Home

Dokument - Publikationsserver UB Marburg

1. RT Ansatz RNA 4ul Primer Unil2 20 uM 2 ul RNase Inhibitor 1 5 ul dNTP Mix 25 mM Nucleotid 2 ul 10x Omniscript RT Puffer 2 ul Omniscript RT 2 5U ul lul H20 RNase frei 75ul Gesamtmenge 20 ul Cycler Programm Elongation 37C 60 min Inaktivierung 93 C 3 min 3 7 2 Polymerasekettenreaktion PCR mit Plasmid abh ngigen Primern Bei der Polymerasekettenreaktion polymerase chain reaction PCR handelt es sich um eine Methode zur Amplifizierung von DNA Sequenzen SAIKI et al 1988 Das Prinzip beruht auf der Denaturierung der Template DNA wodurch es zur Trennung der beiden DNA Str nge kommt Im folgenden Annealing Schritt hybridisieren Primer an die Einzelstrang DNA Bereiche und es erfolgt im Elongationsschritt die Synthese des zwischen den Primern liegenden DNA Bereichs durch eine DNA abh ngige DNA Polymerase Durch mehrmaliges Durchlaufen dieses Zyklus wird das DNA Fragment exponentiell vervielf ltigt Die DNA Synthese wurde in dieser PCR von der hitzestabilen Ultra Pfu DNA Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Pyrococcus furiosus katalysiert Sie hat neben der 5 3 Polymerisationsaktivit t eine verbesserte 3 5 Exonuclease Aktivit die eine Korrekturaktivit t proofreading erlaubt Ein Standard PCR Ansatz ist im Folgenden dargestellt 32 Methoden Template DNA cDNA 100 ng variabel Fo Primer 20 uM 2 ul Re Primer 20 uM 2 ul
2. B Wachstum der Glykosylierungsmutanten auf H hnerfibroblasten 1 E 07 1 E 06 1 E 05 6 1 E 04 1 E 03 1 E 02 1 E 01 G0 pfu ml 4 G2 1 E 00 h p i C Wachstum der Glykosylierungsmutanten auf Putenfibroblasten 1 E 06 1 E 05 4 _ 1 E 04 G0 4 E 03 4 E402 ul 1 E 01 1 E 00 02 Ergebnisse Abb 4 4 Wachstum der Glykosylierungsmutanten GO G1 und G2 in Puten A Hiihner B und Entenzellen C Die Embryofibroblasten wurden mit einer MOI von 4x10 infiziert Der berstand der infizierten Zellen wurde 16h 24h 48h und 72 h p i auf die vorhandeneVirusmenge berpr ft 4 4 2 Gewebstropismus in verschiedenen avi ren Embryonen Die mit GO Gl und G2 Virus infizierten Embryonen der Art Gallus gallus Haushuhn Meleagris gallopavo Truthahn Pute und Anas platyrhynchos Stockente wurden zur Untersuchung des Gewebstropismus sagital in 20um d nne Scheiben geschnitten um anschlie end mittels in situ Hybridisierung Abb 4 5 Huhn G0 G2 und immun histochemischer Nachweismethoden Abb 4 5 Ente und Pute GO G2 siehe Kap 3 17 20 63 Ergebnisse Bereiche zu detektieren in denen Virusreplikation stattfindet W hrend bei der Methode der in situ Hybridisierung die virale RNA in infizierten Zellen detektiert wird k nnen durch immunhistochemische Anf rbung virale Proteine in infiz
3. 1 9 Pathogenese der avi ren Influenza Avi re Influenza A Viren werden aufgrund ihrer F higkeit schwere und nichtschwere Erkrankungen in domestiziertem Gefl gel hervorrufen zu k nnen in zwei Gruppen eingeteilt Die erste Gruppe bilden die hochpathogenen avi ren Influenzaviren HPAI Viren die sich bisher auf die Subtypen H5 und H7 begrenzen HPAI Viren verursachen eine systemische Infektion mit hohem Fieber demen und H morrhagien die in der Regel t dlich verl uft Rott 1992 Die Viren der zweiten Gruppe verursachen wesentlich milder verlaufende Erkrankungen Die Infektion ist auf die Epithelien des Gastrointestinal und Respirationstrakts beschr nkt Sie rufen milde Symptome hervor die sich oft nur in verminderter Eiproduktion u ern Capua und Alexander 2002 Hierbei spricht man von niedrig pathogenen avi ren Influenzaviren LPAI Viren 1 10 Das Hamugglutinin als Pathogenit tsdeterminante Jedes einzelne virale Protein tr gt durch vielf ltige Funktionen und Interaktionen zu einer effektiven Virusvermehrung bei Die Frage welche viralen Faktoren die Pathogenit t Virulenz und das Wirtsspektrum von Influenza A Viren determinieren ist daher noch nicht vollst ndig gekl rt Die Hauptpathogenit tsdeterminante scheint jedoch zumindest im avi ren Wirt das H magglutinin HA zu sein Die Aktivierungsspaltung des HAs ist f r die Infektiosit t des Virions essentiell Klenk et al 1975 W hrend der Endozytose des V
4. Bei allen Kits wird die Probe zuerst lysiert und RNasen inaktiviert Die RNA wird an eine Membran gebunden Kontaminationen durch mehrere Waschschritte entfernt und die RNA in RNase freiem Puffer eluiert Die Isolierung wurde entsprechend der Herstellerangaben durchgef hrt 3 7 Klonierung mittels BD In Fusion m Dry Down PCR Cloning Kit Das BD In Fusion Dry Down PCR Cloning Kit erm glicht es PCR Produkte in jedes Plasmid Vektor zu klonieren ohne dass daf r Restriktionsenzyme Ligasen oder Dephosphorylierungen notwendig sind Die einzige Voraussetzung ist die Verwendung von Primern in der PCR die 15 Basen homolog zu den Enden des verwendeten Vektors sind Das BD In Fusion Enzym erzeugt einzelstr ngige Regionen in den homologen Bereichen und fusioniert anschlie end das PCR Produkt in den Vektor Die Klonierung wurde entsprechend der Herstellerangaben durchgef hrt 3 7 1 Reverse Transkription Mittels einer RNA abh ngigen DNA Polymerase Reverse Transkriptase RT wird die einzelstr ngige RNA mit Hilfe eines Primers in einzelstr ngige DNA cDNA umgeschrieben Verwendet wurde die Omniscript RT von Qiagen Der verwendete Uni 12 Primer erlaubt die Herstellung der cDNA aller Influenza spezifischen Genomsegmente in einem Ansatz Der 31 Methoden Ansatz wurde nach dem anschlie enden Schema erstellt und mittels eines PCR Cyclers Primus 96 advanced PEQLAB nach dem entsprechenden Cycler Programm durchgef hrt
5. Zudem stellt dieser Effekt gen gend RNAs mit Cap Strukturen im Zellkern f r die virale mRNA Synthese bereit Der Export viraler mRNAs wird durch das NS1 Protein nicht inhibiert da die Poly A Enden der viralen mRNAs durch den viralen Polymerasekomplex synthetisiert werden Apoptose ist ein weiterer wichtiger Bestandteil der zellul ren antiviralen Immunantwort Eine Influenzainfektion Kann hierbei in zwei Phasen unterteilt werden Die erste Phase ist die antiapoptotische Phase die NS1 durch Aktivierung des PI3K Akt Weges herbeif hrt und die eine effektive Virussynthese gew hrleistet Zhirnov und Klenk 2007 Die zweite proapoptotische Phase findet gr tenteils nach der Virusproduktion statt und wird induziert durch das zellul re Protein p53 und das virale Protein PB1 F2 siehe 1 13 1 13 Weitere Pathogenit tsfaktoren Die Neuraminidase ist neben dem HA und dem NSI ein weiterer bedeutsamer Pathogenit tsfaktor Beim bergang eines avi ren Influenza A Virus von Wildv geln auf domestiziertes Gefl gel kommt es in den meisten F llen zu einer Deletion des NA Stielbereiches wodurch die Enzymaktivit t abnimmt F r HSN1 Isolate aus H hnern konnte gezeigt werden dass dadurch ein Gleichgewicht zwischen H magglutinin Bindung und Neuraminidase Aktivit t wiederhergestellt wird das durch verringerte Rezeptor Bindef higkeit des HAs im neuen Wirt gest rt war Matrosovich et al 1999 Zudem wurde gezeigt dass die Neuraminidase des m
6. p 125 36 92 Mori Y et al Nuclear localization of Japanese encephalitis virus core protein enhances viral replication J Virol 2005 79 6 p 3448 58 98 Literatur 93 Muramoto Y T Noda and Y Kawaoka Selective packaging mechanism for influenza A virus Tanpakushitsu Kakusan Koso 2006 51 11 p 1596 601 94 Nemeroff M E et al Influenza virus NSI protein interacts with the cellular 30 kDa subunit of CPSF and inhibits 3 end formation of cellular pre mRNAs Mol Cell 1998 1 7 p 991 1000 95 Nemeroff M E X Y Qian and R M Krug The influenza virus NS protein forms multimers in vitro and in vivo Virology 1995 212 2 p 422 8 96 Neumann G et al Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs Proc Natl Acad Sci US A 1999 96 16 p 9345 50 97 Noah D L K Y Twu and R M Krug Cellular antiviral responses against influenza A virus are countered at the posttranscriptional level by the viral NSIA protein via its binding to a cellular protein required for the 3 end processing of cellular pre mRNAS Virology 2003 307 2 p 386 95 98 Obenauer J C et al Large scale sequence analysis of avian influenza isolates Science 2006 311 5767 p 1576 80 99 Ohuchi M et al Regulation of receptor binding affinity of influenza virus hemagglutinin by its carbohydrate moiety J Virol 1997 71 11 p 8377 84 100 Okuwaki M et al Identification of nucleophosmin B2
7. 20 0 0 GO G1 G2 GO G1 G2 gebundene Viren gel ste Viren Abb 4 11 Freisetzung der Viren GO G1 und G2 von infizierten H hner A und Putenembryofibroblastenzellen B Die Zellen wurden mit einer MOI von 3 infiziert 24h p i wurden Zellen und Zell berstand zur Freisetzung gebundener Viruspartikel getrennt voneinander mit Ultraschall behandelt Das Verh ltnis gel ster infekti ser Virionen im Zell berstand und den an Zellen gebundenen Viruspartikeln wurde mittels Plaquetest bestimmt Um festzustellen ob die in Kap 4 4 2 nachgewiesene verringerte Ausbreitung der G2 und insbesondere der GO Viren in avi ren Embryonen durch eine Ver nderung der 73 Ergebnisse Virusfreisetzung zu erkl ren ist wurden H hner Abb 4 11 A und Entenembryofibroblasten Abb 4 11 B mit den entsprechenden Virusmutanten infiziert und 24h p i auf die Menge freier und gebundener infekti ser Partikel berpr ft siehe Kap 3 25 Hier konnte beobachtet werden Abb 4 11 A B dass sich das Gl Virus am effizientesten von Zellen beider Spezies l sen kann 98 4 bzw 96 8 w hrend nur 1 4 bzw 3 2 der Viren an den Zellen haften bleibt Dahingegen kommt es bei der GO Mutante zu einer deutlich geringeren Freisetzung von nur 68 5 bzw 66 der neu gebildeten Viruspartikel Mehr als 30 der Viren bleiben an der bereits infizierten Zelle gebunden und k nnen dementsprechend keine neuen Zellen infizieren 8 2 bzw 21 8 der G2 M
8. ber die Allantoish hle infiziert Anschlie end wurden die Eier alle 12h auf abgestorbene Embryonen untersucht Die MDT dr ckt den mittleren Todeszeitpunkt der infizierten Embryonen aus 4 5 3 Infektiosit t der NS 1 Virusmutanten Zur Bestimmung der EID50 Infektionsdosis die notwendig ist um die H lfte der inokulierterten Hiihnereier zu infizieren wurden Eier mit verschiedenen Verdiinnungsstufen der Virusmutanten infiziert siehe Kap 3 21 Wie aus Abbildung 4 15 hervorgeht ben tigt das rekombinante Virus 984 LP LP eine Infektionsdosis von etwa 6 6 pfu zur Infektion der H lfte der Eier 984 HP LP und 984 LP HP ben tigen Infektionsdosen von 1 2 bzw 1 4 pfu Das rekombinante Wildtypvirus 984 wt weist mit ca 0 5 pfu deutlich die geringste EIDso auf Eine EIDso von weniger als 1 pfu kann auftreten da die Viren zuvor auf MDCK Zellen getitert wurden und sich die meisten Influenzaviren hoch effizient in diesen Zellen vermehren 76 Ergebnisse 533 _ 954 LPLP 984HP LP 984 LP HP 984 wt 2 amp a 3 a 2 ir g E Abb 4 15 11 Tage alte H hnerembryonen wurden mit den verschiedenen NS1 Mutanten in 10er Verd nnungsschritten beimpft 48h p i wurde die Allantoisfl ssigkeit der Eier mittels HA Test auf Viruswachstum untersucht Die EIDso beschreibt die Virusdosis bei der genau die H lfte der inokulierten Embryos infiziert wird 4 5 4 Intrazellul re Lokalisation der NS1 Mutanten Das NS1 Protein der niedrig
9. die durch die Radioaktivit t bestrahlt wurden klar geworden Die bestrahlten Stellen bleiben als schwarze Granula auf der entwickelten Photoemulsion sichtbar 3 18 H matoxylin Eosin HE F rbung In HE gef rbten Pr paraten zeigen sich in der Mikroskopie durch H matoxylin gef rbte basophile Zellkerne und eosinophiles Zytoplasma Die Erythrozyten erscheinen orange und das brige Gewebe ist rot bis violett abgestuft Die Schnitte werden vor Beginn der HE F rbung f r 1 Stunde gew ssert danach 30 60 Sekunden in saures H matoxylin getaucht und anschlie end w hrend 10 min tiger W sserung zur Intensivierung und Fixierung der F rbung gebl ut Die F rbung mit Eosin erfolgt f r 15 30 Sekunden bevor die Objekttr ger dehydriert werden Hierf r werden sie jeweils kurz in 70 80 90 96 Ethanol und zweimal f r 3 Minuten in 100 Ethanol getaucht Die Dehydrierung ist mit zwei f nfmin tigen Schritten in Xylol abgeschlossen Nachdem sich das L sungsmittel verfl chtigt hat werden die Schnitte zur Konservierung mit Entellan eingedeckelt 3 19 Immunhistochemische Odyssey Anf rbung von Schnitten Durch diese Methode lassen sich Proteine in Zellen und Geweben spezifisch darstellen Die eingefrorenen Schnitte der Embryonen wurden dazu an der Luft getrocknet und anschlie end in einer Methanol Aceton 1 1 20 C f r 15min fixiert Die Schnitte wurden dreimal 10min mit PBSaer gewaschen und anschlie end f r eine Stunde mit
10. im Nasopharynxbereich und breiten sich ber die Trachea bis in die Bronchien und Bronchiolen aus Bei einer symptomatischen Infektion kommt es nach einer Inkubationszeit von normalerweise vier bis f nf Tagen zu ersten Krankheitserscheinungen wie Kopfschmerzen Husten Schnupfen K ltegef hl und Sch ttelfrost Hohes rasch ansteigendes Fieber bis 41 C Muskelschmerzen Appetitlosigkeit und allgemeines Krankheitsgef hl folgen Ab dem dritten Tag geht das Fieber zur ck Bei lteren oder immunsupprimierten Patienten tritt als h ufigste Komplikation eine prim r virale interstitielle Lungenentz ndung auf die innerhalb weniger Tage zum Tod f hren kann Ein h ufig auftretendes Problem stellt eine durch bakterielle Superinfektion hervorgerufene sekund re Lungenentz ndung dar die unter anderem durch Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus und Hemophilus influenzae verursacht werden kann Tashiro et al 1987 Ein Grund daf r ist die synergistische F higkeit einiger bakterieller Proteasen bestimmte virale H magglutinine zu spalten 1 8 Avi re Influenza Wildlebende Wasserv gel sind die nat rlichen Wirte und somit das Reservoir der Influenza A Viren Eine Influenzainfektion innerhalb dieser Spezies f hrt meist nicht zu einer symptomatischen Erkrankung Die Virusreplikation in V geln findet meist im Einleitung Gastrointestinaltrakt statt Die Ausscheidung der synthetisierten Viren verl uft ber den f kalen Weg
11. und des Japanese Encephalitis Virus spielt in der viralen Replikation und Pathogenese in S ugerzellen eine wichtige Rolle Mori et al 2005 Wang et al 2002 Westaway et al 1997 Durch direkte Interaktion mit Proteinen wie Nukleolin und B23 k nnen beispielsweise Adenoviren eine Steigerung der viralen Replikation bewirken Matthews et al 2001 Okuwaki et al 2001 Abgesehen von der Wiederherstellung des NoLS f hrt die Trunkierung des C Terminus des NS1 zum Wegfall bzw zur Ver nderung weiterer f r diesen Teil des Proteins beschriebener Funktionen Chen et al 1999 konnte nachweisen dass sich zwischen Position 223 und 237 des NS1 Proteins eine PABII Binde Dom ne befindet Diese wurde durch die bei den HPAI Viren aufgetretene Deletion fast vollst ndig zerst rt war jedoch bereits bei dem NS1 der LPAI Viren mit 230 Aminos uren nur verk rzt vorzufinden Die HPAI Viren mit verk rztem NS1 Protein replizierten jedoch besser in H hnerzellen siehe Kap 4 5 1 und infizierten embryonierte H hnereier besser als die Virusmutanten mit 230 Aminos uren langem NSI Protein und somit potentiell noch vorhandener Bindestelle Kap 4 5 3 Die Interaktion zwischen NS1 und PABI f hrt normalerweise dazu dass der Export zellul rer mRNAs aus dem Zellkern gehemmt wird Die vollst ndige Deletion dieser Dom ne des NS1 sollte 89 Diskussion eigentlich zu verringerter Virulenz f hren das Gegenteil von dem was in dieser Arbeit nachgewiesen
12. 0 1M Glycin und dann in DEPC PBS Zur Reduktion unspezifischer Bindungen der RNA Sonde an freie positiv geladene Aminogruppen von Proteinen wurden die Schnitte f r 10 Minuten in frisch angesetztem Acetylierungspuffer acetyliert Die Pr parate wurden ein weiteres Mal f r 5 Minuten in DEPC PBS gewaschen und durch kurzes Eintauchen in 50 igen und 70 igen Ethanol dehydriert An dieser Stelle k nnen die Schnitte nach Lufttrocknung bis zur weiteren Verarbeitung bei 20 C gelagert werden 3 17 3 Hybridisierung Zur Hybridisierung werden zun chst je 200 ul Pr hybridisierungspuffer auf die vorbehandelten Schnitte gegeben Diese werden mit einem Deckgl schen in einer feuchten Kammer f r 1 Stunde bei 55 C inkubiert W hrend dessen wird der Ansatz f r die Hybridisierung vorbereitet Die Sonde sollte daf r auf 5x10 cpm ul in Hybridisierungspuffer verd nnt werden Nach dem Abgie en des Pr hybridisierungspuffers werden je 50 ul der Sondenl sung mittig auf jeden Schnitt gegeben Anschlie end werden Deckgl schen blasenfrei auf die Objekttr ger gelegt und mit elastischem Montagekleber umfahren und damit verschlossen Die Inkubation erfolgt ber Nacht f r mindestens 16 Stunden Vor Beginn der Posthybridisierung wurden die Objekttr ger vorsichtig vom Montagekleber befreit und die Deckgl schen anschlie end in 2x SSC abgel st Die bersch ssigen und unspezfisch gebundenen Sonden wurden durch Waschschritte mit zunehmender Stringenz entfernt Da
13. 1 Nichtstrukturprotein 2 nukle res Exportprotein Nukleotid optische Dichte Penicillin Streptomycin Polymeraseprotein azidisch Polyacrylamidgelelektrophorese Polymeraseprotein basisch 1 Polymeraseprotein basisch 2 phosphate buffered saline polymerase chain reaction plaque forming units Pyrococcus furiosus potentia hydrogenii protein kinase R Polymerase Polyadenylierungs retinoic acid inducible gene I Ribonukleins ure Ribonukleoprotein rounds per minute Raumtemperatur Reverse Transkription Sekunden single stranded Natriumdodecylsulfat Tabelle Thermus aquaticus TRIS Bors ure EDTA Puffer N N N N Tetramethylethylendiamin Trans Golgi Netzwerk Trishydroxymethylaminomethan transformation and storage solution 105 vRNA WHO wt Aminos uren Kea dgJ ua ot ZB PAP TATJA Abk rzungsverzeichnis Unit Volt virale RNA world health organisation Wildtyp Ala Alanin Cys Cystein Asp Asparagins ure Glu Glutamins ure Phe Phenylalanin Gly Glycin His Histidin Ile Isoleucin Lys Lysin Leu Leucin Met Methionin Asn Asparagin Pro Prolin Gln Glutamin Arg Arginin Ser Serin Thr Treonin Val Valin Trp Tryptophan Tyr Tyrosin 106 9 Lebenslauf Lebenslauf Zur Person Bj rn Keiner Diplom Biologe geboren am 29 02 1976 in M nchen Berufspraxis 2004 2008 Doktorarbeit am Institut f r
14. 1984 Deom et al 1986 Ohuchi et al 1997 Diese Affinit tsverringerung basiert wahrscheinlich auf einer sterischen Behinderung der Zug nglichkeit der Rezeptorbindungstasche Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten deuten darauf hin dass die Schaffung eines zus tzlichen N Glykans in der N he der Rezeptorbindungsstelle eine bevorzugte M glichkeit f r das Virus darstellt die Bindungsaffinit t zum zellul ren Rezeptor zu reduzieren Wie in Kap 4 4 5 dargestellt f hrt dieser Effekt dazu dass die Virusfreisetzung aus infizierten Zellen verst rkt wird Ein Ausbruch wie er 1999 2000 in Norditalien stattfand beg nstigt evolution r solche Viren die sich besonders schnell in und zwischen den Wirten ausbreiten k nnen Gefl gelfarmen stellen f r das Virus eine Ansammlung von Wirten dar wie sie bei Wildv geln in freier Natur nicht vorzufinden ist Dort ist die Distanz zwischen zwei Wirten meist sehr viel gr er so dass es f r das Virus nachteilig w re schnell zu replizieren und dadurch seinen Wirt schnell zu t ten In der Massentierhaltung hingegen steht dem Virus eine gro e Menge an Wirten auf engem Raum zur Verf gung wobei Virusmutanten bevorzugt werden die m glichst schnell viele Nachkommenviren produzieren und freisetzen Langsam replizierende Viren werden hierbei berwachsen und ausselektiert Das Glykan an Position 123 Gl hat einen deutlich positiveren Effekt auf die Virusfreisetzung und vermehrung als die zus tzliche Gl
15. 9 wurden positive Klone Abb 4 1 Kontroll PCR gleicherma en auf lug ul zur Herstellung der Virusreassortanten eingestellt Abb 4 1 PCR Produkte hergestellt mit den spezifischen Klonierprimern der Influenza Gensegmente im pHW2000 Vektor Auftrennung in 1 igem Agarosegel 4 2 2 Herstellung von Reassortanten Zur Herstellung von Virusreassortanten wurden Mischkulturen wie in 3 13 beschrieben transfiziert und die generierten rekombinanten Viren nach Plaquereinigung 3 14 und Sequenzierung 3 15 im embryonierten H hnerei vermehrt und anschlie end der Virustiter 55 Ergebnisse der Allantoisfl ssigkeiten bestimmt Folgende Virusreassortanten in Tab 4 1 wurden mittels der beiden reversen Genetik Systeme f r rekombinante 984 und 1082 Viren hergestellt Tabelle 4 1 Reassortanten aus der Kombination der Gensegmente des niedrigpathogenen 1082 Virus und des hochpathogenen 984 V irus 4 2 3 Wachstum der Virusreassortanten auf avi ren Zellen Um die Pathogenit tsdeterminanten der HPAI Viren einzugrenzen wurden prim re H hnerembryofibroblasten CEF mit den hergestellten 984 1082 Virusreassortanten infiziert und zu bestimmten Zeitpunkten Proben des berstandes entnommen Die Zellen wurden mit einer MOI von 4x 10 der acht Einzelreassortanten infiziert und 16 24 48 und 72 Stunden nach der Infektion Proben abgenommen um deren Plaquetiter zu bestimmen Die erhaltenen Daten sind in Abbildung 4 2 graphisch dargest
16. Aktin mouse Anti Ziege Rhodamin Esel Anti Ziege 800 Esel Anti Maus 800 Ziege Anti Kaninchen HRP Schwein Anti Kaninchen 800 Ziege Anti KP Serum Kaninchen 2 3 Enzyme DNase I Pfu Turbo DNA Polymerase PfuUltra DNA Polymerase Proteinkinase K RNase A RNase T1 T7 RNA Polymerase TPCK Trypsin 10x Trypsin 2 5 Trypsin EDTA Taq Polymerase Restriktionsendonukleasen BsmBI CGTCTC 1 5 Sigma Deisenhofen Serva Heidelberg Acros organics USA Serva Heidelberg Sigma Deisenhofen SANTA CRUZ Santa Cruz Abcam Cambridge U K Jackson Suffolk U K Rockland U S A Rockland U S A Dako D nemark Rockland U S A Inst F Virologie Marburg Stratagene Heidelberg Stratagene Heidelberg Stratagene Heidelberg Qiagen Hilden Roche Mannheim Roche Mannheim Roche Mannheim Sigma Deisenhofen Gibco BRL Eggenstein Gibco BRL Eggenstein Qiagen Hilden NEB Frankfurt 19 Material BstUI CG CG Fermentas St Leon Rot DpnI GmA TC NEB Frankfurt Eco 311 GGTCTC 1V 5 Fermentas St Leon Rot Hind II A AGCTT Fermentas ST Leon Rot Narl GG CGCC Fermentas St Leon Ro Msel T TAA NEB Frankfurt 2 4 Plasmide pBluescript KS pUc 18 pHH21 pollSapl pHW2000 2 5 Oligonukleotide Stratagene Heidelberg Stratagene Heidelberg Labor von Y Kawaoka Madison USA J rgen Stech Erich Hoffmann Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech Ebersberg synthetisiert Klonierungsprim
17. Kaninchen wurde 1 250 in PBSaer 1 BSA verd nnt Nach dem Blocken wurden jeweils 250ul der Erst Antik rper Verd nnung auf die mit Fettstift umfahrenen Schnitte gegeben und diese bei Raumtemperatur f r 2 Stunden leicht geschwenkt Es folgten erneut drei Waschschritte mit PBSaer f r je 10 min bevor 250ul der Zweit Antik rper L sung Anti Kaninchen HRP aus Ziege in PBSaer 0 1 Tween 1 Milchpulver 1 250 verd nnt auf die Schnitte pipettiert wurden Diese wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und nach der Abnahme des Antik rpers nochmals dreimal f r 10min mit PB Saer 0 1 Tween gewaschen Um den mit Peroxidase gekoppelten Zweitantik rper unter dem Lichtmikroskop sichtbar zu machen wurden 300ul einer FAST DAB L sung von Sigma Aldrich auf die Schnitte gegeben Durch die Reaktion mit Sauerstoff lagert sich DAB 3 3 Diaminobenzidin auf dem Objekttr ger ab Dieser braune Farbstoff entsteht an den Stellen an dem die Peroxidase das H202 in H2O und Sauerstoff umwandelt Dar ber kann indirekt Virusprotein nachgewiesen werden Nach 5 30 min tiger Inkubation werden die Schnitte sorgf ltig f r 10min gew ssert und anschlie end einer HE F rbung unterzogen siehe 3 18 46 Methoden 3 21 Bestimmung der Mittleren Todeszeit MDT und der Egg Infectious Dose 50 EID5o Als Ma f r die Virulenz von Influenzaviren gibt es verschiedene Kenngr en die sich auf die Sch digung von H hnerembryonen beziehen Die MDT dr ck
18. PBSaer 1 BSA geblockt Der Erst Antik rper Anti KP Serum aus Kaninchen wurde 1 250 in PBSaer 1 BSA verd nnt Nach dem Blocken wurden jeweils 250ul der Erst Antik rper Verd nnung auf die mit Fettstift umfahrenen Schnitte gegeben und diese bei Raumtemperatur f r 2 Stunden leicht geschwenkt Es folgten erneut drei Waschschritte mit PBSaer f r je 10 min bevor 250ul der Zweit Antik rper L sung Anti Kaninchen 800nm in PBSaer 0 1 Tween 1 Milchpulver 45 Methoden 1 1000 verd nnt auf die Schnitte pipettiert wurden Diese wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur und Abdunklung inkubiert Die Schnitte wurden nach der Abnahme des Antik rpers nochmals dreimal f r 10min mit PBSaer gewaschen Auch dieser Schritt wurde abgedunkelt durchgef hrt bevor die Schnitte am Odyssey Ger t eingescannt wurden Fokus Offset 1 0mm 3 20 Immunhistochemische DAB Anf rbung Ziel dieser Methode ist es die Virusinfektion in bestimmten Zellen und unter dem Lichtmikroskop farblich darzustellen Bei dieser Methode wurden die eingefrorenen Embryoschnitte an der Luft getrocknet und anschlie end in einer Methanol Aceton 1 1 20 C f r 15min fixiert Zur Blockierung endogener Peroxidase wurden die Schnitte 15min in eine 1 ige H gt O gt L sung in PBSdef gelegt und bei Raumtemperatur inkubiert Die Schnitte wurden dreimal 10min mit PBSaer gewaschen und anschlie end f r eine Stunde mit PBSder 1 BSA geblockt Der Erst Antik rper Anti KP Serum aus
