Elucigene® CF Iberian Panel Instruções de utilização
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1. 6 K710X WT amp 2184ims WT 9 12 16 TWT 11 P2055 WT 7 R709XK WT 10_H199Y WT Nota Na presen a de um homozig tico 2183AA gt G espera se que o pico de estirpe selvagem 2184insA desapare a completamente devido aus ncia de amplifica o de qualquer dos alelos Se isto ocorrer recomenda se a realiza o de estudos de seguimento para testar a presen a de 2183AA gt G As muta es que se seguem que n o foram verificadas quanto a uma eventual reactividade cruzada por n o estarem dispon veis amostras relevantes podem interferir com o funcionamento do teste G194R G194V H199R H199Q P205R L233F Q493X Q493P Q493R 1612delTT R560S 1813insC R709Q 2868G gt A S912L S912X 11005R A lista n o exclusiva nem completa CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 20 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene8 CF Iberian Panel Guia de an lise do software do GeneMapper Introdu o A sec o que se segue descreve os procedimentos para an lise de amostra dos resultados do Elucigene CF lberian Panel usando pacotes de software Applied Biosystems GeneMapper vers o 3 7 ou mais recente Nota os screenshots deste documento foram tirados do GeneMapper v5 Processo de an lise O processo para an lise de amostras foi resumido no diagrama abaixo Executar amostras amplificadas no Genetic Analyzer Abrir o software GeneMapper Adicionar ficheiros FSA de amostras para projecto Seleccionar o m todo de an lise2. sua compatibilidade com este teste H relatos de alguns casos em que dispositivos de colheita de amostras afectaram a integridade de determinados analitos e podem interferir com as tecnologias de alguns m todos 8 Recomenda se que cada utilizador zele para que o dispositivo escolhido seja utilizado de acordo com as instru es do fabricante e que os dispositivos de colheita de amostras sejam compat veis com este teste As amostras de sangue devem ser armazenadas a 20 C antes da prepara o do DNA Evite congelar e descongelar repetidas vezes Prepara o de DNA a partir de amostras de sangue total EDTA S o obtidos resultados consistentes com o DNA extra do por meio do QlAamp 96 DNA Blood Kit ou o QlAamp DNA Mini Kit com Proteinase K seguindo o protocolo descrito no Manual QlAamp partindo de 200 ul de sangue total l quido e eluindo o em 2004 de gua de pureza adequada a biologia molecular Concentra o de DNA Utilizando as condi es de PCR e defini es de injec o de amostras recomendadas consulte a nota na sec o de electroforese de capilares indicadas nos m dulos de execu o de colunas de capilares t m sido repetidamente obtidos resultados aceit veis com a quantidade de DNA de 15 ng Por m resultados interpret veis s o obtidos com uma quantidade de DNA de 5 ng a 30 ng A quantifica o do DNA muito importante pelo que a concentra o de cada amostra de DNA a analisar deve ser determinada p
3. http Avww elucigene com produci category cystic fibrosis 2347delG um exemplo de uma dele o detectada pelo ensaio Elucigene CF EU2v1 que tem impacto sobre os picos verdes de estirpe selvagem do ex o 14 do perfil do ensaio CF Iberian como demonstrado em seguida 2347 delG S o observados dois picos com 1 bp de intervalo para a estirpe selvagem verde pico 6 K710X pico 7 R709X e pico 8 2184insA num heterozig tico individual para a muta o 2347delG ver perfil abaixo A presen a da muta o 2347delG ser confirmada se usar o ensaio CF EU2v1 indicado como o pico azul na posi o 16 na mistura A de CF EU2v1 i I I 3 ASG1E WT 4_1609delCA WT 1_41006E WT eA d A EN I I I 5_2869insG WT 6 K710X WT 2184insA WT 9 712 1G6 T WT 11 P205S WT 12 V232D WT 7 R709X WT 10 H199 WT Outras observa es Interac o H199Y e P205S Verificou se que a muta o P205S interfere parcialmente com a amplifica o da sequ ncia de iniciadores de estirpe selvagem H199Y A altura reduzida da estirpe selvagem pico 10 H199Y pode ser observada num heterozig tico individual para a muta o P20558 CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 18 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Reactividade cruzada Durante o desenvolvimento do teste foram envidados todos os esfor os para evitar a interfer ncia no funcionamento do teste da presen a de outros polimorfi
4. Zariwala M Fargo D Xu A Dunn JM Darrah RJ Dorfman R Sandford AJ Corey M Zielenski J Durie P Goddard K Yankaskas JR Wright FA Knowles MR Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis N Engl J Med 2005 353 1443 53 4 Goss CH Newsom SA Schildcrout JS Sheppard L Kaufman JD Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis Am J Respir Crit Care Med 2004 169 816 21 5 Kerem B Rommens JM Buchanan JA Markiewicz D Cox TK Chakravarti A Buchwald M and Tsui LC Identification of the Cystic Fibrosis Gene Genetic Analysis Science 1989 245 4922 1073 8 6 Cystic Fibrosis Mutation Database www genet sickkids on ca cftr app 7 Newton CR et al Analysis of any point mutation in DNA The Amplification Refractory Mutation System ARMS Nucleic Acid Res 17 2503 2516 1989 8 Satsangi J etal Effect of heparin on polymerase chain reaction Lancet 343 1509 1510 1994 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics UK Ltd ARMS uma marca comercial registada da AstraZeneca UK Ltd QIAAMP uma marca comercial registada da Qiagen GmbH PICOGREEN uma marca comercial registada da Molecular Probes Inc GENEMARKER uma marca comercial registada da Softgenetics Corporation GENEMAPPER NED VIC PET POP 7 LIZ e HI DI s o marcas registadas da Life Technologies Corporation AVISO AO COMPRADOR LICEN A LIMITADA Os polinucle ticos marcados com corantes VIC NED
5. adequado o painel e o padr o de Executar an lise da amostra Guardar o projecto GeneMapper Seleccionar amostra e abrir a janela do gr fico Rever dados de tra ado e gen tipo Registar gen tipos de amostras Imprimir tra ados de amostras do Elucigene CF Iberian Panel CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 21 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Importar as defini es para an lise do CF Iberian Panel GeneMapper Antes da primeira utiliza o do kit necess rio importar as defini es do CF Iberian Panel para GeneMapper O processo controlado atrav s da interface GeneMapper Manager As defini es do GeneMapper do CF Iberian Panel est o dispon veis na p gina da Elucigene http www elucigene com producit category cystic fibrosis 1 Abra o GeneMapper Manager clicando no cone Figura 1 Figura 1 Abrir o GeneMapper Manager File Edit Analysis View Tools 2 Seleccione o separador Analysis Methods e depois clique no bot o de importa o Figura 2 Figura 2 Interface do GeneMapper Manager r me GeneMapper Manager Projects Name Last Saved Instrument CF IBN 2014 07 08 12 44 03 0 CFEUZ FAM bg 2012 01 23 14 49 58 0 QSTR Analysis Settings 350 2011 11 03 12 15 02 0 QSTR Analysis Settings 313 2011 11 03 12 10 17 0 Primer QC Analysis 2009 11 13
6. g 39 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Pr visualiza o do relat rio do GeneMarker Clique em Preview para pr visualizar o relat rio do GeneMarker Figura 21 A partir desta janela o operador consegue rever e imprimir os dados de pico de cada amostra fornecendo um relat rio de amostra simples de uma ou duas p ginas Figura 21 GeneMarker Report relat rio do GeneMarker SoftGenetics Allele Report 6 30 2015 1 50 21 PM GeneMarker V2 6 3 Page 1 Allele Report SoftGenetics Project testRun PrintWithoutMarkerNames SGF Template CF Iberian Panel CF Iberian Project Comments Sample 1 frag 001 A07 fsa Run date and time 06 22 2015 14 22 52 gt 0622 2015 15 04 30 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 1 41006E MUT 1 A100E WT 8_2184insA_WT 10 H199Y WT 12 V232D WT 2 181 21 GA WT 6 KT10X WT 97121 GT WT 3 ASG1E WT 7_R709X_WT 4 1609delCA WT Sample 2 frag 002 AQS fsa Run date and time 0622 2015 14 22 52 gt 06 22 2015 15 04 30 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 a A LA A fl A AA 9_712_1G_T_MUT 1_A100E_WT 5 2869insG WT 8 2184insA WT 10 H199Y WrT 12 N232D WT 2 1812 1G A WT 6 KT10X WT 9 712 1G TWT 3 ASB1E WT T RT09X WT 4 1609delCA WT O relat rio do GeneMarker inclui as seguintes funcionalidades e Cabe alho do relat rio cont m informa
