerung den Zustand des Patienten z B Alter andere Erkrankungen und das Tumorstadium beeinflusst werden e Das Testergebnis kann nicht zur endg ltigen Best tigung von Darmkrebs verwendet werden Jedes positive Epi proColon 2 0 CE Testergebnis sollte durch eine Koloskopie oder Sigmoidoskopie best tigt werden e Positive Testergebnisse wurden bei Patienten mit den folgenden Krankheiten beobachtet chronische Gastritis sophagitis nicht rheumatoide Arthritis Lungenkrebs Brustkrebs und Prostatakrebs e Positive Testergebnisse wurden bei schwangeren Frauen beobachtet e Das Septin9 Ergebnis muss im Zusammenhang mit anderen klinischen Parametern beurteilt werden 16 Spezifische Leistungsd
45. nual Baseline 1 0008 005 I BEE DER J I Manual Baseline Start cycle fio Start cycle 110 0 000e 000 0 000e 000 Endfeycleh 22 End cycle 22 1 000e 005 e 1 000e 005 I Snalyze IAE a a TA a a Sr a agree Hel Uei ea a e UE E A E E A e A E 0332357372 E E 245 Help elp Cycle Number Cycle Number Abbildung 3 Screenshots von Septin9 Amplifikationskurven vom Applied Biosystems 7500 Fast A Beispiel f r valide Amplifikationskurven B Beispiel f r negative Kurven aufgrund widerspr chlicher Datenpunkte 1 oder linearem Kurvenverlauf 2 Seite 19 von 31 10 5 Validit t der Epi proColon Kontrollen Applied Biosystems 7500 Fast Fast Dx Ein Lauf ein oder mehrere Patientenproben die zusammen mit einer Epi proColon Positive Control und einer Epi proColon Negative Control prozessiert wurden ist valide wenn die Kriterien aus Tabelle 8 f r ALLE DREI 3 PCR Replikate von jeder Kontrolle erf llt sind Wenn entweder die Epi proColon Positive Control oder die Epi proColon Negative Control oder beide invalide sind k nnen die Patientenproben die zusammen mit den Kontrollen prozessiert wurden nicht bewertet werden Der Test muss f r alle Proben in solch einem Lauf wiederholt werden Tabelle 8 Validit tskriterien f r Epi proColon Kontrollen analysiert auf Applied Biosystems 7500 Fast 7500 Fast Dx Ergebnis der Kontrolle Bestimmung Septin9 Ergebnis ACTB Ergebnis PCR Ct lt 41 1 Ct lt 29 8 Valide E Co
46. oben im Rack vom Magneten mischen Sie auf dem Vortex und geben Sie folgendes Reagenz hinzu o 800 ul Epi proColon Wash A Buffer e Mischen Sie auf dem Vortex f r 5 10 sec Seite 12 von 31 Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz an Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder Entfernen Sie mit Hilfe einer frischen 15 cm Einmaltransferpipette so viel Fl ssigkeit wie m glich w hrend das Reaktionsgef noch immer im Magnetst nder steht Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren 9 2 10 Zweiter Waschschritt Nehmen Sie zum Waschen die Proben im Rack vom Magneten mischen Sie mit dem Vortex und geben Sie folgendes Reagenz hinzu o 800 ul Epi proColon Wash B Buffer Mischen Sie mit dem Vortex f r 5 10 sec Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz an Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2 6 min in den DynaMag 2 Magnetst nder Entfernen Sie mit Hilfe einer frischen 15 cm Einmaltransferpipette so viel Fl ssigkeit wie m glich w hrend das Reaktionsgef noch immer im Magnetst nder steht Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren 9 2 11 Dritter Waschschritt Nehmen Sie zum Waschen die Proben im Rack vom Magneten mischen Sie mit dem Vortex und geben Sie folgendes Reagenz hinzu o 400 ul Epi proColon Wash B Buffer Mischen Sie mit dem Vortex f r 5 10 sec Zentrifugieren Sie das Reaktionsgef kurz an Stellen Sie das Reaktionsgef f r 2