19. Plasmide des 984 Virus eingef hrt Zuerst wurde dabei ein 984 HA Plasmid ohne Glykosylierungsstelle an der Rezeptorbindetasche HA GO hergestellt Nach berpr fung des HA GO Plasmids wurde hieraus ein weiteres Konstrukt mit nur einer Glykosylierungsstelle an Aminos ureposition 149 HA G2 generiert Die Plasmide wurden 59 Ergebnisse anschlie end durch Sequenzierung auf die gew nschten Mutationen berpr ft Das Wildtyp 984 HA Plasmid besitzt ein Glykan an Position 123 und wird nachfolgend als HA G1 bezeichnet 4 3 2 Mutagenese der polV pollI NS Plasmide Die Primer f r die NS1 Mutagenese des polI NS Plasmids des 984 Virus beziehungsweise des polV pollI NS Plasmids des 1082 Virus wurden so gew hlt dass sie die Sequenz des NS2 Gens nicht beeinflussten Das 984 NS Plasmid wurde mit den Primern Ital NS IN VD fo und Ital NS IN VD re durch in vitro Mutagenese Kap 3 8 so ver ndert dass das NS1 des LP HP Plasmids das Kernexportsignal NES des LPAI Virus 1082 Position 136 V 139 D aufweist Umgekehrt wurde bei der Mutagenese des 1082 NS Plasmids vorgegangen Bei dem HP LP Plasmid wurde mit Hilfe der Primer Ital NS VD IN fo und Ital NS VD IN re das NES des HPAI Virus 984 eingef gt Position 136 I 139 N 4 3 3 Rescue der Virusmutanten Mittels reverser Genetik sollten rekombinante 984 Viren hergestellt werden die sich ausschlie lich in den mutierten Positionen von HA und NS1 unterscheiden Dazu wurden 293T Zellen mit den
20. Thermocycler Primus 96 advanced Thermomixer compact Ultraschallger t Zentrifugen Avanti J 26 XP Centrifuge 5417R Minifuge T Multifuge 3 S R Material Amersham Biosciences Braunschweig Keutz Reiskirchen PeqLab Erlangen Eppendorf Wesseling Berzdorf Bandelin Sonorex Beckman Coulter GmbH Krefeld Eppendorf Wesseling Berzdorf Heraeus Instruments Hanau Heraeus Instruments Hanau 25 Methoden 3 Methoden 3 1 Virusanzucht im embryonierten H hnerei Die meisten Influenzaviren lassen sich in elf Tage alten embryonierten H hnereiern vermehren so dass die zu entnehmende Allantoisfl ssigkeit infizierter Eier als Virus Stamml sung dienen kann Dazu wurden zun chst die zu infizierenden H hnereier durchleuchtet um festzustellen ob sich im Inneren ein Embryo befindet Im n chsten Schritt wurden die Eier mittels einer Jodl sung im Bereich der Luftblase desinfiziert und dort vorsichtig ein kleines Loch gebohrt um mit einer Spritze das Ei mit der Virussuspension zu inokulieren Den Eiern wurden jeweils 1000 pfu plaque forming units einer Virussupension in PBSaer in die Allantoish hle injiziert Dies geschieht mit einer Kan le der Gr e 0 55 x 25mm um bei vollst ndigem senkrechtem Einf hren exakt in die Allantoisfl ssigkeit zu treffen Die ffnung wurde nach Infektion mit Ponal Klebstoff verschlossen Die infizierten Eier wurden anschlie end f r mindestens 48h in den 37 C Inkubator mit 80 Luftfeuchtigkeit ges
21. f r NS1 Mutanten im 37 C Inkubator statt Anschlie end wurde das Inokulum abgenommen und die infizierten Zellen zweimal mit PBS 0 2 BSA gewaschen bevor diese mit jeweils 3ml bzw 1 25ml Plaquetest Overlay s 2 7 berschichtet wurden Nach Erkalten der Agarschicht wurden die Zellen f r weitere 3 Tage bei 37 C inkubiert Nach dieser Zeit wurden zur Fixierung und Anf rbung der Zellen je 3ml bzw 1 5ml Kristallviolettl sung siehe 2 10 in jedes Well pipettiert Kristallviolett f rbt nur lebende Zellen an die durch die Virusinfektion abgestorbenen Zellen blieben farblos Nach ca 12 Stunden wurde die F rbel sung abgesaugt und die Agarschicht wurde vorsichtig mit einem Spatel aus den Wells herausgeholt Um verbliebene Agarreste zu entfernen wurden die einzelnen Wells mit entionisiertem Wasser ausgewaschen Zuletzt wurden die 6 Well bzw 12 Well Platten bei Raumtemperatur f r 24h getrocknet und die Plaques ausgez hlt 3 5 Zellkulturmethoden In dieser Arbeit wurden CEF H hnerembryofibroblasten DEF Entenembryofibroblasten TEF Putenembryofibroblasten 293T Humane embryonale Nierenzellen und MDCK II Madin Darby canine kidney Nierentubulus des Hundes als Zellsysteme fiir die gegebenen 28 Methoden Versuche verwendet 293T und MDCK I lagen als permanente Zelllinie vor w hrend CEF DEF und TEF als prim re Zelllinie kurz vor den Versuchen isoliert oder aufgetaut wurden Als Medium f r 293T CEF DEF und TEF dient
22. glykosyliertes Oberfl chenprotein Herrler et al 1981 Bei Influenza A Viren ist in geringen Mengen das M2 Protein als weiteres integrales Protein in die H llmembran eingelagert Lamb et al 1985 welches als Homotetramer vorliegt und die Funktion eines Protonenkanals hat Sugrue amp Hay 1991 Pinto et al 1992 Analog zu dem M2 Protein besitzen die Influenza B Viren das NB Protein und Influenza C Viren das Protein CM2 die jedoch auf einem anderen Gensegment kodiert sind Brassard et al 1996 Tada et al 1998 Im Inneren des Virions befinden sich bei Influenza A und B Viren acht beim Influenza C Virus sieben unterschiedlich gro e Duesberg 1969 einzelstrangige RNA ssRNA Segmente in negativer Orientierung die ber die gesamte L nge mit den Nukleoproteinen NP komplexiert sind Mit jedem RNA Segment ist ein RNA abh ngiger RNA Einleitung Polymerasekomplex assoziiert der aus den Proteinen PB1 PB2 und PA besteht Area et al 2004 Muramoto et al 2006 Der Komplex aus Polymerasekomplex RNA und NP Proteinen wird als Ribonukleoprotein RNP bezeichnet Die RNPs interagieren mit den Matrixproteinen M1 welche die H llmembran des Virus auskleiden und stabilisieren Des Weiteren ist das nukle re Exportprotein NEP NS2 mit dem MI Protein assoziiert das im Viruspartikel in geringer Kopienzahl vorliegt Richardson amp Akkina 1991 Yasuda et al 1993 Das Nichtstrukturprotein 1 NS1 ist keine Komponente des Virions so
23. mit den bekannten Dom nen und Interaktionspartnern Des Weiteren wird die zellul re U6 snRNA eine Schl sselkomponente des Splei osoms durch die RNA Binde Dom ne blockiert Dies f hrt zu einer Inhibition des Splei ens zellul rer mRNA Wang et al 1998 Durch die N terminale und C terminale Dom ne werden neben Typ I Interferonen auch proinflammatorische Cytokine wie tumor necrosis factor a interleukin IL 6 chemokine CC motif ligand 3 CCL3 macrophage inflammatory protein 1 alpha MIP 1a IL1B und IL18 inhibiert Lin et al 2007 Die C terminale Dom ne beinhaltet mehrere funktionelle Bindemotive fiir eIF4GI CPSF CPSF30 und PABII Sie beinhaltet zudem ein NES Kernexportsignal und das NLS2 Durch die Interaktion von NS1 mit dem eukaryotischen Translationsinitiator eIF4GI erfolgt eine Verst rkung der Translation viraler Gene Mittels Bindung an PABI Poly A Binde Protein 2 wird eIF4G an die 5 untranslatierten Regionen viraler mRNAs rekrutiert wodurch eine Pr ferenz des Translationsapparates zu 13 Einleitung Gunsten viraler mRNAs entsteht Enami et al 1994 Burgui et al 2003 Die Menge an Interferon sinkt im Laufe der Influenza Infektion Dies ist durch die Bindung von NS1 an PABH und CPSF30 Cleavage polyadenylation specificity factor 30 kDa zu erkl ren wodurch eine vollst ndige zellul re mRNA Prozessierung der 3Enden und der darauf folgende Export aus dem Zellkern verhindert wird Noah et al 2003
24. nnen erst durch die Vorbehandlung mit geeigneten Chemikalien Calciumchlorid Magnesiumchlorid und einen anschlie enden Hitzeschock eine k nstliche Kompetenz erhalten Chung et al 1989 Der zu Grunde liegende Mechanismus ist im Detail jedoch nicht gekl rt Die DNA wird in Form von Plasmiden mit einer Ampicillinresistenz Lactamase bla als Selektionsmarker in die Bakterien transformiert 3 9 1 Herstellung TSS kompetenter Bakterien 100ul E coli XL1 Blue Stratagene wurden in 5 ml LB Medium angeimpft und ber Nacht bei 37 C auf einem Sch ttler inkubiert Am Morgen wurden von dieser bernachtkultur 400 ul zu 20 ml LB Medium in einem 200 ml Erlenmeyerkolben gegeben und bis zu einer OD von 0 5 bei 37 C gesch ttelt etwa 3 Stunden Anschlie end wurden die Bakterien direkt f r 30 Minuten auf Eis gestellt Die Bakterienl sung wurde gleichm ig auf zwei Flaschen verteilt und 10 Minuten bei 3000rpm und 4 C zentrifugiert Nach dem Absaugen des berstandes wurden die zwei Pellets in je einem ml TSS Medium resuspendiert Zum Einfrieren wurde die Bakteriensuspension auf 20 Glycerin eingestellt die Bakterien zu je 200 ul in Reaktionsgef e aliquotiert und nach einer Schockgefrierung durch Ethanol mit Trockeneis bei 80 C gelagert 3 9 2 Transformation TSS kompetenter Bakterien Die bei 80 C gelagerten kompetenten XL1 Blue Bakterien wurden langsam auf Eis aufgetaut und 1 10 ul Plasmid DNA zugegeben Der Ansatz wurde durchmischt
25. on the infected cell surface Cell 1985 40 3 p 627 33 71 Li M L P Rao and R M Krug The active sites of the influenza cap dependent endonuclease are on different polymerase subunits Embo J 2001 20 8 p 2078 86 78 Li S et al Binding of the influenza A virus NS1 protein to PKR mediates the inhibition of its activation by either PACT or double stranded RNA Virology 2006 349 1 p 13 21 97 Literatur 79 Li X and P Palese Characterization of the polyadenylation signal of influenza virus RNA J Virol 1994 68 2 p 1245 9 80 Li Y Y Yamakita and R M Krug Regulation of a nuclear export signal by an adjacent inhibitory sequence the effector domain of the influenza virus NSI protein Proc Natl Acad Sci U S A 1998 95 9 p 4864 9 81 Lipatov A S et al Pathogenesis of Hong Kong H5N1 influenza virus NS gene reassortants in mice the role of cytokines and B and T cell responses J Gen Virol 2005 86 Pt 4 p 1121 30 82 Lu Y et al Binding of the influenza virus NS1 protein to double stranded RNA inhibits the activation of the protein kinase that phosphorylates the elF 2 translation initiation factor Virology 1995 214 1 p 222 8 83 Luo G X et al The polyadenylation signal of influenza virus RNA involves a stretch of uridines followed by the RNA duplex of the panhandle structure J Virol 1991 65 6 p 2861 7 84 MacRae S Newton R Wattrang E Daly J M Geneti
26. poll Plasmiden des 984 Virus und den entsprechenden HA Plasmiden HA G0 HA G1 HA G2 oder NS Plasmiden NS LP LP NS LP HP NS HP LP NS HP HP transfiziert Der Rescue erfolgte wie unter 3 13 beschrieben Das Genom der erzeugten Viren wurde sequenziert und zus tzlich das Vorhandensein der HA Glykosylierungen sowie die Deletion des NS1 Proteins durch Western Blot Analysen siehe Abb 4 3 berpr ft 60 Ergebnisse A Gi a G2 kDa Marker HP HP HP LP LP HP LPLP B 55 HA 35 Abb 4 3 Die in die Proteine HA A und NS1 B eingebrachten Mutationen wurden mittels Western Blot berpr ft MDCK II Zellen wurden mit einer MOI von 2 infiziert und 10h p i lysiert Das Lysat wurde in einem 12 igen SDS Gel aufgetrennt und das HA Protein mit Anti KP Serum Kaninchen sowie das NS1 Protein mit Anti NS1 Antik rper Ziege detektiert Zur Visualisierung im Odyssey Scanner LICOR wurden Fluoreszenz markierte Zweitantik rper verwendet Die zus tzliche Glykosylierung des HAs sowie der verl ngerte C Terminus des NS1 f hrte zu einem Shift im Laufverhalten im SDS Gel Das HA Protein ist als Einzelbande zu sehen da kein Mercaptoethanol zur Aufl sung der Disulfidbr cke zwischen HA und HA zugegeben wurde Es konnten alle eingef hrten Mutationen in den entsprechenden Segmenten verifiziert und unerw nschte Mutationen in den restlichen Segmenten ausgeschlossen werden Die rekombinanten Viren sind in Tab 4 4 aufgef hrt
27. t LPAI Viren hervorgingen Neben der Entwicklung einer multibasischen Spaltstelle im H magglutinin HA dieser Viren konnten durch Sequenzanalysen weitere markante Unterschiede zwischen HPAI und LPAI Viren detektiert werden Das HA der HPAI Viren wies eine zus tzliche Glykosylierung an Position 123 in der N he der Rezeptorbindungsstelle auf Die meisten LPAI Isolate besitzen dort kein oder nur ein Glykan an Position 149 Im NS1 Protein welches den viralen Faktor f r die Suppression der zellul ren Immunantwort darstellt konnten Mutationen im Kernexportsignal NES sowie eine Deletion von sechs Aminos uren am C Terminus der HPAI Viren festgestellt werden Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurden daher rekombinante Viren des HPAI Isolats A ostrich Italy 984 00 984 generiert die sich ausschlie lich in den Glykosylierungstellen nahe der Rezeptorbindungstasche des HAs unterschieden Das Vorhandensein eines Glykans an Position 123 stellte sich in den Experimenten als signifikante Pathogenit tsdeterminante heraus Die zus tzliche N Glykosylierung f hrte zu einer erh hten Freisetzungsgeschwindigkeit der Viren am Ende des Replikationszyklus Die dadurch beschleunigte systemische Virusausbreitung im avi ren Wirt steigerte die Mortalit t erheblich Des Weiteren wurden f r den zweiten Teil der Arbeit rekombinante 984 NS1 Mutanten hergestellt deren NES und oder C Terminus von einem LPAI Virusisolat stammen Es konnte gezeigt werden dass diese
28. und f r 30 Minuten auf Eis inkubiert Die Bakterien wurden in einem auf 42 C voreingestellten Wasserbad zwei Minuten lang einem Hitzeschock ausgesetzt und anschlie end weitere zwei Minuten auf Eis abgek hlt Um eine Ausbildung der auf den Plasmiden kodierten Resistenz zu gew hrleisten wurden die Bakterien in 800ul LB Medium gegeben und eine Stunde bei 37 C gesch ttelt Zur Selektion auf transformierte Bakterien wurden je 100ul der Bakteriensuspension mit 35 Methoden einem Drigalsky Spatel auf LB Platten mit Ampicillin 100 ug ml ausgestrichen und ber Nacht bei 37 C inkubiert 3 9 3 Transformation von XL10 Gold Ultracompetent Cells Um auch schwierige Plasmidkonstrukte erfolgreich zu transformieren wurden kompetente Bakterien XL10 Gold Ultracompetent Cells von Stratagene verwendet welche sich durch eine hohe Transformationseffizienz auszeichnen Es wurde hierbei nach Herstellerangaben vorgegangen 3 10 Bakterien PCR Durch diese Methode ist es m glich in der Transformation positive Klone direkt mittels PCR zu identifizieren ohne die Plasmid DNA isolieren zu m ssen Durchf hrung Mit einem sterilen Holzzahnstocher wurden Kolonien von einer Platte gepickt und in den in der unten folgenden Tabelle angegebenen Ansatz resuspendiert Ein Teil der Kolonie wurde in 5 ml fliissigem LB Medium mit 0 1 mg ml Ampicillin ber Nacht angez chtet um bei positiver Transformation eine Plasmidpr paration durchzuf hren N
29. und somit den bergang der Zelle in einen antiviralen Status zu hemmen Um diesen Effekt nachweisen zu k nnen wurden CEF Zellen mit einer MOI von 0 5 infiziert und 7 5h nach Infektion wurde die RNA aus den infizierten Zellen mit Hilfe des RNeasy Mini Kits von Qiagen siehe 3 6 isoliert Als Positiv Kontrolle wurden CEF mit PolyIC Sug 2 5x10 52 Methoden Zellen transfiziert Lipofectamin 2000 was zu einer Aktivierung der Interferon Produktion f hrt Zur Amplifikation der Interferon B mRNA wurde eine RT PCR OneStep RT PCR Kit von Qiagen nach Herstellerangaben mit den folgenden Primern durchgef hrt GenBank accession no NM _ 001024836 Primer von Position 194 bis 213 und 398 bis 379 Als RNA Mengenkontrolle wurden des Weiteren H hner Aktin mRNA spezifische Primer GenBank accession no CHKBACTN Primer von Position 866 bis 886 und 1278 bis 1259 in der RT PCR eingesetzt Die Produkte wurden in einem 1 5 igen Agarosegel aufgetrennt und nach Ethidiumbromid Behandlung unter UV Licht fotografiert Die Intensit t der Banden wurde mit Hilfe des Programms ImageJ 1 38x vom National Insitute of Health USA bestimmt 53 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4 1 berblick In der vorliegenden Arbeit sollten Pathogenit tsdeterminanten von Influenza A Viren anhand des hochpathogenen avi ren Influenzavirus A ostrich Italy 984 00 984 und der niedrigpathogenen Variante A chicken Italy 1082 99 1082 herausgearbeitet werden Diese Viren w
30. 10x Ultra Pfu Polymerase Puffer 10 ul dNTP Mix 25 mM Nucleotid lul Ultra Pfu DNA Polymerase lul ddH gt 0O variabel Gesamtmenge 100 ul Die PCR erfolgte in 200 ul PCR Reaktionsgef en in einem PCR Cycler Primus MWG nach folgendem Temperaturprogramm Denaturierung 94 C 3 min Denaturierung 95 C 30s Primer Annealing 50 68 C 30s 35 Zyklen Elongation 172 C 1 min kb Plasmid Finale Elongation 172 C 5 min K hlung 4 C 00 Die optimale Annealing Temperatur wurde durch die theoretische Schmelztemperatur Tm der Primer abz glich 5 C festgelegt Die Schmelztemperatur ist abh ngig von L nge dem GC Gehalt der Oligonucleotide und der gew nschten Spezifit t der Hybridisierung 3 8 In vitro Mutagenese Die in vitro Mutagenese wurde nach der Methode des Quik Change Site Directed Mutagenesis Kit von Stratagene durchgef hrt Dies ist eine molekularbiologische Technik mit der Punktmutationen einzelne und multiple Aminos ureaustausche bei Plasmiden vorgenommen werden k nnen Von einem Ausgangsplasmid wird mittels zweier Mutageneseprimer die an der beabsichtigten Stelle vom Template abweichen eine PCR durchgef hrt Die Primer sollten etwa 15 Nukleotide an beiden Seiten der Mutationsstelle berragen und nach M glichkeit mit Cytosin oder Guanin enden 33 Methoden Bei der PCR entstehen Plasmide die die gew nschte Mutation auf beiden Str ngen tragen allerdings auch Plasmide
31. 17 23 23 Crecelius D M C M Deom and I T Schulze Biological properties of a hemagglutinin mutant of influenza virus selected by host cells Virology 1984 139 1 p 164 77 24 de la Luna S et al Influenza virus NSI protein enhances the rate of translation initiation of viral mRNAs J Virol 1995 69 4 p 2427 33 25 Deom C M A J Caton and I T Schulze Host cell mediated selection of a mutant influenza A virus that has lost a complex oligosaccharide from the tip of the hemagglutinin Proc Natl Acad Sci U S A 1986 83 11 p 3771 5 26 Deshpande K L et al Glycosylation affects cleavage of an H5N2 influenza virus hemagglutinin and regulates virulence Proc Natl Acad Sci U S A 1987 84 1 p 36 40 27 Desselberger U et al The 3 and 5 terminal sequences of influenza A B and C virus RNA segments are highly conserved and show partial inverted complementarity Gene 1980 8 3 p 315 28 28 Duesberg P H Distinct subunits of the ribonucleoprotein of influenza virus J Mol Biol 1969 42 3 p 485 99 29 Dundon W G et al Progressive truncation of the Non Structural I gene of H7N1 avian influenza viruses following extensive circulation in poultry Virus Res 2006 119 2 p 171 6 94 Literatur 30 Ehrhardt C et al Influenza A virus NS protein activates the PI3K Akt pathway to mediate antiapoptotic signaling responses J Virol 2007 81 7 p 3058 67 31 Enami K et al Infl
32. 2M pH 8 5 auf 50 60 C erhitzen zentrifugieren 15 min 4000 U Uberstand 10 DABCO 8 g NaCl 0 2 g KCl 1 15 g NaHPO 0 2 g K HPO ad 1 1 mit dH gt O wie PBS def mit 0 1 g MgClo 0 13 g CaClo 50 deionisiertes Formamid 4x SSC DEPC H 0 0 1 M Tris HCl 50 mM EDTA pH 8 0 0 2 ug ml Proteinase K 23 2x Proteingel Probenpuffer RNase Puffer Sammelgel 4 ig 10x SDS Proteingelpuffer 20x SSC TBE Puffer pH 8 3 10x Trengel 10 ig TSS Puffer 2 11 Ger te Blotapparatur Fluoreszenzmikroskop Mikroskop Labovert ODYSSEY Infrared Imaging System PCR Cycler Primus Material 0 1 M Tris HCl pH 8 0 4 SDS 20 Glycerin 0 1 MDTT 0 04 Bromphenolblau 10 mM Tris7HCl pH 7 6 0 5 M NaCl 1 mM EDTA 20 ug ml RNase A 1 U ml RNaseT 1 2 ml 0 5 M Tris HCl pH 6 8 0 4 SDS 3 ml H2O 0 65 ml 30 Acrylamid 2 Bisacrylamid 50 ul 10 APS 7 ul TEMED 0 03 M SDS 1 25 M Tris HCl pH 7 4 1 92 M Glycin ad 1 1 H20 bidest 3 M NaCl 0 3 M Natriumcitrat pH 7 0 108 g Tris 55 g Bors ure 9 3 gEDTA ad 100 ml mit dH2O 2 5 ml 1 5 M Tris HCl pH 8 8 0 4 SDS 3 9 ml H2O 3 4 ml 30 Acrylamid 2 Bisacrylamid 50 ul 10 APS 5 5 ul TEMED 85 LB Medium 10 w v PEG 8000 5 v v DMSO pH 6 5 steril filtrieren Keutz Reiskirchen Zeiss Jena Leitz Wetzlar LI COR Biosciences Bad Homburg MWG Biotech Ebersberg 24 pH Meter Photometer Gene Quant pro Protein Gelapparatur
33. 3 an acidic nucleolar protein as a stimulatory factor for in vitro replication of adenovirus DNA complexed with viral basic core proteins J Mol Biol 2001 311 1 p 41 55 101 O Neill R E J Talon and P Palese The influenza virus NEP NS2 protein mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins Embo J 1998 17 1 p 288 96 102 Parvin J D et al Promoter analysis of influenza virus RNA polymerase J Virol 1989 63 12 p 5142 52 103 Pichlmair A et al RIG I mediated antiviral responses to single stranded RNA bearing 5 phosphates Science 2006 314 5801 p 997 1001 104 Pinto L H L J Holsinger and R A Lamb Influenza virus M2 protein has ion channel activity Cell 1992 69 3 p 517 28 105 Qian X Y F Alonso Caplen and R M Krug Two functional domains of the influenza virus NSI protein are required for regulation of nuclear export of mRNA J Virol 1994 68 4 p 2433 41 106 Reid A H et al Origin and evolution of the 1918 Spanish influenza virus hemagglutinin gene Proc Natl Acad Sci U S A 1999 96 4 p 1651 6 107 Richardson J C and R K Akkina NS2 protein of influenza virus is found in purified virus and phosphorylated in infected cells Arch Virol 1991 116 1 4 p 69 80 99 Literatur 108 Rogers G N and J C Paulson Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on spe
34. 48 Greenspan D P Palese and M Krystal Two nuclear location signals in the influenza virus NSI nonstructural protein J Virol 1988 62 8 p 3020 6 49 Guo Z et al NSI protein of influenza A virus inhibits the function of intracytoplasmic pathogen sensor RIG I Am J Respir Cell Mol Biol 2007 36 3 p 263 9 50 Hatada E and R Fukuda Binding of influenza A virus NS1 protein to dsRNA in vitro J Gen Virol 1992 73 Pt 12 p 3325 9 51 Hatta M et al Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses Science 2001 293 5536 p 1840 2 52 Helenius A Unpacking the incoming influenza virus Cell 1992 69 4 p 577 8 53 Herrler G and H D Klenk Structure and function of the HEF glycoprotein of influenza C virus Adv Virus Res 1991 40 p 213 34 54 Herrler G et al Isolation and structural analysis of influenza C virion glycoproteins Virology 1981 113 2 p 439 51 55 Hinshaw V S et al Genetic reassortment of influenza A viruses in the intestinal tract of ducks Virology 1980 102 2 p 412 9 56 Hiscox J A The nucleolus a gateway to viral infection Arch Virol 2002 147 6 p 1077 89 57 Hoffmann E and R G Webster Unidirectional RNA polymerase I polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids J Gen Virol 2000 81 Pt 12 p 2843 7 58 Hoyle L Structure of the influenza virus the relation bet
35. 5 Taubenberger J K et al Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes Nature 2005 437 7060 p 889 93 136 Tsuchiya E et al Role of overlapping glycosylation sequons in antigenic properties intracellular transport and biological activities of influenza A H2N2 virus haemagglutinin J Gen Virol 2002 83 Pt 12 p 3067 74 137 Ulmanen I B A Broni and R M Krug Role of two of the influenza virus core P proteins in recognizing cap 1 structures m7GpppNm on RNAs and in initiating viral RNA transcription Proc Natl Acad Sci US A 1981 78 12 p 7355 9 138 Varghese J N et al The structure of the complex between influenza virus neuraminidase and sialic acid the viral receptor Proteins 1992 14 3 p 327 32 101 Literatur 139 Vey M et al Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R X K R R Virology 1992 188 1 p 408 13 140 Wagner R M Matrosovich and H D Klenk Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Rev Med Virol 2002 12 3 p 159 66 141 Wagner R et al Interdependence of hemagglutinin glycosylation and neuraminidase as regulators of influenza virus growth a study by reverse genetics J Virol 2000 74 14 p 6316 23 142 Wang P P Palese and R E O Neill The NPI 1 NPI 3 karyopherin alpha binding site on the influenza a virus nuc
36. Aus dem Institut f r Virologie der Philipps Universit t Marburg Direktor Prof Dr Stephan Becker Mutationen im H magglutinin und dem NS1 Protein steigern die Virulenz hochpathogener avi rer Influenzaviren Philipps Universit t Marburg Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften Dr rer nat dem Fachbereich Biologie der Philipps Universit t Marburg vorgelegt von Bj rn Keiner aus M nchen Marburg Lahn 2008 Vom Fachbereich Biologie der Philipps Universit t Marburg als Dissertation am 22 04 2008 angenommen Erstgutachter Prof Dr Wolfgang Buckel Zweitgutachter Prof Dr Hans Dieter Klenk Tag der m ndlichen Pr fung am 25 04 2008 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1 10 1 11 1 12 1 13 1 14 1 15 2 Material 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 2 11 3 Methoden 3 1 32 3 3 3 4 3 5 3 6 Taxonomie Morphologie Genomaufbau und virale Proteine Replikationszyklus Influenza beim Menschen Epidemiologie der menschlichen Influenza Klinik und Pathogenese Avi re Influenza Pathogenese der avi ren Influenza Das H magglutinin als Pathogenit tsdeterminante Induktion und Wirkung von Typl Interferonen Die Rolle des Nicht Struktur Proteins 1 NS1 Weitere Pathogenit tsfaktoren Ausbruch avi rer influenzaviren 1999 2000 in Italien Problemstellung Chemikalien Antik rper Enzyme Plasmide Oligonukl