7. o do gen tipo de ficheiros de dados n o tratados do CF Iberian Panel importado 1 Na principal janela GeneMapper seleccione as CFEU2 Table Settings da forma apresentada Figura 7 Figura 7 Selec o das defini es da tabela File Edit Analysis View Tools Help so LE DEBU BBB Pg raesetno carrdestnos cH P gt 0DO sa Project Samples Genotypes AFLP Default A Run AB31308 2014 05 TANA Sample File frag_001_A03 fsa e SFN_ Analysis Method F CFEU2_3130 Analys frag 002 ADI fsa CFEUZ 3130 Analys frag 003 BO3 sa 2A ple NA CFEUZ 3130 Analys frag 004 BOdS fsa 2B a 2 wol nEn ple NA CFEU2_3130 Analys C fran NNA CNA fsa R nle NA FFH 34130 Anahelrf 2 Na janela principal do GeneMapper seleccione a primeira c lula no Analysis Method e seleccione o m todo de an lise adequado a partir do menu pendente M todo de an lise do CF Iberian Panel 3130 ou 3500 3 Repita este processo para o Panel seleccionando o CF Iberian Panel e da mesma forma para o Size Standard seleccionando CFEU2 size standard a partir dos menus pendentes 4 Clique em gt para iniciar a an lise da amostra Atribua um nome de projecto quando tal for solicitado CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 27 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Rever dados de tra ado e gen tipo do CF Iberian Panel 1 Seleccione a am
8. o seleccionadas as seguintes caracter sticas e Tipo Regular e Template Modelo FragmentAnalysis36 POP7 e Insira as defini es descritas na tabela abaixo F Nome do par metro Gama Oven Temperature int 18 65 C Poly Fill Vol 6500 38000 etapas Current Stability int 0 2000 uA PreRun Voltage 0 15 kvolts Pre Run Time 1000 S Injection Voltage 15 kvolts Injection Time 600 S Voltage Number Of Step 100 nk Voltage Step Interval 60 S Data Delay Time 3600 S Run Voltage 15 kvolts Run Time 300 14000 S ONO CE ON gt gt Nota O tempo de execu o necess rio varia consoante a temperatura ambiente do local onde o analisador gen tico est instalado Para mais informa es acerca da cria o de m dulos de execu o queira consultar o Manual de utiliza o do analisador gen tico 3130 da Applied Biosystems Crie o protocolo para CF Iberian Panel no Protocol Manager gestor de protocolos e assegure se de que selecciona as seguintes caracter sticas Tipo Regular e Run Module M dulo de execu o CF Iberian ver modulo de execu o acima e Conjunto de corantes G5 Para executar as amostras crie uma ficha de amostras utilizando o Plate Manager gestor de placas e assegure se de que foi seleccionado o protocolo correcto para o protocolo do instrumento ver acima Nota Para mais informa es acerca da configura o opera o e resol
9. principal do GeneMapper Figura 6 Figura 6 Amostras foram adicionadas lista e est o prontas para ser adicionadas ao projecto File Edit Analysis View Tools Help Gal E EEE PSE gt Table Setting QSTR Table Settings voz PE SER sia Project Samples R i E i Status Sample File Sample Name Sample ID Comments Sample Type SFN Analysis Method Panel Size Standard Matrix SNP Set Run Name 1 CJ 2 m a m A H 4 ml i i 4 i m Add Samples to Project 28 Edit View fas Da E Samples To Add RR RR RE Ron 2531304 2014 93 15 15 10 0020 5 Run AB3130A 201403 19 15 10 0020 Run AB3130A 2014 04 10 09 20 0032 4 A01 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0033 4 AOZ Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Ji Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0034 BO1 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0035 4 BO2 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0036 4 CO1 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0037 CO2 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 14 14 24 0038 4 D01 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 15 09 00 0039 DO2 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 15 15 50 0043 4 E0O2 Run AB3130
10. GeneMapper fa a duplo clique na pasta de execu o importada para ver a lista de ficheiros fsa que cont m 2 Seleccione um ficheiro fsa 3 Clique no separador Raw data apresentar o electroforograma de dados n o tratados 4 Usando o pico LIZ GS600v2 de 100 bp laranja como guia decida se por um ponto de dados aproximadamente 100 pontos de dados mais pequeno Figura 11 5 Garanta que a gama de an lise m xima abrange o maior pico do padr o de tamanho 600 bp para GS600LIZv2 6 Introduza os novos valores no ficheiro de an lise acedendo da forma descrita em cima Figura 11 Encontrar a gama m nima usando os dados n o tratados da amostra frag 006 C04 fsa frag 007 DO3 fsa frag 008 DO4 fsa frag 009 E03 fsa frag 010 E0O4 fsa frag 011 FO3 fsa A frag 012 FO4 fsa frag 01 03 f fri ag 0153 G03 fsa ag 014 G04 a frag 015 H03 fsa 7000 frag_016_H04 fsa 6000 4000 1000 CFIBNBYPT 001 sis Project J Info Raw Data EPT Data Run AB3130B 2014 05 Bagi 001 40 3 E frag 013 G03 fsa frag 002 A04 fsa frag 003 B03 fsa 0 frag 004 B04 fsa 3000 frag 005 C03 fsa 1000 2000 3000 4000 5000 100bp 120bp 180bp 140bp 160bp 200bp 80bp y VN ra TA o ara a a haer ai ea tm ma Ne ER i tema DO so DN pn a pr pm rr asa ini dt a A A E AeA AIEA SERENA GAITA PESOLA OE IIIN EEDENI SEREIA IAS AII PERIE EALES Jun 2015 P g 30 of 42 Instru es de utiliza o de
11. T 383 395 H199Y 400 408 P205S 415 423 V232D 496 505 Nota Os tamanhos dos marcadores podem variar consoante o aparelho e o pol mero utilizados CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 16 of 42 3000 2000 1000 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Exemplos de interpreta o Resultado normal Num resultado normal todos os alelos detectados s o homozig ticos estirpe selvagem o que indicado pela presen a de picos verdes nicos marcados para todos os 12 marcadores Os marcadores STR n o devem ser marcados e o tamanho padr o do marcador deve estar de acordo com o tamanho padr o do marcador das misturas CF EU2v1 A e B para uma dada amostra Abaixo encontra se um exemplo de um resultado normal L 1_41006E WT 2_1812 1G_ WT Muta o heterozig tica 270 6 K710X WT 7 R709X WT 8 2184imsA WT Ta 3 ASG1E WT 4 1609delCA WT 5 2869mnsG WT 9 712 1G TWT 11 P2055 WT 12 V232D WT 10 H199 Y WT O exemplo abaixo indicada um heterozig tico 1812 1G gt A O alelo mutante 1812 1G gt A indicado pelo pico azul marcado esquerda do alelo A1006E de estirpe selvagem pico verde marcado Em qualquer caso os picos azuis mutantes devem ser localizados esquerda da estirpe selvagem verde 110 150 130 230 310 Jh 1 ALOOSE WT 2 1812 1G A Mut 2 1812 1G A WT Heterozig tico composto I I I E AS561E
12. atrav s da interface do Panel Editor O ficheiro do painel para o GeneMarker do CF Iberian Panel est o dispon veis na p gina da Elucigene http www elucigene com product category cystic fibrosis 1 Abra Panel Editor a partir do menu pendente Tools Figura 14 Figura 14 Selec o do editor do painel E Fle Vew Pojat Lep E f tas P AMI Roo AENA WIE 1015 de A EM Ar SERIE MIMOIS e ANIN IDO IXO 14 ec BM 200 222 24 ZH air Eur AD 407 4 500 SMO SIT SMT SERE SOTO Goo LO CAME GERE GERE TONI 7 22 7 40 7 0 TEM 500 523 5 42 FITIAMEEZ x Es 2 Seleccione Import Panels a partir do menu pendente File Figura 15 Figura 15 Importar pain is File Tools Help D Create New Panel X Delete Current Panel Marker Help AFLPPanel E Save Change cus Save Changes with Signal Info 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Save As New Panel Pd import Panels Import Pre defined Panels Import ABI Panels Import MRC Holland Panels Export Panel Exit Es microsat panel Panel Name AFLPPanel Ploidy 2 if eae S pre Run AB312304 2014 No Left Range Right Range Allele Name Control Distance kb Chromosome Position Recombination Frequenc a D B01_Run_AB31304_2014 H al Bue o a4 D E 0 l z C01 Run AB31304 2014 LO uo ue id A 3 D 0 00 NC BR 3 Bue Bluel 37 8 04 04 38 0 0 00 1 00 4 Blue Blue1 41 6 04 04 42 0 00 1 00 5 Blue Bl