47. on 31 dem Pipettieren solange sorgf ltig gemischt werden bis das Sediment am Boden der Flasche vollst ndig resuspendiert ist Auch zwischen den Pipettierschritten muss immer auf eine homogene Suspension geachtet werden Geben Sie die Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge in das 15 ml Zentrifugenr hrchen o 90 ul Epi proColon Magnetic Beads frisch resuspendiert o 2 5 ml absolutes Ethanol f r die Molekularbiologie gt 99 5 Schlie en Sie das R hrchen und mischen es durch 5 6 maliges invertieren Stellen Sie das 15 ml R hrchen auf einen Rotationsmischer Inkubieren Sie das R hrchen auf dem Rotationsmischer bei Raumtemperatur f r 45 5 min bei mittlerer Geschwindigkeit ca 10 20 UPM Stellen Sie den Winkel des Rotationsmischers auf ca 35 45 ein 9 2 4 Waschen der DNA Hinweis F r den sp teren Gebrauch bei der Elution und bei der Bisulfit Konvertierung stellen Sie die Temperatur des Thermoshakers auf 80 2 C bevor Sie mit dem Waschen der DNA beginnen Stellen Sie das 15 ml Zentrifugenr hrchen f r 5 10 min in den DynaMag Y 15 Magnetst nder Gie en Sie den berstand vorsichtig ab Achten Sie darauf keine Magnetpartikel zu verlieren o Geben Sie 1 5 ml Epi proColon Wash A Buffer dazu Resuspendieren Sie die Magnetpartikel vollst ndig durch Mischen auf dem Vortex f r 5 10 sec berf hren Sie die Suspension mit den Magnetpartikeln mit Hilfe einer extra langen Einmaltransferpipette 22 5 cm in ein
48. proColon Sensitive PCR Kits M5 02 002 prozessiert In 54 von 54 Seite 28 von 31 Septin9 Bestimmungen entsprachen die Ergebnisse genau den Erwartungen Krebs Pool Septin9 positiv Kontroll Pool Septin9 negativ 16 3 Klinische Leistungsf higkeit Die klinische Leistungsf higkeit des Epi proColon 2 0 CE Tests wurde mit 149 prospektiv gesammelten Proben von Patienten aus einer Screening Population ohne entsprechende Krankheitssymptome und ohne Befund bei der Koloskopie und mit 197 Patientenproben einer Fall Kontroll Studie bestimmt Die Studie enthielt Plasmaproben von Patienten mit histologisch best tigtem Kolorektalkarzinom aller Stadien und Plasmaproben von Individuen die keinen Befund bei einer Koloskopie aufwiesen und ohne entsprechende Krankheitssymptome waren Bisulfit konvertierte DNA wurde aus Plasmaproben gewonnen Das Plasma wurde innerhalb von vier Stunden nach der Blutentnahme mit Vacutainer K EDTA Blutr hrchen Becton Dickinson gewonnen Valide Septin9 Bestimmungen wurden in 346 von 346 Proben 100 erzielt In der prospektiv gesammelten Kohorte wurde 1 Patient von 149 positiv gemessen Das entspricht einer Falsch Positiv Rate von 1 KI 95 0 4 in dieser Gruppe Daraus ergibt sich eine klinische Spezifit t von 99 KI 95 96 100 Von den 99 Individuen der Fall Kontroll Studie ohne den Hinweis auf eine Erkrankung Kontrollen wurden 96 Proben Septin9 negativ gemessen Dies entspricht einer klinische