37. B Medium 10g Pepton 5g Hefeextrakt 10g NaCl ad 1 1 mit dH2O LB Agar 2 Bactoagar in LB Medium NZY Broth 10 g Pepton 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl 12 5 ml IM MgCl 12 5 ml MgSO 10 ml 2 M Glucosel sung ad 1 1 H O 2 9 Virusst mme A ostrich Italy 984 2000 A broiler breeder Italy 1082 99 2 10 Puffer und L sungen Acetylierungspuffer Agarosegel Probenpuffer 6x Anodenpuffer I Anodenpuffer II DEPC H gt 0 DEPC PBS DEPC PBS 0 1 M Triethanolamin pH 8 0 0 25 Essigs ureanhydrid 0 3 konzentrierte Salzs ure 0 25 Bromphenolblau 40 Saccharose 0 3 M Tris HCl pH 10 4 20 Methanol 25 mM Tris HCl pH 10 4 20 Methanol dH gt 0 0 1 DEPC N r hren autoklavieren PBS def 0 1 DEPC N r hren autoklavieren 22 Entwicklungspuffer Eosin Stamml sung 10x Fixierungspuffer Hybridisierungspuffer Katodenpuffer Kristallviolett Gebrauchsl sung Mowiol PBS def PBS Pr hybridisierungspuffer Proteinase K Puffer Material Kodak Developer D 19 1 g Eosin 25 ml Ethanol 25 ml H20 Kodak Fixer 50 deionisiertes Formamid 10 Dextransulfat 1x Denhardt s Solution 4x SSC 1 mg ml Hefe tRNA 0 1 mg ml Fisch DNA immer frisch denaturieren 10 mM EDTA 25 mM Tris HCl pH 9 4 40 mM Aminocaprons ure 20 Methanol 270 ml Formaldehyd 37 730 ml H20 lg Kristallviolett 2 4 g Mowiol 4 88 6 g Glycerin 6 ml H O U N quellen lassen 12 ml TrisHC1 0
38. Forschungsschwerpunkts 1130 der DFG Hirschegg 2006 Keiner B Wagner R Herwig A Klenk H D Pathogenesis and improved diagnosis and control of avian influenza infections EU Aviflu 3rd Year Meeting St Brieuc Frankreich 2005 Keiner B Wagner R Herwig A Klenk H D Pathogenesis and improved diagnosis and control of avian influenza infections EU Aviflu 2nd Year Meeting Padova Italien 2004 109 Lebenslauf Poster Keiner B Wagner R Herwig A Klenk H D Hemagglutinin Glycosylation Promotes Spread of Infection of a Highly Pathogenic Avian Influenza Virus H7N1 Third European Congress of Virology N rnberg 2007 Keiner B Wagner R Herwig A Klenk H D Head Glycans of Influenza A Virus HA influence Cell Tropism and Pathogenicity in Chicken Embryos Jahrestagung Gesellschaft f r Virologie Hannover 2005 110 Erkl rung Eidesstattliche Erkl rung ich versichere da ich meine Dissertation Mutationen im H magglutinin und dem NS1 Protein steigern die Virulenz hochpathogener avi rer Influenzaviren selbst ndig ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdr cklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer hnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Pr fungszwecken gedient Ort Datum Unterschrift mit Vor und Zuname 111 Danksagung D
39. Genom Virusmutante Segment 984 GO 984 G2 984 HP HP 984 LP HP 984 HP LP 984 LP LP 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 984 NS HP HP NS LP HP NS HP LP NS LP LP Tab 4 4 Hergestellte 984 Virusmutanten die sich ausschlie lich in den eingebrachten Mutationen im HA oder NS1 Gen unterscheiden 61 Ergebnisse 4 4 Charakterisierung der HA Glykosylierungsmutanten 4 4 1 Wachstum auf verschiedenen avi ren Zellen Influenza A Viren des Subtyps H7N1 konnten w hrend des Ausbruchs in Nord Italien siehe Kap 1 13 aus verschiedenen avi ren Spezies isoliert werden Diese Viren entwickelten in den verschiedenen Spezies unterschiedlich ausgepr gte Krankheitsverl ufe die von milden kaum detektierbaren Beschwerden bis hin zu einer t dlich verlaufenden Infektion reichten Um zu evaluieren ob es sich bei den entstandenen zus tzlichen Glykosylierungen des HAs um Anpassungen an einzelne avi re Spezies handelt wurden CEF DEF und TEF Zellen mit einer MOI von 0 0004 der Glykosylierungsmutanten 984 G0 G1 und G2 infiziert und eine Wachstumskurve erstellt Dazu wurde 16 24 48 und 72 Stunden nach Infektion berstand des Mediums entnommen Um zu bestimmen ob in diesen Zeitintervallen eine Virusvermehrung stattgefunden hat wurde mittels Plaquetest der Titer des berstandes zum entsprechenden Zeitpunkt ermittelt Die erh
40. Hilden Qiaquick Gel Extraction Kit Qiaquick PCR Purification Kit Quik Change Site Directed Mutagenesis Kit QIAamp Viral RNA Mini Kit Nuclear Extraction Kit 2 7 Zellkultur Materialien 6 Well Platten 12 Well Platten 96 Well Mikrotiterplatte Gewebekulturschalen Zellkulturflaschen 75 cm2 Zellkulturschalen 6 cm Zellschaber Medien MEM 2x DMEM OptiMEM I Wachstumsmedien Infektionsmedien Plaquetest Overlay Qiagen Hilden Qiagen Hilden Stratagene Heidelberg Qiagen Hilden IMGENEX San Diego Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Greiner Bio One GmbH Frickenhausen Gibco BRL Eggenstein Gibco BRL Eggenstein Gibco BRL Eggenste 1x Medium 10 FCS 1 Glutamin 1 Penicillin Streptomycin 1x Medium 1 Glutamin 0 2 BSA 35 1 Penicillin Streptomycin 2x MEM 25 ml Glutamin 0 5 ml BSA 35 0 30 ml 1 8 Bacto Agar 25 ml Penicillin Streptomycin 0 5 ml 21 Material Zelllinien MDCK II Madin Darby canine kidney permanente Epithelzelllinie aus der Niere eines weiblichen Cockerspaniels 293T humane embryonale Nierenzelllinie Prim re Zellen CEF H hnerembryofibroblasten DEF Entenembryofibroblasten TEF Putenembryofibroblasten 2 8 Bakterienkultur Escherichia coli Stamm XL1 Blue Medien L
41. Histochemische Fluoreszenz Anf rbung beruht auf der Affinit t von Antik rpern zu bestimmten Epitopen als Antigen Antik rper Reaktion Dadurch lassen sich Antigene auf Zelloberfl chen und in permeabilisierten Zellen nachweisen Bei der indirekten Immunfluoreszenz wird im ersten Schritt ein spezifischer Antik rper Prim rantik rper auf die zu untersuchenden Zellen aufgebracht Im zweiten Schritt kann ein Sekund rantik rper der mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe z B Rhodamin gekoppelt ist diesen prim ren Antigen Antik rper Komplex detektieren Fluoreszenzfarbstoffe haben die Eigenschaft bei Bestrahlung mit kurzwelligem Licht UV Licht Licht einer l ngeren Wellenl nge zu emittieren und so die markierten Antigene sichtbar zu machen Durchf hrung Konfluente Zellen wurden einen Tag vor Infektion in eine 24 Well Platte mit 1 ml Medium Vertiefung und einem Deckgl schen Vertiefung ausges t Die Verd nnung wurde so gew hlt dass die Zellen bei der Infektion noch nicht vollst ndig konfluent waren Unmittelbar vor der Infektion wurden die Zellen mit 37 C warmem PBS gewaschen Die Virussuspension wurde mit PBS bis zu einer MOI von 1 ein infekti ses Virus pro Zelle verd nnt 500ul der Verd nnung wurden auf die Zellen gegeben und 30 min bei 37 C 50 Methoden inkubiert Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 1ml Infektionsmedium weitere 7 5 Stunden bei 37 C inkubiert Der Uberstand
42. Viren reduziertes Wachstum auf avi ren Zellen sowie eine verminderte Infektiosit t f r den avi ren Wirt aufwiesen Dieser Effekt konnte auf eine ver nderte Lokalisation des HPAI NS1 in den verschiedenen Stadien der Infektion zur ckgef hrt werden Zusammengenommen bewirken das zus tzliche Glykan an Position 123 des HA und die Mutationen im NS1 Protein des HPAI Virus eine deutliche Steigerung der Pathogenit t im avi ren Wirt 92 Literatur 7 Literaturverzeichnis 1 Anwar T S K Lal and A U Khan Matrix protein 1 A comparative in silico study on different strains of influenza A H5N1 Virus Bioinformation 2006 1 7 p 253 6 2 Aragon T et al Eukaryotic translation initiation factor 4GI is a cellular target for NSI protein a translational activator of influenza virus Mol Cell Biol 2000 20 17 p 6259 68 3 Area E et al 3D structure of the influenza virus polymerase complex localization of subunit domains Proc Natl Acad Sci U S A 2004 101 1 p 308 13 4 Baigent S J and J W McCauley Influenza type A in humans mammals and birds determinants of virus virulence host range and interspecies transmission Bioessays 2003 25 7 p 657 71 5 Banks J et al Phylogenetic analysis of H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses Arch Virol 2000 145 5 p 1047 58 6 Banks J et al Changes in the haemagglutinin and the neuraminidase genes prior to the emergence of highly pathogenic H7N1 a
43. Virologie Philipps Universit t Marburg Betreuer Prof Dr W Buckel Prof Dr H D Klenk Thema Mutationen im H magglutinin und dem NS1 Protein steigern die Virulenz hochpathogener avi rer Influenzaviren Schule und Studium 2003 2004 Diplomarbeit am Institut f r Virologie Philipps Universit t Marburg Betreuer Prof Dr H D Klenk Dr Ralf Wagner Thema Die Rolle des H magglutinins als Pathogenit tsdterminante avi rer Influenzaviren 2003 Diplom Pr fung in den F chern Virologie Mikrobiologie und Zellbiologie 1996 2003 Studium des Studienganges Biologie an der Philipps Universit t Marburg 1996 2002 Nebenjob in der Buchaltung der Firma Hedrich vacuum systems Ehringshausen Katzenfurt 1995 1996 Zivildienst Deutsches Rotes Kreuz Wetzlar 1992 1995 Goethe Gymnasium Wetzlar Allgemeine Hochschulreife 1986 1992 Gesamtschule Ehringshausen 1982 1986 Grundschule Asslar Werdorf 107 Lebenslauf Wissenschaftliche Aktivit ten und Fortbildungen 2007 Fortbildung zum Projektleiter und Beauftragten f r Biologische Sicherheit 2007 Reviewer f r das Journal Archives of Virology 2005 Mitglied der Deutschen Gesellschaft f r Virologie GfV Wissenschaftliche F rderungen 2006 2007 Forschungsschwerpunkt 1130 der DFG Infektionen des Endothels 2004 2006 Forschungsprojekt der Europ ischen Union EU Aviflu Pathogenesis and improved diagnosis and control of avian influenza infections Publikation
44. Virusausbreitung im avi ren Wirt f hrt Die schnelle Ausbreitung f hrt vermutlich auch zu einem berrennen des angeborenen Immunsystems des Wirtes was sich in der gesteigerten Pathogenit t des G1 Virus zeigt Daher l sst sich zusammenfassend sagen dass der Erwerb zus tzlicher Glykane am H magglutinin ein wichtiges Pathogenit tsmerkmal avi rer Influenzaviren darstellt 87 Diskussion welches bei weiteren Ausbr chen von avi ren Influenza A Viren in domestiziertem Gefl gel als Warnsignal f r eine m gliche Beschleunigung der Virusausbreitung gesehen werden muss 5 4 Mutationen der Lokalisationssignale des NSI beeinflussen die Virulenz avi rer Influenzaviren Das NS1 Protein von Influenza A Viren kann mit einer gro en Anzahl von zellul ren Faktoren sowohl Protein Protein als auch Protein RNA Interaktionen eingehen Krug et al 2003 Li et al 2006 Chien et al 2004 Hatada und Fukada 1992 Nemeroff et al 1998 Diese Wechselwirkungen sind f r eine effiziente Virusvermehrung essentiell da sie beispielsweise die Auswirkungen als auch die Aktivierung der angeborenen Immunantwort des Wirts supprimieren k nnen Die Hauptfrage hierbei ist wie diese mannigfaltigen Interaktionen optimal f r die Virusreplikation in den verschiedenen Phasen des Infektionszyklus reguliert werden Das NSI Protein besitzt durch zwei Kernlokalisationssignale Greenspan et al 1988 das Kernexportsignal Li et al 1998 sowie das Nukle
45. Wirtsspezies entf llt bei humanen Isolaten der Ort der Isolierung die Nummer des Isolats und das Jahr der Virus Isolierung angegeben Bei Influenza A Viren wird zus tzlich in Klammern der Subtyp angef gt beispielsweise Influenza A ostrich Italy 984 00 H7N1 f r ein avi res Isolat aus dem Jahr 2000 in Italien Die Unterteilung in die verschiedenen Subtypen basiert auf der Antigenit t ihrer Oberfl chenproteine H magglutinin HA und Neuraminidase NA Derzeit sind 16 HA Subtypen H1 H2 etc und 9 NA Subtypen N1 N2 etc bekannt Fouchier et al 2005 1 2 Morphologie Influenzaviren sind sph rische oder filament se Partikel Hoyle 1968 mit einem Durchmesser von 80 120 nm und helikaler Kapsidsymmetrie Die H lle der Influenzaviren stammt von der Zellmembran der Wirtszelle ab und stellt eine bei der Virusreifung von dieser bernommene Lipiddoppelschicht dar Skehel amp Wiley 1995 Bei Influenza A und B Viren sind in die Virush lle die viruskodierten transmembranen Glykoproteine H magglutinin HA und Neuraminidase NA eingelagert die 10 12 nm aus der Lipidh lle herausragen Das HA liegt im Virion als Homotrimer vor und vermittelt Rezeptorbindung und Membranfusion Die NA deren aktive Form durch ein Homotetramer repr sentiert wird besitzt rezeptorzerst rende Wirkung Varghese et al 1992 Influenza C Viren besitzen statt der HA und NA Proteine mit dem H magglutinin Esterase Fusionsprotein HEF nur ein einziges
46. ach der Resuspendierung wurde die Probe in einem PCR Cycler auf 94 C erhitzt um die Plasmide freizusetzen und anschlie end ein PCR Programm durchgef hrt PCR Ansatz Fo Primer 20 uM 0 5 ul Re Primer 20 uM 0 5 ul 10x Taq Polymerase Puffer 2 5 ul dNTP Mix 25 mM Nucleotid 0 5 ul Taq DNA Polymerase 0 25 ul ddH 0 20 5 ul 1 Bakterienkolonie gepickt Gesamtmenge 24 75 ul 36 Methoden Cycler Programm Denaturierung 94 C 3 min Denaturierung 93 C 30 s Primer Annealing 52 C 30s 28 Zyklen Elongation 70 C 2 min Finale Elongation 70 C 10 min 3 11 Restriktion von DNA Fragmenten Beim so genannten Restriktionsverdau werden Restriktionsendonukleasen verwendet Dies sind Enzyme die die Phosphodiesterbindungen im Innern eines DNA Molek ls an genau definierten Stellen hydrolysieren Sie erkennen hierbei eine spezifische Sequenz von meist vier bis acht Nukleotiden mit Palindrom Struktur Durchf hrung Etwa 200 ng Plasmid DNA wurden mit der vom Hersteller angegebenen Menge an Restriktionsenzym 10fach Puffer und falls angegeben BSA bovine serum albumine f r drei Stunden bei dem Temperaturoptimum des Enzyms inkubiert und gegebenenfalls f r 10 Minuten bei 65 C inaktiviert 3 12 Mini und Maxipr paration von Plasmid DNA aus Bakterien Die Minipr paration und Maxipr paration sind molekularbiologische Methoden zur Gewinnung von Plasmiden aus Bakterie
47. altenen Daten sind in den Abb 4 4 A C graphisch dargestellt Hieraus ist ersichtlich dass sich die drei Glykosylierungsmutanten hinsichtlich ihrer Replikationseffizienz auf CEF DEF und TEF deutlich voneinander unterscheiden Die GO Mutante w chst in allen getesteten avi ren Zellen zu den geringsten Titern heran Das G1 Virus zeigt die h chste Wachstumsgeschwindigkeit mit maximalen Titern von etwa 6x10 pfu ml in CEF 7x10 pfu ml in TEF und 8x10 pfu ml in DEF Die maximalen Titer dieses Virus sind im Vergleich zum GO Virus in allen Zellen um etwa das 100fache erh ht Die Titer des G2 Virus sind in CEF im Vergleich zum GO Virus nur geringf gig h her liegen jedoch in DEF bereits etwa eine log Stufe h her Eine Ausnahme bildet die G2 Mutante auf TEF die mit maximal 1 6x10 pfu ml ann hernd die Titer des G1 Virus erreicht Generell l sst sich sagen dass die zus tzliche Glykosylierung an Aminos ure Position 123 im HA G1 Virus zu einer Beschleunigung und Steigerung der Virusproduktion f hrt Die Glykosylierungsstelle an Position 149 des HAs G2 Virus verst rkt das Viruswachstum nur teilweise im Vergleich zur Mutante ohne zus tzliches Glykan in der N he der Rezeptorbindungstasche GO Virus 62 A Wachsium der Glykosylierungsmutanten auf Entenfibroblasten 1 E 08 1 E 07 1 E 06 60 1 E 05 1 E 04 Gi 2 1 E 03 1 E 02 1 E 01 fu m G2 1 E 00 h p i
48. anksagung Mein Dank gilt zuallererst Herrn Prof Dr Hans Dieter Klenk f r die berlassung des Themas der Doktorarbeit und die hervorragende Betreuung die mir bei der Anfertigung der Arbeit zu Teil wurde Des Weiteren m chte ich mich ganz herzlich bei den Mitgliedern der Pr fungskommission bedanken bestehend aus Herrn Prof Dr Klaus Lingelbach Herrn Prof Dr Erhard Bremer und Herrn Prof Dr Wolfgang Buckel der freundlicherweise die Betreuung meiner Doktorarbeit am Fachbereich Biologie bernommen hat Bedanken m chte ich mich besonders bei meinem ehemaligen Betreuer Ralf Wagner der seine Begeisterung f r die Influenza Forschung an mich weitergegeben hat und mich durch seine Lauff higkeiten im Sport auch nach seinem Weggang sehr beeindruckt hat Ebenfalls besonderer Dank gilt den beiden leider ehemaligen guten Seelen der Arbeitsgruppe Astrid und Katharina Die beiden standen mir immer mit Rat und Tat aber auch mit kreativen Ideen zur Verf gung und waren sich nie f r einen Kaffee zu schade Des Weiteren m chte ich mich ganz herzlich bedanken bei all meinen Diplomanden innen meiner Bachelor Studentin und den Praktikanten und Praktikantinnen in unserem Labor Hierbei sind besonders Annika Ben Maren Franzi und Christin hervorzuheben mit denen es im Laboralltag nie langweilig wurde Weiterer gro er Dank geht an all die vielen Kollegen und Kolleginnen der AG Klenk und des gesamten Instituts f r Virologie m
49. asma und im Zellkern inhibiert sowohl Splei en als Auch Polyadenylierung und Kernexport der zellul ren mRNA Interferon Antagonist Nichtstrukturprotein im Cytoplasma und im Zellkern involviert im Kernexport der RNPs Tab 1 2 RNA Segmente der Influenza A Viren kodierte Proteine und deren Funktion 1 4 Replikationszyklus Der Replikationsverlauf bei Influenzaviren beginnt mit dem Eindringen des Virus in eine permissive Wirtszelle Im Zellkern findet die Transkription und Replikation des Genoms statt Einleitung w hrend die zellul re Translationsmaschinerie im Zytoplasma die Synthese der viralen Proteine bernimmt Nach Fertigstellung ausreichender Mengen neuer Virusbestandteile durch die Wirtszelle assembliert das Virus an der Zytoplasmamembran und wird durch Knospung freigesetzt Um in eine Wirtszelle eindringen zu k nnen ist eine Adsorption des Virus an zellul re Rezeptoren notwendig Das Oberfl chenglykoprotein H magglutinin HA des Influenza A Virus bindet dazu an endst ndige N Acetyl Neuramins uren die an Galaktosereste von glykosylierten Membranproteinen oder lipiden gebunden sind Das HA humaner Viren erkennt in den meisten F llen eine a2 6 gebundene Neuramins ure w hrend der berwiegende Teil der avi ren Viren eine o2 3 glykosidische Bindung bevorzugen Rogers und Paulson 1983 Connor et al 1994 ber Rezeptor vermittelte Endocytose gelangt das Virus ins Zellinnere Die anschlie ende A
50. ausadaptierten humanen HINI Isolats A WSN 33 spezifisch zu einer H magglutinin Aktivierung beitr gt Die Neuraminidase dieses Virus kann den ubiquit r vorkommenden Plasmin Vorl ufer Plasminogen rekrutieren welcher in der Lage ist HA zu spalten So kann es trotz monobasischer HA Spaltstelle zu einer systemischen Infektion kommen Gao et al 1999 Verantwortlich daf r sind ein C terminales Lysin sowie das Fehlen einer Zuckerseitenkette an Aminos ureposition 146 des NAs Goto und Kawaoka 1998 Eine Mutation in einem dieser beiden Bereiche f hrt zu einer deutlich verringerten Virulenz des WSN Isolats Goto et al 2001 Interne Virusproteine wirken sich ebenfalls auf Pathogenit t und Wirtsspektrum aus Ein Austausch des PB1 Gens eines humanen Isolates 14 Einleitung mit dem eines avi ren Virus f hrte zu einer Attenuierung der Replikation in MDCK Zellen jedoch nicht in H hnernieren Zellen Snyder et al 1987 Zudem wurde gezeigt dass die viralen Proteine NP Scholtissek et al 1985 PB2 Shinya et al 2007 Subbarao et al 1993 Hatta et al 2001 M1 Anwar et al 2006 M2 Feng et al 2006 und NS2 Iwatsuki Horimoto et al 2004 oftmals Mutationen zeigen die ein Virus an bestimmte Wirte anpassen Dies wurde besonders f r alle Polymerasegene bei H7N7 Gabriel et al 2005 und H5N1 Salomon et al 2006 gezeigt PB1 F2 induziert zellspezifisch Apoptose So werden vor allem Zellen des angeborenen Immunsystems gezielt abge
51. c basis for pathogenicity differences between strains of equine influenza A H3N8 subtype viruses in Abstract at 3rd Orthomyxovirus Research Conference 2005 Cambridge UK 85 Matrosovich M et al The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties J Virol 1999 73 2 p 1146 55 86 Matrosovich M N et al Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium Proc Natl Acad Sci U S A 2004 101 13 p 4620 4 87 Matthews D A Adenovirus protein V induces redistribution of nucleolin and B23 from nucleolus to cytoplasm J Virol 2001 75 2 p 1031 8 88 Melen K et al Nuclear and nucleolar targeting of influenza A virus NS1 protein striking differences between different virus subtypes J Virol 2007 81 11 p 5995 6006 89 Mibayashi M et al Inhibition of retinoic acid inducible gene I mediated induction of beta interferon by the NSI protein of influenza A virus J Virol 2007 81 2 p 514 24 90 Min J Y and R M Krug The primary function of RNA binding by the influenza A virus NS1 protein in infected cells Inhibiting the 2 5 oligo A synthetase RNase L pathway Proc Natl Acad Sci U S A 2006 103 18 p 7100 5 91 Mo I P et al Comparative pathology of chickens experimentally inoculated with avian influenza viruses of low and high pathogenicity Avian Dis 1997 41 1
52. chenden Neuramins uren von dem H magglutinin des Virus gebunden werden 3 26 Virusfreisetzungs Assay F r eine effiziente Virusausbreitung ist es notwendig dass sich neugebildete Viren von bereits infizierten Zellen l sen k nnen Um die erzeugten Virusmutanten auf diese Eigenschaft zu untersuchen wurden konfluent gewachsene CEF und DEF in 6cm Sch lchen mit einer MOI von 3 f r 1 h bei 37 C inkubiert und anschlie end zweimal mit PBS 0 2 BSA gewaschen Der dritte Waschschritt wurde mit PBS pH 5 0 durchgef hrt um verbleibende nicht endozytierte Viren zu inaktivieren Nach Zugabe von 4 ml DMEM 0 2 BSA wurden die Zellen 24h bei 37 C und 5 CO inkubiert Im Anschluss wurde das Medium abgenommen 24h berstand und die Zellen wurden erneut mit PBS 0 2 BSA gewaschen Nach Zugabe von 2 ml DMEM 0 2 BSA wurden die Zellen mit einem Zellschaber abgekratzt Zellsuspension Der 24h berstand sowie die Zellsuspension wurden f r 3 Minuten mit Ultraschall behandelt um gebundene Viren von den Zellen und Zelltriimmern abzul sen Die Proben wurden anschlie end mittels Plaquetest siehe 3 4 auf die Menge neugebildeter Viruspartikel untersucht und miteinander verglichen 3 27 Interferoninduktion und Interferon B mRNA spezifische RT PCR Eine Virusinfektion bewirkt in Zellen normalerweise eine Induktion von Typ I Interferon Influenza A Viren sind durch das Interferon antagonisierende Protein NS1 in der Lage diese Induktion
53. chtet Fetuin ist ein polyvalentes Substrat mit 8 7 gebundenen Neuramins uren NeuS auf der Oberfl che unter anderem a2 3 und a2 6 gebunden Die ber Nacht beschichteten Platten wurden 30min mit 2 fachen Virusverd nnungen in PBSaer inokuliert um die Bindung der Viren an a2 3 bzw a2 6 verlinkten NeuS zu gew hrleisten Alle Schritte wurden auf Eis durchgef hrt um die Aktivit t der viralen Neuraminidase zu inhibieren Die Platten wurden anschlie end mit PBSaer 0 01 TWEEN 20 gewaschen Durch Zugabe von Methanol Aceton 1 1 20 C werden die gebunden Viren an der Fetuin bedeckten Oberfl che fixiert Nach nochmaligem Waschen mit PBSaer 0 01 TWEEN 20 wurden entweder biotinylierte Sambucus nigra oder Maackia amurensis Lektine zugegeben 1 1000 in PBSaer 1 BSA Sambucus nigra Lektin erkennt spezifisch a2 6 gebundene NeuS w hrend Maackia amurensis Lektin an 2 3 verlinkte NeuS bindet Nach erneutem Waschen mit PBSaer 0 01 TWEEN 20 wurden die 51 Methoden Platten mit Streptavidin 800nm Fluoreszenz markiert inkubiert und nach drei weiteren Waschschritten mit PBSaer am LI COR USA Odyssey Infrared Imaging System eingescannt und die Intensit t der Fluoreszenz quantifiziert Als Ma f r die Effizienz mit der die untersuchten Viren an 2 3 bzw 2 6 verlinkte Neuramins uren binden wurde die maximale Bindungsverd nnung BDmax angegeben Sie entspricht der h chsten Verd nnungstufe bei der noch mindestens 95 der entspre
54. chuchardt Hohenbrunn Sigma Deisenhofen Sigma Deisenhofen Sigma Deisenhofen Sigma Deisenhofen Merck Darmstadt Fermentas St Leon Rot Boehringer Mannheim Merck Darmstadt Merck Darmstadt Sigma Deisenhofen Carl Roth GmbH Karlsruh Sigma Deisenhofen Sigma Deisenhofen Roche Mannheim Merck Darmstadt Sigma Deisenhofen Gibco BRL Eggenstein Merck Darmstadt Gibco BRL Eggenstein Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Roche Mannheim Riedel de Haen Seelze Riedel de Haen Seelze Sigma Deisenhofen Roth Karlsruhe Merck Darmstadt Sigma Deisenhofen Invitrogen Karlsruhe Merck Darmstadt Merck Darmstadt Calbiochem USA Riedel de Haen Seelze Merck Darmstadt Merck Darmstadt 18 Natriumhydroxid Natriumhydrogencarbonat Page Ruler Prest Protein Ladder Plus Paraformaldehyd Penecillin Pepton Phenolrot Polyethylenglykol 4000 RNase Inhibitor Sachharose Salzs ure SDS Natriumdodecylsulfat Streptomycin Material Riedel de Haen Seelze Merck Darmstadt Fermentas St Leon Rot Merck Darmstadt Gibco BRL Eggenstein Merck Darmstadt Riedel de Haen Seelze Sigma Deisenhofen Fermentas St Leon Rot Serva Heidelberg Merck Darmstadt Merck Darmstadt Gibco BRL Eggenstein TEMED N N N N Tetramethylendiamin BioRad Miinchen Triethanolamin TEA Triton X 100 Tris Trishydroxymetylaminomethan TWEEN 20 Xylol 2 2 Antik rper Anti Influenza A NS1 sc 17596 goat Anti B