13. de produtos ElucigeneQ CF Iberian Panel Figura 5 Importar o ficheiro do bin CF Iberian E panel Manager File Edit Bins View Exa onsee cem iti o 000000 Panel Name CF Iberian Panel Beta Lot 700245 Only none CFZEU gmbfo L CF2EU gmpfo CF Iberian Panel Bin File L CF Iberian Panel Panel File CFlberian CFIBN bins E CF4v2 CF4v2 E CFlberian Panels CF4v2 Panels _ CF Ivacaftor Panel CF Ivacaftor bins CF EU2 POP6 CF Ivacaftor Panel Panels CF EU2 POP7 CFUK CFUK bins CFUK Panels CF2EU 3100 gmas001 CF2EU 3130 gmas001 _ CF2EU 3500 gmas001 4 CF Iberian Panel Bin File txt All Files CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 25 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Importar os ficheiros de dados n o tratados do CF Iberian Panel para o GeneMapper 1 Abra o ficheiro do programa GeneMapper 2 Clique em Gu para adicionar ficheiros de dados a um novo projecto Navegue para o local onde os ficheiros de dados n o tratados fsa est o guardados realce os ficheiros de dados adequados e clique no bot o Add to List gt gt para adicionar 3 A pasta de execu o aparecer agora na janela Samples to Add Um duplo clique no cone da pasta de execu o nesta janela mostrar cada ficheiros fsa a importar As amostras s o ent o adicionadas clicando em no fundo do ecr Os ficheiros de dados aparecer o agora ecr
14. obter se os melhores resultados nas seguintes condi es de electroforese de capilares num Genetic Analyzer de ABI3130 ou ABI3500 1 Combine 6 8 ul de padr o de tamanho com 250 ul de formamida Hi Di e misture bem mistura suficiente para 16 po os Distribua 15 ul da mistura pelo mero necess rio de po os de uma placa ptica de 96 po os 2 Adicione 3 u de produto de PCR de amostra mistura padr o da etapa 1 j distribu do na placa e misture com a pipeta Sele a placa 3 Desnature o produto de PCR distribu do na placa de PCR num termociclador utilizando os seguintes par metros 94 C durante 3 minutos ligado a 4 C durante 30 segundos 4 Cenirifugue a placa a 1000 g por 10 segundos remova eventuais bolhas existentes nos po os e carregue para o analisador gen tico Nota essencial que po os n o utilizados ou seja po os nos quais n o esteja carregada uma amostra de DNA ainda estejam carregados com formamida Hi Di para garantir que os capilares n o secam As defini es de injec o de amostras podem ser modificadas consoante a quantidade de produto de amplifica o produzido durante a PCR que pode variar devido quantidade de DNA gen mico inicialmente introduzida Pode aplicar se menos produto de amplifica o coluna para an lise reduzindo o tempo de injec o Inversamente pode aplicar se mais produto de amplifica o coluna para an lise aumentando o tempo de injec o Amostras previamente
15. 10 55 19 0 CF4w2 Analysis Method 2009 10 27 09 08 51 0 QSTR Analysis v02 2005 12 09 00 23 06 0 CFEUZ 3500 2010 05 07 09 06 10 0 QSTR 3500 normalisation 2010 04 21 09 10 58 0 CFEUZ 3130 low size 2011 09 08 12 48 45 0 CFEUZ 3130 Analysis Methc 2008 07 26 12 52 32 0 QSTR nalysis 3500 2011 11 03 12 26 44 0 4 E CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 22 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel 3 Navegue para e importe o m todo de an lise do CF Iberian Panel 3130 ou 3500 Figura 3 Figura 3 Importar m todos de an lise E Import Analysis Method Look in Em Supporting Files from Web pi Recentiteme anandOO gmas002 anan gqmps002 1 _ ananddO gmpsdOs ananddO qmsz02 ananD O qmts002 _ anandOS qupfdo _ anandiS gupfdol _ anandi gupfool _ anan 2l qupfoo ananDpl qupf0os K A _ ananbxy gupfios Ro anan500 gusz001 Jd Official QSTR report templates di Old report templates E CF2EU 3100_gmas001 _ CREU 3130 gqmasd0l CF2EU 3500 gmasd0l CF2EU gmsa0l CRREU gmtsd0l CREU Plot PT offDol CREU Plot PT onD0l CF EU2 POP6 CF EU2 POPT cfcfO04 qmasdOs cfcfOO4 qmps00s cfcfO04 gmsz00l cff qmts002 THHO3 gmasd0l Computer ananbdO qusz00l 4 a File name CF Iberian Panel Ana
16. 130A 2014 10 16 16 19 0285 2014 10 16 fsa Completed BO1 Run AB3130A 2014 10 16 16 19 0285 2014 10 16 fsa Completed CO1 Run AB3130A 2014 10 16 16 19 0265 2014 10 16 fsa Completed Checking Calibration 3 samples processed Analysis Time 0 40s CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 38 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Janela de an lise principal A janela de an lise principal Figura 20 do GeneMarker tem um layout f cil de usar Este layout incluir A lista de ficheiros de amostra apresentada do lado esquerdo da janela A imagem de gel sint tico apresentada no topo da janela Electroforograma de dados por baixo da imagem do gel Uma tabela de relat rios Report apresentada direita da janela Nesta janela importante verificar se todos os picos adequados em cada perfil foram considerados correctamente Fa a clique com o bot o direito em cada amostra por sua vez na rvore de ficheiros de amostras do lado esquerdo do ecr Fa a clique com o bot o direito em qualquer pico em quest o e escolha a partir das op es na caixa de di logo p ex edite ou elimine o alelo confirme ou retire a confirma o consoante o adequado Figura 20 Janela de an lise principal Fie View Project Applicatons Took Heip S PEES B A GE JB o Haker iom e Es novos ad esanas SGF 4 EEE SJSSSERRSSaSaANOD BRERERRRRRRRAD E CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P
17. 15 P g 14 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel An lise e interpreta o de resultados Interpreta o geral dos resultados Os produtos de PCR s o observados como um sistema marcado de cinco corantes usando o conjunto de filtros G5 O conjunto de filtros G5 detecta os fragmentos marcados 6 FAM azul VIC verde NED amarelo e PET vermelho mais o marcador de padr o de tamanho com LIZ laranja numa electroforese e no programa GeneMapper ou GeneMarker Nota importante diferentes combina es de instrumento pol mero e padr o de tamanho podem fazer com que o size calling varie ligeiramente Durante a valida o do kit os utilizadores dever o verificar se as defini es padr o de bin resultam em marca o de picos precisa e caso necess rio ajust las Em caso de dificuldades entre em contacto com a Assist ncia T cnica techsupportDelucigene com CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 15 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Guia de an lise geral para o CF Iberian Panel No CF Iberian Panel tanto os prim rios espec ficos mutantes como a estirpe selvagem s o combinados na mesma mistura A presen a de uma muta o CF identificada pela presen a de um pico azul e a presen a de um alelo de estirpe selvagem normal identificada pela presen a de um pico verde Os indiv duos que sejam portadores de uma c pia mutante e uma c pia d
18. A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0048 4 FOZ Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0049 4 G02 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa a Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0050 amp H02 Run AB3130A 2014 03 19 15 10 0020 2014 03 19 fsa Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0051 Run AB3130A 2014 04 17 08 58 0052 Run AB3130A 2014 04 17 16 13 0057 Run AB3130A 2014 04 17 16 13 0058 Run AB3130A 2014 04 17 16 13 0059 Run AB3130A 2014 04 17 16 13 0060 Run AB3130A 2014 04 23 10 46 0067 I J Run AB3130A 2014 06 10 15 50 0100 Run AB3130A 2014 06 13 15 16 0102 Run AB3130A 2014 06 16 12 46 0103 Run AB3130A 2014 06 17 10 38 0105 Run AB3130A 2014 06 17 16 06 0106 Run AB3130A 2014 06 18 09 12 0107 Run AB3130A 2014 06 19 17 33 0110 Run AB3130A 2014 06 20 12 27 0111 Run AB3130A 2014 06 20 15 57 0112 dy Run AB3130A 2014 06 20 15 57 0114 4 Run AB3130A 2014 06 23 12 09 0115 Run AB3130A 2014 06 23 14 33 0116 Run AB3130A 2014 06 20 15 57 0113 H Run AB3130A 2014 06 23 16 28 0117 Run AB3130A 2014 06 24 14 53 0118 Run AB3130A 2014 06 24 14 53 0119 Run AB3130A 2014 06 25 13 54 0120 Run AB3130A 2014 06 25 13 54 0121 Clear Add Add amp Analyze Cancel CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 26 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel An lise e determina