49. s der Einzel PCR Ein ACTB Wert oberhalb des in Tabelle 15 definierten Werts kennzeichnet eine Invalide PCR Tabelle 15 Interpretation der Einzel PCR Ergebnisse LightCycler 480 Instrument Il Einzel PCR Ergebnis Septin9 Ergebnis ACTB Ergebnis Septin9 Positiv CP lt 50 CP lt 33 7 Septin9 Negativ kein CP bestimmt CPE 397 Invalide jedes Ergebnis CP gt 33 7 Crossing Point Schwellenwertzyklus Seite 26 von 31 13 Beurteilung von Patientenproben Das Testergebnis f r einen Patienten wird anhand der Tabelle 16 bestimmt Der Patient ist POSITIV getestet wenn mindestens zwei der drei PCR Replikate Septin9 positiv sind Der Patient ist NEGATIV getestet wenn mindestens zwei der drei PCR Replikate Septin9 negativ sind Das Testergebnis in allen anderen F llen ist INVALIDE Tabelle 16 Interpretation des Epi proColon 2 0 CE Test Ergebnisses Positivkontrolle Negativkontrolle Einzel PCR Ergebnis Test Ergebnis POSITIV Valide Mindestens zwei positive Septin9 PCR NEGATIV Valide Mindestens zwei negative Septin9 PCR INVALIDE Valide Alle anderen F lle INVALIDE Invalide Nicht zutreffend 14 Qualit tskontrolle 14 1 Externe Kontrollen Der Epi proColon 2 0 CE Test enth lt Epi proColon Positive Control und Epi proColon Negative Control M5 02 003 Diese Kontrollen m ssen in jedem Lauf eingesetzt werden um die erfolgreiche Durchf hrung des Tests zu best tigen und die Validit t der Ergebnisse sic
50. t durchzuf hren Alle Laborger te m ssen entsprechend der Herstellerangaben installiert kalibriert gehandhabt und gewartet werden Ben tigte Ausstattung Rack f r 15 ml Zentrifugenr hrchen und 2 ml Reaktionsgef e Rotationsmischer Vortex Thermoshaker f r 2 ml Reaktionsgef e Referenzpipette mit ver nderbarem Volumen in folgenden Bereichen 10 100 ul 100 1000 ul Repeat Pipettor f r die wiederholte Abgabe von ver nderbaren Volumina Tischzentrifuge mit einem Rotor f r 1 5 2 0 ml Reaktionsgef e Mehrkanalpipette Plattenzentrifuge f r PCR Platten 100 ml Messzylinder oder 50 ml serologische Pipette Empfehlungen VWR International Katalog Nr 211 0200 oder gleichwertig VWR International Katalog Nr 445 2102 Carl Roth GmbH Co KG Katalog Nr Y549 1 oder gleichwertig VWR International Katalog Nr 444 1372 oder gleichwertig ThermoMixer C Eppendorf Katalog Nr 5382 000 015 mit 2ml Trockenheizblock Eppendorf Katalog Nr 5362 000 035 oder gleichwertig Eppendorf Reference Pipette mit ver nderbarem Volumen Eppendorf Katalog Nr 4910 000 042 und 4910 000 069 oder gleichwertig Eppendorf Multipette M4 Eppendorf Katalog Nr 4982 000 012 oder HandyStep electronic Brand Katalog Nr 705000 705001 oder gleichwertig Centrifuge 5418 Eppendorf Katalog Nr 5418 000 017 mit Rotor F 45 30 11 Eppendorf Katalog Nr 5490 015 002 oder gleichwertig Eppendorf Research plus 8 Kanal
51. t werden siehe Tabelle 5 e Mischen Sie das die Epi proColon PCR Mix R hrchen f r 5 10 sec auf dem Vortex und zentrifugieren Sie die R hrchen anschlie end kurz an e berf hren Sie das entsprechende Volumen des Epi proColon PCR Mixes und der Epi proColon Polymerase wie in Tabelle 5 angegeben in ein 2 0 ml Reaktionsgef e Mischen Sie den PCR Master Mix mit dem Vortex f r 5 10 sec e Zentrifugieren Sie den PCR Master Mix kurz an um Tropfen vom Deckel zu entfernen Hinweis Verwenden Sie den PCR Master