55. cies of origin Virology 1983 127 2 p 361 73 109 Rott R The pathogenic determinant of influenza virus Vet Microbiol 1992 33 1 4 p 303 10 110 Salomon R et al The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A Vietnam 1203 04 J Exp Med 2006 203 3 p 689 97 111 Schaefer M K and R Day In situ hybridization techniques to map processing enzymes Methods Neurosci 1995 23 p 16 44 112 Scheiffele P et al Influenza viruses select ordered lipid domains during budding from the plasma membrane J Biol Chem 1999 274 4 p 2038 44 113 Scholtissek C Influenza virus genetics Adv Genet 1979 20 p 1 36 114 Scholtissek C et al The nucleoprotein as a possible major factor in determining host specificity of influenza H3N2 viruses Virology 1985 147 2 p 287 94 115 Scholtissek C S Ludwig and W M Fitch Analysis of influenza A virus nucleoproteins for the assessment of molecular genetic mechanisms leading to new phylogenetic virus lineages Arch Virol 1993 131 3 4 p 237 50 116 Seo S H E Hoffmann and R G Webster The NSI gene of H5N1 influenza viruses circumvents the host anti viral cytokine responses Virus Res 2004 103 1 2 p 107 13 117 Sheng M and C Sala PDZ domains and the organization of supramolecular complexes Annu Rev Neurosci 2001 24 p 1 29 118 Shi L et al Influenza A virus RNA polymera
56. d receptor specificity of the 1997 HSN1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong Avian Dis 2003 47 3 Suppl p 1154 60 40 Gao P et al Biological heterogeneity including systemic replication in mice of HS5N1 influenza A virus isolates from humans in Hong Kong J Virol 1999 73 4 p 3184 9 41 Garcia Sastre A Inhibition of interferon mediated antiviral responses by influenza A viruses and other negative strand RNA viruses Virology 2001 27 2 p 375 84 42 Garcia Sastre A et al Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon deficient systems Virology 1998 252 2 p 324 30 43 Garten W et al Proteolytic activation of the influenza virus hemagglutinin The structure of the cleavage site and the enzymes involved in cleavage Virology 1981 115 2 p 361 74 44 Gomez Puertas P et al Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding J Virol 2000 74 24 p 11538 47 45 Goto H and Y Kawaoka A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus Proc Natl Acad Sci U S A 1998 95 17 p 10224 8 95 Literatur 46 Goto H et al Plasminogen binding activity of neuraminidase determines the pathogenicity of influenza A virus J Virol 2001 75 19 p 9297 301 47 Govorkova E A et al Lethality to ferrets of HSN1 influenza viruses isolated from humans and poultry in 2004 J Virol 2005 79 4 p 2191 8
57. de abgesaugt und 4 ml OptiMEM P S zu den Kulturen gegeben Es erfolgte eine weitere Inkubation von 24 48 Stunden bei 37 C und 5 CO W hrend dieser Zeit wurden infekti se Viren in das Medium freigesetzt die zur Weiterpassage genutzt wurden MDCK II Zellen in 6cm Sch lchen wurden einmal mit PBS 0 2 BSA gewaschen Zu diesen Zellen wurde 1 ml des Mischkultur berstandes sowie 3 ml Medium MEM 0 2 BSA 0 5 FCS Glut P S gegeben Nach 2 4 Tagen waren alle Zellen durchinfiziert und ein ausreichender Titer f r die Produktion eines Virus Stocks in H hnereiern oder MDCK II Zellen erreicht 3 14 Plaquereinigung Um nach dem Virusrescue ein klonales Virus f r weitergehende Versuche zu erhalten wurden nacheinander zwei Plaquereinigungsschritte durchgef hrt 39 Methoden Durchf hrung Es wurde ein Plaquetest siehe 3 4 ohne Kristallviolettf rbung durchgef hrt und anschlie end wird ein einzelner Plaque mit der dar ber liegenden Agarschicht ausgestochen Dieser Plaque wurde in 1 ml PBS 0 2 BSA bei 4 C ber Nacht gel st Das gel ste Virus wurde anschlie end im embryonierten H hnerei oder in Zellkultur vermehrt siehe Kap 3 1 oder 32 3 15 DNA Sequenzierung Die DNA Sequenzierung wurde nach der Didesoxymethode nach Sanger auch bezeichnet als Kettenabbruchmethode durchgef hrt hnlich der PCR wird die doppelstr ngige DNA durch Erhitzung aufgeschmolzen und von einem Primer ausgehend ein komplement rer Stran
58. der 24 Well Platten wurde abgesaugt und die Zellen wurden mit 500ul Aceton Methanol 20 C 15 Minuten bei 20 C fixiert Anschlie end wurde mit 500ul PBSaer 0 1 Triton X100 10 Minuten permeabilisiert und danach dreimal 15 Minuten mit PB Saef gewaschen Die Platten wurden ber Nacht bei 4 C in PBSaer gelagert und am n chsten Morgen in PBSder 1 BSA eine Stunde geblockt Als Erstantik rper wurde ein polyklonaler Antik rper gegen den N Terminus von NS1 aus Ziege Santa Cruz Biotechnology in PBSaer 1 BSA 1 100 verd nnt 50 ul mit je 1 ug DAPI auf gespannten Parafilm vorgelegt und das Deckgl schen kopf ber auf die Antik rperl sung gelegt Nach zwei Stunden wurde das Deckgl schen zur ck in die 24 Well Platte gelegt und dreimal mit PBSaer 15 Minuten gewaschen W hrenddessen wurde der Rhodamin gekoppelte Zweitantik rper in PBSaer 0 1 Tween 1 Milchpulver 1 500 verd nnt 50 ul dieser Verd nnung wurden auf gespannten Parafilm vorgelegt Nach dem Waschvorgang wurde das Deckgl schen kopf ber auf die zweite Antik rperl sung gelegt und 1 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert Nach dreimaligem Waschen mit PBSaer wurde das Deckgl schen kopf ber mit 15 ul Mowiol auf einem Objekttr ger fixiert Die Pr parate wurden im Dunklen aufbewahrt und mit einem Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 ApoTome Firma Zeiss betrachtet und fotografiert 3 25 Rezeptorbindungs Assay 96 Well Platten wurden mit einer 0 1 igen w v Fetuinl sung beschi
59. die 7 5h nach Infektion beobachtet wurden f llt auf dass diese im Fall des 984wt Virus am st rksten reduziert sind Sie betr gt nur 1 9 der Menge der Positivkontrolle Transfektion der Zellen mit PolyIC Nur geringf gig mehr Induktion ist mit 4 bei einer Infektion mit dem 984 HP LP Virus zu erkennen Im Vergleich zu diesen beiden Viren kommt es durch die Infektion mit den Mutanten mit niedrigpathogener NES Sequenz 984 LP LP und 984 LP HP zu einer Hochregulierung der Interferon B mRNA Transkription Diese betr gt 34 bzw 39 der Induktion durch polyIC ist aber gegen ber der PBS Kontrolle um das 13 15fache erh ht Der Interferon B Antagonismus korreliert offenbar mit dem Vorhandensein der hochpathogenen NES Sequenz im NS1 Protein welche zu einer Akkumulation des Proteins im Zytoplasma f hrt 81 Diskussion 5 Diskussion 5 1 Ziel der Arbeit Avi re Influenza A Viren werden aufgrund der durch sie hervorgerufenen Erkrankungen in domestiziertem Gefl gel in die Gruppen der niedrigpathogenen LPAI Viren und hochpathogenen Viren HPAI Viren unterteilt W hrend niedrigpathogene Viren in den meisten F llen nur durch milde Krankheitssymptome und verringerte Eiproduktion auff llig werden stellen hochpathogene avi re Influenza A Viren ein massives Risiko f r die Gefl gelindustrie dar da diese Viren Mortalit tsraten von bis zu 100 verursachen k nnen Des Weiteren sind einige dieser Viren H5N1 H7N7 in der Lage Menschen zu in
60. dieses wie aus 4 5 4 hervorgeht zu einer Zunahme des Exports von NS1 in das Zytoplasma f hrt Diese Zunahme des nukle ren Exports wird durch die beiden Mutationen 1136V N139D ausgel st was wie die C terminale Deletion zu einer Erh hung der Infektiosit t und der Pathogenit t f hrt vgl MDT und EID50 von 984wt und 984LP HP in Abb 4 14 und 4 15 Die auch in den Immunfluoreszenzaufnahmen in Abb 4 17 A und D erkennbare Verst rkung der Export F higkeit des NS1 mit der NES Sequenz der HPAI Viren gegen ber dem Signal der LPAI Viren Abb 4 17D und E korreliert mit einer Inhibition der IFN B mRNA Produktion In Abb 4 18 ist gezeigt dass die Mutationen im NES des NS1 der hochpathogenen Viren unabh ngig von dem durch die Deletion des C Terminus entstandene NoL Signal zu einer Abnahme der IFN B mRNA Menge f hren Eine gr ere Menge des NS1 Proteins im Zytoplasma kann durch vielf ltige Interaktionen die Induktion von IFN B entsprechend st rker hemmen Es wurde gezeigt dass die PKR Kinase welche normalerweise Doppelstrang RNA identifizieren kann im Zytoplasma durch NS gebunden wird was zu einer Unterbrechung des Interferon Verst rkungs Zyklus f hrt Li et al 2006 Auch RIG I ein zellul res Protein das ebenfalls im Zytoplasma vorzufinden ist kann die 5 Phosphat Gruppen von nicht zellul rer RNA erkennen und dadurch die IFN induzieren Pichlmaier et 90 Diskussion al 2006 NS1 kann durch direkte oder indirekte B
61. e 1x DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium mit 10 FCS f tales K lberserum 1 P S Penicillin und Streptomycin und 1 Glut L Glutamin MDCK N ben tigten als Medium 1x MEM Minimum Essential Medium mit 10 FCS 1 Glut und 1 P S 3 5 1 Herstellung von prim ren Zellen Die Herstellung der prim ren Zellen avi ren Ursprungs CEF DEF und TEF erfolgt aus 11 13 Tage alten Embryonen Diese wurden 11 bzw 13 Tage lang bei 37 C in feuchter Atmosph re mit zwei bzw vier t glichen Drehungen um 180 bebr tet Um zun chst an den Embryo zu gelangen wurden die Eier im Bereich der Luftblase desinfiziert Die Eischale sowie die Eihaut wurden nach dem ffnen des Eies am oberen Ende vorsichtig mit Hilfe einer sterilen Pinzette entfernt Der Embryo konnte nun am Hals aus dem Ei herausgezogen und in eine Gewebekulturschale berf hrt werden Der Kopf wurde abgetrennt der restliche Torso in einen Schnabel Kolben gegeben und zweimal mit je 200ml 1x GKN Puffer gewaschen Anschlie end nahm man den Torso in 300ml 1x GKN Puffer mit 2 5 Trypsin 1 10 auf und lie ihn zweimal f r jeweils 40min bei 100rpm auf dem Magnetr hrer r hren Durch die Zugabe von Trypsin l sten sich langsam die Fibroblasten von den Embryonen ab Der berstand wurde durch einen Gazetrichter gefiltert in Zentrifugenbecher gleichm ig abgef llt und f r 10min bei 2000rpm und Raumtemperatur in der Minifuge zentrifugiert W hrend dieses Vorgangs setzten sich die is
62. e Todeszeit infizierter Embryonen 4 4 4 Untersuchung der Rezeptorspezifit t des H magglutinins 4 4 5 Freisetzung neu gebildeter Viren Charakterisierung der NS1 Mutanten 4 5 1 Wachstum auf avi ren Zellen 4 5 2 Mittlere Todeszeit infizierter Embryonen 4 5 3 Infektiosit t der NS1 Virusmutanten 4 5 4 Intrazellul re Lokalisation der NS1 Mutanten 4 5 5 Interferon Antagonismus der NS1 Mutanten Ziel der Arbeit Charakterisierung reassortierter Influenzaviren Die HA Kopfglykane als Pathogenit tsdeterminante avi rer Influenza A Viren Mutationen der Lokalisationssignale des NS1 beeinflussen die Virulenz avi rer Influenzaviren 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Abk rzungsverzeichnis 9 Lebenslauf 10 Eidesstattliche Erkl rung Danksagung 56 58 59 59 59 60 60 62 62 63 71 72 73 74 74 75 76 77 80 82 83 84 88 92 93 104 107 111 112 Einleitung 1 Einleitung 1 1 Taxonomie Avi re Influenza A Viren werden der Familie der Orthomyxoviren zugeordnet Hierbei handelt es sich um lipidumh llte Viren mit segmentiertem einzelstrangigem RNA Genom in negativer Orientierung Die Familie besteht aus den Genera der Influenza A B C der Thogoto und Isaviren siehe Tab 1 1 Nur Influenza A B und C Viren sind humanpathogene Erreger W hrend Influenza B und C Viren neben dem Menschen nur Seehunde bzw Schweine infizieren k nnen Baigent amp McCauley 2003 haben d
63. el st hatten Die gel sten MDCK II Zellen wurden in 9 ml OptiMEM resuspendiert Je 3 ml wurden zu den 293T Zellen gegeben Zu der 38 Methoden Mischkultur wurden noch 37 ml OptiMEM gegeben und anschlie end je 4 ml auf 6cm Sch lchen verteilt Im Brutschrank wurde die Mischkultur bei 37 C ber Nacht f r maximal 16 Stunden inkubiert F r die Transfektion wurde ein Ansatz aus den 7 Poll und 1 pHH21 Plasmid sowie den 4 Expressionsplasmiden zu je 1 ug jedes Plasmids erstellt Die Ausnahme bildete das PA Expressionsplasmid von welchem nur 0 2 ug zu dem Ansatz pipettiert wurde Die Ans tze wurden auf Eis in 1 5 ml Reaktionsgef e pipettiert und anschlie end je 250 ul OptiMEM P S zugegeben Zus tzlich wurden pro Ansatz 230 ul OptiMEM P S mit 20 ul Lipofectamin in einem extra Reaktionsgef vermischt Alle Ans tze wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Anschlie end wurden in die Reaktionsgef e mit 250 ul Plasmide OptiMEM 250 ul des Lipofectamin OptiMEM Ansatzes gegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Die Mischkulturen vom Vortag wurden w hrend der Inkubationszeit einmal mit PB Saef gewaschen Anschlie end wurde 3 5 ml 37 C warmes OptiMEM P S zu jedem Sch lchen gegeben Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde jeder Ansatz in ein 6cm Sch lchen mit Mischkultur gegeben Die Zellen wurden im Brutschrank f r 10 16 Stunden bei 37 C und 5 CO inkubiert Danach erfolgte ein Mediumwechsel Das alte Medium wur
64. ellt 56 Ergebnisse Wachstum der Reassortanten auf CEF e 984wt 1 00E 08 984 1082 PB1 1 00E 07 o 984 1082 PB2 x 984 1082 PA 1 00E 06 984 1082 HA Tryp 1 00E 05 m 984 1082 HA Tryp 1 00E 04 a 984 1082 NP a s 984 1082 M 1 00E 03 o 984 1082 NA 1 00E 02 E 984 1082 NS 1 00E 01 1 00E 00 h p i Abb 4 2 Konfluent gewachsene H hnerembryofibroblasten wurden mit einer MOI von 4x 10 infiziert Der berstand der mit den verschiedenen Reassortanten infizierten H hnerembryofibroblasten wurde 16 24 48 und 72 h p i auf Virusmenge berpr ft Aus den gewonnenen Daten geht hervor dass der Austausch des NS sowie des HA Segments von 984 zu 1082 zu einem verringerten Wachstum der reassortierten Viren f hrt Der Austausch des HAs ohne zus tzliche Zugabe von Trypsin 984 1082 HA Tryp l sst den Virustiter im berstand der infizierten H hnerembryofibroblasten CEF auf maximal 7x10 pfu ml steigen siehe Kap 1 10 Mit Zugabe von Trypsin 984 1082 HA Tryp erreicht der Titer 6 3x10 pfw ml Der Titer des 984 Wildtyp Virus 984wt hingegen liegt bei ca 1 1x10 pfw ml und ist somit um den Faktor 18 h her als der Titer der Reassortante 984 1082 HA unter Zugabe von Trypsin Diese Differenz weist auf einen Virulenzfaktor im HA Protein hin der nicht durch die Entstehung der multibasischen Spaltstel
65. en Anti Kaninchen HRP Antik rper und DAB Anf rbung Die Schnitte wurden anschlie end HE gegen gef rbt Die Bilder zeigen in 400facher Vergr erung gro e Blutgef e A D sowie Herz E H Lunge I L und Magen M P der Embryonen in 63facher Vergr erung Endothel 70 Ergebnisse 4 4 3 Mittlere Todeszeit infizierter Embryonen Um Unterschiede in der Pathogenit t der Viren f r den avi ren Wirt zu ermitteln wurden die mittleren Todeszeiten Mean death time MDT infizierter H hnerembryonen wie in Kap 3 21 beschrieben bestimmt Infiziert wurde mit einer Dosis die ausreichend ist um 100 der Embryonen zu infizieren Die GO Mutante zeigt in Abb 4 9 die geringste Pathogenit t mit einer MDT von 86h p i w hrend die Gl Variante nur knapp 30h ben tigt um alle Embryonen zu t ten Das G2 Virus zeigt einen intermedi ren Ph notyp mit einer MDT von fast 70h Die beschleunigte systemische Ausbreitung der Viren mit zus tzlichem Glykan an Position 123 in geringerem Ma auch Viren mit Glykan an Position 149 f hrt zu einer drastischen Verk rzung der MDT der infizierten H hnerembryonen Die Elimination jeglicher Glykosylierung an der Rezeptorbindungsstelle des HAs bewirkt eine Verlangsamung der Virusausbreitung woraus im weiteren Verlauf der Infektion ein sp terer Todeszeitpunkt resultiert Mittlere Todeszeit 120 100 80 60 40 20 h p i Abb 4 9 Mittlere Todeszeit infizierte
66. en Segmenten des 984 Virus und je einem Segment des 1082 Virus besteht Es Konnte 83 Diskussion gezeigt werden dass nur der Austausch des HA und NS Segments zu einer signifikanten Ver nderung im Wachstumsverhalten der Viren auf avi ren Zellen f hrte siehe 4 2 3 Diese Ver nderung konnte auf nur wenige Unterschiede in der Genomsequenz zur ckgef hrt werden 4 2 4 und 4 2 5 Die HA Proteinsequenz des niedrigpathogenen 1082 Virus wies neben einer monobasischen Spaltstelle nicht die zus tzlich N Glykosylierung des hochpathogenen 984 Virus im Bereich der Rezeptorbindungsstelle auf Die Zugabe von Trypsin in den berstand der mit 984 1082HA Virus infizierten Zellen zur Nachspaltung des HAs mit monobasischer Spaltstelle f hrte nicht zur vollst ndigen Wiederherstellung der Virustiter des 984 Virus mit multibasischer Spaltstelle im HA Der Unterschied im Wachstumsverhalten wurde daher auf die zus tzliche N Glykosylierung des HAs des hochpathogenen 984 Virus zur ckgef hrt Das NS Segment kodiert f r zwei Proteine NS1 und NS2 wobei jedoch zwischen den beiden untersuchten Viren nur das NS1 Unterschiede in der Proteinsequenz aufwies Somit konnten neben der Glykosylierung des HAs auch diese Mutationen im NS1 als Pathogenit tsdeterminaten identifiziert werden 5 3 Die HA Kopfglykane als Pathogenit tsdeterminante avi rer Influenza A Viren Das H magglutinin von Influenza A Viren hat im Verlauf des Infektionszyklus zwei Funktionen
67. en und Pr sentationen Publikationen Gabriel G Abram M Keiner B Wagner R Klenk H D Stech J Differential Polymerase Activity in Avian and Mammalian Cells Determines Host Range of Influenza Virus Journal of Virology 2007 Vortr ge Keiner B Wagner R Herwig A Klenk H D Hemagglutinin Glycosylation Promotes Spread of Infection of a Highly Pathogenic Avian Influenza Virus H7N1 Options for the Control of Influenza VI Toronto Kanada 2007 108 Lebenslauf Gabriel G Abram M Keiner B Wagner R Klenk H D Stech J Differential Polymerase Activity in Avian and Mammalian Cells Determines Host Range of Influenza Virus Options for the Control of Influ enza VI Toronto Kanada 2007 Manz B Keiner B Klenk H D High Pathogenicity of an Avian Influenza Virus H7N1 is regulated by the Shuttling Ability of NS1 between Nucleolus and Cytoplasm Third European Congress of Virology N rnberg 2007 Keiner B Gabriel G Herwig A Klenk H D Endotheliotropism of the avian influenza virus SC35 and its mouse adapted variant SC35M Symposium des Forschungsschwerpunkts 1130 der DFG Oberb renburg 2007 Keiner B Wagner R Herwig A Klenk H D Enhanced Virus Growth Triggered by Head Glycans of Avian Influenza A Virus Hemagglutinin Jahrestagung Gesellschaft f r Virologie M nchen 2006 Stech J Keiner B Gabriel G Jung S Klenk H D Infektionen des Endothels Symposium des
68. eotide Kits Zellkultur Bakterienkultur Virusst mme Puffer und L sungen Ger te Virusanzucht im embryonierten H hnerei Virusvermehrung in MDCK II Zellen H magglutinationstest HA Test Plaquetest Zellkulturmethoden 3 5 1 Herstellung von prim ren Zellen 3 5 2 Passagieren von Zellkulturen 3 5 3 Lagerung von Zellkulturen einfrieren auftauen Isolierung viraler RNA 18 19 19 20 20 21 21 22 22 22 24 26 26 27 27 28 29 29 30 31 3 7 3 8 3 9 3 10 3 11 3 12 3 13 3 14 3 15 3 16 3 17 3 18 3 19 3 20 3 21 3 22 3 23 3 24 3 25 3 26 3 27 4 Ergebnisse 4 1 4 2 Klonierung mittels BD In Fusion TM Dry Down PCR Cloning Kit 3 7 1 Reverse Transkription 3 7 2 Polymerasekettenreaktion PCR mit Plasmid abh ngigen Primern In vitro Mutagenese Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien 3 9 1 Herstellung TSS kompetenter Bakterien 3 9 2 Transformation TSS kompetenter Bakterien 3 9 3 Transformation von XL10 Gold Ultracompetent Cells Bakterien PCR Restriktion von DNA Fragmenten Mini und Maxipr paration von Plasmid DNA aus Bakterien Virusrescue Plaquereinigung DNA Sequenzierung Pr paration von Embryonen und Herstellung von Gefrierschnitten In situ Hybridisierung 3 17 1 Herstellung der Sonde 3 17 2 Vorbehandlung der Gewebeschnitte 3 17 3 Hybridisierung 3 17 4 Visualisierung der gebundenen Sonde im histologischen Bild H matoxylin Eosin HE F rbung Im
69. er BDUni PB1 1 BDUni PB1 2 BDUni PA 1 BDUni PA 2 BDUni PB2 1 BDUni PB2 2 BDUni HA 1 BDUni NP 1 BDUni NP 2 BDUni N1 1 BDUni N1 2 BDUNI M 1 BDUni M 2 BDUni NS 1 BDUni NS 2 Mutageneseprimer HA GSI1 Narl Fo HA GS1 NarI Re HA GS2 BstUI Fo HA GS2 BstUI Re 5 CGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGCA 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGCA 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGTAC 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTAC 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAGCGAAAGCAGGTC 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTCG 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGG 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGGTA 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTA 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAGCAAAAGCAGGAGT 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGAGT 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAAGCAAAAGCAGGTAG 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGTAG 3 5 CGAAGTTGGGGGGGAAGCAAAAGCAGGGTG 3 5 GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAAGGGTG 3 5 GGAATAAGAACTAATGGCGCCACCAGTA CATGTAGG 3 5 CCTACATGTACTGGTGGCEGCCATTAGTTC TTATTCC 3 5 CTGTCAAACACAGACAACGCGACATTCC CGCAGATGACTAAG 3 5 CTTAGTCATCTGEGGGAATGTCEGCEGTTGT CTGTGTTTGA CAG 3 20 Ital NS VD IN fo Ital NS VD IN re Ital NS IN VD fo Ital NS IN VD re 2 6 Kits High Pure RNA Isolation Kit Material 5 GCTAATTTCTCAATCCTATTTAATCAACTAGAAAC 3 5 GTTTCTAGTTGATTAAATAGGATTGAGAAATTAGC 3 5 GCTAATTTCTCAGTCCTATTTGATCAACTAGAAAC 3 5 GTTTCTAGTTGATCAAATAGGACTGAGAAATTAGC 3 Roche Mannheim RNeasy Mini Kit Qiagen Hilden Qiaprep8 Miniprep Kit Qiagen Hilden Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen
70. esonderte Position nimmt die PBl mRNA ein Sie wird zus tzlich im Leserahmen 1 translatiert wodurch neben dem PB1 Protein das 87 Aminos uren lange PB1 F2 Protein synthetisiert wird welches eine Rolle im virusinduzierten Zelltod zu spielen scheint Chen et al 2001 Die Initiation findet dabei vermutlich durch ribosomales Scannen der PB1 mRNA statt Einleitung Eine Auflistung der verschiedenen RNA Segmente deren kodierte Virusproteine und ihre Funktionen liegt in Tabelle 1 2 vor RNA Segment L nge b 1 2341 Protein PB2 NS2 NEP Funktion Erkennung der Cap Struktur der Wirtszell RNA Komponente des viralen Polymerasekomplexes Komponente des viralen Polymerasekomplexes Endonuklease Aktivitat Immunevasion Komponente des viralen Polymerasekomplexes genaue Funktion unbekannt Typ I Membranprotein Oberfl chen Glykoprotein Homotrimer Rezeptorbindung proteolytische Aktivit t Fusionsaktivit t Antigendeterminante Monomer interagiert mit den viralen RNA Segmenten Ausbildung der Ribonukleoproteine RNPs Enkapsidierung von vRNA und antigenomischer RNA CRNA Kernimport der RNPs Typ H Membranprotein Oberfl chen Glykoprotein Homotetramer Abspaltung endst ndiger Neuramins uren Antigendeterminante Matrixprotein aktiv bei der Morphogenese am Kernexport der RNPs beteiligt Typ HI Membranprotein Protonenkanal f rdert die Freisetzung der Nukleokapside aus dem Endosom Nichtstrukturprotein im Cytopl
71. eszeit MDT siehe Kap 4 4 3 der untersuchten Glykosylierungsmutanten in H hnerembryonen best tigt werden Das Glykan an Position 149 und besonders das an Position 123 tragen zum beschleunigten Tod der infizierten Embryonen bei Beim Stamm A FPV Rostock 34 H7N1 welcher ebenfalls ber die beiden zus tzlichen Glykane an Position 123 und 149 des HAs verf gt konnte von Feldmann et al 2000 gezeigt werden dass die hohe Pathogenit t des Virus mit einer systemischen Verbreitung im H hnerembryo assoziiert ist Diese beruht auf der Infektion des Endothels das die W nde der Blutgef e in s mtlichen Organen des K rpers auskleidet Im infizierten H hnerembryo kann man beim G2 und GO Virus gegen ber dem G1 Virus eine deutlich verringerte Infektion des Endothels beobachten vg Abb 4 6 Besonders die GO Mutante ist in den endothelialen Bereichen der gro en Blutgef e Abb 4 6B sowie dem Endokard Abb 4 6F das die Innenw nde des Herzens auskleidet kaum mehr nachzuweisen Trotzdem k nnen sich alle Glykosylierungsmutanten systemisch im H hnerembryo ausbreiten siehe Abb 4 5 Hierbei f llt auf dass GO besonders das Herz und hier vermutlich Myozyten infiziert wie es bereits bei einem anderen hochpathogenen Virus A turkey England 50 92 91 H5N1 nachgewiesen werden konnte Kobayashi et al 1996 Das G2 wie auch das Gl Virus k nnen im Entenembryo im Endothel der gro en Blutgef e detektiert werden Abb 4 7 C D w hrend da
72. etroffen waren waren die HPAI Viren in der Lage viele weitere avi re Spezies wie Pfaue Strau e Enten und G nse zu infizieren Capua et al 2000 Capua und Mutinelli Case report 2001 Die HA und NA Gene der Virusisolate wurden gr tenteils sequenziert und phylogenetisch analysiert Banks et al 2001 Die Neuraminidase aller sequenzierten Isolate weist eine Deletion von 22 Aminos uren gegen ber dem n chstverwandten Wildvogelisolat 15 Einleitung A teal Taiwan WB 2 32 2TPFE2 98 auf Eine solche Deletion konnte bereits h ufiger bei der Einf hrung eines Wildvogelisolats in domestiziertes Gefl gel beobachtet werden Zhou et al 1999 Spackman et al 2003 und gilt als Ausweichreaktion des Virus auf den Selektionsdruck dem es in dem neuen Wirt ausgesetzt ist Die Spaltstelle des HAs der niedrigpathogenen Isolate weist gr tenteils das weit verbreitete Motiv PEIPKGRGLE auf Bei den hochpathogenen Viren wurde bis auf vier geringf gig abweichende Isolate die multibasische Sequenz PEIPKGSRVRRGLF nachgewiesen Des Weiteren konnten f r die sp ten Virusisolate zus tzliche Glykosylierungsstellen an Aminos ureposition 123 oder 149 im Rezeptorbindungsbereich des HAs festgestellt werden Auffallend hierbei ist dass alle hochpathogenen Viren mit multibasischer Spaltstelle ebenfalls ein Glykan an Position 123 des HAs besitzen 1 15 Problemstellung Im Verlauf der Influenza Epizootie in Italien kam es im Dezember 1999 zum ersten Au
