FACTOR V G1691A (leiden) Box 1.0
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1. Desnatura o 96 C 25 seg 21 Emparelhamento 65 C 45 seg Extens o 72 C 30 seg Extens o 72 C 10 min 1 7 No final da PCR guarde a placa a 2 8 C 8 Detecte os produtos do PCR com uma electroforese em gel de agarose a 2 7 20 Protocolo de electroforese em gel de agarose Prepara o do gel de agarose a 2 1 Dissolver 4 gramas de p agarose em 200 ml de tamp o TAE 1X 2 Dissolver completamente a agarose aquecendo a no microondas Arrefe a o gel at aproximadamente 50 C 4 Adicione pelo menos 20 pl de brometo de etidio 10 mg ml ou 2 pl de Sybr Safe 10000x concentrado agarose Agite at estar completamente incorporado Numa superf cie nivelada monte a placa do gel com 96 po os Verta uma camada de gel com cerca de 5mm Deixe o gel arrefecer Aten o este reagente um forte agente mutag nico leia atentamente a MSDS do produto Electroforese Submirja o gel na tina de electroforese com tamp o TAE 1X Remova os pentes com cuidado do gel Adicione 10 pl do produto de PCR em cada po o Pow Ne Ligue a tina de electroforese a corrente com uma voltagem m dia 115V 5 Deixe a electroforese correr por cerca de 20 minutos ou at o corante estar a 2 3 da linha Ponha o gel no transiluminador Fotografe o gel e identifique o Use a Tabela de interpreta o de resultados para interpretar os resultados 8 20 Tabela de interpretacao de resultados Esquema d2. 4090 mg kg ratinho LD50 oral 12600 mg kg rato LD50 oral 1480 mg kg humano 5 Estabilidade e reactividade Condi es a evitar Calor e humidade Incompatibilidades Bases e agentes oxidantes fortes 16 20 Folha de Dados de Seguran a 2 3 Material Safety Data Sheet MSDS 6 Protec o pessoal Protec o das m os use luvas apropriadas resistentes a qu micos Protec o dos olhos recomenda se o uso de culos de protec o qu mica 7 Manipula o e armazenamento Manipula o evite o contacto directo com a subst ncia Armazenamento armazene temperatura aconselhada proteja do contacto com a luz Danifica o da embalagem protectora rejeitar o constituinte contido na embalagem 8 Perigos Os componentes da mistura de reac o podem ser perigosos se inalados ingeridos ou absorvidos pela pele Este material pode causar irrita o da pele dos olhos e do tracto respirat rio A ingest o de grandes quantidades desta mistura pode causar dores de est mago v mitos ou diarreia 9 Medidas de Primeiros Socorros No caso de contacto com os olhos deve lavar imediatamente os olhos com gua abundante por cerca de 15 minutos Deve consultar o seu m dico No caso de contacto com a pele deve lavar imediatamente a zona afectada com gua corrente e sab o Lave a roupa contaminada antes da sua utiliza o No caso de ingest o lave a boca com gua abundante Deve contactar o seu m dico se necess ri
3. concentra es finais s o 3 3x NH4 2 0 mM MgCl e 0 4 u pl Amplitaq DNA polimerase pH 8 3 Glicerol concentra o final 16 6 Vermelho de cresol concentra o final de 300ug m l 5 20 Protocolo de amplifica o por PCR Reagentes e Amostra de DNA 100 200 ng ul e PCR Master Mix e gua bi destilada est ril n o fornecida Extrac o de DNA Para a tipagem por SSP necess rio DNA extra puro Recomenda se que o isolamento de DNA seja efectuado utilizando kits de extrac o com marca o CE que garantam um r cio DO 260 280 maior do que 1 6 e uma concentra o entre 100ng 200 ng pl Alternativamente o DNA pode ser extra do utilizando sais de Brometo de Trimetilamonia DTAB CTAB ou por salting out dissolvendo o em Tamp o TE Devem ser asseguradas o mesmo n vel de DO e de concentra o Amplifica o por PCR 1 Agite brevemente os tubos de DNA e da mistura de reac o 2 Junte e 7 pl da PCR Master Mix e 15 pl de agua bi destilada est ril e e 2 pl da amostra de DNA conc 100 200 ng ul num tubo de 0 7 ml ou 1 5 ml Agite vigorosamente durante 15 segundos Pipete 10 ul da mistura para cada po o da tira de tipagem 2 pares de primers 5 Repita os passos anteriores para cada uma das amostras DNA num total de 4 amostras por tira 6 Sele a tira de tipagem com a c psula e coloque num aparelho PCR de 96 po os 6 20 Parametros do programa PCR Desnatura o 96 C 1 min 1