19. File List Figura 12 Figura 12 Amostras adicionadas lista Data File Open Data Files Data File List Esta Run AB31304_2014 10 16_16 19_0285_2014 10 16 fsa E BOT Rum ABStad AMADA TES 0205 AMADA fa E ACO Rum AB 31304_2014 10 16_16 19_0285_2014 10 16 f2a Remove Remove Add Folder Default A Channels uto Elevale OK Cancel 3 Clique no bot o OK da caixa de di logo Open Data Files e as amostras ser o carregadas para o GeneMarker O software abrir automaticamente a janela Raw Data Analysis Figura 13 CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 32 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Figura 13 Janela de an lise de dados n o tratados E Ceretta Inatia Flo Vies Pijan Apofcross Tools Hdp F IR ass lsniganmxalo ES hiwi Eia ea CPEE A MI Fur ABI D 21140246 1E4 1 EO Fuw aB3 3 2714 TIE EIS JN DJI Fur SBT IA 291a TIR 1548 EMO EMO EAN E SME SME SIT SST SAE SEIO SO SIT NIII 6 4 6 40 6 20 1 90 1 20 7 40 ran AL r sm F o CIN CIN nen STE ONE FA ZE 26 SON gt isa yr Ar Aan IME MAIR 1613 DAE T ADI em CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 33 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Importar as defini es de painel para o GeneMarker do CF Iberian Panel Antes da primeira utiliza o do kit necess rio importar o ficheiro do painel CF Iberian para o GeneMarker Este processo controlado
20. Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Elucigene Diagnostics Elucigene CF Iberian Panel Instru es de utiliza o C digo de cat logo Elucigene CF Iberian Panel 25 testes CFIBNB1 Utiliza o em diagn stico in vitro pao por Elucigene Diagnostics Citylabs Nelson Street Manchester M13 9NQ Para Vendas Assist ncia ao Cliente e Assist ncia T cnica T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquirieselucigene com E techsupport Delucigene com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics UK Limited a company registered in England and Wales registration number 8696299 CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 1 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Elucigene CF Iberian Panel Utiliza o prevista Para a detec o simult nea das seguintes muta es do gene regulador da conduct ncia transmembranar na fibrose c stica Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator CFTR respons veis pela fibrose c stica em humanos em DNA extra do de sangue total conservado em EDTA ea o De acordo com as orienta es da HGVS Intr o ex o Do cDNA name Protein name Intr o ex o de Intr o ex o nar c580 1G gt T o ntr o mooy csosCT oHisto9Tvr Ex o6a pos cet3c gt T pPro205Ser Ex o6a Ex o 6a Ex o 10 18124G gt a crsmoia m os Ex o 12 Ex o 1 K710X 0 2128A gt T
21. MS que os oligonucle tidos com um res duo n o correspondente na extremidade 3 n o funcionam como iniciadores da reac o em cadeia da polim rase PCR em condi es espec ficas A selec o de oligonucle tidos adequados permite a amplifica o e detec o de sequ ncias de DNA mutantes ou normais espec ficas As sequ ncias amplificadas produtos de amplifica o s o separadas por electroforese de capilares utilizando um analisador gen tico da Applied Biosystems O software de an lise permite a identifica o e a marca o dos produtos de amplifica o segundo o seu tamanho e a cor do corante O Elucigene CF Iberian Panel um ensaio multifacetado que abrange uma reac o de PCR Numa mistura de uma nica reac o tanto os alelos mutantes como os de estirpe selvagem s o detectados para doze muta es dentro do gene CFTR No ensaio CF Iberian Panel os alelos mutantes s o visualizados como picos de produtos de amplifica o azuis e os alelos de estirpe selvagem s o visualizados como picos de produtos de amplifica o verdes Os marcadores de controlo interno da amplifica o n o associados a fibrose c stica que se encontram no CF EU2v1 est o tamb m inclu dos na mistura CF Iberian Panel Estes s o visualizados sob a forma de picos de produtos de amplifica o vermelhos e s o usados para monitorizar a efici ncia da amplifica o das amostras e identifica o de paciente auxiliar ao usar o CF Iberian Panel ao la
22. Percentage gt 5 a Global Max We Pulkup Comechon w Spike Removal Local Region gt Es Ss Local Max W Stutter Peak Filter 5 We Flus A Filter Left 90 Right Ei a Size Call te Local Southerm CubicSplne Large Size Load Default Save Default lt lt Back Cancel Nota para dados 3500 aumente a Min Intensity intensidade m nima para 150 CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 37 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Run Wizard Defini es adicionais N o s o necess rias defini es adicionais Figura 18 1 Clique em OK para continuar Figura 18 Run Wizard Additional Settings Defini es adicionais Run Wizard Additional Settings Fragment Animal Analysis Set additional optione related to the different analysis type Allelic Ladder MONE Allele E valuatior Peak Score Reject 10 00 Check 20 00 lt Pass E 30 4 Back Cancel Caixa de processamento de dados Depois de clicar em OK na caixa de defini es adicionais do Run Wizard surge a caixa de processamento de dados Figura 19 Os dados n o tratados s o processados e dimensionados e depois os par metros de filtragem e o painel seleccionado s o aplicados 1 Clique em OK na caixa de processamento de dados quando a an lise for conclu da Figura 19 Caixa de processamento de dados Events Checking options Processing Samples hO1 Rum AB3
23. WT 4 1609delCA WT 5_2869insG WT 6 _K710X WT 7 R709X WT 8 2184insA WT I I 9_712 1G_T WT 11 P205S WT 12 V232D WT 10 H199Y WT O exemplo abaixo apresenta um resultado de um heterozig tico composto para as muta es P205S e V232D Os alelos mutantes P205S e V232D s o indicados pelos picos azuis marcados esquerda dos respectivos picos de alelos de estirpe selvagem pico verde marcado dd 3 ASGLE WT 4 1609delCA WT 5 2869nsG WT 2 1812 1G A WT 1 AJOO6E WT CFIBNBYPT 001 E 6 K710X WT 7_R709X WT 8 2184ins WT Jun 2015 aal MAIO LA 2 712 1G TWT 11 P2055 Mut 10 H1997 WT 11 P2055 WT 12 V232D Mut 12 V232D WT P g 17 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Inser es e dele es Devido natureza do desenho do Elucigene CF Iberian Panel a presen a de inser es ou dele es entre dois iniciadores opostos resulta em varia es do tamanho da totalidade dos produtos de amplifica o produzidos entre estes dois iniciadores Por conseguinte al m das 12 muta es detectadas pelo Elucigene CF Iberian Panel quaisquer inser es e dele es no interior das sequ ncias alvo amplificadas podem ser detectadas atrav s da varia o do tamanho esperado do produto de amplifica o dos picos de estirpe selvagem verde Estes foram descritos na Tabela de inser es e dele es dispon vel a partir da p gina da Elucigene
24. amplificadas podem ser reinjectadas diversas vezes para rean lise An lise de dados p s PCR ANALISADOR GEN TICO ABI3130 O CF Iberian Panel foi concebido para ser compat vel com o produto Elucigene CFEU2v1 Como tal o CF Iberian Panel pode ser realizado usando m dulos de execu o e defini es CFEU2v1 Alternativamente um m dulo de execu o separado CF Iberian pode ser criado pelo utilizador da seguinte maneira Crie uma ficha de amostras usando o software de recolha de dados 3130 com as seguintes defini es Nome da amostra tem de ser o mesmo nome ou n mero espec fico da amostra Propriet rio da execu o seleccione ou propriet rio padr o para o laborat rio e Protocolo de execu o CF lIberian cont m m dulo de execu o 3130 Nota necess rio criar um m dulo de execu o com detalhes das defini es de instrumento e posteriormente atribuir este a um protocolo de execu o em que o conjunto de corantes G5 foi seleccionado Para mais informa es acerca da cria o de m dulos de execu o queira consultar o manual de utiliza o do instrumento CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 12 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel M DULO DE EXECU O 3130 PARA POL MERO POP7 M dulo de capilares de 36 cm MFI Crie o m dulo execu o de CF Iberian no Module Manager gestor de m dulos do software do software de recolha de dados 3130 Certifique se de que s