73. fchen auf dem Boden der Wells 3 4 Plaquetest Diese Methode dient der quantitativen Bestimmung infekti ser Viruspartikel in einer Virussuspension Das Grundprinzip beinhaltet dass eine Verdiinnungsreihe des Ausgangsvirus auf eine Zellkultur wie beispielsweise MDCKII Zellen inokuliert und 27 Methoden anschlie end durch Zusatz von Agar verfestigt wird Der Agar erm glicht den Viren zwar die Ausbreitung auf benachbarte Zellen verhindert aber dass Viren weiter entfernte Zellen durch Diffusion im Medium infizieren k nnen Wenige Tage nach Infektion sind so genannte Plaques sichtbar Plaques sind voneinander abgrenzbare Bereiche abgestorbener Zellen Jeder Plaque geht durch die Infektion eines einzigen Virus hervor Der Plaquetiter einer Virussuspension wird in plaque forming units pfu ml angegeben Am Vortag wurden hierzu MDCKII Zellen in vierfacher Verd nnung auf 6 bzw 12 Well Platten gegeben und ber Nacht bei 37 C inkubiert MDCKII Zellen wurden in Minimal Essential Medium MEM mit 10 f talem K lberserum FCS kultiviert Am n chsten Tag wurden die konfluenten Zellen zun chst mit PBS 0 2 BSA gewaschen und anschlie end mit einer Verd nnungsreihe einer Virussuspension infiziert Die Verd nnungsreihe wurde in 10er Schritten durchgef hrt Die Infektion der MDCKII Zellen fand mit jeweils 333ul 6 Well Platte bzw 200ul 12 Well Platte pro Well der entsprechenden Virusverd nnung f r eine halbe Stunde 90 Minuten
74. fizieren und dort teils schwerwiegende Krankheitsverl ufe zu verursachen Ausbr che solcher HPAI Viren treten immer wieder in Gefl gelfarmen in der ganzen Welt auf und f hren in sehr wenigen F llen auch zu Infektionen im Menschen Der Ausbruch eines hochpathogenen avi ren H7N7 Virus f hrte beispielsweise im Februar 2003 in den Niederlanden zum Tod eines Veterin rs Bei weiteren 89 Personen die alle sehr engen Kontakt mit infiziertem Gefl gel hatten konnte ebenfalls eine Infektion nachgewiesen werden Fouchier et al 2004 Die 1997 erstmals in Hongkong aufgetretenen und immer noch kursierenden hochpathogenen avi ren HSNI Viren f hrten bis heute zur Infektion von 369 Menschen von denen 234 t dlich verliefen WHO Internetseite Trotz der relativ hohen Mortalit tsrate dieser Influenzaviren im Menschen handelt es sich jedoch nach wie vor um einen Tierseuchenerreger Bis zu diesem Zeitpunkt konnte eine bertragung von Mensch zu Mensch nach Informationen der WHO nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden Der relativ geringen Zahl menschlicher Opfer stehen gegen ber 30 Millionen tote V gel im Fall von H7N7 und mehr als 150 Millionen V gel die bis jetzt durch das H5N1 Virus zu Tode gekommen sind Die Virusisolate die in dieser Arbeit verwendet wurden konnten w hrend eines Ausbruchs von Viren des Subtyps H7N1 in Norditalien in den Jahren 1999 2000 isoliert werden Im Dezember 1999 kam es dort in Gefl gelzuchtbetrieben zum ersten Auftreten
75. flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus Virology 1997 234 1 p 31 41 151 Whittaker G M Bui and A Helenius Nuclear trafficking of influenza virus ribonuleoproteins in heterokaryons J Virol 1996 70 5 p 2743 56 152 Wiley D C and J J Skehel The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus Annu Rev Biochem 1987 56 p 365 94 102 Literatur 153 Wood G W et al Deduced amino acid sequences at the haemagglutinin cleavage site of avian influenza A viruses of H5 and H7 subtypes Arch Virol 1993 130 1 2 p 209 17 154 Yasuda J et al Regulatory effects of matrix protein variations on influenza virus growth Arch Virol 1993 133 3 4 p 283 94 155 Yuen K Y et al Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus Lancet 1998 351 9101 p 467 71 156 Zell R etal Prevalence of PB1 F2 of influenza A viruses J Gen Virol 2007 88 Pt 2 p 536 46 157 Zhirnov O P M R Ikizler and P F Wright Cleavage of influenza a virus hemagglutinin in human respiratory epithelium is cell associated and sensitive to exogenous antiproteases J Virol 2002 76 17 p 8682 9 158 Zhirnov O P and H D Klenk Control of apoptosis in influenza virus infected cells by up regulation of Akt and p53 signaling Apoptosis 2007 12 8 p 1419 32 159 Zhou N N et al Rapid evolutio
76. ftreten hochpathogener avi rer Influenzaviren HPAI Viren welche aus zuvor grassierenden Viren niedriger Pathogenit t LPAI Viren hervorgingen Banks et al 2000 Innerhalb weniger Monate kam es zu weiteren 412 Ausbr chen mit Mortalit tsraten von bis zu 100 Durch Sequenzanalysen konnten Mutationen in den meisten viralen Proteinen der beiden Gruppen nachgewiesen werden Die auff lligste Ver nderung zwischen HPAI und LPAI Viren war die Einf hrung einer multibasischen Spaltstelle im H magglutinin welche als Grundvoraussetzung f r eine erh hte Pathogenit t im avi ren Wirt gilt Weitere Auff lligkeiten waren die Entstehung einer zus tzlichen Glykosylierungsstelle in der N he der Rezeptorbindungsstelle des H magglutinins HA sowie Mutationen in den zellul ren Lokalisationssignalen des Nicht Struktur Proteins 1 NS1 die ausschlie lich in den hochpathogenen Varianten zu finden waren Um die Mutationen in den viralen Proteinen n her zu charakterisieren sollten rekombinante HPAI Viren des Isolats A ostrich Italy 984 00 hergestellt werden die jeweils nur ein Protein des LPAI Virus A chicken Italy 1082 99 tragen Zus tzlich sollten HPAI Virusmutanten hergestellt werden deren Glykosylierungsmuster an der Rezeptorbindetasche des HAs dem der LPAI Viren entspricht In einem weiteren Teil der Doktorarbeit sollten HPAI Varianten hergestellt werden deren NS1 Gene die entsprechenden LPAI Mutationen tragen Die hergestellten Virusmutanten s
77. g durch eine DNA Polymerase aufsynthetisiert In dem Reaktionsansatz befinden sich alle vier Desoxynucleotide sowie mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelte Didesoxynucleotide ddNTPs Jedes der vier verschiedenen ddNTPs ist mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzmarker versehen Der Einbau eines ddNTPs f hrt zu Kettenabbruchprodukten die in einer Kapillar Gelelektrophorese aufgetrennt und zur Fluoreszenz angeregt werden ber das Fluoreszenzsignal und die Strangl nge wird die Basensequenz der Ausgangs DNA als Chromatogramm ausgegeben Durchf hrung Die DNA Konzentration bei Plasmiden f r eine Probe sollte bei 200 ng liegen die Konzentration f r PCR Produkte bei 100 ng Ein Primer wurde in der Konzentration von 10 pmol hinzugegeben und das Gemisch auf ein Endvolumen von 6 ul mit H2O aufgef llt Die Proben wurden mit einem Megabace Sequenzierer Amersham Bioscience sequenziert Sequenzierprimer Je nach Gen wurde eine unterschiedliche Anzahl an Primern eingesetzt Da das NS Gen das k rzeste DNA Fragment im Influenza Genom ist wurde hierf r nur ein Forward und ein Reverse Primer ben tigt Das HA Gen ben tigte weitere innen liegende Primer 40 Methoden 3 16 Pr paration von Embryonen und Herstellung von Gefrierschnitten 11 13 Tage alte embryonierte Eier wurden wie in 3 1 beschrieben infiziert und fr hestens 36 Stunden nach Infektion kurz auf 4 C abgek hlt Anschlie end wurden Allantoisfl ssigkeit und Embryonen entno
78. ie Influenza A Viren ein breiteres Wirtsspektrum das viele S ugetier und Vogelarten einschlie t Wildlebende Wasserv gel stellen bei den Influenza A Viren vermutlich das prim re Wirtsreservoir dar Hinshaw et al 1980 Rott et al 1985 Mensch Influenza A Virus Influenza A Viren Influenza A Viren Schweine Pferde Robben Puten Enten M wen etc Influenza B Virus Influenza B Viren Influenza B Viren Robben Influenza C Virus Influenza C Viren Influenza C Viren Schwein Thogotovirus Thogotovirus Dhorivirus Rinder Schafe Ziegen Nagetiere Zecken als Vektor Isavirus Infectious Salmon Anemia Virus Lachse Tab 1 1 Unterteilung der Orthomyxoviridae und deren Wirte Die Anzahl der RNA Segmente unterscheidet sich in den verschiedenen Influenza Genera Acht f r Influenza A und B und sieben f r Influenza C Influenza A und Influenza B Viren besitzen jeweils ein Glykoprotein mit H magglutinations bzw Neuraminidase Aktivit t w hrend Influenza C Viren nur ein multifunktionelles Glykoprotein das H magglutinin Esterase Fusionsprotein auf der Virusoberfl che besitzen Herrler amp Klenk 1991 Die Einleitung Gliederung der Influenzaviren in die verschiedenen Genera A B und C erfolgt aufgrund der serologischen Unterschiede in ihren Nukleokapsid NP und Matrix M Proteinen 1980 vereinheitlichte die WHO die Nomenklatur f r Influenzaviren So werden der Reihenfolge nach der Typ die
79. ier die Tunica intima zu infizieren enorm eingeschr nkt 66 Ergebnisse Huhn Blutgef ss PBS GO G1 Abb 4 6 Zelltropismus der Glykosylierungsmutanten in H hnerembryonen Die 11 Tage alten Embryonen wurden mit je 1000 pfu infiziert 36h p i in 50 C kaltem Isopentan schockgefroren und anschlie end wurden 20um breite sagitale Schnitte angefertigt Mittels in situ Hybridisierung einer 5S markierten RNA Sonde gegen die virale NP mRNA wurde Virus schwarz in den Embryonenschnitten nachgewiesen und anschlie end HE gegengef rbt Die Bilder zeigen in 63facher Vergr erung gro e Blutgef e A D und Herz E H sowie Lunge I L der Embryonen in 180facher Vergr erung Myozyten o Endokard Endothel 67 Ergebnisse Magen Abb 4 7 Zelltropismus der Glykosylierungsmutanten in Entenembryonen Die 13 Tage alten Embryonen wurden mit je 1000 pfu infiziert 36h p i in 50 C kaltem Isopentan schockgefroren und anschlie end wurden 20um breite sagitale Schnitte angefertigt Immunhistochemischer Virusnachweis dunkelbraun mit Anti KP Serum Kaninchen Anti Kaninchen HRP Antik rper und DAB Anf rbung Die Schnitte wurden anschlie end HE gegen gef rbt Die Bilder zeigen in 400facher Vergr erung gro e Blutgef e A D sowie Herz E H Lunge I L und Magen M P der Embryonen in 63facher Vergr erung Endothel 68 Ergebnisse In den Schnitten der infizierten Entenembryonen ist zu erkenne
80. iert werden um die gelartige Masse der Photoemulsion zu schmelzen Die verd nnte Photoemulsion wird in 20 ml Aliquots in Szintillationsr hrchen abgef llt und anschlie end einzeln mit mindestens zwei Lagen Aluminiumfolie lichtdicht umschlossen Die verd nnte Photoemulsion ist bei 4 C gelagert 6 Monate lang haltbar Diese und die folgenden Schritte m ssen entweder in absoluter Dunkelheit oder bei geeignetem Rotlicht Safelight Filter No 2 durchgef hrt werden um eine vorzeitige Belichtung der Photoemulsion zu vermeiden Die vorverd nnte Photoemulsion wurde in ein spezielles Gef Hypercoat dipping vessel RPN 39 Amersham Pharmacia UK umgef llt Nach einer 5 min tigen Wartezeit wurden die Objekttr ger in die 42 C warme gebrauchsfertige Emulsion getaucht und bis zur v lligen Trocknung zusammen mit einer Schale hygroskopischer Silikagelkugeln ber Nacht bei Raumtemperatur aufgestellt In Objekttr gerk sten sortiert werden die Schnitte f r weitere 5 11 Tage bei 4 C bis zur Entwicklung aufbewahrt Die Dauer der Exposition hing von der zuvor durch den aufgelegten R ntgenfilm BioMax MR Kodak USA abgesch tzten Signalst rke der Hybridisierungsreaktion ab Die beschichteten Schnitte werden danach 5 Minuten in speziellem Entwickler D19 Kodak USA inkubiert 44 Methoden dann kurz in Wasser gesp lt und 10 Minuten in Fixierer Rapid Fixer Kodak USA vollst ndig entwickelt Die Photoemulsion ist bis auf die Stellen
81. ierten Zellen nachgewiesen werden Da jedoch bei beiden Methoden spezifisch infizierte Zellen angef rbt werden k nnen die Ergebnisse miteinander verglichen werden Infizierte Zellen erscheinen bei der in situ Hybridisierung schwarz angef rbt Beim immunhistochemischen Virusnachweis wurde im berblick des gesamten Torsos der infizierten Embryonen Abb 4 5 ein 800nm Fluoreszenz markierter Zweitantik rper verwendet der beim Scannen der Schnitte im Odyssey Ger t LICOR gr n abgebildet wird Durch die F rbung der Schnitte mit Hilfe von HRP gekoppeltem Zweitantik rper und DAB Behandlung erscheinen die detektierten Virusproteine im Mikroskop dunkelbraun Auff llig ist dass sich das Gl Virus in allen untersuchten Spezies systemisch ausbreiten kann W hrend die von der G2 Mutante infizierten Bereiche sich in Enten und Putenembryonen nur geringf gig von denen des Gl Virus unterscheiden l sst sich im H hnerembryo ein ausgepr gter Herztropismus erkennen Das GO Virus zeigt in allen drei Spezies die geringste Ausbreitungsgeschwindigkeit Im Huhn ist es haupts chlich im Herzen nachzuweisen kann jedoch punktuell auch in anderen Bereichen detektiert werden Im Putenembryo zeigt sich ebenfalls eine sehr punktuelle Verteilung der Infektion w hrend im Entenembryo haupts chlich Bereiche des Magen Darm Traktes betroffen sind 64 Ergebnisse Abb 4 5 Gewebstropismus der Viren GO G1 und G2 in infizierten H hner Puten und Entenembry
82. in der Lage an Erythrozyten zu adsorbieren Aufgrund dieser F higkeit entstehen in einer Virus Erythrozytensuspension Vernetzungen von Viren und Erythrozyten H magglutination Bei zunehmenden Virusverd nnungen und gleich bleibender Erythrozytenkonzentration unterbleibt ab einer kritischen Viruskonzentration die H magglutination Dadurch kann eine quantitative Aussage ber die entsprechende Viruskonzentration getroffen werden Eine so genannte H magglutinationseinheit HAU ist der reziproke Wert der Verd nnungsstufe bei der gerade noch eine H magglutination erfolgt und ist damit ein Ma f r den Virustiter Die Verd nnung der Virussuspension erfolgte in 2er Verd nnungsschritten auf einer 96 Well Mikrotiterplatte mit V f rmiger Vertiefung Zun chst wurden ab dem zweiten Well 50ul PBSaer vorgelegt 100ul der Virussuspension wurden ins erste Well pipettiert Aus diesem Well wurden 50ul Virus entnommen in die n chste Vertiefung gegeben und resuspendiert Die Verd nnungsreihe setzte sich fort indem 50ul aus der letzten Verd nnung ins n chste Well gegeben wurden Aus dem letzten Well wurden 50ul verworfen Zu den einzelnen Virusverd nnungen wurden nun 50ul einer 1 igen H hnererythrozytenl sung gegeben Nach einer 30min tigen Inkubationszeit dieser Virus Erythrozytensuspension bei 4 C konnten in einzelnen Wells Agglutinationen festgestellt werden Nicht agglutinierte Erythrozyten sedimentierten und bildeten so genannte Kn p
83. indung diese Aktivierung und somit den bergang der infizierten Zelle in den antiviralen Status blockieren Hatada und Fukuda 1992 Min und Krug 2006 Durch Inhibierung von IRF 3 und NF KB im Zytoplasma kann NS1 ebenfalls die IFN Transkription reduzieren Talon et al 2000 Wang et al 2000 Eine erh hte Konzentration an NS1 Protein im Zytoplasma kann durch die Interaktion mit dem eukaryotischen Translationsinitiator eIF4G zu einer verst rkten Translation viraler mRNAs f hren Burgui et al 2003 Aragon et al 2000 Des Weiteren sind in der fr hen Infektionsphase apoptotische Prozesse als antiviraler Mechanismus f r den viralen Replikationzyklus hinderlich Der apoptotische Prozess durch die Aktivierung des PI3K Akt Signalweges wird beispielsweise durch die Bindung von NS1 an die Phosphatidylinositol 3 Kinase PI3K im Zytoplasma verhindert Zhirnov und Klenk 2007 Ehrhardt et al 2007 Zudem konnte beobachtet werden dass die N terminale Dom ne des NS1 Proteins f r die Kontrolle der Caspase 1 abh ngigen Apoptose in infizierten prim ren humanen Makrophagen zust ndig ist Stasakova et al 2005 Weitere Vorteile die sich aus der vorrangig zytoplasmatischen Akkumulation des NS1 ergeben ist die verst rkte Interaktion mit der 2 5 Oligo A Synthetase Hierdurch wird die Aktivierung des RNaseL Signalwegs inhibiert was eine Degradation zellul rer und viraler RNA zur Folge h tte und f r das Virus von Nachteil w re Min und Kr
84. irale Neuraminidase nicht in der Lage ist direkt an das HA gebundene Neuramins uren abzuspalten k nnte eine h ufigere kurzzeitige Rezeptorabl sung des glykosylierten HAs dazu f hren dass die Neuraminidase vermehrt die M glichkeit erh lt die Rezeptoren zu entfernen Dies h tte eine vermehrte Freisetzung neugebildeter Viren zur Folge wie sie beim Gl und G2 Virus in Abb 4 11 dargestellt ist Abb 5 1 Modell der verbesserten Freisetzung von Viren mit zus tzlichem Glykan in der N he der Rezeptorbindungsstelle des Virusfreisetzung H magglutinins A Bei Viren ohne Glykan nahe der Rezeptorbindungstasche kommt es zu einer verringerten Freisetzung neugebildeter Viruspartikel Viele Viren bleiben durch die feste Bindung des HAs an die Rezeptoren oT auf der Zelloberfl che haften a or Ee N B Viren mit zus tzlichem Glykan aif ay nahe der Rezeptorbindungsstelle pE ae besitzen eine verringerte Affinitat Virusfreisetzung b zum zellul ren Rezeptor C Dies erleichtert der viralen el F Neuraminidase die Abspaltung des fsa o Rezeptormolek ls von der Oberfl che der infizierten Zelle b Dadurch kommt es zu einer verst rkten Freisetzung neu synthetisierter Viruspartikel Zusammengefasst l sst sich sagen dass zus tzliche Glykane nahe der Rezeptorbindungstasche des HAs den Prozess der Virusabl sung von der infizierten Zelle verbessern k nnen was h chst wahrscheinlich zu der beschleunigten
85. irol 1989 63 11 p 4603 8 67 Klenk H D and W Garten Host cell proteases controlling virus pathogenicity Trends Microbiol 1994 2 2 p 39 43 68 Klenk H D and R Rott The molecular biology of influenza virus pathogenicity Adv Virus Res 1988 34 p 247 81 69 Klenk H D et al Activation of influenza A viruses by trypsin treatment Virology 1975 68 2 p 426 39 70 Kobayashi Y et al Neuropathological studies of chickens infected with highly pathogenic avian influenza viruses J Comp Pathol 1996 114 2 p 131 47 71 Krug R M and R Soeiro Studies on the intranuclear localization of influenza virus specific proteins Virology 1975 64 2 p 378 87 72 Krug R M et al Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells the roles of the viral NS1 protein Virology 2003 309 2 p 181 9 73 Laemmli U K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970 227 5259 p 680 5 74 Lamb R A and C J Lai Conservation of the influenza virus membrane protein M1 amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment 7 encoding a second protein M2 in HINI and H3N2 strains Virology 1981 112 2 p 746 51 75 Lamb R A and M Takeda Death by influenza virus protein Nat Med 2001 7 12 p 1286 8 76 Lamb R A S L Zebedee and C D Richardson Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed
86. irus in eine neue Wirtszelle kann sich die fusogene Aktivit t des HAs nur bei gespaltenem Protein entwickeln Durch Umlagerung des HAs kommt es zur Fusion der viralen mit der endosomalen Membran die letztendlich zur Freisetzung der Nukleokapside in die Zelle und somit zur Virusreplikation f hrt Bei einigen Virusst mmen des H5 und H7 Subtyps wird diese Reifespaltung des H magglutinins bereits im TGN durchgef hrt Dort prozessiert die Subtilin hnliche Protease Furin das Protein in die zwei Untereinheiten HA und HA3 Stieneke Gr ber et al 1992 die jedoch durch eine Disulfidbr cke miteinander verbunden bleiben Voraussetzung daf r ist das Vorhandensein 10 Einleitung einer multibasischen Spaltstelle Die minimale Furin Erkennungssequenz ist R X K R R G wobei zwischen Arginin und Glycin gespalten wird Vey et al 1992 Da es sich bei Furin um eine ubiquit r vorhandene Protease handelt k nnen sich Viren mit multibasischer Spaltstelle systemisch im avi ren Wirt ausbreiten Bei den brigen Virusst mmen die nur eine mono oder dibasische Erkennungssequenz besitzen wird das HA auf der Zelloberfl che oder nach der Virusfreisetzung durch exogene Proteasen wie z B Tryptase Clara in der Lunge oder Trypsin hnliche Proteasen Garten et al 1981 Zhirnov et al 2002 nachgespalten Die Ausbreitung dieser Viren im Wirtsorganismus ist durch das Vorhandensein einer entsprechenden Protease beschr nkt Der Gewebstropismus und die Wirts
87. it PBSaer gewaschen und zus tzlich f r eine Stunde in PBSaer mit 1 BSA geblockt Nach dem Blocken wurde die Fl ssigkeit abgegossen und der erste Antik rper in PBSaer mit 1 BSA f r 90 Minuten bei Raumtemperatur hinzugegeben Nach erneutem dreimaligem Waschen mit PBSaer wurde der zweite Antik rper Infrarot Fluoreszenz markiert in PBSaer mit 0 1 Tween 1 Milchpulver verd nnt und f r 90 Minuten zu der Membran gegeben Die Membran wurde nochmals dreimalig mit PBSaer gewaschen Am Odyssey Ger t wurde die Membran eingescannt und einzelne Banden auf deren korrekte Laufh he und Intensit t untersucht 49 Methoden 3 23 Zellkern Zytoplasma Auftrennung Zur Konzentrationsbestimmung des NS1 Proteins in Zellkern und Zytoplasma infizierter Zellen wurde eine Auftrennung mittels des Nuclear Extraction Kits von IMGENEX durchgef hrt Dabei wird mittels eines hypotonischen Puffers eine Zelllyse herbeigef hrt und durch Abzentrifugieren der Zellkerne eine Fraktionierung durchgef hrt Die Fraktionen wurden in einem Proteingel aufgetragen Mittels Western Blot Verfahren konnten die Banden identifiziert und quantifiziert werden siehe 3 22 3 Die Durchf hrung erfolgte nach dem im Benutzerhandbuch aufgef hrten Kapitel V NUCLEAR EXTRACTION KIT PROCEDURE A Preparation of Nuclear Extract from Cells von IMGENEX 3 24 Intrazellul rer Proteinnachweis mittels indirekter Immunfluoreszenz Der Nachweis von Proteinen mittels Immunfluoreszenz
88. it denen man hervorragend diskutieren aber auch durchaus einmal eine kleine Feier starten konnte Zum Schluss m chte ich mich noch ganz besonders bei meiner gesamten Familie und meiner Traumfrau Andrea bedanken die mich durch meine Doktorarbeit begleitet und mich in jeder erdenklichen Weise unterst tzt haben 112
89. k nnen mittels Elektroblotting auf eine Nitrozellulose NC Membran transferiert werden Dabei wandern die durch SDS negativ geladenen Proteine in Richtung Anode und binden durch hydrophobe Wechselwirkungen an die NC Membran Durchf hrung Als Vorbereitung f r den Transfer wurden Filterpapiere zugeschnitten und mit den in der Tabelle angegebenen Puffern getr nkt F r den Semi Dry Blot wurden die Papiere Membran und Gel zwischen zwei Graphitelektroden wie folgt geschichtet 48 Methoden Kathode 9 Filterpapiere Getr nkt mit Kathodenpuffer SDS Gel NC Membran Befeuchtet mit Anodenpuffer II 6 Filterpapiere Getr nkt mit Anodenpuffer I 3 Filterpapiere Getr nkt mit Anodenpuffer I Anode Die f r den Transfer ben tigte Stromst rke l sst sich aus der Fl che des Gels berechnen 0 8 mA cm Der Transfer erfolgte dementsprechend bei einer zu blottenden Membran f r 75 Minuten bei 43 mA 3 22 3 Detektion viraler Proteine auf Western Blots mittels Odyssey Technik Mittels des Odyssey Systems K nnen mit einem Infrarot Fluoreszenz Farbstoff gekoppelte an die Membran gebundene Antik rper bei der gegebenen Wellenl nge detektiert werden und die entsprechenden Banden mit einem Marker verglichen werden Durchf hrung Nach dem Semi Dry Blot wurde die Membran vorsichtig aus der Blotkammer genommen und bei 4 C ber Nacht in PBSaer mit 10 Milchpulver geblockt Am n chsten Morgen wurde die Membran dreimal 10 Minuten m
90. le im HPAI Virus 984wt zu erkl ren ist Eine noch deutlichere Differenz im Virustiter kann nur beobachtet werden wenn das 1082 NS Segment in den Hintergrund des 984 Virus eingebracht wird 984 1082 NS Mit maximal 1 6x10 pfu ml liegt dieser ca um das 680fache niedriger als im Uberstand der mit 984wt Virus infizierten CEF 57 Ergebnisse Der Austausch eines der anderen Segmente f hrt in der Wachstumskurve der entsprechenden Reassortanten 984 1082 PB1 984 1082 PB2 984 1082 PA 984 1082 NP 984 1082 NA und 984 1082 M nicht zu einer signifikanten Ver nderung im Vergleich zum 984wt Virus 4 2 4 Sequenzvergleich LPAI vs HPAI H magglutinin Das HA Protein des 1082 Virus LPAI unterscheidet sich neben der inserierten multibasischen Spaltstelle 338 341 in weiteren acht Aminos uren von dem des HPAI 984 Virus siehe Tab 4 2 Die auff lligste Ver nderung ergibt sich aus dem Austausch des Alanins zu Threonin an Position 125 was zur Entstehung einer zus tzlichen Glykosylierungsstelle in der N he der Rezeptorbindungstasche f hrt Weitere LPAI Viren der Italien Epizootie entwickelten zudem ein zus tzliches Glykan an Aminos ureposition 149 siehe Kap 1 13 Diese Glykosylierungsstellen wurden im Laufe dieser Arbeit n her untersucht Position Hl Numerierung Mutation 119 T gt A 125 ADT 128 ADT 184 V gt 2G 217 ADE 338 341 Insertion SRVR 444 AT 457 Q gt L 543 K gt R Tab 4 2 P
91. leoprotein NP is a nonconventional nuclear localization signal J Virol 1997 71 3 p 1850 6 143 Wang S H et al Intracellular localization and determination of a nuclear localization signal of the core protein of dengue virus J Gen Virol 2002 83 Pt 12 p 3093 102 144 Wang W and R M Krug The RNA binding and effector domains of the viral NSI protein are conserved to different extents among influenza A and B viruses Virology 1996 223 1 p 41 50 145 Wang W and R M Krug U6atac snRNA the highly divergent counterpart of U6 snRNA is the specific target that mediates inhibition of AT AC splicing by the influenza virus NS1 protein Rna 1998 4 1 p 55 64 146 Wang W et al RNA binding by the novel helical domain of the influenza virus NS1 protein requires its dimer structure and a small number of specific basic amino acids Rna 1999 5 2 p 195 205 147 Wang X et al Influenza A virus NSI protein prevents activation of NF kappaB and induction of alpha beta interferon J Virol 2000 74 24 p 11566 73 148 Webby R J and R G Webster Emergence of influenza A viruses Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2001 356 1416 p 1817 28 149 Webster R G W G Laver and B Tumova Studies on the origin of pandemic influenza viruses V Persistence of Asian influenza virus hemagglutinin H2 antigen in nature Virology 1975 67 2 p 534 43 150 Westaway E G et al Proteins C and NS4B of the