4. 189 96 5 Mueller T Marschon R Dieplinger B Haidinger D Gegenhuber A Poelz W Webersinke G Haltmayer M factor V Leiden prothrombin G20210A and methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutatios are not associates With chronic limb ischemia the Linz peripheral arterial disease LIPAD study J Vasc Surg 2005 41 5 808 15 DESENVOLVIMENTO E PRODU O DE TESTES DIAGN STICOS instituto pedro nunes quinta da nora 3030 199 coimbra Portugal tel fax 351 239 700 930 e mail info genebox com 19 20 20 20
5. C digo do Produto 0107 FACTOR V G1691A leiden Box 1 0 Typing Kit Dispositivo para utiliza o in vitro Manual de Instru es DESENVOLVIMENTO E PRODU O 6 DE TESTES DIAGNOSTICOS e Ue geneBox 000 Vers o1 0 Junho de 2007 DESENVOLVIMENTO E PRODU O J 2 DE TESTES DIAGN STICOS instituto pedro nunes quinta da nora 3030 199 coimbra Portugal tel fax 351 239 700 930 e mail info genebox com 2 20 Apresenta o erui nen nai iS 4 Altera es e melhoramento do Produto t 4 Controlo da Qualidade is eereeeeeseeseereeerenesa 4 Componentes do FACTOR V Box 1 0 Typing Kit 5 Protocolo de amplifica o por PCR 6 Reagentes iesaiis exsccabebesecedesands desis ed erae 6 Extrac o de DNA ia 6 Amplifica o por PCR 6 Par metros do programa de PCR 7 Protocolo de electroforese em gel de agarose 8 Prepara o do gel a 2 8 Electroforese causas serias issuesriaaia sans ossada cuentas a cold 8 Esquema da tira FACTOR V Box 1 0 9 Identifica o da tira FACTOR V Box 1 0 9 Tabela de interpreta o dos Resultados 10 Guia de resolu o de problemas 11 GUIA TECNICO x sas el ssa il Alan a oral er e 12 Garantia 22 debs sel denceibs sto pensei a dia Gis DA den ud GA a Pla ida 13 Aviso de Garantiia ccceceessessscssesesssecer
6. a tira FACTOR V Box 1 0 FACTOR V FACTOR V 1691 A 228 790 Sim lolo m I D Direc o de pipetagem EO CEEE Qs pares de primers controlo emparelham com sequ ncias n o polim rficas Os primers de controlo positivo interno amplificam segmentos do gene PIC1 originando fragmentos com 790 pares de bases Na presen a da banda espec fica a banda controlo pode ver diminu da a sua intensidade A reac o de PCR s valida na presen a da banda controlo ou nalguns casos na presen a da banda espec fica Na aus ncia da banda controlo por favor repita a tipagem NOTA Se o PCR tiver bandas com tamanhos diferentes dos previstos n o as considere pois pode tratar se de bandas n o espec ficas ou artefactos Identifica o da tira FACTOR V Box 1 0 Posi o Gene Local polim rfico A C E G FACTOR V 1691 B D F H FACTOR V 1691 9 20 10 20 Guia de resolucao de problemas PROBLEMAS 1 As bandas controlo e especificas fracas 2 Os controlos internos falharam em diversos po os 3 Falsos negativos de uma banda espec fica com o controlo interno normal 4 Detec o de mais de dois alelos espec ficos 5 Resultados amb guos 6 Esfrega o de bandas Poss veis Causas a Concentra o do DNA baixa b Degrada o do DNA c Presen a de inibidores da Taq polimerase nas amostras de DNA d Excesso de DNA e Con