Mix unmittelbar nach der Herstellung und lagern Sie diesen nicht Nicht verwendete Epi proColon Polymerase und Epi proColon PCR Mix ist sofort nach der Benutzung wieder einzufrieren Hinweis F r einen einzelnen PCR Ansatz ben tigen Sie 16 0 ul Epi proColon PCR Mix und 0 8 ul Epi proColon Polymerase In diesem Volumen ist bereits eine ausreichende Pipettiertoleranz ber cksichtigt Zur Herstellung des PCR Master Mixes muss deshalb kein zus tzliches Volumen einkalkuliert werden Seite 14 von 31 Tabelle 5 Herstellung des PCR Master Mixes mit entsprechender Pipettiertoleranz Ben tigtes Ben tigtes Ben tigtes Ben tigtes Komponente Volumen f r Volumen f r Volumen f r Volume f r 8 16 24 32 Bestimmungen Bestimmungen Bestimmungen Bestimmungen 24 PCRs 48 PCRs 72 PCRs 96 PCRs Epi proColon PCR Mix Epi proColon Polymerase Epi proColon Positive Control Epi proColon Negative Control S1 S14 Patientenproben
52. te in den Rahmen die Position Al muss sich in der oberen linken Ecke befinden und stellen Sie sicher dass die Platte genau in den Rahmen passt Schlie en Sie die Ladeklappe Klicken Sie auf Start Run um die PCR zu beginnen Tabelle 13 Standard PCR Programm f r das LightCycler 480 Instrument Il Programm ER Denaturierung Zyklen Abk hlung Analyse Modus None Quantification Mode None Zyklen 1 50 1 Segment 1 1 2 3 1 Zieltemperatur C 94 62 56 93 40 Dauer hh mm ss 00 20 00 00 00 05 00 00 35 00 00 30 00 00 30 Heizrate C s 1 0 1 3 1 3 1 3 1 3 Detektionsmodus keine keine einmalig keine keine LightCycler 480 Instrument Il W hlen Sie das Detektionsformat Dual Color Hydrolysis Probe UPL Probe aktivieren Sie die Filterkombination 465 510 nm und 533 580 nm und setzten Sie das Reaction Volume auf 30 12 3 Ergebnisanalyse LightCycler 480 Instrument II Hinweis F hren Sie die Datenanalyse ausschlie lich auf belegten Well Positionen durch indem Sie ein entsprechendes 4 sample sub set wie im Benutzerhandbuch des LightCycler 480 Instruments Il beschrieben definieren Klicken Sie auf Analysis in der LightCycler 480 Basic Software um das Analysis Overview Fenster zu ffnen W hlen Sie Abs Quant Fit Points f r alle Proben aus Aktivieren Sie die Filterkombination Filter Comb 465 510 Seite 24 von 31 e Setzen Sie den ersten Zyklus First C
53. ugenherstellers nachgeschlagen werden e Nehmen Sie das Blutr hrchen aus der Zentrifuge e Benutzen Sie eine frische Einmaltransferpipette 15 cm um das Plasma aus dem Blutr hrchen in ein 15 ml Zentrifugenr hrchen PP mit konischem Boden zu berf hren e Zentrifugieren Sie das Plasma in dem 15 ml Zentrifugenr hrchen 12 min bei 1350 150 rcf e berf hren Sie mit Hilfe einer frischen extra langen Einmaltransferpipette 22 5 cm oder serologische Pipette 3 5 ml Plasma aus dem 15 mi Zentrifugenr hrchen in ein beschriftetes Kryor hrchen oder Zentrifugenr hrchen e Das Plasma kann bis zu 4 Wochen bei 15 bis 25 C gelagert werden e Plasmaproben die aus Vacutainer K EDTA Blut gewonnen wurden k nnen auch bei 2 bis 8 C bis zu 18 h gelagert werden Hinweis Achten Sie darauf dass die Schicht des Buffy Coats Leukozytenfilm nach dem ersten Zentrifugationsschritt oberhalb der roten Blutk rperchen bzw nach der zweiten Zentrifugation sedimentiert auf dem Boden des R hrchens nicht zerst rt oder mittransferiert wird 9 Testverfahren Es wird empfohlen f r wiederholtes Pipettieren folgender Reagenzien einen Repeat Pipettor zu verwenden Epi proColon Lysis Binding Buffer Epi proColon Magnetic Bead Suspension Ethanol in DNA Bindungsschritt 9 2 3 Epi proColon Wash A Buffer Epi proColon Wash B Buffer Epi proColon Elution Buffer Epi proColon Bisulfite Solution Epi proColon Protection Buffer und