92. llen mit PBSaer gewaschen anschlie end mit Trypsin EDTA abtrypsiniert und in 5 ml Medium 1x DMEM 10 FCS P S Glut aufgenommen Nach 5 miniitiger Zentrifugation bei 1000U wurde der Uberstand verworfen und das Zellpellet erneut in 5 3 ml des identischen Mediums resuspendiert Als Gefrierschutzmittel zur Kryokonservierung wurden jeweils 750 ul steriles DMSO Dimethylsulfoxid hinzugegeben und je 1 5 ml der Zellsuspension auf vier Einfrierr hrchen verteilt Zum Einfrieren wurden die R hrchen ber Nacht in einem Isopropanoltank bei 80 C gelagert und am n chsten Tag in fl ssigen Stickstoff berf hrt Zum Auftauen der Zellen wurden die Zellen dem Stickstofftank entnommen und direkt bei 37 C inkubiert bis die Zellen vollst ndig aufgetaut waren Die Zellen wurden vorsichtig resuspendiert und mit dem entsprechenden Medium 1x DMEM 10 FCS P S Glut in Plastikgef e 6 cm Sch lchen 75 cm Flaschen nach Bedarf verteilt Die Zellen wurden im 30 Methoden Brutschrank bei 37 C 5 CO und konstanter Luftfeuchtigkeit ber Nacht inkubiert Am n chsten Tag wurde ein Mediumwechsel durchgef hrt um das verbliebene DMSO zu entfernen und die Zellkultur erneut bei 37 C inkubiert 3 6 Isolierung viraler RNA Zur Isolierung viraler RNA aus Allantoisfl ssigkeit und Zell berst nden wurden die drei Kits RNeasy Mini Kit Qiagen High Pure RNA Isolation Kit Roche und QlAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen verwendet
93. mit in der Lage sind einem auf sie wirkenden Selektionsdruck zu entgehen Zum einen besitzt die RNA abh ngige RNA Polymerase keine Korrekturlesefunktion Proofreading so dass es bei der Replikation zu der relativ hohen Fehlerrate von 10 Mutationen pro Nukleotid kommt Durch den Erwerb von Punktmutationen in antigenen Bereichen der Oberfl chenproteine k nnen neue Subtypvarianten entstehen die nicht mehr vom Immunsystem erkannt werden Diesen Vorgang bezeichnet man als antigenic drift Zum anderen gibt es die M glichkeit des Austausches ganzer Gensegmente zwischen verschiedenen Influenza Subtypen Solche Reassortanten k nnen entstehen wenn eine Zelle von zwei verschiedenen Influenzaviren infiziert wird und bei der folgenden Zusammenlagerung der Nachkommenviren ein Austausch von Segmenten stattfindet Sind die Gensegmente der Oberfl chenproteine vom Reassortment betroffen kann es zum antigenic shift der Entstehung neuer Subtypen mit stark abweichender Antigenit t kommen Scholtissek 1979 S dostasien ist h ufig der Ursprung solcher Reassortanten da dort Menschen Schweine und V gel auf engstem Raum zusammenleben 7 Einleitung Schweine k nnen sowohl von avi ren als auch von humanen Influenzaviren infiziert werden und stellen somit eine Art von Mischgef f r die Rekombination der viralen RNA Segmente dar Scholtissek et al 1993 In j ngster Vergangenheit kam es jedoch ebenfalls zu schwerwiegenden Erkrankungen bei Mensche
94. mmen Den Embryonen wurden Kopf Fl gel und Beine mit einer Schere abgetrennt und der Rumpf danach f r maximal 10 Sekunden in auf 50 C gekiihltes Isopentan getaucht und somit schockgefroren Die schockgefrorenen Embryonen k nnen anschlie end bei 80 C bis zu zwei Jahre lang aufbewahrt werden Am Kryotom Frigocut 2800 N Fa Reichert Jung k nnen von den so pr parierten Embryonen bei 20 C 20 um dicke Gefrierschnitte angefertigt werden Diese werden anschlie end auf SuperFrost Objekttr ger Fa Menzel Gl ser aufgebracht und k nnen nach Lufttrocknung wie die schockgefrorenen Embryonen bei 80 C gelagert werden 3 17 In situ Hybridisierung Mit Hilfe der in situ Hybridisierung l sst sich unter anderem mRNA oder virale RNA in Zellen und Geweben spezifisch darstellen F r die spezifische Erkennung werden RNA Sonden in komplement rer Orientierung zu der zu detektierenden RNA verwendet Diese Sonden lassen sich durch den Einbau von S markiertem dUTP kennzeichnen und k nnen so im Gewebe mittels einer speziellen Photoemulsion dargestellt werden In dieser Arbeit wurde die in situ Hybridisierung zur Detektion viraler RNA in Gefrierschnitten von H hnerembryonen verwendet 3 17 1 Herstellung der Sonde F r die in situ Hybridisierung werden S markierte RNA Sonden verwendet da sie spezifisch mit der gew nschten Zielsequenz hybridisieren k nnen Diese Eigenschaft von RNA Sonden beruht auf der gro en Stabilit t v
95. munhistochemische Odyssey Anf rbung von Schnitten Immunhistochemische DAB Anf rbung Bestimmung der Mittleren Todeszeit MDT und der Egg Infectious Dose 50 EID50 Western Blot 3 22 1 SDS PAGE 3 22 2 Western Transfer von Proteinen auf Nitrozellulose Semi Dry Blot 3 22 3 Detektion viraler Proteine auf Western Blots mittels Odyssey Technik Zellkern Zytoplasma Auftrennung Intrazellul rer Proteinnachweis mittels indirekter Immunfluoreszenz Rezeptorbindungs Assay Virusfreisetzungs Assay Interferoninduktion und Interferon B mRNA spezifische RT PCR Uberblick Herstellung und Charakterisierung von Influenza Reassortanten 4 2 1 Herstellung rekombinanter Viren des Stammes A chicken Italy 1082 99 4 2 2 Herstellung von Reassortanten 31 31 32 33 35 35 35 36 36 37 37 38 39 40 41 42 42 43 43 44 45 45 46 47 47 47 48 49 50 50 51 52 52 54 55 55 55 4 3 4 4 4 5 5 Diskussion 5 1 5 2 5 3 5 4 4 2 3 Wachstum der Virusreassortanten auf avi ren Zellen 4 2 4 Sequenzvergleich LPAI vs HPAI H magglutinin 4 2 5 Sequenzvergleich LPAI vs HPAI NS1 Herstellung rekombinanter Virusmutanten 4 3 1 Mutagenese der poll HA Plasmide 4 3 2 Mutagenese der polV polII NS Plasmide 4 3 3 Rescue der Virusmutanten Charakterisierung der HA Glykosylierungsmutanten 4 4 1 Wachstum auf verschiedenen avi ren Zellen 4 4 2 Gewebstropismus in verschiedenen avi ren Embryonen 4 4 3 Mittler
96. n dass sich das G1 und das G2 Virus in ann hernd gleichem Ausma in den Endothelzellschichten der gro en Blutgef e vermehrt Abb 4 7 C und D Das GO Virus hingegen kann dort wie bereits zuvor in den infizierten H hnerembryonen kaum nachgewiesen werden Abb 4 7 B Auch im Herz kann die GO Mutante nur schwach detektiert werden Abb 4 7 F w hrend das Herz der mit G1 und G2 Virus infizierten Embryonen stark braun angef rbt ist Abb 4 7 G und H Auch in den Endothelien der Lunge siehe 4 7 J L und des Magens ist die Replikation der GO Mutante im Vergleich zum Gl und G2 Virus stark verringert W hrend die braune Anf rbung der Virusproteine entlang der Gef e in der Magenwand beim G1 und dem G2 Virus in Abb 4 7 O und P deutlich zu erkennen ist handelt es sich bei der GO Mutante 4 7 N nur um eine punktuelle lokal begrenzte Infektion Die Virusausbreitung im Putenembryo weicht nur geringf gig von der im Entenembryo ab Abb 4 8 Jedoch l sst sich hier eine deutlichere Infektion der Endothelien besonders in den gro en Blutgef e durch das GO Virus nachweisen Abb 4 7 B 69 Ergebnisse Magen Abb 4 8 Zelltropismus der Glykosylierungsmutanten in Putenembryonen Die 11 Tage alten Embryonen wurden mit je 1000 pfu infiziert 36h p i in 50 C kaltem Isopentan schockgefroren und anschlie end wurden 20um breite sagitale Schnitte angefertigt Immunhistochemischer Virusnachweis dunkelbraun mit Anti KP Serum Kaninch
97. n durch Influenza A Viren avi ren Ursprungs 1 6 Epidemiologie der menschlichen Influenza Die j hrlich auftretenden Influenza A Epidemien finden auf der n rdlichen Hemisph re von Oktober bis April und auf der s dlichen Hemisph re von Mai bis September statt Die Krankheit bertr gt sich durch Aerosole so da einer Ansteckung schlecht vorgebeugt werden kann In den Jahren 1918 1957 und 1968 gab es drei gro e Influenza Pandemien Fast alle hatten ihren Ursprung in S dostasien und breiteten sich von dort nach Europa aus In der Zeit zwischen den gro en Pandemien kommt es zu kleineren Epidemien Eine Influenza Pandemie zeichnet sich durch die beiden Eigenschaften der weltweiten Ausbreitung sowie hoher Mortalit tsraten aus Webster amp Laver 1975 Treten neue Influenza A Subtypen auf oder kommt es zur Wiederkehr eines alten Subtyps hat der Gro teil der Bev lkerung noch keine sch tzende Immunit t gegen die neuen Oberfl chenantigene der Viren entwickelt Die neutralisierenden Antik rper gegen einen bekannten Subtyp kreuzreagieren nicht mit dem neu auftretenden Subtyp Somit kann sich ein neuer Subtyp in der Bev lkerung ungehindert ausbreiten Dem Ursprung einer Pandemie liegt eine bertragung eines urspr nglich avi ren Virus auf einen S ugetierwirt zu Grunde Die Adaptation an den neuen Wirt kann entweder durch fortlaufende Mutationen oder durch Reassortierung zustande kommen siehe 1 5 Die Pandemie von 1918 war die schlimms
98. n of HSN1 influenza viruses in chickens in Hong Kong J Virol 1999 73 4 p 3366 74 103 8 Abk rzungsverzeichnis Abb APS bp BSA PC cDNA cRNA ddNTP dH gt 0 DMEM DMSO DNA dNTP ds E coli EDTA eIF 2a ER FCS Qa HA HEF IFN IRF kDa p SSH 1 Mda 5 MEM min Abk rzungsverzeichnis Ampere Abbildung Ammoniumpersulfat Basen Basenpaare bovines Serumalbumin Grad Celsius complementary DNA complementary RNA Didesoxynukleosidtriphosphat deionisiertes Wasser Dulbecco s modified Eagle s medium Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleins ure Desoxynukleosidtriphosphat double stranded Escherichia coli Ethylendinitrilotetraessigs ure eukaryotic translation initiation factor 2a Endoplasmatisches Retikulum f tales K lberserum Gramm Guanin Stunde H magglutinin H magglutinin Esterase Fusionsprotein Interferon interferon regulatory factors Kilo Kilodalton Liter Meter milli molar Matrixprotein melanoma differentiation associated gene 5 minimal essential medium Minute 104 mol mRNA u n NA NC NES NLS NP NSI NS2 NEP nt OD P S PA PAGE PB1 PB2 PBS PCR pfu Pfu pH PKR Pol poly A Rig I RNA RNP rpm RT RT S ss SDS Tab Taq TBE TEMED TGN TRIS TSS Abk rzungsverzeichnis Mol messenger RNA mikro nano Neuraminidase Nitrocellulose nuclear export signal nuclear localisation signal Nukleoprotein Nichtstrukturprotein
99. ndern ist nur in der infizierten Zelle vorzufinden 1 3 Genomaufbau und virale Proteine Das Influenza A Virus besitzt acht virale RNA Segmente vRNA die in Negativstrangorientierung vorliegen und somit nicht per se infekti s sind Die RNA kann nicht direkt als Boten RNA messenger RNA mRNA zur Translation von viralen Proteinen verwendet werden Neumann et al 1999 Um die Transkription und Replikation zu gew hrleisten wird die kodierende Region jedes Segments von kurzen nicht kodierenden Bereichen flankiert Die nicht kodierenden Regionen am 3 und 5 Ende der jeweiligen Segmente enthalten hoch konservierte Sequenzen von 12 und 13 Nukleotiden Diese Sequenzen der einzelnen Segmente sind ber kurze Bereiche zueinander komplement r und bilden Doppelstr nge aus Desselberger et al 1980 Hsu et al 1987 Flick und Hobom 1999 die als Promotoren f r die Initiation der Transkription und der Replikation dienen Parvin et al 1989 Die meisten RNA Segmente des Influenza Genoms kodieren nur f r ein bestimmtes Virusprotein Die beiden kleinsten RNA Segmente das M und das NS Segment des Influenza A Virus kodieren jedoch f r zwei Polypeptide deren Translation von unterschiedlich gesplei ten mRNA Spezies ausgeht Das Segment 7 kodiert f r M1 und M2 Lamb et al 1981 das Segment 8 f r NS1 und NS2 Inglis und Almond 1980 Das NS2 Protein wird auch als NEP nuclear export protein bezeichnet O Neill et al 1998 Eine g
100. nkulturen F r die Isolierung von Plasmid DNA aus kleinen Kulturvolumina wurde das Qiaprep8 Miniprep Kit verwendet f r die Isolierung aus gro en Kulturvolumina das QIAGEN Plasmid Maxi Kit Beide Kits beruhen auf der Methode der alkalischen Lyse Birnboim und Doly 1979 der bakteriellen Zellen Bei der Minipr paration schlie t eine Adsorption der DNA an eine Silica Membran unter hohen Salzkonzentrationen an Nach einem Waschschritt zur Entfernung von Endonukleasen und Salzen wird die DNA in EB Puffer oder Wasser eluiert Bei der Maxipr paration schlie t jedoch an die Lyse die Auftrennung ber Anionen Austauscher Membranen unter niedrigen Salz und pH Konzentrationen an Ein Waschschritt folgt unter Mediumsalzbedingungen 37 Methoden wonach die DNA unter Hochsalzbedingungen eluiert und anschlie end durch Isopropanol F llung entsalzt und aufgereinigt wird Die genaue Durchf hrung ist dem beiliegenden Handbuch des Herstellers zu entnehmen 3 13 Virusrescue Die Herstellung der f r diese Arbeit ben tigten rekombinanten Influenza A Viren erfolgte mittels der Methode nach Neumann Neumann et al 1999 Dazu werden 293T Zellen mit acht Plasmiden transfiziert die f r je ein Gen des Influenzavirus unter Kontrolle des humanen RNA Polymerase I Promotors kodieren Nach Transkription dieser Plasmide entstehen die acht viralen RNAs vRNASs Zur Erstellung infekti ser Virionen wird eine RNA abh ngige RNA Polymerase ben tigt Dahe
101. ns uerung der Endosomen durch zellul re H ATPasen bewirkt eine starke Konformations nderung des HAs die letztendlich in der Verschmelzung der endosomalen mit der viralen Membran endet bersicht s Skehel und Wiley 2000 ber den Protonenkanal des M2 Proteins wird der niedrige pH Wert weiter ins Virusinnere gegeben was zur Abl sung der Nukleokapside von den die Virusinnenseite auskleidenden M1 Proteinen f hrt Helenius 1992 Aufgrund der Kernlokalisationssequenzen der Nukleoproteine NP werden die RNPs ber die zellul ren Transportwege in den Zellkern gebracht Whittaker et al 1996 Wang et al 1997 Die virale RNA abh ngige RNA Polymerase besitzt nicht die F higkeit mRNAs mit 5 Cap Strukturen zu modifizieren oder diese zu methylieren und somit die Transkription der viralen Gene zu initiieren Anstatt dessen haben die Viren den Mechanismus des Cap Snatching etabliert bei dem die PB2 Untereinheit des Polymerasekomplexes das 5 Ende einer zellul ren mRNA an das 3 Ende einer vRNA anlagert Die PB1 Untereinheit schneidet dann die angelagerte mRNA durch ihre Nukleaseaktivit t 10 13 Nukleotide vom 5 Ende entfernt ab Li et al 2001 Dadurch wird sowohl eine 5 Cap Struktur als auch ein freies 3 OH Ende bereitgestellt welches der viralen Polymerase als Primer f r die Transkription dient Ulmanen et al 1981 Shi et al 1995 Die mRNA wird nun von der PB 1 Untereinheit bis zu einem Bereich von 15 bis 22 Nukle
102. nte nachgewiesen werden dass dieses Wachstumsdefizit auf Mutationen in den zellul ren Lokalisationssignalen des NS1 basiert Das NS1 Protein der HPAI Viren konnte akkumuliert in den Nukleoli und dem Cytoplasma der infizierten Zellen detektiert werden w hrend die LPAI Variante zu gro en Teilen nukle r aber nicht ausschlie lich nukleol r lokalisiert war 54 Ergebnisse 4 2 Herstellung und Charakterisierung von Influenza Reassortanten 4 2 1 Herstellung rekombinanter Viren des Stammes A chicken Italy 1082 99 Neben dem bereits etablierten reversen Genetik System des HPAI Virus 984 A ostrich Italy 984 00 wurde ein System zur Herstellung von rekombinantem LPAI Virus 1082 A chicken Italy 1082 99 ben tigt Hierzu wurde mit Hilfe des QIAamp Viral RNA Mini Kit virale vRNA aus 1082 Virussuspension isoliert um sie in der nachfolgenden Klonierung in ein RNA Polymerase I RNA Polymerase II Promotor Plasmid pHW2000 einzusetzen siehe Hoffmann et al 2000 Zur reversen Transkription der acht VRNAs wurde entsprechend der Herstellerangaben des Omniscript RT Kits Qiagen vorgegangen Als Primer diente ein 12 Basen langes Oligonukleotid das sich an die Influenza spezifischen 5 Enden der vRNAs anlagern konnte In der anschlie enden PCR wurden Primer verwendet die entsprechend der Vorgaben zur sp teren Klonierung mit Hilfe des BD In Fusion Dry Down PCR Cloning Kits 3 7 konzipiert waren Nach Transformation und Plasmidisolation 3
103. olierten Zellen auf dem Boden des Zentrifugenbechers ab Diese wurden nach Absch tten des Uberstands in 20ml des entsprechenden Mediums aufgenommen in 75cm Zellkulturflaschen verteilt und bei 37 C 5 CO und konstanter Luftfeuchtigkeit im Brutschrank inkubiert 3 5 2 Passagieren von Zellkulturen Um eine stabile Zelllinie aufrecht zu erhalten wurden die permanenten Zellkulturen alle drei bis vier Tage in 75 cm Flaschen passagiert Vor der Passage wurden Medium Trypsin und PBSaez auf 37 C im Wasserbad erhitzt Der berstand der Zellkultur wurde abgegossen die 29 Methoden Zellen mit 20 ml PBSaer gewaschen und 2 ml Trypsin EDTA hinzu gegeben MDCK I Zellen wurden f r ca 20 Minuten bei 37 C inkubiert bis sich alle Zellen abgel st hatten Bei 293T CEF DEF und TEF wurde das Trypsin vor der Inkubation abgegossen und die Inkubation erfolgte nur f r ca 3 5 Minuten Die abgel sten Zellen wurden in frischem Medium aufgenommen und je nach Bedarf auf Flaschen oder Sch lchen verteilt Zur Regeneration und weiterem Wachstum wurde die Zellkultur bei 37 C 5 CO und konstanter Luftfeuchtigkeit inkubiert Umsetzfaktoren Passage f r 1 Tag Passage f r 2 Tage Passage f r 3 Tage 3 5 3 Lagerung von Zellkulturen einfrieren auftauen Zur schnelleren und einfacheren Handhabung von Zellkulturen lassen sich diese einfrieren und bei Bedarf wieder auftauen und weiter verwenden Hierzu wurden die Ze
104. ollten bez glich ihrer Replikationseffizienz in avi ren Zellen 16 Einleitung und anschlie end auf Unterschiede in Pathogenit t und Infektiosit t untersucht werden Ebenfalls sollten die funktionellen Auswirkungen der eingef hrten Mutationen aufgedeckt werden 17 Material 2 Material 2 1 Chemikalien Acrylamid Rotiphorese Gel 30 Agarose Seakem LE Ammoniumpersulfat APS Ampicillin Natrium Salz Bacto Agar Bovines Serumalbumin BSA 35 Bovines Serumalbumin BSA 98 Bors ure Calciumchlorid DAPI DABCO 1 4 diazabicyclo 2 2 2 Oktan DEAE Dextran Dextransulfat Denhardt s L sung 50x Diethylpyrocarbonat DEPC Dimethylsulfoxid DMSO DNA L ngenstandard Massruler DTT Eosin G Essigs ure Essigs ureanhydrid Ethanol absolut Ethidiumbromid Ethylendinitrilotetraessigs ure EDTA Fisch DNA aus Heringsspermien Formaldehyd 37 Formamid F tales K lberserum FCS Glukose Glutamin Glycerin Hefeextrakt Hefe tRNA Isopentan Isopropanol Jodl sung Kaliumchlorid Kaliumdihydrogenphosphat Kristallviolett Lipofectamin 2000 Magnesiumchlorid Mayers H malaunl sung Mowiol 4 88 Natriumchlorid Natriumcitrat di Natriumhydrogenphosphatdodecahydrat Carl Roth GmbH Karlsruhe Cambrex Bio Science Rockland BioRad Miinchen Serva Heidelberg BD Frankreich MP Biomedicals USA Sigma Deisenhofen Merck Darmstadt Merck Darmstadt Sigma Aldrich Deisenhofen Merck S
105. oluslokalisationssignal Mel n et al 2007 die M glichkeit die Lokalisation zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion zu variieren und entsprechend seine Interaktionspartner zu ver ndern Die Kernlokalisationssignale sowie das Nukleoluslokalisationssignal bestehen vorwiegend aus basischen Aminos uren w hrend das Kernexportsignal Aminos urepositionen 134 147 aus hydrophoben Aminos uren besteht und zudem durch einen bislang unbekannten viralen Faktor gesteuert wird ohne den es nicht funktionell ist Li et al 1998 In dieser Arbeit konnte dargelegt werden dass das NS1 der hochpathogenen Virusisolate Mutationen in dem Kernexportsignal NES sowie eine Deletion des C Terminus aufweist siehe Kap 4 2 5 Aus dieser C terminalen Trunkierung ergibt sich eine Wiederherstellung des Nukleoluslokalisationssignals NoLS das ausschlie lich bei Viren des hochpathogenen Ph notyps vorzufinden ist Dieses ist C terminal normalerweise an Aminos ureposition 219 bis 230 bzw 219 bis 237 je nach Virusisolat gelegen und beinhaltet mehrere der basischen Aminos uren Arginin und Lysin Bei vielen avi ren Isolaten wird dieses NoLS durch die saure Aminos ure Glutamat an den Aminos urepositionen 227 und 229 ausgeschaltet Mel n et al 2007 Fr he Italien Isolate niedrigpathogenen Ph notyps weisen diese sauren Aminos uren auf Dundon et al 2006 Die Deletion dieser Glutamins uren f hrt zum 88 Diskussion Verlust des nicht basischen Gl
106. on RNA Hybriden Die RNA Sonden k nnen durch run off in vitro Transkription hergestellt werden Dazu kloniert man ein Fragment des 41 Methoden entsprechenden Gens in einen Transkriptionsvektor so dass es von Promotoren f r die T3 und T7 RNA Polymerase umgeben wird Vor der in vitro Transkription muss das Transkriptionskonstrukt durch einen Restriktionsverdau am Ende des klonierten Genfragments linearisiert werden Nur so kann es effizient zur Herstellung von run off Transkripten kommen Da die beiden Promotoren der RNA Polymerasen rechts und links des Inserts liegen k nnen je nach Wahl RNA Sonden in sense oder antisense Richtung synthetisiert werden In dieser Arbeit soll die Ausbreitung des Virus in histologischen Schnitten dargestellt werden Deshalb wird ein Transkriptionskonstrukt mit kloniertem Influenza NP Fragment verwendet Die radioaktiv markierten NP Sonden erkennen spezifisch die Inluenza NP RNA und somit die Bereiche in denen Virusreplikation stattfindet Ein NP Fragment des FPV Virus von 365 bp L nge lag bereits in dem Vektor pBluescript KS kloniert vor Die antisense RNA kann mit mRNA und cRNA hybridisieren Sie ist daher sp ter effizienter zu detektieren als die antisense RNA die nur mit vRNA hybridisieren kann Aus diesem Grund wurden ausschlie lich antisense RNA Transkripte verwendet 5 ug des Vektor Konstrukts wurden mit 15 Units des Restriktionsenzyms HindIII ber Nacht bei 37 C linearisiert und mi
107. onen Die 11 13 Tage alten Embryonen wurden mit je 1000 pfu infiziert 36h p i in 50 C kaltem Isopentan schockgefroren und anschlie end 20um breite sagitale Schnitte angefertigt Links in situ Hybridisierung mit S markierten RNA Sonden gegen influenza NP mRNA schwarz Rechts Immunhistochemischer Virusnachweis gr n im Odyssey Scanner mit Anti KP Serum Kaninchen und Anti Kaninchen 800nm Antik rper Im rot umrandeten Bereich befindet sich das Herz 65 Ergebnisse Die Schnitte der Embryonen wurden anschlie end einer H matoxylin Eosin Behandlung unterzogen und im Fall der immunhistochemischen Anf rbung wurde Virusprotein mit HRP gekoppeltem Zweitantik rper und DAB Behandlung nachgewiesen Radioaktiv markierte virale mRNA wurde durch berschichtung mit Foto Emulsion detektiert Im H hnerembryo zeigt sich siehe Abb 4 6 dass bei der Infektion mit dem G1 Virus besonders das Endothel betroffen ist Dies ist deutlich in den gro en Blutgef en Abb 4 6 C den Blutgef en der Lunge Abb 4 6 K und dem Endokard des Herzens Abb 4 6 G 0 zu beobachten Die sich entwickelnden Blutgef e in der avi ren Lunge gruppieren sich hier um die zentral liegenden Parabronchien Wie in Abb 4 6 F G und H zu erkennen ist k nnen Myozyten des Herzens durch alle Glykosylierungsmutanten infiziert werden Wie aus Abb 4 6 B und C hervorgeht sind das G2 Virus und insbesondere das GO Virus jedoch in ihrer F higkeit das Endothel h
108. ositionen der Mutationen die zwischen dem HA Protein des niedrigpathogenen 1082 Virus und dem des hochpathogenen 984 Virus existieren 58 Ergebnisse 4 2 5 Sequenzvergleich LPAI vs HPAI NS1 Beim Vergleich der NS1 Proteinsequenzen des 1082 und des 984 Virus konnten zwei Mutationen im Kernexportsignal NES detektiert werden Position 136 und 139 Des Weiteren war der C Terminus des HPAI 984 NS1 im Vergleich zum LPAI 1082 NS1 um 6 Aminos uren deletiert Das NS2 obwohl vom gleichen Gensegment als Splei variante synthetisiert wurde von den Mutationen nicht beeinflusst Position Mutation 136 V gt 21 139 D gt N 225 230 Deletion RVESEV Tab 4 3 Positionen der Mutationen die zwischen dem NS1 Protein des niedrigpathogenen 1082 Virus und dem des hochpathogenen 984 Virus existieren 4 3 Herstellung rekombinanter Virusmutanten Um die zuvor detektierten Mutationen im HA und NS1 Protein des 984 Virus n her zu charakterisieren wurden rekombinante Virusmutanten aus den bereits etablierten 984 und 1082 Systemen siehe Kapitel 4 2 1 hergestellt Dazu wurden die entsprechenden poll HA und polI NS Plasmide durch in vitro Mutagenese Kap 3 8 wie folgt ver ndert 4 3 1 Mutagenese der poll HA Plasmide Zur Untersuchung der zus tzlichen Glykosylierungsstellen im H magglutinin der Virusisolate der Italienepidemie 1999 2000 siehe Kap 1 13 wurden bereits zuvor die entsprechenden Mutationen in die HA