7. ara as leis nacionais dos estados membros da Uni o Europeia A ficha e os documentos t cnicos deste produto s o mantidos na geneBOX Instituto Pedro Nunes Quinta da Nora 3030 199 Coimbra Portugal Paulo Santos Director T cnico 15 20 Folha de Dados de Seguran a 1 3 Material Safety Data Sheet MSDS geneBOX R amp D Diagnostic Tests PCR SSP Kits Produtos de tipagem SSP da geneBOX Esta folha de dados de seguranca aplicavel a todos os produtos de tipagem por PCR SSP da geneBOX 1 Produtos Qu micos e Identifica o da Companhia Data de realiza o Junho de 2007 Grupo do produto Produtos de tipagem SSP da geneBOX Manufactura o geneBOX R amp D Diagnostic Tests Instituto Pedro Nunes Quinta da Nora 3030 199 Coimbra Portugal tel fax 351 239 700 930 e mail info genebox com 2 Composi o e Informa o sobre os reagentes Componente Qu mico Nome vulgar N de lote Placa Acido Desoxiribonucleico Oligonucledtido E0505F1149 Vermelho de Cresol 121613 1604 Mistura de reac o Desoxiribonucle tidos Nucle tidos 300495 Tamp o NH NH 204 Cloreto de Magn sio MgCl2 MG 204 Vermelho de Cresol 121613 1604 Glicerol 16715 1 Taq DNA Polimerase Taq Taq 105 3 Propriedades fisico quimicas Componente Aspecto Cor Odor Placa seco no fundo do poco vermelho nenhum Mistura de reac o l quido vermelho rosa nenhum 4 Informa o Toxicol gica Qu mico Toxicidade Glicerol LD50 oral
8. ata de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 meses a partir da data de produ o temperatura ambiente os primers desidratados permanecem est veis durante 3 a 4 semanas a partir da data de recep o Quando o selante removido os primers desidratados permanecem est veis durante 2 dias no m ximo desde que n o humede am 2 Mistura de Reac o Armazenamento a 20 C a mistura de reac o permanece est vel durante 18 meses a partir da data de produ o ver validade do lote na embalagem Armazenamento a 4 C a mistura de reac o permanece est vel durante 15 dias a partir da data de recep o A temperatura ambiente a mistura de reac o permanece est vel durante 3 dias a partir da data de recep o A mistura de reac o nunca deve ser deixada ou armazenada com a tampa aberta 3 DNA O DNA extra do por salting out ou por qualquer outro m todo deve ser armazenado a 4 C ou 20 C Ao optar pela congela o das amostras devem ser evitadas ciclos repetidos de congela o descongela o de modo a impedir a degrada o da amostra As amostras de DNA armazenadas em dH O permanecem est veis durante pelo menos 4 semanas a 4 C ou 2 anos a 20 C As amostras de DNA armazenadas em tamp o TE permanecem est veis durante pelo menos 2 anos a 4 C ou 5 anos a 20 C 13 20 Aviso de garantia geneBOX inve
9. o No caso de inala o n o aplic vel 10 Medidas a tomar em caso de inc ndio Meios de extin o Agua di xido de carbono p qu mico seco ou espuma apropriada Meios de extin o n o aconselhados n o existem restri es conhecidas Perigos espec ficos de exposi o em caso de inc ndio podem emitir fumos t xicos de di xido e mon xido de carbono nitrog nio f sforo cloreto de hidrog nio e g s hidrog nio Equipamento especial de combate ao inc ndio quando s o libertadas grandes quantidades de subst ncia trabalhe apenas com protec o adequada para olhos e pele 11 Medidas a tomar no caso de derrame acidental Precau es pessoais evite o contacto directo com a subst ncia Limpeza limpe normalmente a rea afectada n o s o necess rios cuidados adicionais Protec o da pele use uma bata de laborat rio 17 20 Folha de Dados de Seguran a 3 3 Material Safety Data Sheet MSDS 12 Informa o ecol gica N o existem dados dispon veis 13 Informa o sobre a elimina o Elimine o material de acordo com toda a regulamenta o aplic vel Grupo IV res duos hospitalares espec ficos 14 Informa o sobre o transporte No transporte dos Kits devem estar a seguradas as temperaturas n o devendo ultrapassar os 15 C A dura o do transporte n o deve ser superior a 3 dias de modo a garantir que todos os componentes do Kit cheguem em perfeitas condi es aos seus destinat rio