25. ara garantir a obten o dos melhores resultados S o aceit veis t cnicas como a fluoresc ncia PicoGreen ou a absorv ncia de UV Devido s varia es entre as t cnicas de quantifica o de DNA o utilizador deve ter em considera o as seguintes orienta es Quantidades de DNA de entrada muito elevadas aumentam a probabilidade de marca o de picos de fundo pelo software de an lise Podem ser tomadas as seguintes medidas para reduzir a probabilidade de marca o de picos de fundo e Dilua a amostra de DNA e volte a amplificar e Reduza o tempo de injec o consulte a sec o de electroforese de capilares e Aumente o limiar m nimo de amplitude do pico Quantidades baixas de DNA de entrada aumentam a probabilidade de os picos de diagn stico serem fracos e n o serem marcados pelo software de an lise Podem ser tomadas as seguintes medidas para aumentar o sinal e Aumente o tempo de injec o consulte a sec o de electroforese de capilares e Volte a extrair a amostra de gotas de sangue seco e elua num volume reduzido 50ul de gua CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 9 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Protocolo do ensaio Procedimento de amplifica o Nota para minimizar o risco de contamina o as etapas 3 5 t m de ser realizadas numa rea isenta de DNA Tamb m devem ser realizadas etapas para evitar contamina o com produto PCR 1 Programe o termoci
26. clador para um ciclo de etapa nica para activar o DNA polimerase a 94 C durante 20 minutos ligado a um programa de ciclos de amplifica o de 1 minuto a 94 C desnatura o 2 minutos a 58 C hibrida o e 1 minuto a 72 C extens o para 30 ciclos Este deve estar ligado a um ficheiro de tempo de atraso de 20 minutos a 72 C extens o no ciclo final Enzyme Activation Final Extension Ambient Temperature 30 Cycles necess rio incluir se um controlo negativo de gua em cada execu o de PCR Pode tamb m ser considerado adequado incluir outros controlos p ex controlos positivos controlo DNA fornecido Descongele a mistura de iniciadores e a mistura principal para PCR e centrifugue um pouco para recolher o conte do do fundo das ampolas Agite suavemente no v rtex para misturar e volte a centrifugar um pouco as ampolas Prepare mistura de reac o suficiente para o n mero de amostras e controlos a testar Tabela 1 Nota a mistura principal para PCR viscosa e necess rio ter cuidado para assegurar que se lida com os volumes correctos Recomenda se a adi o da mistura principal para PCR s misturas de iniciadores previamente distribu das para garantir que todo o l quido distribu do pela pipeta na mistura de iniciadores Nota n o utilize misturas nem componentes de lotes diferentes do kit CF Iberian Panel CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 10 of 42 Instru es de utiliza o de produto
27. dade com a norma 15015223 harmonizada Fabricante N mero de an lises ES E Consulte as instru es de utiliza o Armazene abaixo da temperatura indicada Utilize at data indicada REF C digo de cat logo LO N mero de lote 3 Dispositivo m dico para diagn stico in vitro 5 Q CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 6 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Materiais fornecidos Cada kit cont m Elucigene CF Iberian Panel TA c digo da pe a 450215 1 x 120ul 25 testes mistura de iniciadores contendo iniciadores para amplificar os seguintes alelos mutantes e estirpe selvagem A1006E 1812 1G gt A A561E 1069delCA 2869insG K710X R709X 2184insA 712 1G gt T H199Y P205S e V232D Esta mistura tamb m cont m prim rios para a identifica o de dois marcadores de microssat lites short tandem repeat STR hipervari veis Mistura principal para PCR TM c digo da pe a 404480 1 x ampola 400ul contendo DNA polimerase HotStart Tag e trifosfatos de desoxinucle tidos em tamp o Controlo DNA DC c digo da pe a 40448 1 x ampola de 50 ul de controlo de DNA a 6 ng ul normal para as muta es detectadas pelo Elucigene CF Iberian Panel Prepara o e armazenamento do kit Os reagentes devem ser armazenados em reas isentas de DNA ou produtos de PCR contaminantes Armazene os componentes a 20 C e em ambiente escuro Os corantes fluorescentes usados n
28. do do ensaio Elucigene CF EU2v1 CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 4 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Advert ncias e precau es E O controlo de DNA fornecido com os kits foi analisado independentemente tendo se verificado que negativo para o v rus da hepatite B HBV o v rus da hepatite C HCV e o v rus da imunodefici ncia humana HIV 1 e 2 H que ter cautela quando se manuseia material de origem humana Todas as amostras devem ser consideradas potencialmente infecciosas Nenhum m todo de teste pode garantir totalmente a aus ncia de HBV HCV HIV ou de outros agentes infecciosos O manuseamento das amostras e dos componentes dos testes a sua utiliza o o seu armazenamento e a sua elimina o devem estar de acordo com os procedimentos definidos pelas orienta es ou regulamentos nacionais de seguran a biol gica De acordo bom as boas pr ticas de laborat rio actuais e para que se possa avaliar a validade do procedimento os laborat rios devem processar em cada ensaio as suas pr prias amostras de QC interno de estirpe conhecida Se a caixa do kit estiver danificada o conte do poder estar danificado n o utilize o kit e contacte o Apoio ao Cliente CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 5 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Simbolos utilizados nos r tulos Os s mbolos utilizados em todos os r tulos e embalagens est o em conformi
29. e E AFLP Template Name CF Iberiar 4 BHS MPXI l Fanel EF Ib NH z 4 CF Iberian Uic E FragileX Size Standard CFEUZ Size Standard uu LOH Standard Color range 4 Microsatellite Dinucleoti E HLPA analysis Type Fragment Animal a EA mn Firari Save X Delete C Use last template a cr CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 36 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Run Wizard Processo de dados A janela Data Process do Run Wizard permite que utilizador seleccione os par metros de filtragem do pico 1 Seleccione as defini es de an lise adequadas na janela Data Process da forma apresentada na figura em baixo Figura 17 2 Clique em Next para continuar Nota 4 defini o da gama de an lise dentro do arco de an lise de dados n o tratados variar dependendo do pol mero usado durante a recolha de dados O operador deve seleccionar um valor de pontua o de uma data de in cio que inclua o pico do padr o de tamanho de 60 bp Figura 17 Run Wizard Janela de processo de dados Run Wizard Data Process Fragment Animal Analysis Set data process options Ham Data Analysis Allele Call W Auto Range frame tal M Auto Range bps j e0000 i 00 Ww Smooth Enhanced Smooth Feak Detection Threshold W Peak Saturation Baseline Subtraction Mir Intensity Roo z Max Intensity 20000 S Enh d Baseline Subtract mi e ae
30. e PET e ou a sua utiliza o podem estar abrangidos por uma ou mais patentes detidas pela Life Technologies Corp O pre o de aquisi o deste produto inclui os direitos limitados e n o transmiss veis ao abrigo de determinadas reivindica es de certas patentes detidas pela Life Technologies Corp para a utiliza o pelo comprador apenas desta quantidade do produto e exclusivamente em actividades de detec o de alvo s no dom nio do diagn stico humano N o s o transmitidos outros direitos Podem obter se mais informa es acerca da aquisi o de licen as relacionadas com os corantes atr s mencionados contactando o Director de Licenciamento outlicensingDlifetech com Copyright O 2015 Delta Diagnostics UK Ltd CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 42 of 42