54. vom verwendeten Real Time PCR Ger t ben tigt werden e Magnet Separator DynaMag 15 Magnetst nder Invitrogen Katalog Nr 123 01D e Magnet Separator DynaMag 2 Magnetst nder Invitrogen Katalog Nr 123 21D 6 4 Ger teanforderungen Die Installation Kalibrierung Funktionsqualifizierung und Wartung des Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real Time PCR Instrumentes des Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR Instrumentes oder Seite 7 von 31 des Roche LightCycler 480 Real Time PCR Instrumentes I oder II muss entsprechend der Herstellerangaben durchgef hrt werden Hinweis Eine monatliche Hintergrundkalibrierung wie in der Gebrauchsanleitung des Herstellers f r das Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real Time PCR und das Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR Instrument beschrieben ist erforderlich Eine halbj hrliche Wartung wie in der Gebrauchsanleitung des Herstellers f r das Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real Time PCR Instrument und f r das Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR Instrument beschrieben ist erforderlich Diese Wartung muss die Kalibrierung der Farbstoffe FAM JOE TAMRA einschlie en 7 Vorsichtsma nahmen 7 1 Vorsichtsma nahmen im Labor Die Einhaltung der Regeln zur Guten Laborpraxis Good Laboratory Practices GLP ist erforderlich um w hrend und nach der DNA Extraktion Bisulfitbehandlung und Reinigung das Risiko einer Kreuzkontamination von Patientenproben zu ver
55. ycle auf 1 und den letzten Zyklus Last Cycle auf 50 e Stellen Sie den Hintergrund auf 5 22 klicken Sie auf den blauen background Knopf indem Sie Min Offset auf 4 und Max Offset auf 21 im Fenster Cycle Range setzen e Stellen Sie die Hintergrundkompensation im Noise Band Fenster auf Noise Band Fluoresc und setzen Sie den Grenzwert auf 2 0 e Stellen Sie im Analysis Fenster den Threshold Manual Grenzwert auf 2 0 e Stellen Sie im Analysis Fenster die Anzahl der Fit Points auf 2 ein e Dr cken Sie auf Calculate Der Septin9 Crossing Point CP wird f r jede Probe automatisch berechnet und in der Ergebnistabelle angezeigt e Exportieren Sie die CP Werte durch Anklicken der Ergebnistabelle mit der rechten Maustaste W hlen Sie Export aus Speichern sie den Datensatz unter einem spezifischen f r Sie zweckm igen Namen e W hlen Sie Filter Comb 533 580 aus e Setzen Sie First Cycle auf 1 und Last Cycle auf 50 e Legen Sie den Hintergrund nach Anklicken des blauen Background Knopfes auf 5 22 fest indem Sie Min Offset auf 4 und Max Offset auf 21 im Fenster Cycle Range setzen e Stellen Sie die Hintergrundkompensation im Noise Band Fenster auf Noise Band Fluoresc und setzen Sie den Grenzwert auf 2 0 e Stelle
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