10. s 15 Contactos teis N mero Nacional de Emerg ncia 112 Centro de Informa o Anti Venenos 808 250 143 16 Outras informa es As informa es a cima dispon veis s o baseados no n vel de conhecimento actual devendo ser utilizado apenas como guia A geneBOX R amp D Diagnostic Tests n o se responsabiliza por qualquer dano causado pela manipula o inapropriada ou pelo contacto com os referidos produtos Para mais esclarecimentos por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 239 700 930 18 20 Refer ncias 1 Reid S Halliday J Ditchfield M Ekert H Byron K Glynn A Petrou V Reddihough D Factor V Leiden a contributory factor for cerebral palsy Dev Med Child Neurol 2006 48 1 14 9 2 Wakim Ghorayeb SF Keleshian SH Timson G Finan RR Najm P Irani Hakime N Almawi WY Factor V G1691A single nucleotide polymorphisms in type 2 diabetes mellitus Am J hemato 2005 80 1 84 6 3 Almawi WY Keleshian SH Borgi L Fawaz NA Abboud N Mtiraoui N Mahjoub T Varied prevalence of factor V G1691A leiden and prothrombin G20210A single nucleotide polymorphisms among Arabs J thromb thrombolysis 2005 20 3 163 8 4 Almawi WY Tamim H Kreidy R Timson G Rahal E Nabulsi M Finan RR Irani Hakime N A case control study on the contribution of factor V Leiden prothombin G20210A and MTHFR C677T mutations to the genetic susceptibility of deep venous thombosis J 7homb thrombolysis 2005 19 3
11. sesesseessesseesrsseessnserens 14 Declara o de Conformidade CE 15 Folha de dados de seguran a 16 Refer ncias einega a e antes ASI aa 19 3 20 Apresenta o Este kit cont m tiras com misturas de primers desidratadas e PCR Master Mix para efectuar a tipagem gen tica do polimorfismo 1691 do gene do FACTOR V de leiden Altera es e melhoramento do Produto Este produto pode ser melhorado de modo a aumentar o seu rendimento As altera es adi es ou modifica es de primers em rela o ao lote anterior est o detalhadas na tabela abaixo Tubo primers motivo N A Controlo de Qualidade Devido inexist ncia de linhas celulares controlo n o foram feitos testes normais de controlo da qualidade Contudo a Genebox testou as misturas de primers com v rios DNAs padr o obtendo amostras positivas e negativas para cada uma das muta es A Genebox garante a qualidade e a fiabilidade do seu kit FACTOR V Box 4 20 Componentes do FACTOR V Box 1 0 Typing e Tiras de tipagem de FACTOR V 48 tipagens 12 tiras 48 amostras conservar de 15 a 30 C e PCR Master Mix com Taq DNA Polimerase 1 X 340 ul conservar de 15 a 30 C e Selantes das tiras 12 capsulas selantes e Manual de instru es 1 Manual de Instru es com pares de primers espec ficos desidratados Componentes da PCR Master Mix Nucle tidos concentra o final de cada dNTP 600 uM Tamp o da PCR
12. stiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos responsabiliza se perante os seus clientes pelos defeitos no material e componentes dos seus produtos aplicados em condi es normais Os produtos da empresa que apresentam esta garantia devem ser substitu dos sem encargos para o cliente Esta garantia aplica se s para produtos que sejam manipulados e armazenados de acordo com as especifica es e recomenda es de utiliza o As reclama es devem ser enviadas por escrito directamente para a geneBOX e devem ser acompanhadas por uma c pia da guia de transporte ou