31. e estirpe selvagem heterozig tico de um alelo espec fico mostrar o um pico azul e um verde para esse alelo Os indiv duos que sejam portadores de c pias mutantes de um alelo espec fico mutante homozig tico mostrar o um nico pico azul para esse alelo Os indiv duos que sejam portadores de duas c pias de estirpe selvagem de um alelo espec fico estirpe selvagem homozig tica mostrar o um nico pico verde para esse alelo S o inclu dos marcadores STR hipervari veis vermelhos nesta mistura Estes marcadores STR s o os mesmos que os inclu dos nas misturas CF EU2v1 A e B o que possibilita a compara o entre amostras de pacientes com o CF Iberian Panel e as misturas CF EU2v1 A e B Isto ajuda a reduzir o potencial para confus o de amostras porque um perfil de STR diferente em qualquer das tr s misturas indica isso mesmo A aus ncia destes marcadores STR indica que a amostra falhou A presen a de marcadores STR com RFU muito baixas indica uma amostra fraca que deve ser analisada com cautela Marcadores detectados A tabela que se segue resume os marcadores detectados pela mistura CF Iberian Panel Os marcadores s o indicados por intervalo de tamanhos do produto de PCR observado Marcadores detectados Marcador Produto bp Tamanho N Pico Marcador Intervalo dados A1006E 145 154 1812 1G gt A 175 182 5 A561E 183 191 1609deICA 198 213 2869insG 228 233 K710X 261 268 R709X 270 277 2184insA 332 338 712 1G gt
32. eal ado a azul 5 Seleccione File Import Bin Set Navegue para e importe o ficheiro do bin GeneMapper CF Iberian GeneMapper Bin File txt Figura 5 6 Clique em Apply e em OK para aplicar Figura 4 Importar o ficheiro do painel CF Iberian E panel Manager File Edit Bins View Kit Name Kit Type Comment EE Iberian Panel Jonarshot none CDCF Iberian Panel Bet MFI reflex Microsate none CD MFI reflex DCF UK EDQSTR MI pe Lookin Supporting Files from Web DQSTR anan500 gusz001 E CF2EU gmbfol pia cio ho anan600 gusz001 _ CF2EU gmpfol E Devyser CFTR Core Ov f cent e Mb CF iberan Panel Analysis Method _ CF2EU_gmsz0 E CFEU2v1 CF Iberian Panel Bin File _ CF2EU_gmts00 ED QSTR MFI _ CF Iberian Panel CFIBN bins _ CF2EU_Plot_P CF Iberian CF2EU Plot PT LD CF Ivacaftor Panel j T CF Iberian_CF IBN_bins E CF4v2 CF4v2 E L CF Iberian Panels CF4v2 Panels 4 HE p 4 CF Ivacaftor Panel CF Ivacaftor bins _ CF EU2 POP6 gt CF Ivacaftor Panel_Panels CF_EU2_POP7 a RE ES CFUK CF UK bins cfcfOO4 gmas CFUK Panels cfcfOO4 gmbfl _ CF2EU 3100 gmas001 cfcf0O4 gmpfl _ CF2EU 3130 gmas001 _ cfcf0Os gmps _ CF2EU 3500 gmas001 _ cfcf004_gmsz0 HE Network File name CF Iberian Panel Panel File txt Cancel Files of type All Files CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 24 of 42 Instru es de utiliza o
33. ento Depois de os ficheiros dos dados n o tratados terem sido carregados para o GeneMarker estar o prontos para ser processados A etapa de processamento inclui a aplica o de uma norma de dimensionamento a filtragem de picos ruidosos e a compara o com um painel al lico conhecido se assim pretendido O GeneMarker combina todas estas etapas numa ferramenta simples cnamada Run Wizard Figura 16 Para aceder ao Run Wizard basta clicar no cone de Run Project na barra de ferramentas principal Run Wizard criar um modelo de execu o necess rio criar um modelo de execu o da primeira vez que este software usado para analisar os dados do CF Iberian Panel Isso feito atrav s do Run Wizard 1 Para aceder ao Run Wizard basta clicar no cone de Run Project na barra de ferramentas principal 2 Atribua um nome ao modelo Template Name p ex CF Iberian 3 Seleccione o painel Panel o padr o de tamanho Size Standard a cor do padr o Standard Colour e o tipo de an lise Analysis Type como apresentado na Figura 16 em baixo 4 Clique em Save para guardar o modelo para an lises futuras 5 Clique em Next para continuar CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 35 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Figura 16 Run Wizard Janela de selec o de modelo Run Wizard Template Selection Set the template of the project e Select an existing template or create on
34. es sobre a an lise o projecto a amostra e os par metros e Electroforograma Tal como a janela de an lise da trissomia apresenta todas as cores dos corantes do tra ado da amostra CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 40 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Caracter sticas do desempenho Realizou se o teste ocultado de 35 amostras de DNA extra das de sangue total com o Elucigene CF Iberian Panel Todas as amostras testadas deram resultados interpret veis Desses resultados 16 eram normais 1 era heterozig tico para A1006E 2 eram heterozig ticos para 1812 1G gt A 1 era heterozig tico para A561E 2 eram heterozig ticos para 1609delCA 3 eram heterozig ticos para 2869insG 2 eram heterozig ticos para K710X 1 era heterozig tico para R709X 1 era heterozig tico 2184insA 2 eram heterozig ticos para 12 1G gt T 1 era heterozig tico para H199Y 1 era um heterozig tico composto para P205S e V232D e 1 era heterozig tico para V232D Um heterozig tico 2184delA foi testado e identificado correctamente pelo marcador 2184insA Todos os resultados mostraram 100 de especificidade e sensibilidade com resultados anteriormente obtidos por um m todo alternativo estabelecido Limita es do procedimento 1 Os resultados obtidos com este ou com qualquer outro teste de diagn stico devem ser utilizados e interpretados apenas no contexto do quadro cl nico global A Elucigene Diagnostics n o respon
35. este produto s o fotossens veis minimize a exposi o luz CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 7 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Materiais necess rios mas n o fornecidos Generalidades Consum veis de laborat rio luvas tubos de microcentrifuga de tampa de rosca ampolas para PCR de 0 2 ml ou placas de microtitula o recomendadas pelo fabricante do termociclador utilizado pontas de pipeia Equipamento de laborat rio pipetas de precis o 2 conjuntos 1 para utilizar antes da amplifica o e 1 para depois da amplifica o preferencialmente pipetas de deslocamento positivo vestu rio de protec o agitador v rtex microcentr fuga centr fuga de placas de microtitula o de 96 po os Amplifica o por PCR Termociclador onde caibam placas de microtitula o de 96 po os ou ampolas de 0 2 ml com exactid o m nima da temperatura de 1 C entre 33 Ce e 100 C e uniformidade da temperatura est tica de 1 C O CF Iberian Panel foi validado e ficou demonstrado que desempenha especifica o nas seguintes plataformas de termociclador recomendadas Applied Biosystems GeneAmp 9700 Applied Biosystems Veriti Dx em modo standard Applied Biosystems Veriti Dx em modo de simula o 9700 Applied Biosystems Proflex em modo standard Nota O equipamento do termociclador deve ser mantido regularmente obedecendo s instru es do fabricante e calibrado de forma a gara
36. io da inf ncia em resultado de doen a pulmonar obstrutiva progressiva com broncoectasia at insufici ncia pancre tica com doen a pulmonar obstrutiva gradualmente progressiva durante a adolesc ncia e aumento da frequ ncia de hospitaliza es motivadas por doen as pulmonares no in cio da idade adulta e at sinusite e bronquite recorrentes ou infertilidade masculina no in cio da idade adulta Habitualmente o diagn stico de fibrose c stica estabelecido em indiv duos com uma ou mais caracter sticas fenot picas de CF e dados de uma anomalia na fun o do CFTR com base em um dos seguintes aspectos presen a de duas muta es causadoras de doen a no gene CFTR ou dois valores quantitativos anormais de cloro na iontoforese da transpira o estimulada pela pilocarpina gt 60 mEq L ou determina es da diferen a de potencial nasal transepitelial NPD caracter sticas de CF A taxa de detec o da muta o CFTR varia segundo o m todo anal tico e a heran a tnica Em alguns indiv duos sintom ticos apenas se detecta UMa OU nenhuma muta o causadora de doen a em alguns portadores a muta o causadora de doen a n o detect vel As doen as relacionadas com o CFTR s o transmitidas de forma autoss mica recessiva Irm os de um probando com fibrose c stica t m uma probabilidade de 25 de estarem afectados uma probabilidade de 50 de serem portadores assintom ticos e uma probabilidade de 25 de n o serem afectados
37. lysis Method xml Network Files of type xML Files xml 4 Repita o processo seleccionando o separador adequado e importando o ficheiro correspondente para e Defini es de tabela e Defini es de gr fico e Padr o de tamanho Nota as defini es de tabela as defini es de gr fico e o padr o de tamanho s o as mesmas que as usadas no CF EU2v1 Os operadores que actualmente usem o CF EU2v1 podem aplicar estas defini es sem importar CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 23 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Importar o bin do produto CF Iberian e os ficheiros do painel para o Panel Manager Antes da primeira utiliza o do kit necess rio importar o bin do produto CF Iberian e os ficheiros do painel para o GeneMapper Este processo controlado atrav s da interface Panel Manager O bin e os ficheiros do painel do GeneMapper do CF Iberian est o dispon veis na p gina da Elucigene http www elucigene com produci category cystic fibrosis 1 Abra o Panel Manager Program clicando no cone l 2 Clique em Panel Manager na janela de navega o da esquerda O Panel Manager aparecer agora real ado a azul 3 Seleccione File Import Panels Navegue para e importe o painel do GeneMapper CF Iberian GeneMapper Panel File txt Figura 4 4 O ficheiro do painel ser agora apresentado na janela de navega o da esquerda Clique no ficheiro do painel garantindo que est r
38. nem portadores Os testes de gen tica molecular de muta es causadoras de doen a s no gene CFTR s o utilizados para a detec o de portadores em programas de rastreio na popula o Existem testes pr natais para gravidezes com maior risco de sofrer anomalias relacionadas com o CFTR se forem conhecidas muta es causadoras de doen a na fam lia Desde a descoberta do gene CFTR em 1989 5 foram descritas mais de 1700 muta es e variantes do gene 6 Muitas destas muta es s o privadas tendo sido descritas apenas num doente e ou fam lia As an lises de rotina de todas as muta es poss veis n o s o exequ veis nem rent veis estando assim confinadas an lise das muta es mais comuns O Elucigene CF Iberian Panel foi concebido para prolongar a cobertura do Elucigene CF EU2v1 especificamente para abordar as muta es mais comuns encontradas nas popula es portuguesa e espanhola O Elucigene CF Iberian Panel identifica 12 muta es adicionais no total CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 3 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Princ pios do procedimento O m todo utilizado pelo Elucigene CF Iberian Panel utiliza uma tecnologia de sistema de muta o refract ria amplifica o Amplification Refractory Mutation System ARMS de fluoresc ncia para amplifica o espec fica de alelos que detecta muta es inser es ou dele es pontuais no DNA 7 O princ pio do AR
39. ntir a exactid o dos ciclos de PCR e um desempenho ideal O ensaio Elucigene CF Iberian foi desenvolvido no termociclador Applied Biosystems Veriti em modo 9 00 Outras marcas e modelos dever o ser cabalmente testados e avaliados pelo utilizador para verificar se o seu desempenho o ideal antes de os resultados relativos ao CF Iberian Panel serem lan ados Electroforese de capilares Electroforese de capilares pol mero POP 7 N Cat ABI 4352759 10x tamp o para analisador gen tico N Cat ABI 402824 e formamida Hi Di ABI Cat No 4311320 padr o de tamanho GeneScan 600 LIZ N Cat ABI 4311320 padr o de tamanho GeneScan 600v2 LIZ N Cat ABI 4408399 padr o de matriz multicapilares DS 33 conjunto de corantes G5 N Cat ABI 4345833 Applied Biosystems ABI 3130 e analisadores gen ticos 3500 com software GeneMapper matriz de capilares de 36 cm matriz de capilares de 50 cm para analisador gen tico 3500 placas pticas de 96 po os septos de 96 po os cassetes de 96 po os An lise de dados necess rio um dos seguintes pacotes de software de an lise de dados GeneMapper 3 7 Applied Biosystems Inc ou mais recente ou GeneMarker 1 65 SoftGenetics LLC ou mais recente CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 8 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Colheita e armazenamento de amostras Efectuou se a avalia o de amostras de DNA extra do de sangue total EDTA quanto
40. ostra para an lise realce a linha da amostra 2 Clique em para Display Plot mostrar o gr fico 3 Use o menu pendente para seleccionar as defini es de gr fico CF EU2v1 certas Figura 8 Nota se analisar os dados do CF Iberian Panel lado a lado com os dados do CF EU2v1 ver que o CF Iberian Panel compat vel com as defini es de CFEU2v1 Plot PT on ligado e CFEU2v1 Plot PT off desligado Figura 8 Use o menu pendente para seleccionar as defini es de gr fico CFEUZ2 E Samples Plot File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting CFEU2 Plot PT on L CFEUZ Plot Sample Fila m pam Panes 2 FT off Fa ple Hame Fane 4 A janela do gr fico apresentar dados de tra ados de amostras Figura 9 5 Recomenda se que a janela do gr fico tenha Single click editing activado Para o fazer seleccione Alelos set click editing e certifique se de que esta op o est seleccionada Figura 9 Janela do gr fico da amostra do CF Iberian Panel apresentando dados de tra ados marcados CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 28 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Modificar o ficheiro de par metros de an lise Pode ser necess rio modificar as gamas de an lise Analysis Ranges nas defini es de m todo de an lise do CF Iberian Panel para responder pelas suas condi es de execu o A gama de an lise m nima ir depende do capilar e pol mero
41. p Lvs71OX Ex o 13 2737 2738in Ex o 1 80 1G gt T 95C gt T 61 gt T 80 1G gt A insA gt I 2184insA p GInGBSThrisx4 Ex o 1 U A1006E 3017C gt A 9 Ala1006Glu Ex o 17a with reference to Mutation Nomenclature in Practice Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme Berwouts S Morris M Girodon G Schwarz M Stuhrmann M and Dequeker E Human Mutation Vol 00 No O 1 7 2011 O Elucigene CF Iberian Panel consegue distinguir entre indiv duos que s o heterozig ticos e homozig ticos para todas as muta es e variantes acima CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 2 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Resumo e explica o A fibrose c stica CF a patologia autoss mica recessiva limitante mais comum entre a popula o caucasiana A incid ncia da doen a de 1 3200 nados vivos nesta etnia 1 Na popula o caucasiana a frequ ncia de heterozig ticos de aproximadamente 1 25 A fibrose c stica afecta o epit lio de diversos rg os resultando numa doen a complexa e multissist mica que envolve o p ncreas ex crino os intestinos o aparelho respirat rio o aparelho genital masculino o sistema hepatobiliar e as gl ndulas sudor paras ex crinas A express o da doen a varia segundo a gravidade das muta es do CFTR 2 dos modificadores gen ticos 3 e dos factores ambientais 4 Esta gravidade varia desde morte no in c
42. produtos Elucigene8 CF Iberian Panel Guia de an lise do GeneMarker Introdu o A sec o que se segue descreve os procedimentos para an lise de amostra dos resultados do Elucigene CF Iberian Panel usando o pacote de software SoftGenetics GeneMarker vers o 1 95 ou mais recente Nota os screenshots deste documento s o tirados do GeneMarker v 2 6 3 Processo de an lise O processo para an lise de amostras foi resumido no diagrama abaixo Executar amostras amplificadas no Genetic Analyzer Abrir o software GeneMarker Adicionar ficheiros FSA de amostras para projecto Seleccionar defini es CF Iberian Panel relevantes e confirmar Executar an lise da amostra Seleccionar a aplica o ARMS an lise comparativa Seleccionar impress o Seleccionar pr visualiza o CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 31 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Adicionar ficheiros de amostras ao GeneMarker Abra o ficheiro de programa GeneMarker e quando solicitado seleccione Open Data A caixa Open Data Files surgir Clique no bot o Add Abre se a caixa de di logo Open Navegue para o direct rio que contiver ficheiros de dados n o tratados 1 Seleccione todos os ficheiros com CTRL A ou use as teclas CTRL e ou SHIFT para seleccionar amostras individuais 2 Clique no bot o Open abrir da caixa de di logo com o mesmo nome Os ficheiros seleccionados surgir o listados no campo Data
43. s vel por quaisquer decis es cl nicas que sejam tomadas 2 A aus ncia de detec o de muta es por este kit n o constitui garantia de que n o estejam presentes outras muta es do gene CFTR E poss vel a exist ncia de outras muta es n o detectadas por este kit 3 As muta es variam de frequ ncia entre popula es diferentes Os dados de frequ ncia das muta es nas popula es est o dispon veis no The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium 6 O utilizador deste kit deve salientar estes aspectos quando reporta os resultados ao m dico que efectua o diagn stico respons vel pelo aconselhamento gen tico Exonera o de responsabilidade Os resultados deste e de outros ensaios de diagn stico devem ser interpretados em conjunto com outros dados laboratoriais e cl nicos de que o m dico disponha Estes reagentes Elucigene s o fornecidos para fins de diagn stico in vitro CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 41 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Bibliografia 1 Rosenstein BJ Cutting GR The diagnosis of cystic fibrosis a consensus statement Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel J Pediatr 1998 132 589 95 2 De Braekeleer M Allard C Leblanc JP Simard F Aubin G Genotype phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation Hum Genet 1997 101 208 11 3 Drumm ML Konstan MW Schluchter MD Handler A Pace R Zou F
44. s Elucigene CF Iberian Panel Tabela 1 Formula o da mistura de reac o N mero de amostras a testar Mistura de iniciadores u 45 45 1125 225 O Toa 12 120 30 600 A 4 Pipete 10 ul de cada mistura de reac o para o fundo de ampolas ou placas para PCR de 0 2 ml devidamente rotuladas 5 Utilizando pontas de pipeta distintas adicione 2 5 ul de amostra de DNA de teste a cada uma das ampolas e coloque a tampa N o adicione DNA ampola para controlo negativo substitua por 2 5 ul de gua desionizada esterilizada 6 Centrifugue um pouco as ampolas at que todo o l quido esteja no fundo de cada ampola 7 Coloque firmemente todas as ampolas no bloco do termociclador Inicie o programa de activa o de 94 C seguido do programa de amplifica o ver passo 1 8 Conclu do o programa de amplifica o as amostras podem ser armazenadas durante a noite temperatura ambiente ou a 2 C 8 C durante 7 dias at an lise por electroforese de capilares CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 11 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Electroforese de capilares Recomenda se que cada utilizador zele para que o dispositivo escolhido seja utilizado de acordo com as instru es do fabricante e que os dispositivos de colheita de amostras sejam compat veis com este teste Neste contexto os par metros principais s o o pol mero e a matriz de capilares Podem
45. smos e muta es do gene CFTR descritos A avalia o de muta es e polimorfismos conhecidos do gene CFTR revelou os seguintes efeitos nos resultados do Elucigene CF Iberian Panel 2184delA O prim rio mutante 2184insA ir detectar a muta o 2184delA As muta es 2184insA e 2184delA podem ser distinguidas com base na diferen a de tamanho do produto de amplifica o de 2 bp A distin o entre estas muta es apresentada nos diagramas A e B em baixo A B 2184delA Mutant Peak a 218454 WT 3 2l84in WT A O produto de amplifica o mutante 2184insA do mesmo tamanho que o produto de amplifica o de estirpe selvagem e apresentado como um pico azul marcado sobrepondo significativamente o pico de estirpe selvagem como mostrado em cima B O produto de amplifica o mutante 2184delA 2 bp mais pequeno do que o produto de amplifica o de estirpe selvagem e apresentado como um pico azul n o marcado o que n o inclu do na gama do bin do painel 2184insa CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 19 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel 2183AA gt G O iniciador de estirpe selvagem 2184insA n o amplificar os alelos que contiverem a muta o 2183AA gt G traduzindo se no desaparecimento do pico 2184insA de estirpe selvagem O exemplo abaixo mostra o pico de estirpe selvagem 2184insA de meia intensidade na presen a de um heterozig tico 2183AA gt G 270 310 350 330 430
46. u o de problemas do instrumento queira consultar o Manual de utiliza o do analisador gen tico 3130 da Applied Biosystems CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 13 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel ANALISADOR GEN TICO ABI3500 Precisa de ser criado um Instrument Protocol que possa ent o ser usado para o CF Iberian Panel e o CF EU2v1 Crie o Instrument Protocol protocolo do instrumento atrav s da biblioteca de protocolos do instrumento 3500 Certifique se de que s o seleccionadas as seguintes caracter sticas e Run Module M dulo de execu o FragmentAnalysis50_POP7 Insira as defini es descritas na imagem abaixo E Edit Instrument Protocol CFEU2 Setup an Instrument Protocol Application Type Fragment v Capillary Length 50 cm Polymer POP7 Dye Set 65 x Instrument Protocol Properties Run Module Fragment nalysis50 POP7 v Protocol Name CFEU2 Description Owen Temperature C 60 Run Voltage kVolts 19 5 PreRun Voltage kVolts 15 Injection Voltage kVolts 3 Run Time sec 1200 PreRun Time sec 180 Injection Time sec 12 Data Delay sec 1 gt Advanced Options Close Para executar as amostras crie uma placa de amostras clicando em Create Plate from Template criar placa a partir de modelo no Dashboard painel e assegure se de que foi atribu do o protocolo do instrumento correcto CFIBNBYPT 001 Jun 20
47. uel 43 2 04 04 43 0 00 4 00 G Blu Blue1 45 2 04 1 2 45 0 0 00 1 00 7 Blue Bluel 47 0 04 0 8 47 0 00 1 00 8 Blu Bluel 49 4 04 06 49 0 00 1 00 9 Blu Bluel 52 1 1 0 1 0 52 0 00 1 00 10 Blue Blue 54 5 04 04 55 0 00 1 00 11 Blu Blue1 56 4 04 04 56 0 00 1 00 12 Blue Blue1 57 9 04 04 58 0 00 1 00 13 Blue Blue 59 9 10 10 60 0 00 1 00 14 Blu Blue1 63 7 10 07 E4 0 00 1 00 3 Navegue para o painel CF Iberian Panel GeneMarker Panel File xml e importe o 4 Repita o processo da forma que for necess ria para outros ficheiros de pain is relevantes CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 34 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Importar as defini es de padr o de tamanho para o GeneMarker do CF Iberian Panel Antes da primeira utiliza o do kit necess rio importar o ficheiro de padr o de tamanho adequado para o GeneMarker Este processo controlado atrav s da interface do Size Template Editor O ficheiro do padr o de tamanho para o GeneMarker do CF Iberian Panel est dispon vel na p gina da Elucigene http www elucigene com product category cystic fibrosis 5 Para o ficheiro do padr o de tamanho abra Size Template Editor a partir do menu pendente Tools 6 Seleccione Size Standard a partir do menu pendente File 7 Navegue para o ficheiro de padr o de tamanho do CF Iberian Panel CF Iberian Panel GeneMarker Size Standard xml e importe o Dados de processam
48. usados durante a recolha de dados Para visualizar as actuais defini es de an lise 1 2 Abra o GeneMapper Manager clicando no cone l Seleccione o separador Analysis Methods O ficheiro importado do CF Iberian Panel ser listado como CF Iberian Panel Analysis Method Clique no CF Iberian Panel Analysis Method A fila abrir se real ada Clique no bot o Open pra abrir e seleccione o Peak Detector Figura 10 Figura 10 Gamas de an lise Analysis Method Editor SNaP Shot Peak Detection Algorithm Advanced Ranges Peak Detection Analysis Sizing Peak Amplitude Thresholds Partial Range All Sizes B 00 R 30 Start Pt 1500 Start Size 0 Stop Ft 39000 Stop Size 000 G 150 P 0 Y 100 O 5 Smoothing and Baselining Smoothing E None i O Light Polynomial Degree Heavy Feak Window Size Slope Threshold Peak Start Min Peak Half Width Baseline Window 51 pts Size Calling Method O 3nd Order Least Squares 7 3rd Order Least Squares Size Standard Normalization Cubic Spline Interpolation 19 Local Southern Method Global Southern Method Note For 35XX series data collection normalization only Peak End Enable Normalization Factory Defaults CFIBNBYPT 001 Jun 2015 P g 29 of 42 Instru es de utiliza o de produtos Elucigene CF Iberian Panel Para encontrar a gama de an lise certa para o seu laborat rio 1 A partir da janela principal do
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