109. otide vor dem 5 Ende der vRNA elongiert Hier kommt es am Beginn des pfannenstielf rmigen Doppelstrangbereichs in einer Uridin reichen Region zum Stottern der Polymerase und somit zur Polyadenylierung der neusynthetisierten mRNA Luo et al 1991 Li und Palese 1994 Die von den Gensegmenten 7 und 8 gebildeten Transkripte werden teilweise gesplei t Zur Translation werden die mRNAs ins Zytoplasma exportiert Die mRNAs der viralen Membranproteine werden durch Ribosomen direkt ins 5 Einleitung rauhe endoplasmatische Retikulum synthetisiert und bleiben in der Membran verankert Auf dem Weg ber Golgi Apparat und das Trans Golgi Netzwerk TGN zur Zytoplasmamembran werden sie glykosyliert und im Fall von HA und M2 zudem noch palmitoyliert NA und M2 bilden Tetramere w hrend HA als Trimer in der Zytoplasmamembran vorliegt HA und NA Glycoprotein Spikes 1 Anheftung von HA an Sialins ure der Plasmamembran niedriger pH Wert ES 12 Freisetzung T oe E Einbau der viralen Glycoproteine in die Zellmembran Abb 1 1 Replikationszyklus von Influenza A Viren Die brigen Proteine werden an den Ribosomen im Zytoplasma synthetisiert Die Proteine PB1 PB2 PA NP MI NS1 und NS2 besitzen Kernlokalisationssequenzen und werden daher zur ck in den Zellkern transportiert Sobald im Zellkern eine hohe Konzentration der Nukleoproteine vorliegt werden die Pfannenstielstrukturen der vRNA aufgel st und die Transkription komm
110. outbreaks in commercial poultry in the United States J Virol 2003 77 24 p 13399 402 127 Stasakova J et al Influenza A mutant viruses with altered NS1 protein function provoke caspase 1 activation in primary human macrophages resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins Ibeta and 18 J Gen Virol 2005 86 Pt 1 p 185 95 128 Stieneke Grober A et al Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin a subtilisin like endoprotease Embo J 1992 11 7 p 2407 14 129 Subbarao E K W London and B R Murphy A single amino acid in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range J Virol 1993 67 4 p 1761 4 130 Sugrue R J and A J Hay Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses evidence that it forms a tetrameric channel Virology 1991 180 2 p 617 24 131 Tada Y et al Phosphorylation of influenza C virus CM2 protein Virus Res 1998 58 1 2 p 65 72 132 Talon J et al Activation of interferon regulatory factor 3 is inhibited by the influenza A virus NSI protein J Virol 2000 74 17 p 7989 96 133 Tashiro M et al Synergistic role of staphylococcal proteases in the induction of influenza virus pathogenicity Virology 1987 157 2 p 421 30 134 Taubenberger J K et al Initial genetic characterization of the 1918 Spanish influenza virus Science 1997 275 5307 p 1793 6 13
111. prim re H hnerembryofibroblasten mit den verschiedenen NS1 Mutanten mit einer MOI von 2 infiziert und nach 7 5 Stunden f r die Immunfluoreszenz fixiert Das NS1 Protein ist in Abb 4 17 rot dargestellt die Zellkerne der Zellen wurden mit DAPI 4 6 Diamino 2 phenylindol angef rbt und erscheinen blau Das NS1 des 984wt Virus ist sowohl in den Nukleoli als auch im Zytoplasma vorzufinden Im Zellkern kann au erhalb der Nukleoli nur sehr wenig NS1 detektiert werden siehe Abb 4 17A a Das NS1 der Virusmutante mit niedrigpathogener NES Sequenz und deletiertem C Terminus 984 LP HP ist in der Immunfluoreszenz nur sehr schwach im Zytoplasma zu beobachten wohingegen die Nukleoli verst rkt NS1 aufweisen 4 17B b Die brigen Bereiche des Zellkerns scheinen frei von NS1 Protein zu sein Das NS1 Protein der 984 78 Ergebnisse HP LP Mutante ist wie aus Abbildung 4 17D d vorranging im Zytoplasma vorzufinden NS1 im Zellkern ist nicht im Nukleolus akkumuliert Beim 984 LP LP Virus sind die NS1 Proteine ber die gesamte Zelle verteilt und es findet ebenfalls keine Akkumulation in den Nukleoli statt 4 17E e Abb 4 17 Lokalisation des NS1 Proteins in infizierten H hnerembryofibroblasten Die Zellen wurden mit einer MOI von 1 infiziert 7 5h nach Infektion fixiert und das NS1 der Viren 984 wt A a 984 LP HP B b PBS als Negativ Kontrolle C 984 HP LP D d und 984 LP LP E e wurde durch indirekte Immunfluoreszenz detek
112. r H hnerembryonen Pro Virus wurden jeweils 10 embryonierte Eier mit 10 pfu der Viren GO G1 und G2 ber die Allantoish hle infiziert Anschlie end wurden die Eier alle 12h auf abgestorbene Embryonen untersucht Die MDT dr ckt den mittleren Todeszeitpunkt der infizierten Embryonen aus 71 Ergebnisse 4 4 4 Untersuchung der Rezeptorspezifit t des Hamagglutinins Influenza A Viren sind in der Lage spezifisch a2 3 oder a2 6 gebundene endst ndige Neuramins uren NeuS zu binden um mittels Endozytose in ihre Zielzellen aufgenommen zu werden Um die Bindungseigenschaften der Glykosylierungsmutanten zu charakterisieren wurde ein Fetuinbindungstest Fetuin binding assay etabliert in dem Fetuin welches ein polyvalentes Substrat mit a2 3 oder a2 6 gebundenen endst ndigen Neuramins uren darstellt als Rezeptor dient 96 Well Platten wurden dazu mit Fetuin berschichtet die Glykosylierungsmutanten in abnehmender Konzentration zugegeben und nach mehrmaligem Waschen wurden nicht Virus gebundene NeuS mittels Lektinen detektiert die spezifisch je eine der beiden Neuramins ureverkn pfungen erkennen siehe Kap 3 24 Fetuinbindungs Assay WKF E ogo 861 us h h Uy Mg ag Usp les Unze Virusverd nnung Abb 4 10 Fetuinbindungstest der Viren GO G1 und G2 Links a2 6 und a2 3 verlinkte Neuramin s uren wurden durch biotinylierte Sambucus nigra and Maackia amurensis Lektine und Fluoreszenz ma
113. r werden zus tzlich zu den acht Plasmiden noch vier Expressionsplasmide transfiziert die unter der Kontrolle eines Polymerase II Promotors stehen Diese beinhalten die Gene f r die Polymerasegene und das Nucleoprotein des Virus A WSN 33 Nach Bildung der vRNAs und des Polymerasekomplexes erfolgt der vollst ndige Replikationszyklus bei dem infekti se Virionen entstehen Da sich 293T Zellen zwar gut transfizieren lassen jedoch in ihnen nur eine geringe Virusvermehrung stattfindet erfolgt im Anschluss eine Infektion von MDCK I Zellen in denen Influenzaviren zu hohen Titern replizieren In dieser Arbeit wurde der Virus Rescue in Mischkultur verwendet Bei dieser Methode transfiziert man eine Mischkultur aus 293T Zellen und MDCK II Zellen wodurch den in 293T Zellen entstandenen Viren eine direkte Infektion der MDCK II Zellen erm glicht wird und eine gute Vermehrung erfolgt Durchf hrung Am Vortag wurden 293T Zellen 1 2 und MDCK II Zellen 1 3 in neue Flaschen umgesetzt Zur Herstellung der Mischkultur wurden MDCK II Zellen einmal mit PBSaer gewaschen und anschlie end zweimal mit 2 5 ml Trypsin EDTA gesp lt Der berstand wurde sorgf ltig abgegossen und die Zellen f r 20 Minuten bei 37 C inkubiert Kurz vor dem Abl sen der MDCK I Zellen wurden die 293T Zellen einmal mit PBSaer gewaschen und mit 2 ml Trypsin EDTA gesp lt Das Trypsin wurde sorgf ltig abgegossen und die Zellen f r ca 3 Minuten in den Brutschrank gestellt bis sie sich g
114. rkiertes Streptavidin nachgewiesen Rechts die maximale Bindungsverdiinnung BDmax ent spricht der Verd nnungsstufe der Viren bei der mindestens 95 der Neuramins uren durch das HA gebunden werden Messungen wurden mit dem LI COR Odyssey Infrared Imaging System durchgef hrt Aus Abbildung 4 10 wird deutlich dass zwischen den Glykosylierungsmutanten G1 G2 und GO bez glich der Pr ferenz der Bindung von 02 3 oder 02 6 verlinkten NeuS keine signifikanten Unterschiede bestehen Die maximale Bindungsverd nnung BDmax der Viren zeigt dass G2 nur unwesentlich besser als GO oder Gl an a2 6 verkn pfte NeuS binden kann Die Unterschiede in der BDmax f r 2 3 verkn pfte NeuS sind noch geringer Die in Kap 4 4 2 beschriebene Reduzierung des Endotheltropismus des GO und G2 Virus 72 Ergebnisse kann nicht durch eine ge nderte Bevorzugung von a2 3 oder a2 6 verlinkten Neuramins uren als Rezeptormolek l der Viren erkl rt werden 4 4 5 Freisetzung neu gebildeter Viren Ein weiterer wichtiger Schritt im Vermehrungszyklus stellt die Freisetzung der Viren nach Infektion der Zelle dar Ist die Bindung des HA Proteins zum zellul ren Rezeptor zu stark kann es dazu kommen dass neu gebildete Viruspartikel an der bereits infizierten Zelle h ngen bleiben und dementsprechend nicht mehr in der Lage sind neue Zellen zu infizieren A 100 B 100 80 80 60 60 40 40 20
115. rt ber die Phosphorylierung von STAT 1 Signal Transducer And Activator of Transcription 1 und STAT 2 Signal Transducer And Activator of Transcription 2 und der Rekrutierung von IRF 9 Interferon Regulatory Factor 9 zur erh hten Transkription und somit Expression von 11 Einleitung Interferon stimulierten Genen ISGs Zu diesen ISGs geh ren unter anderem die 2 5 Oligoadenylate Synthetase OAS und die PKR Die Stimulierung der OAS durch dsRNA im Zytoplasma f hrt zur Aktivierung der RNase L und somit zur Degradation s mtlicher RNA in der Zelle Silverman 2007 Eine Aktivierung der PKR durch dsRNA f hrt zudem zu einer Phosphorylierung des Translations Elongationsfaktors 2 a eIF 2a was ein Abbrechen der Proteinsynthese zur Folge hat und somit als antivirale Reaktion der Zelle zu verstehen ist Garcia Sastre et al 1998 FLUAV IN S ppp ssRNA H NS1 H dsRNA TLRS e H em B E a IKKay TBK 1 IKKe Abb 1 2 Schematische Darstellung der Interferon Induktion und der Inhibition durch NS1 1 12 Die Rolle des Nicht Struktur Proteins 1 NS1 Beim NS1 handelt sich um ein Nichtstrukturprotein da es in infizierten Zellen synthetisiert aber nicht in Virionen verpackt wird Lamb und Krug 2001 Es wird von dem kleinsten genomischen RNA Segment mit 890 Nukleotiden kodiert und ist in der exprimierten Form je nach Virusspezies 202 237 Amino
116. rus of H7N1 subtype Avian Pathology 2001 30 p 179 183 93 Literatur 15 Capua I F Mutinelli and M H Hablovarid Avian embryo susceptibility to Italian H7N1 avian influenza viruses belonging to different genetic lineages Arch Virol 2002 147 8 p 1611 21 16 Capua I et al The 1999 2000 avian influenza H7N1 epidemic in Italy veterinary and human health implications Acta Trop 2002 83 1 p 7 11 17 Capua I et al Highly pathogenic avian influenza H7N1 in ostriches farmed in Italy Vet Rec 2000 146 12 p 356 18 Chen W et al A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death Nat Med 2001 7 12 p 1306 12 19 Chen Z Y Li and R M Krug Influenza A virus NS1 protein targets poly A binding protein II of the cellular 3 end processing machinery Embo J 1999 18 8 p 2273 83 20 Chien C Y et al Biophysical characterization of the complex between double stranded RNA and the N terminal domain of the NS1 protein from influenza A virus evidence for a novel RNA binding mode Biochemistry 2004 43 7 p 1950 62 21 Chung C T S L Niemela and R H Miller One step preparation of competent Escherichia coli transformation and storage of bacterial cells in the same solution Proc Natl Acad Sci U S A 1989 86 7 p 2172 5 22 Connor R J et al Receptor specificity in human avian and equine H2 and H3 influenza virus isolates Virology 1994 205 1 p
117. s uren lang Das NS1 ist ein multifunktionelles Protein das sowohl an Protein Protein als auch an Protein RNA Interaktionen beteiligt ist Das 26 kDa gro e Protein wird dabei in zwei Dom nen unterteilt Qian et al 1994 Wang und Krug 1996 wobei die N terminale Strukturdom ne RNA Binde Dom ne RBD das Virus prim r vor der antiviralen Immunantwort durch Interferon w sch tzt w hrend die C terminale Strukturdom ne Effektor Dom ne mit diversen zellul ren Faktoren interagieren kann 12 Einleitung Die N terminale RNA Binde Dom ne beinhaltet die ersten 73 Aminos uren des NSI Proteins Etwa in der Mitte der Dom ne befindet sich das erste Kernlokalisationssignal NLS1 dessen Aminos uren 35 38 und 41 entscheidend f r die Bindung an Importin a sind Mittels NMR und X ray Kristallstruktur wurde gezeigt dass NS1 symmetrische Homodimere bildet Nemeroff et al 1995 Bornholdt und Prasad 2006 Diese binden an die antiparallelen Helices doppelstr ngiger RNA Wang et al 1999 Eine Funktion dieser dsRNA Bindung ist der Schutz gegen die antivirale Immunantwort durch Inhibition des in 1 11 beschriebenen Interferon a induzierten 2 5 oligoadenylate synthetase OAS RNase L Weges Min et al 2006 Zus tzlich verhindert NS1 durch Bindung an doppelstr ngige RNA die Aktivierung der dsRNA aktivierten Kinase PKR Enami et al 1994 RNA Binde Dom ne Effektor Dom ne Abb 1 3 Schematische Darstellung des NS1 Proteins
118. s GO Virus dort nicht nachzuweisen ist Abb 4 7 B In den kleineren sich entwickelnden Gef en der Lunge des Herzens und des Magens kann jedoch GO wie auch G1 und G2 beobachtet werden In den infizierten Putenembryonen kann bei allen Virusmutanten eine Replikation im Endothel sowohl der gro en als auch der kleinen Gef e detektiert werden siehe Abb 4 8 Auch in diesen Embryonen ist das Signal der G2 besonders jedoch das der GO Mutante deutlich schw cher als das des G1 Virus Auf molekularer Ebene konnte f r keine der Glykosylierungsmutanten eine Pr ferenz f r die Bindung an 2 3 oder 2 6 gebundene endst ndige Neuramins uren festgestellt werden Kap 4 4 4 Alle Viren konnten besser 02 3 als 02 6 verlinkte Neuramins uren binden wie es f r die meisten avi ren Influenzaviren beschrieben wurde Rogers und Paulson 1983 Connor et al 1994 Gambaryan et al 2003 Matrosovich et al 2004 Die zuvor beobachteten Unterschiede in Wachstum Verbreitung und Pathogenit t der Viren lassen sich nicht durch die Bevorzugung verschiedener Rezeptoren durch die einzelnen Glykosylierungsmutanten erkl ren Die Menge freigesetzter neugebildeter Viruspartikel ist 86 Diskussion jedoch durch die zus tzliche Glykosylierung des HAs gegen ber der GO Mutante deutlich erh ht siehe Kap 4 4 5 Dies kann m glicherweise in einer st rkeren Bindung des unglykosylierten HAs zum zellul ren Rezeptor begr ndet sein siehe Abb 5 1 Obwohl die v
119. se subunit PB2 is the endonuclease which cleaves host cell mRNA and functions only as the trimeric enzyme Virology 1995 208 1 p 38 47 119 Shinya K et al Adaptation of an H7N7 equine influenza A virus in mice J Gen Virol 2007 88 Pt 2 p 547 53 120 Silverman R H A scientific journey through the 2 5A RNase L system Cytokine Growth Factor Rev 2007 18 5 6 p 381 8 121 Skehel J J et al Membrane fusion by influenza hemagglutinin Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1995 60 p 573 80 122 Skehel J J et al A carbohydrate side chain on hemagglutinins of Hong Kong influenza viruses inhibits recognition by a monoclonal antibody Proc Natl Acad Sci U S A 1984 81 6 p 1779 83 123 Skehel J J and D C Wiley Receptor binding and membrane fusion in virus entry the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 2000 69 p 531 69 100 Literatur 124 Snyder M H et al The avian influenza virus nucleoprotein gene and a specific constellation of avian and human virus polymerase genes each specify attenuation of avian human influenza A Pintail 79 reassortant viruses for monkeys J Virol 1987 61 9 p 2857 63 125 Solorzano A et al Mutations in the NS1 protein of swine influenza virus impair anti interferon activity and confer attenuation in pigs J Virol 2005 7 12 p 7535 43 126 Spackman E et al Sequence analysis of recent H7 avian influenza viruses associated with three different
120. spezifit t werden dar ber hinaus von der Rezeptorspezifit t des H magglutinins gepr gt Aus der unterschiedlichen Verteilung der a2 3 und a2 6 gebundenen Sialins uren auf verschiedenen Zellen lassen sich zum Teil R ckschl sse auf die Ausbreitung eines Virusisolats in einem bestimmten Wirt ziehen Baum und Paulson 1990 Ito et al 1999 1 11 Induktion und Wirkung von TypI Interferonen Doppelstrangige RNA dsRNA kommt in der Zelle unter normalen Umst nden nur in sehr geringem Ma vor Bei einer Infektion durch RNA Viren kommt es jedoch durch die Aktivit t der viralen Polymerase zu einem erh hten Auftreten von dsRNA und 5 Triphosphat Einzelstrang RNA 5 ppp ss RNA was die Induktion von Typ I Interferon zur Folge hat und Zellen in einen antiviralen Status versetzen kann Die Erkennung von dsRNA und 5 ppp ss RNA erfolgt ber die Proteinkinase R PKR RIG I Retinoic Acid Inducible Gene I MDA 5 Melanoma Differentiation Associated Gene 5 oder Toll Like Rezeptoren TLRs in der Membran von Vesikeln siehe Abb 1 2 A Durch die Aktivierung dieser zellul ren Proteine werden Signalkaskaden in Gang gesetzt die ber NF KB Nukle rer Faktor kB und IRF 3 Interferon Regulatory Factor 3 die Transkription von Interferon a und B stark erh hen Interferon wird daraufhin von der Zelle sezerniert und dockt an Interferonrezeptoren benachbarter Zellen an Die in Abbildung 1 2 B dargestellte Aktivierung von Interferonrezeptoren f h
121. stiter die 10 pfu ml nicht berschreiten siehe Abb 4 13 74 Ergebnisse Wachstum der NS1 Mutanten auf H hnerfibroblasten 1 6407 1 E 06 1 E 05 A 984wt g 1 E 04 _ amp 984 HP LP 1 03 a 1 e 984 LP HP 1 E 02 984 LP LP 1 6401 1 00 f Oh 16h 24h 48h 72h p i Abb 4 13 Wachstum der NS1 Mutanten 984wt HP LP LP HP LP LP in Hiihnerzellen Die Embryofibroblasten wurden mit einer MOI von 4x10 infiziert Der Uberstand der infizierten Zellen wurde 16h 24h 48h und 72 h p i auf die vorhandene Virusmenge tiberpriift 4 5 2 Mittlere Todeszeit infizierter Embryonen Als Ma der Pathogenit t dr ckt die Mean Death Time MDT den mittleren Todeszeitpunkt 11 Tage alter infizierter Hiihnerembryonen bei einer bestimmt Infektionsdosis aus vgl Kap 3 21 Wie aus dem Diagramm Abbildung 4 14 ersichtlich f hrt die Infektion mit wt Virus zur schnellsten mittleren Todeszeit 984 LP HP und 984 HP LP zeigen untereinander keine signifikanten Unterschiede Die infizierten H hnerembryonen berleben etwa 8 h l nger als bei 984 wt Die Variante 984 LP LP zeigt die geringste Pathogenit t und die entsprechend h chste MDT die mit 49 2 h etwa 12 h ber der des 984 wt Virus liegt 75 Ergebnisse MDT h p i Abb 4 14 Mittlere Todeszeit infizierter H hnerembryonen Es wurden jeweils 10 embryonierte Eier mit 10 pfu der Viren 984 LP LP HP LP LP HP und 984wt
122. t tet Chen et al 2001 Dies k nnte ein weiterer viraler Schutz vor der Immunantwort des Wirtes sein und somit die Pathogenit t beeinflussen PB1 F2 wird allerdings als einziges virales Protein nicht von allen Influenzaisolaten exprimiert Bei Virusisolaten aus bestimmten Tierarten insbesondere Schweinen ist der Leserahmen unterbrochen so dass eine Expression des Proteins nicht stattfindet Zell et al 2007 1 14 Ausbruch avi rer Influenzaviren 1999 2000 in Italien Im Fr hjahr 1999 kam es im Norden Italiens zur bertragung eines avi ren Influenza A Virus des Subtyps H7NI wahrscheinlich von wildlebenden Wasserv geln auf domestiziertes Gefl gel Die zu diesem Zeitpunkt in H hnern noch niedrigpathogenen Viren breiteten sich auf insgesamt 199 Gefl gelzuchtbettriebe in den Regionen Venetien und Lombardei aus und zeigten trotz monobasischer Spaltstelle des H magglutinins in jungen Puten bereits Mortalit tsraten von bis zu 97 Capua et al 2000 Im Dezember 1999 trat zum ersten Mal eine auch f r H hner hochpathogene Virus Variante mit multibasischer Spaltstelle im HA auf Da diese aufgrund der zuvor beobachteten erh hten Mortalit tsraten in Puten nicht als hochpathogenes Virus erkannt wurde und Massen Keulungen und weitere Schutzma nahmen ausblieben kam es innerhalb k rzester Zeit zu weiteren 412 Ausbr chen dieser HPAI Viren Capua et al 2002 W hrend von den LPAI Viren zu Beginn fast ausschlie lich Puten und H hner b
123. t dem Qiaquick PCR Purification Kit aufgereinigt Anschlie end wurde die dUTP L sung in der Speed Vac eingedampft und der folgende Reaktionsansatz zugegeben Ansatz 1 ug linearisiertes Plasmid 8 ul DTT 1 5 ul 10x Transkriptionspuffer 1 7 ul dNTP Mix ohne UTP 25 mM Nucleotid 2 5 ul RNase Inhibitor 1 3 ul T7 Polymerase 2 ul Gesamtmenge 17 ul Der Reaktionsansatz wurde fiir 2 Stunden bei 37 C inkubiert und die RNA Sonden anschlie end mit dem Roche High Pure RNA Isolation Kit aufgereinigt Die Effizienz der S Markierung wurde per Szintillationsmessung bestimmt Dafiir wurden 2 jedes S ulendurchflusses entnommen mit 2 ml Szintillationsl sung versetzt und die vorhandene Radioaktivit t bestimmt 42 Methoden 3 17 2 Vorbehandlung der Gewebeschnitte Durch die Vorbehandlung wird das Gewebe fixiert und die zu detektierende RNA f r die Sonde zug nglich gemacht Die bei 80 C gelagerten Kryoschnitte wurden auf Raumtemperatur erw rmt und f r 1 Stunde in 4 iger frisch angesetzter Formaldehydl sung in DEPC PBS pH 7 2 fixiert Anschlie end wurden die Schnitte dreimal je 10 Minuten mit DEPC PBS gewaschen und dann f r 10 Minuten bei 37 C mit Proteinase K 0 2 ug ml in Proteinase K Puffer behandelt Nun wurden die Schnitte f r 1 Minute in DEPC Wasser getaucht und anschlie end f r 10 Minuten in 4 iger Formaldehydl sung nachfixiert Es folgten zwei Waschschritte zuerst in DEPC PBS mit
124. t den mittleren Todeszeitpunkt 11 13 Tage alter infizierter avi rer Embryonen aus Sie wird in Stunden nach Infektion h p i angegeben Pro Virus wurden jeweils 10 embryonierte Eier infiziert die anschlie end mehrmals t glich auf abgestorbene Embryonen untersucht wurden Die Infektionsdosis sollte die niedrigst m gliche Virusverd nnung sein bei der alle Embryonen sterben Die EIDso beschreibt die Virusdosis angegeben in pfu siehe 3 4 bei der genau die H lfte der inokulierten Embryos infiziert werden Dazu wurden 11 Tage alte avi re Embryonen verschiedenen Viruskonzentrationen in 10er Verd nnungen beimpft und nach 48 Stunden die Allantoisfl ssigkeit mittels HA Test 3 3 auf Viruswachstum untersucht 3 22 Western Blot Beim Western Blot Immunoblot werden durch Gelelektrophorese aufgetrennte Proteine auf eine Tr germembran elektrophoretisch transferiert und durch Antik rper nachgewiesen 3 22 1 SDS PAGE Als Gelelektrophoresetechnik wurde die diskontinuierliche Natrium Dodecylsulfat SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese SDS PAGE verwendet bei der sich Proteine unter denaturierenden Bedingungen aufgrund ihrer Massenunterschiede auftrennen lassen Laemmli 1970 Bei der Probenvorbereitung wird SDS in Probenpuffer im berschuss zu den Proteinen hinzugegeben Die Probe wird anschlie end 5 Minuten auf 95 C erhitzt um Sekund r und Terti rstrukturen aufzubrechen Jedes SDS Anion bindet an zwei Aminos urereste der Pro
125. t zum Erliegen Nun setzt die Synthese von vollst ndigen Gegenstr ngen 6 Einleitung cRNA ein Beaton und Krug 1986 Diese werden von Nukleoproteinen enkapsidiert und als Matrize zur Synthese neuer VRNAs verwendet Die neusynthetisierten VRNAs assoziieren mit dem Polymerasekomplex und den NP Proteinen zu RNPs welche mit Hilfe des Matrixproteins MI und des nukle ren Exportproteins NS2 aus dem Zellkern in Richtung Zytoplasmamembran exportiert werden Whittacker et al 1996 O Neill et al 1998 An Stellen erh hter Konzentration viraler Membranproteine bilden sich initiale Budding Strukturen an denen es durch die Interaktion des Matrixproteins mit HA NA und der Membran als auch den RNPs zur Freisetzung neuer Viruspartikel kommt Gomez Puertas et al 2000 Um das Verkleben der Viren untereinander und die Bindung an eine bereits infizierte Zelle zu verhindern entfernt die Neuraminidase endst ndige Neuramins uren sowohl von der H llmembran der Virionen als auch von der Membran infizierter Zellen Dadurch wird den neugebildeten Viren eine h here Effizienz bei Freisetzung und Ausbreitung erm glicht Das Budding der Influenzaviren erfolgt an besonderen Cholesterin reichen Lipidstrukturen auf der Zelloberfl che der Wirtszelle den sogenannten Lipid Rafts Scheiffele et al 1999 1 5 Influenza beim Menschen Menschen werden immer wieder durch Influenzaviren infiziert da die Viren in zweifacher Hinsicht genetisch instabil und so
126. te Pandemie in der Geschichte der Menschheit und forderte nach unterschiedlichen Angaben bis zu 50 Millionen Todesopfer Johnson und Mueller 2002 Aus archiviertem formalinfixiertem Lungenautopsiematerial und aus gefrorenem nicht fixiertem Lungengewebe eines Influenzaopfers das im November 1918 im Permafrostboden begraben wurde ist das gesamte Genom des Pandemiestamms rekonstruiert worden Taubenberger et al 1997 und stellte sich als HIN1 Virus heraus das offenbar ohne Reassortierung von V geln abstammte Reid et al 1999 Die nachfolgenden Pandemiest mme geh rten zu den Subtypen H2N2 1957 58 und H3N2 1968 es handelte sich um reassortierte Viren die Gene avi ren Ursprungs enthielten 1957 Einleitung waren es drei Gene HA NA und PB1 1968 waren es zwei HA und PB1 Kawaoka et al 1989 1997 wurde die erste Erkrankung mit einem HSN1 Stamm dokumentiert Yuen et al 1998 Neuere Isolate zeigen Mutationen in den Polymerasegenen die sich der Genomsequenz des humanen 1918 Isolats angleichen Taubenberger et al 2005 HSN1 wird daher als ein Virus betrachtet von dem m glicherweise eine weitere Pandemie ausgehen k nnte Bislang ist das HSN1 Virus jedoch ein Tierseuchenerreger der nur in ganz seltenen F llen durch intensiven direkten Kontakt mit erkranktem Gefl gel auf den Menschen bertragen wird 1 7 Klinik und Pathogenese Die aerogen bertragenen Influenzaviren infizieren Menschen zuerst ber die Epithelzellen