factura do produto Este produto n o pode ser reformulado reembalado ou revendido em nenhuma forma sem o expresso consentimento da geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos 14 20 Declara o de Conformidade Nome do Produto FACTOR V Box Numero do Produto GB 01 07 Utiliza o Tipagem gen tica do gene FACTOR V Produ o geneBOX R amp D Diagnostic Tests Instituto Pedro Nunes Quinta da Nora 3030 199 Coimbra Portugal N s geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos indubitavelmente declaramos que este produto ao qual se relaciona esta declara o de conformidade est em conformidade com os seguintes documentos normativos ISO 9001 2000 e ISO 13485 2004 Seguindo ainda as indica es da Directiva Europeia 98 79 CE anexo III sobre dispositivos m dicos de diagn stico in vitro transposto p
13. tamina o com outros produtos de PCR ou outras amostras de DNA durante a prepara o do PCR f O tamp o pode aquecer demasiado devido a elevadas voltagens g Tamp o com composi o errada h Tamp o velho SUGESTOES Verifique a qualidade e concentra o do DNA Re purifique o DNA e dilua o em gua desionisada destilada Ajuste a concentra o do DNA para a desejada Repita a tipagem com o DNA com maior qualidade Separe a sala de pr PCR da de p s PCR Vista uma bata diferente para cada sala Lave bem a zona de trabalho Mude v rias vezes de luvas especialmente na transi o de p s PCR para pr PCR 9 Use o tamp o recomendado Sor Om um SU Ne Guia T cnico 1 Pureza e Concentra o do DNA Para obter bons resultados com o FACTOR V Box 1 0 Typing Kit a pureza da amostra de DNA cr tica Ter uma amostra pura significa obter uma raz o 260nm 280nm de DO superior a 1 6 e uma por o de DNA superior a 9 4 kb A elevada degrada o do DNA ou uma raz o 260nm 280nm inferior a 1 5 requer uma nova extrac o de DNA Cada amostra de DNA deve ter aproximadamente 100 a 200 ng ul Concentra es elevadas de DNA provocam um decl nio consider vel na especificidade da PCR Recomenda se o uso de qualquer kit de extrac o de DNA que apresente marca o CE de modo a obter um DNA extra puro 2 Taq Polimerase O FACTOR V Box 1 0 Typing Kit foi intensivamente testado utilizando a Taq da Reagente 5 Reagen
14. te 5 Lisboa Portugal 3 Mistura de reaccao Para uma boa performance da tipagem com o FACTOR V Box 1 0 Typing kit obrigat ria a utiliza o da PCR Master Mix fornecida com o Kit 4 Procedimentos de amplifica o No fim da PCR examine o grau de evapora o e de condensa o da mistura de reac o da PCR Se as perdas de volume forem superiores a 20 devem adicionar leo mineral mistura de reac o para que n o se verifiquem perdas por evapora o Tamb m se deve ter em aten o a temperatura de aquecimento do aparelho Se a temperatura de aquecimento n o for suficiente v o se verificar problemas de condensa o 5 Termociclador Recomenda se utiliza o de qualquer Termociclador que apresente as seguintes caracter sticas heating rate superior a 2 5 C sec cooling rate superior a 1 5 C sec gama de temperatures 4 100 C uniformidade de temperaturas 0 5 C heated lid superior a 100 C 6 Validade Como especificado na embalagem Se os problemas persistirem por favor contactem com o apoio t cnico para o 351 239 700 930 geneBOX investiga o e desenvolvimento de teste diagn sticos garante que os primers presentes no kit de tipagem FACTOR V Box apresentam as especificidades dadas nas folhas e tabelas de interpreta o de resultados do produto 1 Placa de Tipagem Armazenamento a 20 C os primers desidratados permanecem est veis durante 12 a 19 meses a partir da d
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