127. teine was ihnen eine negative Ladung verleiht die ungef hr proportional zur Masse ist Durchf hrung Zu Beginn wurden alle Komponenten der Gelkammer und Gie apparatur gereinigt sowie das Gel nach folgendem Pipettierschema vorbereitet 47 Methoden Trenngel Trenngel Sammelgel 10 15 4 5 30 Acrylamid 0 8 Bisacrylamid 3 4 ml 1 5M Tris HCL 0 4 SDS pH 8 8 2 5 ml 0 5M Tris HCL 0 4 SDS pH 6 8 ddH2O 3 9 ml 10 APS 50 ul TEMED 5 5 ul APS und TEMED wurden direkt vor dem Gie en des Trenngels hinzugegeben und die Gelschicht mit Isopropanol berschichtet um eine glatte Oberkante zu erzeugen Nach Auspolymerisieren des Gels wurde das Isopropanol abgenommen und APS sowie TEMED zu der vorbereiteten Sammelgell sung hinzugegeben die L sung ber das Trenngel gegossen und der Gelkamm eingesetzt Nach ausreichender Polymerisationszeit wurde das Gel nun vertikal in die Elektrophoresekammer eingespannt und die Kammer mit 1x SDS Laufpuffer gef llt Nach Entfernen des Kamms wurden die Taschen gesp lt und die Proben sowie lul PageRuler Prestained Protein Ladder Plus von Fermentas in die Taschen pipettiert Anode und Kathode wurden angeschlossen sowie eine Spannung von 100 Volt angelegt Die Elektrophorese wurde gestoppt nachdem die Farbbande der Lauffront aus dem Gel hinaus geflossen war 3 22 2 Western Transfer von Proteinen auf Nitrozellulose Semi Dry Blot Die in der Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine
128. tellt Um eine blutfreie Entnahme der ben tigten Allantoisfl ssigkeit zu erm glichen wurden die Eier nach 48h f r vier Stunden bei 4 C gelagert was zu einer Kontraktion der Blutgef e f hrte Nach ffnung des Eies wurden Embryo und Dottersack mit dem Stiel eines kleinen Plastikl ffels vorsichtig an die Seite gedr ckt um m glichst gut an die Allantoisfl ssigkeit zu gelangen Diese wurde mit einer 10ml Spritze und einer Kan le mit einer Gr e von 1 2 x 40mm aus dem Ei gezogen Nachdem der Virustiter mittels eines HA Tests siehe 3 3 bestimmt wurde teilte man die Fl ssigkeit in Einfrierr hrchen 200u1 auf und lagerte diese bei 80 C 3 2 Virusvermehrung in MDCK I Zellen Als Alternative zum H hnerei bietet sich die M glichkeit Influenzaviren in S ugetierzellkulturen zu vermehren In diesem Fall wurden MDCK II Zellen verwendet Hierbei wurden in einer 75 cm Flasche konfluent gewachsene MDCK II Zellen mit PBS 0 2 BSA gewaschen und anschlie end mit 1000 pfu infiziert Nach ca 48h wurde der HA Titer wie in 3 3 beschrieben bestimmt und der berstand als Aliquots bei 80 C eingefroren 26 Methoden Der exakte Titer infekti ser Partikel in der L sung wurde anschlie end ber einen Plaquetest bestimmt 3 3 H magglutinationstest HA Test Influenzaviren besitzen das Oberfl chen Glykoprotein H magglutinin welches an zellul re endst ndige Neuramins uren bindet Durch dieses Protein sind sie auch
129. tiert Der Zellkern wurde mit DAPI gef rbt Vergr erung 630fach bei Bildern mit Gro buchstaben eine zus tzlicher 2fach Digitalzoom und nur der Rhodamin Kanal bei Bildern mit kleinen Buchstaben Ergebnisse 4 5 5 Interferon Antagonismus der NS1 Mutanten Um eine Erkl rung f r die in 4 5 1 beobachteten Wachstumsunterschiede der rekombinanten NS1 Mutanten zu finden wurde die Induktion des Interferon B mRNA Niveaus durch die virale Infektion untersucht Die Induktion der Interferon B mRNA Mengen wurde mittels RT PCR siehe Kap 3 7 1 und 3 7 2 und Interferon B mRNA spezifischen Primern berpr ft Zus tzlich wurde eine RT PCR zur Amplifikation der B Aktin mRNA als Kontrolle durchgef hrt HP HP HP LP LP HP LP LP PolyIC PBS Abb 4 18 Induktion von Interferon INF B durch Infektion der NS1 Mutanten 984wt 984 LP HP 984 HP LP and 984 LP LP in H hnerembryofibroblasten Die Zellen wurden mit einer MOI von 0 5 infiziert entspr Kochs et al 2007 7 5h nach Inokulation wurde zellul re RNA isoliert und durch 80 Ergebnisse Auftrennung der RT PCR Produkte im Agarosegel auf die mRNA Menge von IFN f und B Aktin untersucht Die Banden wurden mit Hilfe der Software ImageJ National Institute of Health USA quantifiziert RNA aus Zellen die als Positivkontrolle mit polyIC transfiziert wurden entsprechen einer 100 igen Induktion von INF B mRNA Transkription Vergleicht man die in Abb 4 18 dargestellten mRNA Mengen
130. uenza virus NS protein stimulates translation of the M1 protein J Virol 1994 68 3 p 1432 7 32 Feldmann A et al Targeted infection of endothelial cells by avian influenza virus A FPV Rostock 34 H7N1 in chicken embryos J Virol 2000 74 17 p 8018 27 33 Feng J et al Influenza A virus infection engenders a poor antibody response against the ectodomain of matrix protein 2 Virol J 2006 3 p 102 34 Flick R and G Hobom Interaction of influenza virus polymerase with viral RNA in the corkscrew conformation J Gen Virol 1999 80 Pt 10 p 2565 72 35 Fouchier R A et al Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype H16 obtained from black headed gulls J Virol 2005 79 5 p 2814 22 36 Fouchier R A et al Avian influenza A virus H7N7 associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome Proc Natl Acad Sci U S A 2004 101 5 p 1356 61 37 Gabriel G et al The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host Proc Natl Acad Sci U S A 2005 102 51 p 18590 5 38 Gallagher P et al Addition of carbohydrate side chains at novel sites on influenza virus hemagglutinin can modulate the folding transport and activity of the molecule J Cell Biol 1988 107 6 Pt 1 p 2059 73 39 Gambaryan A S et al Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken an
131. ug 2006 De la Luna et al 1995 konnten zeigen dass NS1 zu einer Erh hung der viralen Translation beitragen kann was eine Erkl rung f r die gesteigerten Wachstumsraten der NS1 Mutanten mit hochpathogenem NES darstellt vgl Kap 4 5 1 Eine Mutation im NES an Position 137 des NSI von Valin zu Isoleucin konnte auch im Fall einer t dlich verlaufenen Tier zu Mensch bertragung eines H7N7 Virus 2003 in den Niederlanden als einzige Mutation festgestellt werden die das NS1 Protein des menschlichen von dem des avi ren Virusisolats unterschied Fouchier et al 2004 Dies k nnte ein weiteres Indiz f r die Relevanz der Anpassung des NES f r eine gesteigerte Transmissionf higkeit des Virus darstellen Zusammengefasst l sst sich sagen dass die durch die Mutationen im NES und dem NoLS des NSI Proteins der hochpathogenen Viren verursachte optimierte Verteilung des Proteins offenbar eine erh hte Infektionseffizienz erm glicht Die verst rkte Akkumulation im Nukleolus und der erh hte Export des NS1 in das Zytoplasma wirken additiv um eine gesteigerte Virulenz des Influenzavirus zu erm glichen 91 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Im Jahr 1999 kam es in Italien bei Gefl gel zu einem Ausbruch hochpathogener avi rer Influenza A Viren HPAI Viren des Subtyps H7NI der zum Verlust von 14 Millionen Tieren f hrte Aus Stammbaumanalysen ging hervor dass die HPAI Viren aus bereits zuvor zirkulierenden Influenzaviren niedriger Pathogenit
132. und hochpathogenen Viren unterscheidet sich unter anderem in 2 Aminos ureaustauschen im NES Daher wurde die Lokalisation in den Zellkompartimenten mittels Zellkern Zytoplasma Auftrennung und quantitativer Auswertung im Western Blot untersucht Im Western Blot wurde NS1 und Aktin als Zytoplasma Marker detektiert Abb 4 16A In Abbildung 4 16B ist quantitativ ausgewertet zu sehen dass beide Viren mit hochpathogenem Kernexportsignal 984 HP LP 984 wt eine erh hte Konzentration des NS1 Proteins im Zytoplasma zeigen Bei der Variante 984 HP LP und 984 LP LP ist deutlich weniger NS1 im Kern lokalisiert 77 Ergebnisse A ae oe HP LP et LP HP 984 LP LP ZK ZK ZK CY ZK a 100 90 80 70 60 NS1 im 50 Zytoplasma 40 ANAS S NS1 im Zellkern 30 20 10 0 984wt 984 HP LP 984 LP LP 984 LP HP Abb 4 16 Detektion von NS1 Protein in Zellkern ZK und Zytoplasma CY Fraktion von infizierten H hnerembryofibroblasten A Die Zellen wurden mit einer MOI von 2 der NS1 Mutanten infiziert und 7 5h nach Inokulation fraktioniert B Aktin wurde als Kontrolle f r die Zytoplasma Fraktion verwendet Die Quantifizierung B der Banden wurde mit Hilfe der Odyssey Infrared Imaging Software durchgef hrt Um die durch Fraktionierung festgestellte Lokalisation des NS1 zu berpr fen wurden Immunfluoreszenzstudien durchgef hrt Dazu wurden
133. urden w hrend einer Influenza Epizootie in Italien isoliert in deren Verlauf der hochpathogene Ph notyp aus Viren niedriger Pathogenit t hervorgegangen war Banks et al 2001 Aufgrund von Sequenzanalysen konnten Mutationen in ann hernd jedem viralen Gen abgesehen von M2 NS2 und PB1 F2 nachgewiesen werden Mittels Reverser Genetik Systeme der Viren 984 und 1082 wurden Reassortanten generiert welche ein Gensegment des LPAI 1082 und sieben Gensegmente des HPAI Virus 984 tragen Signifikante Unterschiede im Wachstum auf avi ren Zellen die auf das Vorhandensein viraler Pathogenit tsmerkmale schlie en lassen konnten nur bei einem Austausch des NS bzw des HA Segments beobachtet werden Das HA der hochpathogenen Virusisolate wies neben einer multibasischen Spaltstelle eine zus tzliche Glykosylierung im Bereich der Rezeptorbindungsstelle auf die in den meisten niedrigpathogenen Varianten nicht zu detektieren war Um diese zus tzlichen Glykane n her zu charakterisieren wurden HPAI Virusmutanten hergestellt deren Glykosylierungsmuster an der Rezeptorbindetasche des HAs dem der LPAI Viren entspricht Das verringerte Wachstum dieser Mutanten sowie deren verz gerte Ausbreitung in avi ren Embryonen konnte auf molekularer Ebene auf eine ineffiziente Virusfreisetzung zur ckgef hrt werden Der Austausch des NS Segments f hrte auf avi ren Zellen ebenfalls zu einer verminderten Vermehrung der reassortierten Viren In dieser Arbeit kon
134. utamats an Position 227 und 229 und somit zur Aufhebung der Hemmung des NoLS In dieser Arbeit konnte wie in Abb 4 17 A B D und E gezeigt auch f r avi re Zellen best tigt werden dass das Entfernen der Glutamins uren an Position 227 und 229 des NSI zur Relokalisation des Proteins in den Nukleolus f hrt Des Weiteren scheint auch eine Verk rzung des C Terminus auf 224 Aminos uren auszureichen um dennoch ein funktionelles NoLS zu beinhalten C terminale Verk rzungen des NS k nnen im Genom vieler Influenza A Virus Subtypen nachgewiesen werden wie beispielsweise in HINI H2N2 H3N2 H9N2 Dundon et al 2006 H3N8 MacRae et al 2005 und sogar in einem humanen HSNI Isolat A Vietnam 1203 04 das nachweislich im Frettchen Modell zu schwersten Krankheitsverl ufen f hrte Govorkova et al 2005 Wie aus Kap 4 5 2 und 4 5 3 hervorgeht weist das HPAI 984 Virus mit verk rztem C terminalen Ende ebenfalls eine Erh hung der Pathogenit t im Besonderen jedoch der Infektiosit t in H hnerembryonen auf In vorangegangenen Arbeiten Krug und Soeiro 1975 Konnte gezeigt werden dass NS1 im Nukleolus zur Inhibition der rRNA Synthese f hrt F r andere Viren gibt es Belege dass virale Proteine im Nukleolus dazu f hren dass die virale Transkription und Translation bevorzugt wird oder dass der Zellzyklus auf die viralen Bed rfnisse abgestimmt wird Hiscox 2002 Die vorwiegende Lokalisation der viralen Nukleokapsidproteine des Dengue Kunjin
135. utante bleiben an den Zellen gebunden 4 5 Charakterisierung der NS1 Mutanten Wie aus Abbildung 4 2 bereits deutlich zu erkennen ist f hrt das Einbringen des niedrigpathogenen NS Gensegments in den Hintergrund des hochpathogenen Virus 984 zu einer starken Verringerung im Wachstum der reassortierten Viren Die Unterschiede zwischen hoch und niedrigpathogenem NS Segment beschr nken sich auf den Austausch von zwei Aminos uren im NES und der Deletion des C Terminus des NS1 Proteins siehe Kap 4 2 5 Aus diesem Grund wurden die in 4 3 3 beschriebenen rekombinanten Viren hergestellt und in den hier folgenden Kapiteln charakterisiert 4 5 1 Wachstum auf avi ren Zellen Das rekombinante 984 wt Virus zeigt im Wachstum auf H hnerembryofibroblastenzellen vgl 4 4 1 einen deutlichen Replikationsvorteil gegen ber allen getesteten Virusmutanten Dieser Unterschied betr gt bereits 16h nach Infektion p i mehr als 2 Log Stufen Das Virus mit NES und C Terminus des niedrigpathogenen NS1 Gens 984 LP LP zeigt ein deutlich vermindertes Wachstum zu allen untersuchten Zeitpunkten Die Virusmutanten 984 LP HP und 984 HP LP mit entweder dem NES oder dem C Terminus der niedrigpathogenen Isolate zeigen im Wachstum einen intermedi ren Ph notyp der sich im Titer 16h p i noch nicht von der 984 LP LP Mutante abhebt 48h p i erreichen 984 LP HP und 984 HP LP jedoch teilweise 50fach h here Titer 984 LP LP erreicht zu den sp teren Zeitpunkten nur Viru
136. vian influenza viruses in Italy Arch Virol 2001 146 5 p 963 73 Ta Baum L G and J C Paulson Sialyloligosaccharides of the respiratory epithelium in the selection of human influenza virus receptor specificity Acta Histochem Suppl 1990 40 p 35 8 8 Birnboim H C and J Doly A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic Acids Res 1979 7 6 p 1513 23 9 Bornholdt Z A and B V Prasad X ray structure of influenza virus NS1 effector domain Nat Struct Mol Biol 2006 13 6 p 559 60 10 Bosch F X et al Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of Avian influenza viruses Virology 1981 113 2 p 725 35 11 Brassard D L G P Leser and R A Lamb Influenza B virus NB glycoprotein is a component of the virion Virology 1996 220 2 p 350 60 12 Burgui I et al PABPI and eIF4GI associate with influenza virus NS1 protein in viral mRNA translation initiation complexes J Gen Virol 2003 84 Pt 12 p 3263 74 13 Capua I et al Monitoring for highly pathogenic avian influenza in wild birds in Italy Vet Rec 2000 147 22 p 640 14 Capua I and F Mutinelli Mortality in Muscovy ducks Cairina moschata and domestic geese Anser anser var domestica associated with natural infection with a highly pathogenic avian influenza vi
137. von HPAI Viren welche sich aus zuvor grassierenden Viren niedriger Pathogenit t LPAI Viren entwickelt hatten Banks et al 2000 Das H magglutinin HA der HPAI Isolate wies eine multibasische Spaltstelle auf welche als Grundvoraussetzung f r die hohe Pathogenit t dieser Viren gilt Das HA von Viren mit einer solchen Spaltstelle kann von der ubiquit r vorkommenden zellul ren Protease Furin in die Untereinheiten HA und HA gespalten und 82 Diskussion damit aktiviert werden Klenk et al 1988 LPAI Viren mit einem HA mit mono oder dibasischer Spaltstelle k nnen hingegen erst auf der Zelloberfl che oder nach Virusfreisetzung durch exogene Proteasen nachgespalten werden Garten et al 1981 Klenk und Garten 1994 Das HA der hochpathogenen Isolate unterscheidet sich des Weiteren durch eine zus tzliche N Glykosylierungsstelle an Position 123 in der N he der Rezeptorbindungstasche von dem der meisten LPAI Viren Diese besitzen entweder ein Glykan an Position 149 oder keine zus tzliche Glykosylierung in diesem Bereich Das Vorhandensein solcher Glykane wurde zuvor mit der notwendigen Balance zwischen Rezeptorbindungsaffinit t des HAs und der Rezeptor zerst renden Aktivit t der viralen Neuraminidase in Verbindung gebracht Wagner et al 2000 Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der zus tzlichen Glykane auf die Pathogenit t anhand rekombinant hergestellter Viren zu untersuchen die sich ausschlie lich in diesem Merkmal
138. voneinander unterscheiden Neben dem HA gilt das Nichtstrukturprotein 1 NS1 von Influenza A Viren als bedeutender Virulenzfaktor Dieses besitzt die F higkeit durch Verhinderung des Exports zellul rer mRNA aus dem Kern Noah et al 2003 und seine Funktion als IFN a und IFN B Antagonist Solorzano et al 2005 sowie zus tzlicher Interaktionen mit RNA und anderen zellul ren Proteinen den Infektionsverlauf entscheidend zu beeinflussen Dundon et al 2006 konnte durch Sequenzanalysen von 40 Virusisolaten der oben genannten Italien Epizootie zeigen dass alle HPAI Viren eine C terminale Trunkierung von 6 Aminos uren im NS1 aufweisen die nicht bei den niedrigpathogenen Viren auftrat In der vorliegenden Arbeit konnten weitere zwei Mutationen im Kernexportsignal des NS1 V 1361 D139N zwischen LPAI und HPAI Viren aufgedeckt werden Die Auswirkungen der Mutationen im NS1 Protein der HPAI Viren sollte ebenfalls mit Hilfe rekombinanter Viren untersucht werden 5 2 Charakterisierung reassortierter Influenzaviren Influenza A Viren besitzen ein segmentiertes RNA Genom siehe Kap 1 3 Somit ist es m glich aus reversen Genetik Systemen zweier Viren Virusreassortanten herzustellen die Segmente von zwei verschiedenen Influenzaviren tragen Wie in Tab 4 1 zu sehen wurden in dieser Arbeit aus den rekombinanten Systemen des hochpathogenen 984 und des niedrigpathogenen 1082 Virus Einzelreassortanten hergestellt deren Genom aus jeweils sieb
139. ween biological activity and chemical structure of virus fractions J Hyg Lond 1952 50 2 p 229 45 59 Hsu M T et al Genomic RNAs of influenza viruses are held in a circular conformation in virions and in infected cells by a terminal panhandle Proc Natl Acad Sci U S A 1987 84 22 p 8140 4 60 Inglis S C and J W Almond An influenza virus gene encoding two different proteins Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1980 288 1029 p 375 81 61 Ito T et al Receptor specificity of influenza A viruses from sea mammals correlates with lung sialyloligosaccharides in these animals J Vet Med Sci 1999 61 8 p 955 8 62 Iwatsuki Horimoto K et al Generation of influenza A virus NS2 NEP mutants with an altered nuclear export signal sequence J Virol 2004 78 18 p 10149 55 96 Literatur 63 Jelen F et al PDZ domains common players in the cell signaling Acta Biochim Pol 2003 50 4 p 985 1017 64 Johnson N P and J Mueller Updating the accounts global mortality of the 1918 1920 Spanish influenza pandemic Bull Hist Med 2002 76 1 p 105 15 65 Kaverin N V et al Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation of escape mutants J Gen Virol 2002 83 Pt 10 p 2497 505 66 Kawaoka Y S Krauss and R G Webster Avian to human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics J V
140. welche nicht oder nur einzelstr ngig mutiert sind Um nur komplett mutierte Plasmide zu erhalten wird die Probe einem DpnI Verdau unterzogen Dpnl ist eine Endonuklease mit der Zielsequenz 5 G meth A TC 3 und schneidet spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA Aus Escherichia coli isolierte DNA ist DAM methyliert Das in der PCR amplifizierte mutierte Plasmid tr gt an die Primer anschlie end zwei Nicks die nach einer Transformation in E coli durch das Bakterium repariert werden Durchf hrung In dieser Arbeit wurden die verwendeten Plasmide des 984 und 1082 Virus nach folgendem Schema mutagenisiert PCR Mutagenese Ansatz Plasmid DNA 10 100 ng lul Fo Primer 20 uM 1 wl Re Primer 20 uM 1 wl 10x Pfu Turbo Polymerase Puffer Sul dNTP Mix 25 mM Nucleotid lul Pfu Turbo DNA Polymerase lul ddH gt 0 40 ul Gesamtmenge 50 ul Cycler Programm Denaturierung 94 C 1 min Denaturierung 95 C 30 s Primer Annealing 48 52 C 30s 18 Zyklen Elongation 70 C 1 min kb Plasmid Finale Elongation 70 C 5 min K hlung 4 C o0 Die Proben wurden mit je 1 ul DpnI SU ul versetzt und f r eine Stunde bei 37 C inkubiert 34 Methoden 3 9 Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien Gewisse Bakterienst mme zeigen nat rliche Kompetenz und sind in der Lage auch ohne Vorbehandlung freie DNA aufzunehmen Bakterien wie z B Escherichia coli k
141. werden konnte Daraus l t sich schlie en dass bereits die 230 Aminos uren lange LPAI NS1 Variante h chstwahrscheinlich nicht mehr zu einer starken Interaktion mit dem PABII Protein in der Lage ist und somit diese Funktion des C Terminus des NS1 bei den untersuchten Virusisolaten nur eine untergeordnete Rolle spielt Die 4 letzten Aminos uren am C Terminus des NS k nnen des Weiteren als PDZ Dom nen Ligand dienen Obenauer et al 2006 Durch die Bindung ihrer PDZ Dom nen an andere Proteine k nnen sich Multiproteinkomplexe ausbilden die in vielen zellul ren Funktionen wie der Signaltransduktion und dem intrazellul ren Transport von Proteinen eine wichtige Rolle spielen Jelen et al 2003 Obenauer et al konnten zeigen dass die C terminale Aminos uresequenz der h ufigsten Vertreter der avi ren Influenzaviren ESEV ber 30 humane Proteine mit PDZ Dom nen effektiv bindet Hingegen bindet die aktuell am h ufigsten vorkommende humane C terminale NS1 Sequenz RSKV diese Proteine nicht bzw nur eingeschr nkt Obwohl ber die Interaktion von PDZ Dom nen in avi ren Zellen wenig bekannt ist ist davon auszugehen dass eine Minimierung des Einflusses des NS1 auf zellul re Proteine mit PDZ Dom nen von Vorteil w re da es nicht zur Zerst rung vieler zellul rer Signal und Transportwege kommen w rde Die C terminale Deletion des NS1 kann daher auch als notwendige Entwicklung vor der Entstehung des HPAI NES Signals zu sehen sein da
142. ykosylierung an Position 149 des HAs G2 Im berstand infizierter H hnerembryozellen ist dieser Unterschied besonders deutlich w hrend G1 und G2 im Uberstand von Enten und Putenembryozellen ann hernd den gleichen Titer aufweisen Das GO Virus ohne Glykan an der Rezeptorbindungsstelle w chst in den Zellen aller getesteten avi rer Spezies zu den geringsten Titern heran siehe Kap 4 4 1 Beide zus tzlichen Glykosylierungsstellen des HAs sind im Verlauf der Italien Epizootie zwar aus einem gemeinsamen Vorg nger jedoch getrennt voneinander entstanden Banks et al 2001 Die Glykosylierung an Position 149 G2 stellt m glicherweise eine Anpassung an Puten und Enten dar w hrend die Gl Variante als evolution rer Vorteil in H hnern entstanden sein k nnte Eine weitere bereits durch Skehel et al 1984 sowie Wiley und Skehel 1987 beschriebene Funktion zus tzlicher Glykane in den Kopfbereichen der HA Proteine ist es dem immunologischen Druck des Wirtes durch das Verdecken antigener Epitope zu entkommen Da es sich bei den untersuchten Tieren in dieser Arbeit um H hnerembryonen handelt die noch nicht ber ein ausgereiftes Immunsystem verf gen K nnen hierzu keinerlei Aussagen gemacht werden 85 Diskussion Beobachtungen nach denen zus tzliche Glykane am HA die Pathogenit t und Virulenz von Influenzaviren in H hnern erh hen Desphande et al 1987 Matrosovich et al 1999 konnten durch die Bestimmung der mittleren Tod
143. zu wurden die Schnitte f r je 10 Minuten bei 37 C in 2x SSC und 1x SSC in DEPC Wasser gewaschen Beim folgenden RNase Verdau f r 1 Stunde bei 37 C wird s mtliche noch 43 Methoden vorhandene einzelstr ngige RNA abgebaut Die zu Doppelstr ngen hybridisierten RNA Sonden sind vor dem Verdau durch die RNase gesch tzt Es folgten weitere Waschschritte von je 10 Minuten in 0 5x SSC und 0 2x SSC bei 37 C Der letzte Waschschritt fand in 0 2x SSC bei 60 C f r 1 Stunde in feuchter Kammer statt F r weitere 2 Minuten in dH gt 5O und jeweils kurzem Eintauchen in 50 70 und 96 Ethanol sind die Schnitte nach Lufttrocknung bereit f r die Visualisierung 3 17 4 Visualisierung der gebundenen Sonde im histologischen Bild Die getrockneten Objekttr ger wurden f r 24 Stunden bei 20 C in einer Fotokassette mit aufgelegtem R ntgenfilm BioMax MR Kodak aufbewahrt Nach der Entwicklung konnte anhand der Intensit t der Schwarzf rbung beurteilt werden wie lange die anschlie end aufgetragene Photoemulsion Kodak NTB2 auf den Objekttr gern verbleiben sollte Die Beschichtung ist notwendig um die radioaktive gebundene Sonde mikroskopisch auf dem histologischen Schnitt sichtbar zu machen Die Photoemulsion muss vor dem ersten Gebrauch 1 1 mit Wasser verd nnt und ein paar K rnchen Waschpulver zur Herabsetzung der Oberfl chenspannung zugesetzt werden Sowohl das Wasser als auch die Photol sung m ssen 1 Stunde lang bei 42 C inkub
144. zu erf llen die f r eine effiziente Virusvermehrung unabdinglich sind Zum einen hat es die F higkeit nach vorangegangener Endozytose des Viruspartikels virale und zellul re Membran zu fusionieren was zu einer Freisetzung der Nukleokapside ins Zytoplasma f hrt Die zweite Funktion des HAs ist es an endst ndige Neuramins uren glykosylierter Membranbestandteile als Rezeptormolek l auf der Zielzelle zu binden Diese F higkeit kann das Virus jedoch ebenfalls mit einem schwerwiegenden Problem bei der Freisetzung neugebildeter Partikel konfrontieren Hierbei kann es dazu kommen dass das HA dieser Viren an die bereits infizierte Zelle bindet oder die Viren miteinander verklumpen Dieses Problem wird von der ebenfalls in der Virusmembran verankerten Neuraminidase gel st die die Neuramins uren auf der Zell und Virusoberfl che hydrolytisch abspaltet Ist die Bindung des Rezeptors durch das HA jedoch zu stark k nnen sich die neugebildeten Viren nicht effizient von der infizierten Zelle l sen Andererseits kann ein Virus mit starker Neuraminidaseaktivit t und schwacher Rezeptorbindungsf higkeit schlecht an neue Zielzellen binden Die Effizienz der HA und NA Aktivit t sollten ausbalanciert sein um eine produktive Virusvermehrung zu gew hrleisten Wagner et al 2000 Oligosaccharide an der 84 Diskussion Spitze des HAs k nnen die Affinit t des Virus zu Neuramins uren auf Erythrozyten und anderen Zellen herabsetzen Crecelius et al

Dokument - Publikationsserver UB Marburg

Contents

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents