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Ensaio PROGENSA PCA3

1. 2 Relat rio de r cio O software de ensaio gera automaticamente um Relat rio de r cio para um teste consecutivo em que ambos os processamentos de analito s o v lidos O software calcula e indica o PCAS3 Score dos espec menes no Relat rio de r cio Os espec menes indicados no Relat rio de r cio n o necessitam de qualquer outro teste ou ambos os analitos t m de ser novamente testados Os espec menes n o indicados no Relat rio de r cio ser o encontrados na sec o de Resumo de excep es do Relat rio de teste em bruto Pode tamb m ser gerado um Relat rio de r cio ap s uma correspond ncia manual consulte Correspond ncia manual para obter mais informa es 3 Relat rio de CQ O relat rio de CQ indica crit rios de validade do processamento do ensaio concentra es atribu das e interpoladas e recupera es de calibradores e controlos O relat rio indica tamb m os par metros que definem a curva de calibragem de resposta de dose log stica de quatro par metros 3 Para mais informa es consulte o Manual do operador do software do ensaio PROGENSA PCAS B Correspond ncia 1 Correspond ncia autom tica Nos processamentos consecutivos em que ambos os testes de analito s o v lidos o software faz a correspond ncia autom tica dos resultados individuais do analito PCA3 e PSA para os espec menes e determina o PCA3 Score se for poss vel de calcular Os resultados s o indicados no relat rio de r ci
2. A Consulte Tabela 1 para obter informa es sobre o armazenamento de reagentes Tabela 1 Armazenamento dos reagentes Aberto Reconstitu do Reagente Fluido Armazenamento n o aberto Estabilidade at data de validade Reagentes de amplifica o 2 C a8 C at data de validade 30 dias de 2 Ca 8 C Reagentes de sonda 2 C a8 C at data de validade 30 dias de 2 C a 8 C Reagente enzim tico 2 C a8 C at data de validade 30 dias de 2 C a 8 C Reagentes de captura do alvo 15 C a 30 C at data de validade 30 dias de 15 Ca 30 C a E de ta aso at data de validade N A utiliza o nica S de reconstitui o de 46 4 30 C at data de validade N A utiliza o nica PRSA a recononiNgag 2 C a 30 C at data de validade N A utiliza o nica Reagente de selec o 2 C a30 C at data de validade 30 dias de 15 Ca 30 C Calibradores 2 C a8 at data de validade N A utiliza o nica Controlos 2 C a8 at data de validade N A utiliza o nica Reagente de leo 15 Ca 30 C at data de validade 30 dias de 15 Ca 30 C Solu o de lavagem 15 C a 30 C at data de validade 30 dias de 15 Ca 30 C Tamp o para o fluido de desactiva o 15 C a 30 C at data de validade 28 dias de 15 Ca 30 C Podem ser usados novamente para outros processamentos de ensaio at 4 vezes desde que a quantidade total de tempo temperat
3. cen PROGENSA A GEN PROBE sono Ensaio PROGENSA PCA3 Para utiliza o em diagn stico in vitro Exclusivamente para exporta o dos EUA Informa es gerais ciiciiiiissiscissiscirasraa 2 Utiliza o pretendid iere sietosinoctasie ant deg i tip css caras 2 Resumo e explica o do teste n annann 2 Princ pios do procedimento a n s saaana aaaea 2 Reagentes e materiais fornecidos sssannnnnnnnnnnnnn 4 Materiais umas sas sema sra am dama a LD aaa Sa a Eca 8 Advert ncias e precau es cicciissisicssooo 10 Requisitos de armazenamento e manuseamento dos reagentes 13 Colheita transporte e armazenamento de espec menes 15 Procedimento de teste iciiiscls lc 17 Notas sobre o procedimento ccccciiisciiis 23 Procedimentos de controlo de qualidade 27 Interpreta o dos resultados cccciiiicco 28 Limita es saias ssssismsassss ram da a a sa E 33 Caracter sticas do desempenho cc o 34 Bibliografia ssa spasisgs seg essa Desa a Ds qu ssa E 40 1 501377PT Rev D Informa es gerais Informa es gerais Utiliza o pretendida O ensaio PROGENSA PCA3 um teste de amplifica o de cido nucleico NAAT in vitro que detecta o cido ribonucleico RNA do Gene 3 do Cancro da Pr stata PCAS em espec menes de urina de indiv duos do sexo masculino para gerar um PCA3
4. o de hipoclorito de s dio de 5 a 7 0 7 M a 1 0 M e de tamp o para fluido de desactiva o num recipiente de pl stico com tampa grande Coloque uma etiqueta e escreva a data de validade no recipiente de pl stico O Fluido de Desactiva o permanece est vel durante 4 semanas temperatura ambiente Quando o processamento terminar o software de ensaio gerar dois relat rios de processamento um Relat rio de teste em bruto e um Relat rio de r cio se os processamentos consecutivos consulte Procedimentos de controlo de qualidade e Interpreta o dos resultados Quando o teste terminar retire as TTU usadas do lumin metro e coloque as TTU no recipiente com a solu o de fluido de desactiva o Deixe as TTU no recipiente durante 15 minutos antes de as deitar fora Os m todos de manuseamento e elimina o adequados devem ser estabelecidos pelo director do laborat rio Notas sobre o procedimento A Prepara o de Esp cimen 1 Se os espec menes contiverem precipitados suspensos aque a os a 37 C durante at 5 minutos seguido de invers o suave No caso de o precipitado n o voltar a transformar se em solu o certifique se de que o precipitado n o impede a distribui o do esp cimen Espec menes congelados devem ser descongelados temperatura ambiente 15 C a 30 C pode usar um banho de gua com invers o ocasional durante a descongela o para impedir a forma o de um tamp o insol vel Mist
5. 6 Nas concentra es indicadas n o foi observada qualquer interfer ncia no ensaio Tabela 8 Subst ncias testadas relativamente interfer ncia do ensaio PROGENSA PCA3 Agentes terap uticos continua o Concentra o de Agentes terap uticos Concentra o de Subst ncia Subst ncia teste teste Acetaminofeno Coda na 5 34 umol l Uroxatral 30 mg l Atorvastatina 25 mg l Doxazosina 1 33 umol Lisinopril 0 74 umol l Terazosina 7 8 umol Amilodipina 245 umol Finasterida 15 mg l Atenolol 37 6 umol Tamsulosina 1 2 ug l Sulfasalazina 754 umol Metformina 310 umol Esomeprazol 120 mg l Sildenafil 12 9 pmol Alopurinol 294 umol Saw palmetto 1600 mg l Difenidramina 19 6 umol Sel nio 0 275 mg l Acetaminofeno 1324 umol cido acetilsalic lico 3 62 mmol l Constituintes da urina Ibuprofeno 2425 pmol l Subst ncia poncenta o de teste Furosemida 181 umol cido rico 1 4 mmol l Ciprofloxacina 30 2 umol Hemoglobina 29 Levaquin 48 6 umol l Gl bulos brancos 4 56 x 10 c lulas Doxiciclina 67 5 umol Gl bulos vermelhos 3 06 x 10 c lulas l Hidrocloreto de fluoxetina 11 2 umol Albumina 50 g l Flutamida 1500 mg l Bilirrubina n o conjugada 342 g l Dutasterida 1 5 mg l IgG 60 g l 3 Exactid o A exactid o do ensaio PROGENSA PCAS3 foi avaliada de acordo com o documento EP15 A2 do Instituto CLSI 2005 7 Os transcritos de RNA do PCA3 e PSA foram quantificad
6. Ensaio PROGENSA PCA3 25 501377PT Rev D Procedimento de teste 5 Suportes Mergulhe os suportes em solu o de hipoclorito de s dio de 2 5 a 3 5 0 35 M a 0 5 M garantindo que ficam cobertos pela solu o Mantenha os suportes mergulhados durante 10 minutos Uma exposi o mais prolongada danifica os suportes Lave bem os suportes com gua e seque bem com toalhetes de papel Contamina o do ensaio 1 A introdu o de materiais contaminantes pode ocorrer se n o for tido o cuidado suficiente durante o procedimento de ensaio 2 As TTU t m de ser descontaminadas no fluido de desactiva o conforme descrito em Procedimento de teste N o volte a utilizar as TTU 3 Realize uma descontamina o regular do equipamento e das superf cies de trabalho conforme descrito em Descontamina o 4 Como em qualquer sistema de reagentes o excesso de p nalgumas luvas pode causar a contamina o de tubos abertos Recomenda se que os operadores utilizem luvas sem p Ensaio PROGENSA PCA3 26 501377PT Rev D Procedimentos de controlo de qualidade A Validade do teste 1 Os calibradores e os controlos devem ser processados com todos os ensaios e no mesmo suporte que os espec menes de teste Devem ser cumpridos os seguintes crit rios para que um teste seja considerado v lido RLU m dia do Calibrador 2 gt Cutoff RLU Em que o cutoff das RLU RLU m dia do calibrador 1 1 645 desvios padr o de replicados RL
7. N Cat Kit de transporte de esp cimen de urina PROGENSA PCA3 302352 Lumin metro LEADER HC 104747 Sistema de Captura de Alvo Target Capture System TCS 104555 GEN PROBE Kit APTIMA Auto Detect 301048 2 pipetadores eppendorf Repeater Plus 105725 Pontas de pipetador de repeti o 2 5 ml 5 0 ml 25 0 ml Um dos seguintes materiais 2 Misturadores v rtex multitubos 102160F 3 Banhos de gua circulantes 104586F 62 C 1 T 42 C 1 62 C 1 3 Espa adores de banho de gua 104627 OU 2 SB100 Banho de calor seco misturadores v rtex 105524F Poder o ser necess rios mais instrumentos SB100 dependendo do rendimento exigido Micropipetador 1000 ul RAININ PR1000 901715 Pontas 1000 ul P1000 105049 Pipetador eppendorf 20 a 200 ul 105726 Pontas Pipeta 20 a 200 ul Lix via 5 a 7 solu o de hipoclorito de s dio 0 7 M a 1 0 M Recipiente de pl stico com tampa grande no Recipientes padr o de colheita de urina sem conservantes Unidades de Dez Tubos TTU TU0022 Cassetes de Dez Pontas TTC 104578 Padr o de calibra o SysCheck 301078 Materiais opcionais N Cat Kit de 100 reac es PROGENSA PCA3 302354 Kit de 100 reac es PROGENSA PSA 302357 Kit de calibradores e controlos PROGENSA PCA3 302353 Kit de calibradores e controlos PROGENSA PSA 302356 Pain is de profici ncia PROGENSA PCA3 PSA 302350 Ensaio PROGENSA PCA3 8 501377PT Rev D N Cat Kit de diluente de espec menes PROGENSA PCA3
8. Os prazos de validade indicados nos kits de colheita referem se ao local da colheita e n o s instala es de testes As amostras colhidas em qualquer momento antes da data de validade constante do kit de colheita e transportadas e armazenadas de acordo com o folheto da embalagem s o v lidas para realiza o do teste mesmo que a data de validade do tubo de colheita tenha expirado Ensaio PROGENSA PCA3 10 501377PT Rev D Advert ncias e precau es L Armazene todos os espec menes s temperaturas indicadas O desempenho do ensaio pode ser afectado pela utiliza o de espec menes conservados de forma incorrecta Consulte Colheita transporte e armazenamento de espec menes para obter instru es espec ficas M Os espec menes de urina podem ser infecciosos Empregue Precau es Universais ao executar este ensaio Os m todos de manuseamento e elimina o adequados devem ser estabelecidos pelo director do laborat rio Este procedimento deve ser realizado apenas por pessoal adequadamente qualificado como especialista na utiliza o do ensaio PROGENSA PCA3 e com forma o adequada no manuseamento de materiais infecciosos N Evite a contamina o cruzada durante os passos de manuseamento dos espec menes Os espec menes de urina podem conter n veis altos de RNA alvo Certifique se de que os recipientes de espec menes n o entram em contacto uns com os outros e deite fora os materiais usados sem pass los por cima de reci
9. M Karthaus J A Schalken F M J Debruyne N Ru and W B Isaacs 1999 DD3 A New Prostate Specific Gene Highly Overexpressed in Prostate Cancer Cancer Res 59 5975 5979 2 Hessels D J Mt Klein Gunnewiek van Oort H F M Karthaus G J L van Leenders B van Balken L A Kiemeney J A Witjes and J A Schalken 2003 DD3 S Urology 44 8 16 3 Groskopf J S M Aubin I L Deras A Blase S Bodrug C Clark S Brentano J Mathis J Pham T Meyer M Cass P Hodge M L Macairan L S Marks and H Rittenhouse 2006 APTIMA PCA3 Molecular Urine Test Development of a Method to Aid in the Diagnosis of Prostate Cancer Clin Chem 52 1089 95 4 CLSI 1995 CLSI document GP10 A Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic ROC Plots CLSI Wayne PA 5 CLSI 2004 CLSI document EP17 A Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation CLSI Wayne PA 6 CLSI 2005 CLSI document EP7 A2 Interference Testing in Clinical Chemistry CLSI Wayne PA CLSI 2005 CLSI document EP15 A2 User Verification of Performance for Precision and Trueness CLSI Wayne PA 8 CLSI 2003 CLSI document EP6 A Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures A Statistical Approach CLSI Wayne PA 9 CLSI 2004 CLSI document EP5 A2 Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods CLSI Wayne PA based Mo
10. Solu o de reconstitui o de sonda PCA3 PSA 1x12 4 ml Solu o tamponada de succinato com lt 5 de lauril sulfato de l tio S Reagente de selec o PCA3 PSA 1x31 ml Solu o tamponada de borato com surfactante 1 Triton X 100 TCR Reagente de captura de alvo PCA3 1x22 ml cido nucleico n o infeccioso em solu o tamponada HEPES com fase s lida Cart es de selagem 1 embalagem Colarinhos de Reconstitui o 1 embalagem Ensaio PROGENSA PCA3 4 501377PT Rev D Reagentes e materiais fornecidos Kits de calibradores e controlos PROGENSA PCA3 Armazenar entre 2 C e 8 C ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade CAL Calibrador 1 PCA3 1x2 0ml Solu o tamponada de fosfato com lt 5 de lauril sulfato de l tio CAL Calibradores 2 5 PCA3 4x1 7 ml cido nucleico PCA3 n o infeccioso em solu o tamponada de fosfato com lt 5 de lauril sulfato de l tio PC Controlos positivos PCA3 2x1 7 ml cido nucleico PCA3 n o infeccioso em solu o tamponada de fosfato com lt 5 de lauril sulfato de l tio Folha informativa da concentra o de PCA3 1 folha Kit de 100 reac es PROGENSA PSA Caixa refrigerada PROGENSA PSA Armazenar entre 2 C e 8 C ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade A Reagente de amplifica o PSA 1 frasco cidos nucleicos n o infecciosos liofilizados
11. bicos Para este ensaio necess rio utilizar no m nimo dois pipetadores de repeti o um para utiliza o nos passos pr amplifica o e outro para utiliza o nos passos p s amplifica o Deve ser dedicado um micropipetador para utiliza o em transfer ncia do esp cimen excepto se for usado um instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 Todos os pipetadores t m de ser limpos regularmente conforme descrito nas Notas sobre o procedimento T Quando utilizar pipetadores de repeti o para adi o de reagentes n o toque no tubo de reac o com a ponta do pipetador para evitar a contamina o cruzada de um tubo para outro Ensaio PROGENSA PCA3 11 501377PT Rev D Advert ncias e precau es U necess ria uma mistura adequada para alcan ar resultados de ensaio precisos Para informa es mais completas consulte Notas sobre o procedimento V Devem ser dedicados banhos de gua separados para os passos de pr amplifica o amplifica o e p s amplifica o do ensaio W Alguns reagentes deste kit est o etiquetados com s mbolos de risco e seguran a de acordo com a Directiva Europeia 1999 45 CE e devem ser manuseados em conformidade As Fichas de Dados de Seguran a de Materiais podem ser consultadas em www gen probe com e est o dispon veis a pedido Ensaio PROGENSA PCA3 12 501377PT Rev D Requisitos de armazenamento e manuseamento dos reagentes Requisitos de armazenamento e manuseamento dos reagentes
12. com gua N o deixe secar a solu o de hipoclorito de s dio As solu es com cloro podem provocar corros o nos equipamentos e metais Enxag e bem o equipamento com gua para evitar a corros o Ensaio PROGENSA PCA3 24 501377PT Rev D Procedimento de teste 2 Distribuidor de Aspira o TCS Ap s cada utiliza o a b Remova a tubagem distribuidora do caminho Coloque um TTC novo no suporte de TTC Active a bomba de v cuo Aplique o distribuidor de aspira o s pontas no TTC Aspire qualquer solu o de lavagem remanescente na cuba de prepara o da esta o de distribui o Coloque pelo menos 100 ml de solu o de hipoclorito de s dio a 0 5 at 0 7 0 07 M a 0 1 M ou se preferir 2 5 a 3 5 0 35 M a 0 5 M na cuba de prepara o Aspire toda a solu o com a tubagem distribuidora de aspira o Coloque pelo menos 100 ml de gua desionizada na cuba de prepara o Aspire toda a gua com a tubagem distribuidora de aspira o Ejecte as pontas no TTC original Deixe a bomba de v cuo ligada at que a tubagem distribuidora esteja seca para evitar o refluxo aproximadamente 3 minutos Descontamine as superf cies do distribuidor de aspira o como descrito na Unidade TCS 3 Recipiente de res duos TCS Limpe o frasco de res duos pelo menos uma vez por semana ou quando o frasco de res duos estiver 25 cheio conforme o que ocorrer primeiro a b Desligue a bomba de v cuo e per
13. e fa a a incuba o do suporte num banho de gua a 62 C 1 C durante 10 1 minutos c Retire o suporte do banho de gua Fa a a incuba o do suporte temperatura ambiente durante 15 3 minutos J Detec o Para utiliza o do LEADER HC Lumin metro consulte o Manual do operador LEADER HC Lumin metro Para utiliza o do software do ensaio PROGENSA PCAS consulte o Guia de refer ncia r pida ou o Manual do administrador e o Manual do operador do sistema do software do ensaio PROGENSA PCAS 1 Prepare o Lumin metro LEADER HC colocando uma TTU vazia na posi o 1 da cassete e executando o protocolo WASH uma vez 2 Assegure se de que h volume suficiente de reagentes Auto Detect 1 e 2 para completar as reac es 3 Carregue as TTU no lumin metro utilizando o diagrama do lumin metro como orienta o Se quiser testar ambos os analitos processamento consecutivo carregue primeiro todas as TTU PCAS seguidas imediatamente de todas as TTU PSA 4 Inicie sess o no computador Clique em NEW RUN Novo processamento de ensaio e seleccione o protocolo e as concentra es de ensaio adequados Clique em NEXT Seguinte para iniciar o processamento Ensaio PROGENSA PCA3 22 501377PT Rev D Procedimento de teste Nota O processamento deve ser realizado num per odo de 2 horas ap s o final da incuba o do passo de selec o a 62 Prepare o fluido de desactiva o misturando volumes iguais de solu
14. manuseamento dos reagentes de kits com n meros de lote diferentes consulte Advert ncias e precau es Nenhum dos componentes do reagente associado pode exceder os limites de armazenamento do reagente aberto ou reconstitu do Assegure se de que o reagente associado foi minuciosamente misturado e que foi preparado o volume bastante para fornecer reagente suficiente para um processamento de ensaio completo Ensaio PROGENSA PCA3 14 501377PT Rev D Colheita transporte e armazenamento de espec menes Colheita transporte e armazenamento de espec menes O ensaio PROGENSA PCA3 foi concebido para quantificar o RNA de PCAS e PSA na primeira urina colhida ap s um TR constitu da por tr s passagens por lobo A urina processada utilizando o kit de transporte de esp cimen de urina PROGENSA PCAS A estabilidade do RNA de PCA3 e PSA em urina e em urina processada foi determinada por monitoriza o dos n veis de c pia de RNA em espec menes de urina colhida segundo as instru es abaixo A Instru es de colheita e processamento de esp cimen de urina 1 Pode ser til pedir ao paciente que beba uma quantidade grande de gua aproximadamente 500 ml para garantir urina suficiente para colheita Realize um exame de TR tal como descrito abaixo imediatamente antes da colheita da urina Aplique uma press o suficiente na pr stata para baixar a superf cie em cerca de 1 cm desde a base ao pex e desde a lateral linha m d
15. ponta dedicada para cada tubo de reac o 13 Coloque o distribuidor sobre cada TTU e utilizando a bomba da esta o de fornecimento forne a 1 0 ml de solu o de lavagem a cada tubo da TTU 14 Cubra os tubos com um cart o de selagem e retire o suporte do TCS Coloque uma vez no misturador v rtex de multitubos Consulte as Notas sobre o procedimento para obter mais informa es 15 Coloque o suporte na base magn tica do TCS durante 5 a 10 minutos 16 Aspire todo o l quido tal como nos Passos 11 e 12 17 Ap s a aspira o final retire o suporte da base do TCS e inspeccione visualmente os tubos para assegurar que todo o l quido foi aspirado e que todos os tubos cont m gr nulos de part culas magn ticas Se for vis vel qualquer l quido coloque o suporte de novo na base do TCS durante 2 minutos e repita a aspira o para essa TTU utilizando as mesmas pontas utilizadas anteriormente para cada tubo de reac o Se for vis vel QUALQUER gr nulo de part cula magn tica ap s ter terminado a aspira o o tubo pode ser aceite Se n o for vis vel qualquer gr nulo o esp cimen deve ser testado novamente Se o mesmo esp cimen n o contiver um gr nulo de part cula magn tica neste passo num teste posterior isto poder ser indica o de que existe um problema espec fico do esp cimen Nesta situa o recomenda se uma nova colheita de esp cimen de urina H Amplifica o Nota A adi o de enzima a um suporte de
16. reac o Passos 6 e 7 abaixo deve ser executada em 90 segundos ou menos Execute os Passos 6 e 7 num suporte antes de repetir os procedimentos no segundo suporte Se utilizar o SB100 Banho de calor seco misturador vort x consulte a Ficha de aplica es SB100 Se utilizar o instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 consulte tamb m a Ficha de aplica es do TECAN Freedom EVO para mais instru es 1 Utilizando o pipetador de repeti o adicione 75 ul do reagente de amplifica o espec fico de cada analito reconstitu do a cada tubo de reac o Todas as misturas de reac o no suporte dever o estar vermelhas Utilizando o pipetador de repeti o adicione 200 ul de Reagente de leo Cubra os tubos com um cart o de selagem e leve ao misturador v rtex multitubos Incube o suporte no banho de gua de pr amplifica o a 62 C 1 C durante 10 5 minutos Transfira o suporte para um banho de gua a 42 C 1 C durante 5 2 minutos Com o suporte no banho de gua remova cuidadosamente o cart o de selagem e utilizando o pipetador de repeti o adicione 25 ul do reagente enzim tico reconstitu do a cada uma das misturas de reac o Todas as reac es dever o agora ter a cor laranja Ensaio PROGENSA PCA3 21 501377PT Rev D Procedimento de teste 7 Cubra imediatamente os tubos com um cart o de selagem novo retire os do banho de gua e misture rapidamente as reac es agitando suavemente o suporte manu
17. resultados no resumo de excep es para mais informa es Ensaio PROGENSA PCA3 31 501377PT Rev D Interpreta o dos resultados D Realiza o de novo teste 1 Linhas de orienta o para realiza o de novo teste a Embora n o seja obrigat rio que ambos os analitos sejam testados no mesmo processamento os resultados de ambos os analitos devem ser provenientes do mesmo frasco de amostra para um PCA3 Score comunic vel b Todos os processamentos inv lidos devem ser repetidos e todos os espec menes inv lidos de processamentos v lidos devem ser testados novamente c Volte a testar o s espec mene s utilizando um novo conjunto de calibradores e controlos d Um armazenamento adequado do esp cimen residual antes do novo teste essencial consulte Colheita transporte e armazenamento de espec menes para mais informa es e Poder ser necess ria uma correspond ncia manual dos analitos PCA3 e PSA para determinar o PCAS3 Score consulte Correspond ncia manual para mais informa es 2 Dilui o de espec menes fora do intervalo alto a Se a concentra o de um esp cimen ultrapassa o Calibrador 5 num processamento v lido o resultado fora do intervalo alto e o resultado ser etiquetado com um c digo de an lise f ou F nos relat rios de teste A concentra o ser expressa como gt concentra o do Calibrador 5 b Inverta o esp cimen de urina processado para mistur lo a
18. 27 501377PT Rev D Interpreta o dos resultados Interpreta o dos resultados A Tipos de relat rios 1 Relat rio de teste em bruto O Relat rio de teste em bruto fornece informa o sobre a validade do processamento PASS aprovado ou FAIL n o aprovado consulte Procedimentos de controlo de qualidade e sobre os tubos de reac o individuais testados com o ensaio PROGENSA PCAS Se um teste for inv lido FAIL n o aprovado todos os tubos desse teste ser o etiquetados como inv lidos No entanto os tubos individuais podem ser considerados inv lidos dentro de um teste v lido PASS aprovado Para testes consecutivos ou seja ambos os analitos PCA3 e PSA s o testados do mesmo processamento um teste de analito pode ser inv lido enquanto o outro teste de analito v lido O resumo de excep es encontra se no fim do Relat rio de teste em bruto Para testes consecutivos onde ambos os testes de analitos foram v lidos os espec menes listados no Resumo de excep es podem necessitar de ser novamente testados relativamente a um analito Embora possa ser indicado no resumo de excep es um resultado de PCA3 Score este resultado s ser considerado no relat rio se tiver sido efectuada correspond ncia manual e o resultado for indicado num Relat rio de r cio Se tiver sido testado s um analito ou se um processamento de analito foi inv lido todos os espec menes testados ser o indicados no Resumo de excep es
19. 3 Score comunicado estiver abaixo do cutoff o resultado dever ser interpretado como NEGATIVE Negativo Se o PCA3 Score estiver acima ou for igual ao cutoff o resultado dever ser interpretado como POSITIVE Positivo O director do laborat rio estabelecer o cutoff consulte Caracter sticas do desempenho para obter mais informa es Em algumas condi es fornecido um intervalo de PCA3 Score gt PCA3 Score calculado ou lt Score calculado Se o lt PCA3 Score calculado estiver abaixo do cutoff o resultado dever ser interpretado como NEGATIVE Negativo Se o gt PCA3 Score calculado estiver acima do cutoff o resultado dever ser interpretado como POSITIVE Positivo Se for necess rio um valor num rico a dilui o do esp cimen e um novo teste poder o gerar um PCA3 Score em vez de um intervalo de PCA3 Score consulte Realiza o de novo teste Dilui o de espec menes fora do intervalo alto 2 Interpretar os c digos de estado e an lise A coluna Estado do Relat rio de teste em bruto e no Relat rio de r cio fornece informa o no formato s a Os c digos de estado espec ficos do teste s s o indicados antes esquerda dos dois pontos e os c digos de an lise espec ficos do analito a s o indicados ap s direita os dois pontos Os c digos espec ficos do analito s o indicados em letra min scula para os resultados PCAS3 e em letra mai scula para os resultados PSA Cada
20. 302351 Kit de Fluidos de Ensaio APTIMA 302002C Pontas de pipeta descart veis com filtro 1 ml 10612513 Tecan TECAN Freedom EVO 100 4 900932 Conjunto de placa de plataforma PCAS DTS 800 902021 Reservat rio de reagente m dulo de quarto de 40 ml 104765 Reservat rio de reagente dividido 19 ml x 2 m dulos de quarto 901172 Tubos de transporte 302521 Tampas perfur veis de substitui o 302520 Tampas n o perfur veis de substitui o 103036A Ensaio PROGENSA PCA3 9 501377PT Rev D Advert ncias e precau es Advert ncias e precau es A Para utiliza o em diagn stico in vitro B Exclusivamente para exporta o dos EUA Relacionados com o laborat rio C Utilize apenas os artigos de laborat rio descart veis que sejam fornecidos ou especificados D Empregue todas as precau es laboratoriais de rotina N o coma n o beba nem fume nas reas de trabalho designadas Use luvas sem p descart veis protec o ocular e batas de laborat rio quando manusear espec menes e reagentes de um kit Lave bem as m os depois de manusear os espec menes de urina e os reagentes do kit E Advert ncia Irritante corrosivo Evite o contacto do Auto Detect 1 e 2 com a pele olhos e membranas mucosas Se estes fluidos entrarem em contacto com a pele ou os olhos lave bem com gua a zona afectada Se estes fluidos derramarem dilua o derrame com gua antes de o limpar e secar F As superf cies de trabalho os p
21. NA do PCAS3 na urina Os espec menes de indiv duos submetidos a prostatectomia radical n 97 foram testados com o ensaio PROGENSA PCA3 e os n veis de RNA do PCA3 foram comparados com os de indiv duos pr biopsia n 464 O valor mediano de c ml de RNA do PCAS estava abaixo do limite de detec o do ensaio para espec menes de indiv duos ap s prostatectomia enquanto o valor mediano de c ml de RNA do PCAS para espec menes de indiv duos pr biopsia foi de 7243 c ml estes dados confirmam que o RNA do PCA3 na urina pertence pr stata c Especificidade do tecido O RNA total foi extra do de tecidos de dois nicos doadores masculinos por tipo de tecido adicionado a diluente de esp cimen 10 ng por reac o e testado com o ensaio PROGENSA PCAS O tecido da pr stata foi o nico tipo detectado acima do limite de detec o do RNA do PCAS dos tipos de tecido indicados na Tabela 7 Ensaio PROGENSA PCA3 35 501377PT Rev D Caracter sticas do desempenho Tabela 7 Tipos de tecido masculino testados para RNA do PCA3 Tipo de tecido Bexiga normal Rim Bexiga tumor P nis Medula ssea Pr stata Canal deferente Ves cula seminal Epid dimo Test culo d Subst ncias interferentes As subst ncias indicadas na Tabela 8 foram adicionadas a al quotas de urina de homens processada em conjunto Os espec menes foram testados com o ensaio PROGENSA PCA3 de acordo com o documento EP7 A2 do Instituto CLSI 2005
22. Score O PCAS3 Score destina se a ser utilizado em conjunto com algoritmos de diagn stico standard of care como auxiliar de diagn stico do cancro da pr stata Resumo e explica o do teste A utiliza o do teste do antig nio espec fico da pr stata PSA no soro sangu neo para detec o do cancro da pr stata teve como resultado o diagn stico por biopsia de tumores mais pequenos anteriormente n o detectados 1 o que criou um novo dilema no diagn stico apenas uma parte dos homens com n veis aumentados de PSA no soro sangu neo possuem cancro da pr stata detect vel Os homens com pelo menos uma biopsia negativa t m frequentemente um PSA aumentado no soro devido principalmente a pr statas aumentadas e hiperplasia benigna da pr stata BPH No entanto uma propor o significativa de homens com um PSA ligeiramente aumentado no soro 2 5 4 0 ug l tem ou vir a ter um cancro da pr stata significativo do ponto de vista cl nico 1 Embora a biopsia continue a ser o m todo mais importante para detec o do cancro da pr stata s o necess rios testes mais precisos com uma maior especificidade para ajudar a orientar as decis es de realiza o de biopsia pr stata O PCA3 tamb m conhecido como PCA3 ou DD3 um RNA espec fico da pr stata de n o codifica o altamente expressado por c lulas cancer genas da pr stata com uma regula o superior 66 vezes mediana quando comparada com a do tecid
23. U do calibrador 1 1 645 desvios padr o de replicados RLU do calibrador 2 Recupera o m dia interpolada do Calibrador 5 100 30 Recupera o m dia interpolada do Controlo A 100 60 Recupera o m dia interpolada do Controlo B 100 35 O software PCAS3 avalia automaticamente os resultados relativamente aos crit rios acima e comunicar o estado do teste como PASS aprovado se os crit rios de validade forem cumpridos e como FAIL n o aprovado se esses mesmos crit rios n o forem cumpridos Se o estado do teste for FAIL n o aprovado todos os resultados de teste no mesmo processamento s o inv lidos para esse analito e n o devem ser inclu dos no relat rio Se um processamento for inv lido dever ser repetido para esse analito consulte Interpreta o dos resultados Se o processamento for v lido para o outro analito esses resultados podem ser usados em an lise de dados com o processamento v lido repetido do primeiro analito B Validade do esp cimen Num processamento v lido os resultados de cada esp cimen podem ser considerados INVALID inv lido e ser o indicados no Relat rio de teste em bruto consulte Interpreta o dos resultados Embora os replicados individuais para um esp cimen possam ser v lidos um esp cimen ser invalidado se a diferen a de c ml interpolada entre os replicados exceder 600 Os testes do esp cimen para esse analito devem ser repetidos Ensaio PROGENSA PCA3
24. a superf cie de trabalho limpa e coberta Segurando o frasco de solu o na bancada insira firmemente a outra extremidade do colarinho de reconstitui o na abertura do frasco Figura 2 Passo 2 d Inverta suavemente os frascos montados Deixe a solu o vazar do frasco para o frasco de vidro Figura 2 Passo 3 Aguarde que o reagente liofilizado passe para dentro da solu o e em seguida agite suavemente a solu o dentro do frasco de vidro para misturar Evite criar espuma quando rodar o frasco Figura 2 Passo 4 e Inverta o conjunto e incline o num ngulo de 45 para minimizar a espuma Figura 2 Passo 5 Deixe o l quido vazar todo de novo para o frasco de pl stico f Retire o colarinho de reconstitui o e o frasco de vidro Figura 2 Passo 6 g Volte a tapar o frasco de pl stico Figura 2 Passo 7 Anote as iniciais do operador e a data de reconstitui o em todos os frascos de reagente reconstitu dos Certifique se de que regista o analito PCA3 ou PSA nos frascos de reagente de sonda h Deite fora o colarinho de reconstitui o e o frasco de vidro Figura 2 Passo 8 2 Os reagentes de sonda de amplifica o e enzim tico previamente reconstitu dos t m de alcan ar a temperatura ambiente 15 C a 30 C antes do in cio do ensaio Consulte Requisitos de armazenamento e manuseamento dos reagentes se quiser juntar reagentes residuais Se o reagente de amplifica o reconstitu do contiver precipitado que
25. ados em tr s replicados e os controlos em dois replicados cada devendo ser testados no mesmo suporte como espec menes Os espec menes devem ser testados em duplicado N o deixe tubos de rea o vazios entre calibradores controlos e espec menes Se estiver a usar o instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 consulte a Ficha de aplica es do TECAN Freedom EVO 100 4 para o ensaio PROGENSA PCA3 ficha de aplica es do TECAN Freedom EVO para obter mais instru es Ensaio PROGENSA PCA3 18 501377PT Rev D Procedimento de teste Tabela 3 Exemplo de configura o do suporte Suporte Amostra Concentra o do Concentra o de Posi o Descri o FORAS alvo de A alvo c pias ml c pias ml 1a3 Calibrador 1 0 0 4a 6 Calibrador 2 250 7500 7a9 Calibrador 3 2500 75 000 10a 12 Calibrador 4 25 000 750 000 13a15 Calibrador 5 125 000 3 000 000 16a 17 Controlo A 1250 37 500 18a 19 Controlo B 62 500 1 500 000 20 para n Esp cimen Desconhecido Desconhecido Aos calibradores e controlos positivos para PCA3 e PSA s o atribu dos valores logo os valores reais de c pias ml para os calibradores 2 a 5 e para os controlos A e B ser o ligeiramente diferentes das concentra es alvo indicadas na tabela variando de lote para lote A informa o sobre as concentra es fornecida num cart o na embalagem dos frascos de calibrador e de controlo e usada para calibragem e determina o da validade do processamento do te
26. almente Nota Minimize o tempo que o suporte est fora do banho para evitar que os tubos arrefe am 8 Incube o suporte a 42 C 1 C durante 60 5 minutos P s amplifica o O pipetador de repeti o usado na hibrida o e selec o dever ser aplicado apenas a estes passos consulte Advert ncias e precau es O ambiente de p s amplifica o incluindo detec o deve situar se entre 15 C e 30 C Se utilizar o SB100 Banho seco Misturador v rtex consulte a Ficha de aplica es SB100 1 Hibrida o a Retire o suporte do banho de gua de pr amplifica o e transfira para a rea de p s amplifica o Adicione 100 ul do reagente de sonda espec fico do analito reconstitu do utilizando o pipetador de repeti o Todas as misturas de reac o dever o estar agora de cor amarela b Cubra os tubos com um cart o selante e leve ao misturador v rtex durante 10 segundos ou at a cor estar uniforme no misturador v rtex de multitubos c Incube o suporte num banho de gua de 62 C 1 C durante 20 5 minutos d Retire o suporte do banho de gua e fa a a incuba o temperatura ambiente durante 5 1 minutos 2 Selection a Utilizando o pipetador de repeti o adicione 250 ul do reagente de selec o a cada tubo de reac o Todas as reac es dever o agora ter a cor rosa b Cubra os tubos com um cart o de selagem leve ao v rtex durante 10 segundos ou at a cor ficar uniforme
27. amostra para evitar a gera o de espuma e bolhas Ensaio PROGENSA PCA3 23 501377PT Rev D Procedimento de teste C Reagentes 1 A solu o de reconstitui o de sonda pode precipitar durante o armazenamento Aque a a solu o a 62 C 1 C durante 1 a 2 minutos Ap s este passo de aquecimento a solu o de reconstitui o de sonda pode ser usada mesmo que se mantenha precipitado residual Ap s a ressuspens o misture o frasco invertendo o suavemente 2 Quando fizer a pipetagem de reagentes n o enzim ticos aponte ligeiramente para o lado da parte inferior do tubo de reac o onde o fundo se encurva para se encontrar com os lados Quando fizer a pipetagem do reagente enzim tico aponte directamente para o centro do tubo de reac o Confirme visualmente que os reagentes est o a ser correctamente fornecidos sem quantidade excessiva de reagente nos lados dos tubos e uma altera o de cor adequada D Temperatura 1 Os passos de captura do alvo de amplifica o de hibrida o e de selec o dependem da temperatura Assim torna se imperativo que os banhos de gua sejam mantidos nos intervalos de temperatura especificados 2 A temperatura ambiente define se como uma temperatura entre 15 Ce 30 C E Tempo As reac es de captura do alvo da amplifica o da hibrida o e da selec o dependem todas do tempo Aplique os tempos especificados em Procedimento de teste F Utiliza o do misturad
28. ar entre 2 C e 8 C ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade CAL Calibrador 1 PSA 1x2 0ml Solu o tamponada de fosfato com lt 5 de lauril sulfato de l tio CAL Calibradores 2 5 PSA 4x 1 7 ml cido nucleico PSA n o infeccioso em solu o tamponada de fosfato com lt 5 de lauril sulfato de l tio PC Controlos positivos PSA 2x1 7 ml Acido nucleico PSA n o infeccioso em solu o tamponada de fosfato com lt 5 de lauril sulfato de l tio Folha informativa da concentra o de PSA 1 folha Ensaio PROGENSA PCA3 6 501377PT Rev D Reagentes e materiais fornecidos Fluidos de ensaio APTIMA Armazenar entre 15 C e 30 C 2 caixas ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade W Solu o de lavagem 1 x 402 ml Solu o tamponada HEPES com lt 2 dodecil sulfato de s dio DF Tamp o para o fluido de desactiva o 1 x 402 ml Solu o tamponada de bicarbonato O Reagente de leo 1x24 6ml leo de silicone Nota Todos os materiais inclu dos no kit do ensaio PROGENSA PCA3 podem tamb m ser adquiridos separadamente consulte a sec o Materiais para mais informa es Ensaio PROGENSA PCA3 7 501377PT Rev D Materiais Nota Os materiais dispon veis na Gen Probe possuem a indica o dos n meros de cat logo Materiais necess rios mas dispon veis separadamente
29. ara gerar uma c pia de cido desoxirribonucleico DNA contendo uma sequ ncia de activa o para a polimerase do RNA T7 da sequ ncia alvo A polimerase do RNA T7 produz v rias c pias do produto de amplifica o do RNA a partir do modelo da c pia do DNA A detec o alcan ada por HPA utilizando sondas de cido nucleico etiquetadas por quimioluminesc ncia e de estirpe nica que s o complementares ao amplicon Para cada amplicon alvo s o utilizadas sondas separadas As sondas de cido nucleico marcadas s o hibridadas especificamente no produto de amplifica o O reagente de selec o diferencia entre sondas hibridadas e n o hibridadas atrav s da inactiva o do marcador nas sondas n o hibridadas Durante o passo de detec o o sinal de quimioluminesc ncia produzido pela sonda hibridada medido num lumin metro e registado como unidade de luz relativa RLU O RNA do PCA3 e o RNA do PSA s o quantificados em tubos separados e o PCA3 Score calculado Os calibradores que cont m quantidades conhecidas de transcritos de RNA do PCA3 ou RNA do PSA s o inclu dos em todos os processamentos de ensaio e usados para gerar uma curva padr o Os controlos PCA3 e PSA est o tamb m inclu dos para verificar a precis o dos resultados interpolados a partir da curva padr o Ensaio PROGENSA PCA3 3 501377PT Rev D Reagentes e materiais fornecidos Reagentes e materiais fornecidos A seguir est o indicados os reagentes
30. as por espectrofotometria UV vis adicionadas a urina de mulheres normais processada sem RNA de PCA3 ou PSA detect vel e as concentra es foram medidas no ensaio PROGENSA PCAS A percentagem de recupera o foi calculada como raz o entre o c ml medido e o c ml adicionado multiplicada por 100 Ensaio PROGENSA PCA3 36 501377PT Rev D Caracter sticas do desempenho Tabela 9 Recupera o de c pia do ensaio PROGENSA PCA3 Analito conhecida Concentra o cimi i medida c ml Recupera o 750 808 108 7500 7618 102 PCA3 18 750 18 722 100 75 000 70 287 94 20 000 23 684 118 250 000 278 373 111 PSA 500 000 599 941 120 1 750 000 1 960 775 112 4 Linearidade e intervalo O intervalo linear do ensaio PROGENSA PCA3 foi determinado de acordo com o documento EP6 A do Instituto CLSI 2003 8 com base na an lise de regress o linear m nimos quadrados Foram preparados dois conjuntos de s ries de dilui o a partir de espec menes contendo elevadas concentra es de RNA de PCAS e PSA Um conjunto foi dilu do em urina feminina processada e o outro foi dilu do em diluente de esp cimen As dilui es abrangeram todo o intervalo de ensaio entre os mais baixos e os mais altos calibradores positivos para cada analito Para ambos os analitos PCA3 e PSA os resultados medidos pelo ensaio mostraram uma rela o directamente proporcional entre as dilui es testadas e o c ml do analito comunicado N
31. cteristic utilizando a biopsia da pr stata como m todo de refer ncia de acordo com o documento GP10 A do Instituto CLSI 1995 4 Para o ensaio PROGENSA PCAS a rea sob a curva AUC foi de 0 685 intervalo de confian a de 95 0 637 a 0 733 A Tabela 6 mostra a sensibilidade e a especificidade de diagn stico com valores de cutoff de PCA3 Score diferentes Cada laborat rio dever determinar o cutoff para a sensibilidade e especificidade do diagn stico consulte Interpreta o dos resultados Tabela 6 Sensibilidade e especificidade de diagn stico do ensaio PROGENSA PCAS com cutoffs de PCAS Score diferentes Cutoff do PCAS3 Score 5 10 15 25 35 50 95 Sensibilidade 96 85 77 63 53 41 17 Especificidade 14 33 47 61 74 84 95 Ensaio PROGENSA PCA3 34 501377PT Rev D Caracter sticas do desempenho 2 Estudos de estabilidade do esp cimen a Estabilidade em urina total Foi colhida a primeira urina de 10 indiv duos e armazenada entre 2 Ce 8 C ou a 30 C antes do processamento atrav s da adi o ao meio de transporte da urina UTM Entre 2 Ce 8 C foi observada uma degrada o significativa de RNA de PCA3 e PSA em alguns espec menes ap s 4 horas Assim a urina total deve ser processada num per odo de 4 horas A 30 C foi observada uma degrada o significativa em menos de 1 hora Logo a urina total deve estar sempre refrigerada ou mantida em gelo antes do processamento b Estabilidade em u
32. de s dio Cubra a superf cie da bancada em que ser executado o teste com capas absorventes para bancadas de laborat rios com forro pl stico Coloque um n mero suficiente de Cassetes de Dez Pontas no Sistema de Captura do Alvo Target Capture System TCS Assegure se de que o frasco de lavagem do TCS est cheio com solu o de lavagem e que o aspirador est ligado bomba de v cuo Consulte o Manual do operador do sistema de Captura do Alvo Reconstitui o e prepara o do reagente A reconstitui o dos reagentes deve ser feita antes de se iniciar a transfer ncia de espec menes 1 Para reconstituir os Reagentes de Amplifica o Enzim tico e de Sonda combine os frascos do reagente liofilizado com a solu o de reconstitui o Se estiverem refrigeradas deixe que as solu es de reconstitui o alcancem a temperatura ambiente antes de serem utilizadas Figura 2 Processo de reconstitui o a Associe a solu o de reconstitui o adequada com o respectivo reagente desidratado Verifique se os frascos t m cores de etiqueta correspondentes para assegurar que est o adequadamente associados b Abra o frasco do reagente liofilizado e insira bem a extremidade com entalhe do colarinho de reconstitui o na abertura do frasco Figura 2 Passo 1 Ensaio PROGENSA PCA3 17 501377PT Rev D Procedimento de teste c Abra a solu o de reconstitui o correspondente e coloque a tampa sobre um
33. e armazenamento de espec menes para mais informa es para o caso de serem necess rios novos testes 3 Cubra as TTU com o crat o de selagem e agite ligeiramente o suporte m o N o utilize o misturador v rtex Incube o suporte a 62 C 1 C num banho de gua durante 30 5 minutos 4 Retire o suporte do banho de gua e seque a parte inferior dos tubos com material absorvente 5 Assegure se de que os cart es de selagem est o bem colocados Se necess rio substitua com novos cart es de selagem e sele bem as TTU 6 Leve o suporte ao misturador v rtex durante 60 segundos no misturador v rtex multitubos consulte Notas sobre o procedimento Inicie o procedimento de mistura no misturador v rtex num per odo de 2 minutos ap s remo o do suporte do banho de gua 7 Sem remover os cart es de selagem incube o suporte temperatura ambiente durante 30 5 minutos 8 Coloque o suporte com a aba frontal virada para a frente na base magn tica TCS durante 5 a 10 minutos Carregue o suporte de TTC com TTCs 9 Prepare as linhas da bomba da esta o de fornecimento bombeando a solu o de lavagem atrav s do distribuidor Bombeie l quido suficiente pelo sistema para que n o existam bolhas de ar na linha e todos os dez bicos forne am um fluxo de l quido constante 10 Ligue a bomba de v cuo e desligue o distribuidor de aspira o no primeiro conector entre o distribuidor de aspira o e o frasco colector Certi
34. e de diagn stico tal como a prostatectomia a radia o a biopsia da pr stata e outros podem afectar a viabilidade do tecido prost tico e subsequentemente exercer algum impacto sobre o PCAS Score O efeito destes procedimentos sobre o desempenho do ensaio ainda n o foi avaliado Devem ser colhidas amostras para teste de PCA3 quando o m dico achar que o tecido da pr stata j est recuperado C A utiliza o do ensaio PROGENSA PCA3 limitada ao pessoal que tenha recebido forma o sobre o procedimento O n o cumprimento das instru es constantes deste folheto poder originar resultados err neos D Cada laborat rio dever validar de forma independente um processo de transfer ncia LIS E A obten o de resultados fi veis depende de uma colheita adequada do esp cimen de urina Uma vez que o sistema de transporte utilizado para o ensaio PROGENSA PCA3 n o permite uma avalia o microsc pica da adequa o do esp cimen de urina necess ria a forma o dos m dicos nas t cnicas adequadas de colheita do esp cimen de urina Consulte Colheita transporte e armazenamento de espec menes Para obter informa es detalhadas consulte o folheto da embalagem fornecido no kit de transporte do esp cimen de urina PROGENSA PCAS F Os resultados do ensaio PROGENSA PCAS devem ser interpretados em conjunto com outros dados laboratoriais e cl nicos que o m dico disponha Os resultados de teste podem ser afectados por uma colhe
35. e materiais fornecidos no kit do ensaio PROGENSA PCA3 PSA para o ensaio PROGENSA PCAS Os S mbolos de Identifica o do Reagente tamb m est o indicados ao lado do nome do reagente Kit do ensaio PROGENSA PCAS 2 x 100 Reac es N Cat 302355 8 caixas Kit de 100 reac es PROGENSA PCA3 Caixa refrigerada PROGENSA PCA3 Armazenar entre 2 C e 8 C ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade A Reagente de amplifica o PCA3 1 frasco cidos nucleicos n o infecciosos liofilizados em solu o tamponada HEPES com lt 10 de agente de volume E Reagente enzim tico PCAS PSA 1 frasco Transcriptase reversa e RNA polimerase liofilizadas em solu o tamponada HEPES com lt 10 de reagente de volume P Reagente de sonda PCA3 1 frasco Sondas de DNA quimioluminescente n o infeccioso desidratadas em solu o tamponada de succinato com lt 5 de agente de volume e lt 5 de lauril sulfato de l tio Caixa temperatura ambiente PROGENSA PCA3 Armazenar entre 15 C e 30 C ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade AR Solu o de reconstitui o de amplifica o PCAS3 1x9 3ml Solu o aquosa com conservantes lt 1 parabenos ER Solu o de reconstitui o enzim tica PCA3 PSA 1x3 3ml Solu o tamponada HEPES com um surfactante 10 Triton X 100 e 20 de glicerol PR
36. em solu o tamponada HEPES com lt 10 de agente de volume E Reagente enzim tico PCA3 PSA 1 frasco Transcriptase reversa e RNA polimerase liofilizadas em solu o tamponada HEPES com lt 10 de reagente de volume P Reagente de sonda PSA 1 frasco Sondas de DNA quimioluminescente n o infeccioso desidratadas em solu o tamponada de succinato com lt 5 de agente de volume e lt 5 de lauril sulfato de l tio Ensaio PROGENSA PCA3 5 501377PT Rev D Reagentes e materiais fornecidos Caixa temperatura ambiente PROGENSA PSA Armazenar entre 15 Ce 30 C ap s a recep o at ao prazo de validade indicado no r tulo S mbolo Componente Quantidade AR Solu o de reconstitui o de amplifica o PSA 1x9 3 ml Solu o aquosa com conservantes lt 1 parabenos ER Solu o de reconstitui o enzim tica PCA3 PSA 1x3 3 ml Solu o tamponada HEPES com um surfactante 10 Triton X 100 e 20 de glicerol PR Solu o de reconstitui o de sonda PCA3 PSA 1x124ml Solu o tamponada de succinato com lt 5 de lauril sulfato de l tio S Reagente de selec o PCA3 PSA 1x31 ml Solu o tamponada de borato com surfactante 1 Triton X 100 TCR Reagente de captura de alvo PSA 1x22ml Acido nucleico n o infeccioso em solu o tamponada HEPES com fase s lida Cart es de selagem 1 embalagem Colarinhos de Reconstitui o 1 embalagem Kits de calibradores e controlos PROGENSA PSA Armazen
37. empenho Tabela 11 Reprodutibilidade do ensaio PROGENSA PCAS An lise de c pia ml i inter V inter V Analito Pame medida y Maa eana GV Inter is eis Membro c ml total mento mento operador Manto lote 1 36 248 27 24 7 15 11 0 2 36 7021 11 6 9 9 0 0 3 36 31 469 8 6 5 9 0 4 4 36 1469 15 13 7 6 0 1 PCA3 5 36 14 844 7 5 2 6 0 4 6 36 72 372 7 4 6 0 1 0 7 36 430 26 26 0 11 0 1 8 36 62 274 13 8 8 3 0 5 1 34 52 739 9 6 6 7 4 2 2 34 218 789 10 6 7 7 4 0 3 32 1 073 920 11 4 6 9 8 0 4 34 37 185 9 5 7 3 0 1 RSA 5 32 386 504 10 4 8 6 3 4 6 34 1 518 748 12 5 8 4 3 7 7 32 11 007 14 8 9 0 6 0 8 34 1 694 404 11 7 7 0 1 6 Tabela 12 Reprodutibilidade do ensaio PROGENSA PCA3 An lise do PCA3 Score Painel Score CN inter CY Inters CV Inter CV Inter CV Inter Membro m dio CV total processar processa operador equipamento lote mento mento 1 34 5 27 26 5 23 8 0 2 34 32 14 9 10 12 0 2 3 32 30 12 7 5 17 7 6 7 32 39 28 24 2 8 11 7 8 34 37 21 14 12 0 0 9 Os membros 4 a 6 do painel continham apenas transcrito do RNA do PCA3 ou PSA e como tal n o foram inclu dos nesta an lise Ensaio PROGENSA PCA3 39 501377PT Rev D Bibliografia Bibliografia 1 Bussemakers M J G A Van Bokhoven G W Verhaegh F P Smit H F
38. erem de ser congelados ou transportados retire a tampa perfur vel e coloque novas tampas n o perfur veis nos tubos de espec menes de urina Se os espec menes tiverem de ser transportados para a realiza o de testes noutras instala es as temperaturas recomendadas dever o ser mantidas Evite salpicos e contamina o cruzada Nota Os espec menes t m de ser transportados de acordo com os regulamentos de transporte nacionais e internacionais em vigor Ensaio PROGENSA PCA3 16 501377PT Rev D Procedimento de teste Procedimento de teste A Prepara o da rea de trabalho 1 Ajuste um banho de gua para 62 C 1 C para pr amplifica o um segundo banho de gua para 42 C 1 C para amplifica o e um terceiro banho de gua para 62 C 1 C para p s amplifica o Assegure se de que os banhos de gua cont m gua suficiente consulte Notas sobre o procedimento Se utilizar o SB100 Banho de calor seco misturador vort x consulte a Ficha de aplica es do SB100 Banho de calor seco misturador vort xpara o ensaio PROGENSA PCA3 ficha de aplica es SB100 Antes de iniciar o ensaio limpe as superf cies de trabalho e os pipetadores com solu o de hipoclorito de s dio de 2 5 a 3 5 0 35 M a 0 5 M Deixe a solu o de hipoclorito de s dio entrar em contacto com as superf cies e os pipetadores durante pelo menos 1 minuto e depois enxag e com gua N o deixe secar a solu o de hipoclorito
39. es O resumo de excep es poder n o indicar quaisquer excep es Nestes casos n o s o necess rias quaisquer outras ac es Se o resumo de excep es indicar um esp cimen ou espec menes para processamentos consecutivos em que ambos os testes de analitos s o v lidos consulte a Tabela 4 para mais instru es Para testes de analito individual consulte Interpretar os c digos de estado e an lise Em processamentos consecutivos em que um teste de analito inv lido volte a testar o processamento inv lido consulte Realiza o de novo teste para mais informa es e trate os resultados como se tivessem sido realizados processamentos de analito individuais Ser necess ria a correspond ncia manual Um esp cimen poder ser etiquetado como inv lido embora os tubos individuais replicados possam ser etiquetados como v lidos o resultado combinado dos replicados que determina a validade do esp cimen e uma grande diferen a entre replicados invalidar um esp cimen consulte Procedimentos de controlo de qualidade para mais informa es Tabela 4 Condi es do resumo de excep es do ensaio PROGENSA PCAS Resultado PCA3 Resultado PSA PCA3 Score Outro C digo Se C digo ae listado teste Ac o coment rio an lise an lise Dentro de nian lo Inv lida Testar PSA de novo consulte Realiza o i de novo teste e fa a a correspond ncia sem c digo A B E H ou Sim E Vedas p
40. fique se de que o vacu metro cumpre a especifica o do teste de fuga Pode demorar 15 segundos a alcan ar esta leitura Volte a ligar o distribuidor e assegure se de que o man metro de v cuo cumpre as especifica es do n vel de v cuo Deixe a bomba de v cuo ligada at que todos os passos da captura do alvo estejam conclu dos e o tubo do distribuidor de aspira o esteja seco Consulte a ficha de especifica es de v cuo do sistema de captura do alvo localizada na parte posterior do Manual do operador do sistema de captura do alvo ou contacte o Suporte T cnico da Gen Probe para mais informa es 11 Fixe bem o tubo de aspira o no primeiro conjunto de pontas Fa a baixar as pontas para dentro da primeira TTU at que as pontas entrem em contacto com o topo do l quido Mantenha o contacto das pontas com o topo do l quido medida que as pontas se movem para baixo at que estas entrem em contacto breve com o fundo dos tubos Bata suavemente com as pontas contra o fundo Ensaio PROGENSA PCA3 20 501377PT Rev D Procedimento de teste dos tubos at que todo o l quido restante seja removido N o deixe que as pontas mantenham um contacto prolongado com o fundo dos tubos nem bata rapidamente as pontas pois pode criar se espuma excessiva na apreens o de v cuo 12 Terminada a aspira o ejecte as pontas para a respectiva cassete de pontas original Repita os passos da aspira o para as TTU restantes utilizando uma
41. ia para cada lobo tal como mostrado na Figura 1 Realize exactamente tr s toques em cada lobo N o se pretende que seja uma massagem prost tica Lobo Pase Lobo esquerdo direito pex Figura 1 Instru es adequadas de press o aplicada pr stata No seguimento do TR instrua o paciente para recolher a primeira urina cerca de 20 ml a 30 ml do fluxo de urina inicial num copo de colheita de urina devidamente etiquetado Este dever ser o primeiro esp cimen de urina evacuado no seguimento do TR Utilize um copo de colheita isento de conservantes Se o paciente n o conseguir parar o fluxo de urina e fornecer mais urina do que os primeiros 20 ml a 30 ml solicitados conserve o volume total Se o paciente n o conseguir fornecer o volume solicitado necess rio pelo menos 2 5 ml para efectuar o ensaio PROGENSA PCAS De outra forma o esp cimen deve ser rejeitado Nota Volumes de urina muito elevados podem baixar as concentra es dos analitos PCA3 e PSA e podem ocasionalmente resultar num esp cimen inv lido Por conseguinte o paciente deve tentar evitar encher o copo de colheita de urina Os espec menes de urina n o processados se n o forem processados imediatamente t m de ser mantidos entre 2 C e 8 C ou conservados em gelo Os espec menes de urina n o processados e refrigerados devem ser transferidos para dentro do tubo de transporte de esp cimen de urina dentro do per odo de quatro horas ap s a colheita Cas
42. ipetadores e outro equipamento t m de ser regularmente descontaminados com solu o de hipoclorito de s dio de 2 5 a 3 5 0 35 M a 0 5 M ver Notas sobre o procedimento G Recomenda se veementemente a exist ncia de uma rea independente para p s amplifica o para minimizar a contamina o pelo amplicon no ensaio Esta rea dedicada deve estar afastada da rea de pr amplifica o onde ocorre a prepara o de reagentes a captura de alvo e a amplifica o H Para ajudar a prevenir que reas de laborat rio fiquem contaminadas com o amplicon a rea do laborat rio deve estar disposta de modo a ter um fluxo de trabalho unidireccional desde a prepara o dos reagentes at p s amplifica o Os espec menes equipamentos e reagentes n o devem ser devolvidos rea onde um passo anterior tenha sido executado Os t cnicos n o devem voltar s reas de trabalho anteriores sem as devidas medidas de protec o contra contamina o Relacionados com os espec menes Ap s ter sido adicionada urina o n vel do l quido no tubo de transporte de esp cimen de urina deve estar inicialmente entre duas linhas pretas indicadoras na etiqueta do tubo De outra forma o esp cimen deve ser rejeitado J Mantenha condi es de armazenamento adequadas durante o envio do esp cimen para garantir a integridade do mesmo A estabilidade do esp cimen sob condi es de envio diferentes das recomendadas n o foi avaliada K
43. ita inadequada do esp cimen erro t cnico ou troca de espec menes Ensaio PROGENSA PCA3 33 501377PT Rev D Caracter sticas do desempenho Caracter sticas do desempenho A Resultados cl nicos 1 Sensibilidade e especificidade do diagn stico As caracter sticas de desempenho para o ensaio PROGENSA PCA3 foram determinadas utilizando espec menes de indiv duos utentes em quatro instala es cl nicas geograficamente diversas da Am rica do Norte A popula o em quest o era constitu da por 529 homens com biopsia pr stata j programada Os dados demogr ficos respectivos s o indicados em seguida a Idade m dia DP 64 8 anos m dia 63 intervalo 32 a 89 b N vel m dio de PSA do soro 7 9 21 9 ug l 5 6 0 3 a 484 c Volume m dio da pr stata determinado por ultra som transrectal 44 25 cm 39 5 a 225 d 34 180 529 biopsia positiva para cancro da pr stata A Figura 3 mostra a correla o do PCA3 Score com a probabilidade de biopsia positiva medida que o PCA3 Score aumentava a ocorr ncia de biopsia positiva para cancro nos indiv duos aumentava 80 70 60 Z 3 50 e i 40 Qu 2 30 se 20 10 0 PCA3 Score lt 5 5 9 10 19 20 34 35 49 50 100 gt 100 HAssuntos 58 85 104 97 57 86 42 Figura 3 Correla o de PCA3 Score com probabilidade de biopsia positiva Foi efectuada uma an lise ROC Receiver operating chara
44. lecular Urine Analysis for the Diagnosis of Prostate Cancer European Desenvolvido fabricado e distribu do por taal Ce Gen Probe Incorporated San Diego CA 92121 EUA Contactos nos EUA e a n vel internacional Apoio ao Cliente 1 858 410 8002 customerserviceOgen probe com Assist ncia T cnica 1 858 410 8511 technicalsupportOgen probe com N mero de telefone gratuito nos EUA e Canad Apoio ao Cliente 1 800 523 5001 Assist ncia T cnica 1 888 484 4747 Www gen probe com EMERGO EUROPE Molenstraat 15 2513 BH Haia Pa ses Baixos GEN PROBE GEN PROBE e o design APTIMA DTS LEADER PROGENSA e SB100 s o marcas comerciais da Gen Probe Incorporated eppendorf estilizado e REPEATER s o marcas comerciais da Eppendorf AG RAININ uma marca comercial da Rainin Instrument LLC TECAN e FREEDOM EVO s o marcas comerciais da Tecan Group AG Qualquer outra marca que apare a neste documento pertence ao respectivo propriet rio 02006 2013 Gen Probe Incorporated 501377PT Rev D 2013 02 Ensaio PROGENSA PCA3 40 501377PT Rev D
45. manual de resultados Fora de intervalo Inv lid Testar PSA de novo consulte Realiza o baixo aaea Sim de novo teste e fa a a correspond ncia g A B E H ou I manual de resultados Inv lida Dentro do intervalo TESANPGAS denovo Consule a b e h ou i sem c digo se Sim Realiza o de novo teste e correspond ncia manual de resultados 1 Corresponder manualmente para obter lt PCAS Score calculado OU 2 Dilua o esp cimen em diluente de lt PCAS Score esp cimen consulte Dilui o de F calculado espec menes fora do intervalo alto volte F a testar o PSA e fa a a correspond ncia manual dos resultados se for necess rio um PCA3 Score Fora de intervalo Dentro do intervalo alto sem c digo Opcional 1 Corresponder manualmente para obter gt PCA3 Score calculado OU Dentro do intervalo gt PCAS Score 2 Dilua o esp cimen em diluente de sem c digo calculado esp cimen volte a testar o PCA3 e fa a a correspond ncia manual dos resultados se for necess rio um PCAS Score Fora de intervalo alto Opcional Ensaio PROGENSA PCA3 30 501377PT Rev D Interpreta o dos resultados Tabela 4 Condi es do resumo de excep es do ensaio PROGENSA PCAS continua o Fora de intervalo baixo 9 Fora de intervalo Fora de intervalo baixo alto 9 F Consulte o Manual do Operador do software do Ensaio PROGENSA PCA3 para obter uma lista completa do
46. mita que a press o do v cuo seja equalizada Liberte as uni es de desconex o r pida entre o frasco de res duos e o frasco de recolha de l quido excedent rio e o frasco de res duos e o distribuidor de aspira o Remova o frasco de res duos do compartimento de apreens o de v cuo Remova a tampa e adicione cuidadosamente 400 ml de solu o de hipoclorito de s dio a 5 at 7 0 7 M a 1 0 M ao frasco de res duos de 4 1 Nota Isto pode ser feito numa camp nula estufa de isolamento de vapores para evitar a liberta o de vapores no laborat rio Tape o frasco de res duos e fa a girar suavemente o conte do at que se misture completamente Deixe o frasco de res duos repousar durante pelo menos 15 minutos e depois descarte o conte do res duos Enxag e o frasco de res duos com gua para remover quaisquer res duos remanescentes no seu interior Tape o frasco de res duos vazio e coloque o no compartimento de apreens o de v cuo Aplique as uni es de desconex o r pida unidade TCS Descarte cuidadosamente ambas as luvas 4 Unidade TCS Limpe as superf cies da unidade TCS o distribuidor de aspira o e as pontas de ejec o do tamp o de lavagem com toalhetes de papel humedecidos com solu o de hipoclorito de s dio de 2 5 a 3 5 0 35 M a 0 5 M Siga o passo da solu o de hipoclorito de s dio fazendo uma limpeza com gua e em seguida seque totalmente as superf cies com toalhetes de papel
47. mostra a precis o de repetibilidade do ensaio PROGENSA PCA3 a diferentes n veis de concentra o de teste Tabela 10 Repetibilidade do ensaio PROGENSA PCAS Analito Painel M dia Repetibilidade Repetibilidade Membro c ml DP CV 1 1228 145 12 PCA3 2 12 020 809 7 3 61 108 2489 4 1 48 091 3715 8 PSA 2 484 457 41 026 8 3 2 001 430 131 554 7 Para a reprodutibilidade foi preparado um painel de teste de 8 membros constitu do por espec menes agrupados 1 a 3 e transcrito de RNA dilu do in vitro 4 a 8 Tr s operadores testaram o painel em 18 processamentos durante 3 dias utilizando um nico lote de calibradores e controlo 3 lotes de reagente e 3 conjuntos de equipamento As Tabelas 11 e 12 resumem a precis o do processamento total do intra processamento e do inter processamento do operador do equipamento e do lote relativamente ao ensaio PROGENSA PCA3 para c ml de analito e para o PCA3 Score As variabilidades intra processamento inter operador e inter processamento foram por ordem decrescente os maiores contribuintes para a varia o total do ensaio O lote de reagentes e o equipamento demonstraram ter uma reduzida contribui o para a varia o total do ensaio Estes resultados demonstraram que o ensaio PROGENSA PCA3 apresenta reprodutibilidade e que a fonte principal de varia o o erro aleat rio intra processamento Ensaio PROGENSA PCA3 38 501377PT Rev D Caracter sticas do des
48. n o retorna a solu o temperatura ambiente aque a a 62 C 1 C durante 1 ou 2 minutos na rea de pr amplifica o Se o reagente de sonda reconstitu do contiver precipitado que n o retorna a solu o temperatura ambiente aque a a 62 C 1 C durante 1 ou 2 minutos na rea de p s amplifica o Ap s estes passos de aquecimento os reagentes reconstitu dos podem ser usados mesmo que se mantenha precipitado residual Ap s ressuspens o misture os frascos invertendo suavemente C Configura o do suporte O pipetador de repeti o utilizado na captura do alvo transfer ncia de espec menes e amplifica o deve ser dedicado apenas a estes passos consulte Advert ncias e precau es 1 Configure um suporte para o analito PCA3 e outro para o analito PSA Nota Se o n mero de espec menes for suficientemente baixo ambos os analitos podem ser testados num nico suporte Se utilizar o instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 devem ser mantidos suportes separados para cada analito N o podem ser testados em simult neo mais de dois suportes cheios com 20 TTU 2 Nos suportes de unidades de dez tubos TTU coloque TTUs suficientes para acomodar os calibradores controlos e espec menes para cada analito 3 Etiquete os TTU com a ID da amostra espec menes A Tabela 3 descreve a adi o dos calibradores controlos e espec menes Inicie os calibradores de PSA numa nova TTU Nota Os calibradores devem ser test
49. ntes da dilui o do mesmo Uma dilui o recomendada mas n o obrigat ria 1 10 utilizando o kit de diluente de esp cimen PROGENSA PCAS Adicione 1800 ul de diluente de esp cimen e 200 ul de esp cimen a um frasco adequado tape o tubo e inverta cinco vezes para misturar totalmente O factor de dilui o ser de 10 na lista de trabalho de processamentos Se ambos os analitos forem testados novamente duplique os volumes use 3600 ul de diluente de esp cimen e 400 ul de esp cimen Consulte o folheto da embalagem do kit de diluente de esp cimen PROGENSA PCAS Teste o esp cimen dilu do com o ensaio c Se ap s novo teste o resultado do esp cimen for novamente fora do intervalo alto necess ria outra dilui o at o resultado do esp cimen ficar interpolado dentro do intervalo dos calibradores permitida outra dilui o da dilui o inicial de 1 10 desde que a dilui o inicial 1 10 tenha sido armazenada adequadamente consulte Colheita transporte e armazenamento de espec menes para mais informa es Ensaio PROGENSA PCA3 32 501377PT Rev D Limita es A O ensaio PROGENSA PCA3 n o deve ser usado em pacientes que tomam medica o que afecta os n veis de PSA no soro tal como a finasterida Proscar Propecia dutasterida Avodart e a terapia de antiandrog nios Lupron O efeito destes medicamentos sobre a express o do gene PCA3 ainda n o foi avaliado B Determinados procedimentos terap uticos
50. o benigno adjacente 2 Ao contr rio a express o do gene do PSA semelhante nas c lulas cancer genas e benignas da pr stata logo os n veis de RNA do PSA podem ser usados para normaliza o relativamente quantidade de cido ribonucleico RNA espec fico da pr stata em amostras de testes moleculares Ficou demonstrada a viabilidade de testes quantitativos moleculares baseados no PCAS3 a partir de sedimento de urina 2 e de urina total 3 O ensaio PROGENSA PCAS utiliza urina total recolhida ap s exame de toque rectal TR com tr s passagens por lobo O TR faz libertar c lulas da pr stata atrav s do sistema de ducto da pr stata para o tracto urin rio onde podem ser recolhidas na primeira urina A urina processada atrav s da adi o de um meio de transporte da urina que faz a lise das c lulas e estabiliza o RNA O RNA do PCA3 e o RNA do PSA s o quantificados e o PCAS3 Score determinado com base na rela o entre o RNA do PCAS PSA Para al m da normaliza o do sinal de PCA3 a medi o do RNA do PSA serve tamb m para confirmar que o produto de RNA espec fico da pr stata suficiente para gerar um resultado v lido PCA3 Scores mais elevados est o relacionados com uma maior probabilidade de biopsia positiva da pr stata Princ pios do procedimento O ensaio PROGENSA PCAS3 constitu do por dois testes quantitativos de amplifica o de cido nucleico O ensaio PROGENSA PCA3 combina as tecnologias de captu
51. o contr rio o esp cimen tem de ser rejeitado e tem de ser colhido um novo esp cimen N o congele espec menes de urina n o processados Ensaio PROGENSA PCA3 15 501377PT Rev D Colheita transporte e armazenamento de espec menes 5 Para processar os espec menes de urina tape bem e inverta cinco vezes os espec menes de urina para ressuspender as c lulas Retire a tampa do tubo de transporte de esp cimen de urina e transfira 2 5 ml da urina recolhida para dentro do tubo usando a pipeta de transfer ncia descart vel fornecida O volume correcto de urina foi adicionado quando o n vel de fluido est entre as linhas de enchimento pretas da etiqueta do tubo de transporte de esp cimen de urina 6 Volte a fechar bem o tubo de transporte de esp cimen de urina e inverta o esp cimen de urina cinco vezes para mistur lo Este conhecido agora como esp cimen de urina processado B Transporte e armazenamento de espec menes antes do teste 1 Os espec menes de urina processados t m de ser transportados para o laborat rio no tubo de transporte de esp cimen de urina Podem ser enviados em condi es ambientais sem controlo de temperatura ou congelados Devem ser efectuados preparativos de expedi o de modo a assegurar que os espec menes s o recebidos no laborat rio de an lise nos 5 dias posteriores colheita Ap s a recep o dos espec menes enviados o laborat rio deve verificar a data de colheita do esp cimen n
52. o existiu efeito significativo da matriz de dilui o Consulte Figura 4 Analito PCA3 Analito PSA 1 4E 05 mMM 3 0E 06 y 0 9932x 613 87 y 1 0875x 27 939 1 2E 05 R 0 9998 2 5E 06 R 0 9991 1 0E 05 4 o k e 5 N c o q lt 5 a E o 8 0E 04 J 6 0E 04 4 0E 04 O Diluente de esp cimen X O Diluente de esp cimen 2 0E 06 1 5E 06 1 0E 06 i y 0 9663x 27 393 9 0E 03 R 0 9973 c ml PSA Mensurado y 0 9523x 79 762 2 0E 04 R 0 9999 A Urina A Urina 0 0E 00 4 0 0E 00 0 0E 00 5 0E 05 1 0E 06 1 5E 06 2 0E 06 2 5E 06 3 0E 06 0 0E 00 3 0E 04 6 0E 04 9 0E 04 1 2E 05 c ml PCA3 Esperado c ml PSA Esperado Figura 4 Linearidade do ensaio PROGENSA PCA3 para analitos PCA3 e PSA 5 Precis o A precis o do ensaio PROGENSA PCA3 foi avaliada de acordo com o documento EP5 A2 do Instituto CLSI 2004 9 A repetibilidade a precis o em condi es de variabilidade m nima e a reprodutibilidade precis o em condi es de variabilidade m xima Para a repetibilidade foi preparado um painel de teste de 3 membros constitu do por transcrito de RNA dilu do in vitro Um operador num local testou o painel em Ensaio PROGENSA PCA3 37 501377PT Rev D Caracter sticas do desempenho 20 processamentos de 5 replicados durante 20 dias utilizando um nico lote de calibrador e controlo um lote de reagente e um conjunto de equipamento A Tabela 10
53. o ou no Resumo de excep es do relat rio de teste em bruto Ensaio PROGENSA PCA3 28 501377PT Rev D Interpreta o dos resultados 2 Correspond ncia manual Quando os analitos de PCAS e PSA s o testados em testes diferentes o software n o consegue determinar automaticamente o PCA3 Score A correspond ncia manual dos resultados do analito necess ria para determinar o PCA3 Score ou o intervalo do PCA3 Score consulte o Guia de refer ncia r pida ou o Manual do operador do software do ensaio PROGENSA PCA3 A correspond ncia manual pode ser necess ria tamb m para resultados que s o indicados no resumo de excep es do relat rio de teste em bruto Ap s a correspond ncia manual os PCA3 Scores para os espec menes de correspond ncia ser o indicados num novo relat rio de r cio C Interpreta o de resultados 1 PCA3 Score Nota S o comunicados apenas os PCA3 Scores e intervalos de PCA3 Scores indicados no relat rio de r cio Os resultados que aparecem no resumo de excep es podem requerer ac o adicional e n o s o comunicados O PCA3 Score calculado como o r cio de c pias de RNA de PCAS para c pias de RNA de PSA multiplicado por 1000 Os PCA3 Scores s podem ser calculados utilizando resultados de processamentos e espec menes v lidos Os processamentos e espec menes inv lidos devem ser testados novamente para esse analito consulte Realiza o de novo teste para mais informa es Se o PCA
54. o tubo Se o esp cimen tiver sido enviado em condi es ambientais e tiver sido recebido mais do que 5 dias ap s a colheita este deve ser rejeitado e deve ser feito um pedido de um novo esp cimen O laborat rio pode guardar os espec menes entre 2 Ce 8 C at 14 dias antes de ser necess ria a sua elimina o Se forem necess rios per odos de tempo mais prolongados consulte a Tabela 2 para saber quais os tempos de armazenamento permitidos a temperaturas diferentes Tabela 2 Dura es de armazenamento do esp cimen de urina processado Temperatura de armazenamento Tempo Armazenamento e transporte de espec menes processados At 5 dias Ap s recep o no laborat rio de an lises 2 Cas C At 14 dias 35 Ca 15 C At 11 meses A temperatura igual ou inferior a 65 C At 36 meses Tempo permitido para envio de espec menes em condi es ambientais ou congelados Tempo permitido para armazenamento em refrigera o 2 Os espec menes de urina processados podem ser submetidos a at cinco ciclos de congela o descongela o C Conserva o de espec menes ap s o teste 1 Os espec menes que tenham sido analisados devem ser conservados na vertical num suporte 2 Os tubos de transporte do esp cimen de urina se n o forem tapados novamente com uma tampa intacta devem ser cobertos por uma nova barreira limpa de pl stico ou folha metalizada 3 Se os espec menes analisados tiv
55. or vort x Um procedimento de mistura no misturador v rtex adequado importante para um desempenho bem sucedido do ensaio PROGENSA PCAS Para misturar as reac es no misturador v rtex defina a velocidade do misturador v rtex multitubos para a posi o mais baixa fixe o suporte e ligue a corrente el ctrica Aumente a velocidade lentamente at o l quido ir at metade do tubo Sujeite ao misturador v rtex durante 10 segundos durante o tempo indicado ou at a cor ficar uniforme Rode a velocidade para a defini o mais baixa antes de desligar o misturador v rtex de multitubos e remover o suporte As misturas de reac o n o devem nunca tocar nos cart es de selagem G Banhos de gua 1 O n vel de gua nos banhos de gua deve ser mantido entre 3 8 e 5 0 cm 1 5 a 2 0 pol de profundidade conforme medido desde o tabuleiro met lico de suporte no fundo do banho de gua at superf cie da gua Assim ficar assegurada uma transfer ncia de calor adequada 2 Para evitar contamina o cruzada os banhos de gua devem ser dedicados para um passo espec fico do ensaio H Descontamina o 1 Superf cies e pipetadores As superf cies das bancadas de laborat rio e os pipetadores t m de ser descontaminados regularmente com solu o de hipoclorito de s dio de 2 5 a 3 5 0 35 M a 0 5 M Deixe a solu o de hipoclorito de s dio entrar em contacto com as superf cies durante pelo menos 1 minuto e depois enxag e
56. ou i P m espec menes fora do intervalo alto teste F novamente ambos os analitos Fora de intervalo is Dilua o esp cimen em diluente de Inv lida Ra alto ABEH Sim esp cimen teste novamente ambos os f A B E H ou 1 analitos Fora de intervalo Fora de intervalo Dilua o esp cimen em diluente de alto alto Sim esp cimen teste novamente ambos os f F analitos n Fora de intervalo A amostra n o tem RNA suficiente para uma Inv lida A i b houi baixo N o an lise precisa Deve ser colhido um novo ae Buer Rou i G esp cimen do paciente Dentro do interval Fora de intervalo A amostra n o tem RNA suficiente para uma n We ao baixo N o an lise precisa Deve ser colhido um novo isemcoel o G esp cimen do paciente Fora de intervalo Fora de intervalo A amostra n o tem RNA suficiente para uma alto baixo N o an lise precisa Deve ser colhido um novo f G esp cimen do paciente Fora de intervalo Fora de intervalo A amostra n o tem RNA suficiente para uma baixo baixo N o an lise precisa Deve ser colhido um novo g G esp cimen do paciente Consulte o Manual do Operador do software do Ensaio PROGENSA PCA3 para obter uma lista completa dos c digos de an lise Aplica se apenas a espec menes inv lidos num processamento v lido Se os espec menes eram inv lidos porque o processamento foi inv lido os resultados ser o indicados no resumo de excep es consulte Interpretar os
57. pientes abertos Se as luvas entrarem em contacto com o esp cimen troque as luvas para evitar contamina o cruzada Relacionados com o ensaio O N o utilize o kit ap s o prazo de validade P Para o kit de ensaio PROGENSA PCAS n o permute misture ou combine reagentes do ensaio PCA3 com diferentes n meros de lote ou seja para cada analito os reagentes do ensaio na caixa refrigerada e na caixa temperatura ambiente t m de pertencer ao mesmo lote Os reagentes do ensaio podem ser utilizados com lotes diferentes de kits de calibradores e controlos Os kits de fluidos do ensaio APTIMA s o permut veis Os kits de reagentes PCA3 e PSA n o necessitam de corresponder uns aos outros em termos de lote Q Armazene todos os reagentes de ensaio s temperaturas indicadas O desempenho do ensaio pode ser afectado pela utiliza o de reagentes conservados de forma incorrecta Consulte Requisitos de armazenamento e manuseamento dos reagentes e Notas sobre o procedimento para obter instru es espec ficas R Para desactiva o do ensaio consulte Procedimento de teste a concentra o m nima da solu o de hipoclorito de s dio tem de ser 2 5 0 35 M ap s dilui o de 1 1 com tamp o de desactiva o Por conseguinte a solu o de hipoclorito de s dio inicial tem de ser de 5 a 7 0 7 M a 1 0 M para obter a concentra o final necess ria para a desactiva o S Tem de utilizar pontas com encaixes hidrof
58. ra do alvo Target Capture amplifica o mediada pela transcri o TMA Transcription Mediated Amplification e ensaio de protec o de hibrida o HPA Hybridization Ensaio PROGENSA PCA3 2 501377PT Rev D Informa es gerais Protection Assay para respectivamente optimizar o processamento do esp cimen de urina amplificar o RNA alvo e detectar o amplicon Quando o ensaio PROGENSA PCA3 realizado em laborat rio as mol culas do RNA alvo s o isoladas dos espec menes de urina por captura do alvo Os oligonucle tidos oligonucle tidos de captura complementares a regi es espec ficas da sequ ncia dos alvos s o hibridados conforme os alvos no esp cimen de urina Para cada alvo utilizado um oligonucle tido de captura separado O alvo hibridado ent o capturado para micropart culas magn ticas que s o separadas do esp cimen de urina num campo magn tico Os passos de lavagem s o utilizados para remover componentes secund rios do tubo de reac o Os passos de separa o magn tica e lavagem s o realizados com um sistema de captura do alvo A amplifica o de alvo ocorre atrav s de TMA que um m todo de amplifica o de cido nucleico baseado em transcri o que utiliza duas enzimas a transcriptase reversa do v rus da leucemia mur nica de Moloney MMLV e a polimerase do RNA T7 Para cada alvo utilizado um conjunto nico de elementos de prepara o A transcriptase reversa utilizada p
59. relat rio cont m descri es dos c digos de estado e an lise que aparecem nesse relat rio Por exemplo os c digos poder o indicar se um resultado de esp cimen ou replicado v lido ou est fora do intervalo Consulte o Guia de refer ncia r pida ou o Manual do operador do software do ensaio PROGENSA PCA3 para uma lista completa dos c digos de estado e an lise e mais informa es Se for apresentado um PCA3 Score no relat rio de r cio e n o aparecer nenhum c digo de estado ou an lise nas colunas Status Estado de PCA3 ou PSA isto indica que ambos os analitos tiveram resultados v lidos e dentro do intervalo O resultado do esp cimen pode ser apresentado e n o s o necess rias outras ac es Ensaio PROGENSA PCA3 29 501377PT Rev D Interpreta o dos resultados Se aparecer um c digo de estado ou an lise no relat rio resumido de excep es ou no relat rio de r cio poder ser necess rio um novo teste consulte Interpretar os resultados no resumo de excep es e Interpretar resultados no relat rio de r cio Se os resultados de analito forem provenientes de testes separados e possu rem um ns c digo s de an lise procure a combina o para ambos os analitos na Tabela 4 ou Tabela 5 para determinar se s o necess rias outras ac es Nota A presen a de um c digo de estado ou an lise n o significa automaticamente que necess rio um novo teste 3 Interpretar os resultados no resumo de excep
60. rina processada Foram incubados doze espec menes a 4 C ou 30 C durante um per odo de 38 dias A 4 C o RNA de PCA3 e PSA manteve se est vel durante 21 dias a 30 C durante 5 dias Os espec menes armazenados a 20 C e 70 C demonstraram estabilidade do RNA do PCA3 e PSA durante um per odo de 90 dias c Estabilidade na congela o descongela o Os espec menes foram submetidos 6 vezes a ciclos entre 37 C e 70 C N o foi observada qualquer diminui o dos n veis de c pia do RNA do PCAS ou PSA B Resultados anal ticos 1 Sensibilidade anal tica Foi utilizado um painel de sensibilidade anal tica constitu do por transcrito do RNA in vitro dilu do para avaliar a sensibilidade do ensaio Um operador testou o painel em doze processamentos de cinco replicados utilizando um nico lote de reagente O limite de detec o e o limite de quantifica o foram calculados de acordo com o documento EP17 A do Instituto CLSI 2004 5 O limite de detec o do analito do PCAS foi 80 c ml e para o analito do PSA foi de 1438 c ml O limite de quantifica o de ambos os analitos foi o Calibrador 2 2 Especificidade anal tica a Transcrito dividido O ensaio PROGENSA PCA3 foi concebido para detectar apenas o RNA do PCAS unido ex o 3 ex o 4 espec fico do cancro da pr stata 2 O ensaio n o detectou 1 milh o c ml de RNA do PCA3 dividido significativamente acima do n vel basal b Especificidade para a pr stata do R
61. s c digos de an lise Aplica se apenas a espec menes inv lidos num processamento v lido Para valores fora do intervalo o PCA3 Score calculado determinado utilizando o n vel de c pia para o calibrador positivo mais pr ximo Dentro do intervalo lt PCAS Score N Corresponder manualmente para obter sem c digo calculado ao lt PCAS Score calculado lt PCAS Score N Corresponder manualmente para obter calculado ao lt PCAS Score calculado 4 Interpretar resultados no relat rio de r cio Se um esp cimen for indicado no relat rio de r cio com um PCAS Score o resultado um PCA3 Score comunic vel n o sendo necess rias quaisquer outras ac es Se n o for indicado um PCA3 Score expresso como na coluna de PCAS Score consulte a Tabela 5 para obter instru es Tabela 5 Condi es de relat rio de r cio do ensaio PROGENSA PCA3 Resultado PCA3 Resultado PSA PCA3 Score Outro C digo de C digo de i Ac o coment rio Ph e li an lise an lise sado teste Dentro do intervalo Dentro do intervalo PCA3 Score N o Mais nenhuma ac o o resultado pode ser sem c digo sem c digo apresentado Inv lida Inv lida 7 Sim Teste novamente ambos os analitos a b e h ou i A B E H ou I consulte Realiza o de novo teste F iadeiinterval Dilua o esp cimen em diluente de Inv lida RSE it ear n si esp cimen consulte Dilui o de a b e h
62. ste D Verifica o da informa o de concentra o Verifique junto do administrador do sistema do software para o ensaio PROGENSA PCAS se foi introduzida a informa o sobre concentra o para os lotes de kits de calibradores e controlos PROGENSA PCA3 e PSA testados Para mais informa es consulte o Guia de refer ncia r pida para o ensaio PROGENSA PCA3 Guia de refer ncia r pida ou o Manual do administrador do sistema do software para o ensaio PROGENSA PCAS Nota A introdu o da informa o sobre concentra o necess ria antes da primeira utiliza o de cada novo lote de kit de calibradores e controlos Os testes seguintes que utilizarem calibradores e controlos do mesmo lote de kit n o necessitam que seja realizada qualquer outra ac o E Configura o do Worklist Editor Gere uma lista de trabalho de processamento de ensaio utilizando o GEN PROBE Worklist Editor num computador localizado na rea de pr amplifica o Para utilizar o Worklist Editor consulte o Guia de refer ncia r pida ou o Manual do operador do GEN PROBE Worklist Editor Se utilizar o instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 consulte tamb m a Ficha de aplica es do TECAN Freedom EVO para mais instru es F Prepara o de Amostra 1 Deixe que os calibradores e controlos alcancem a temperatura ambiente antes do teste Misture os frascos por meio de invers o suave 2 Deixe que os espec menes alcancem a temperatura ambiente antes do
63. teste N o agite os espec menes no misturador v rtex Os espec menes dever o ser misturados por invers o suave e ocasional durante o per odo de aquecimento Consulte as Notas sobre o procedimento para obter informa es sobre o precipitado que n o voltar para a solu o e sobre o manuseamento de espec menes congelados G Pr amplifica o O ambiente de pr amplifica o deve estar entre os 15 C e os 30 C Teste ambos os suportes em paralelo Se utilizar o SB100 Banho de calor seco misturador vort x Ensaio PROGENSA PCA3 19 501377PT Rev D Procedimento de teste consulte a Ficha de aplica es SB100 Se utilizar o instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 consulte tamb m a Ficha de aplica es do TECAN Freedom EVO para mais instru es 1 Misture bem por agita o ou invers o o reagente de captura do alvo TCR Utilizando o pipetador de repeti o adicione 100 ul de TCR espec fico de analito ao tubo de reac o adequado 2 Perfure a tampa do frasco de calibrador com o micropipetador e adicione 400 ul do calibrador ao tubo de reac o etiquetado correctamente Utilizando a mesma ponta de pipeta retire adi es de replicado do frasco atrav s da tampa perfurada Utilize novas pontas de pipeta para cada frasco de calibrador Repita para a adi o de controlos e espec menes Cubra e guarde qualquer resto de esp cimen e armazene o a uma temperatura igual ou inferior a 8 C consulte Colheita transporte
64. ura ambiente n o seja superior a 24 horas B N o armazene o reagente de captura do alvo a temperaturas abaixo dos 15 C C O Reagente de Sonda e o Reagente de Sonda Reconstitu do s o fotossens veis Proteja estes reagentes de exposi o prolongada luz durante o armazenamento e prepara o para utiliza o D N o congele os reagentes E N o utilize reagentes ou fluidos ap s a data de validade F Os calibradores e controlos PROGENSA PCA3 e PSA s o frascos de processamento nico e devem ser eliminados ap s utiliza o G Altera es no aspecto f sico do reagente fornecido poder ser indica o de instabilidade ou deteriora o destes materiais Se forem observadas altera es no aspecto f sico dos reagentes quando estes estiverem em ressuspens o por exemplo altera es bvias na cor do reagente ou turva o indicativas de contamina o microbiana contacte o Suporte T cnico da Gen Probe antes de utilizar H Elimine o reagente reconstitu do ap s 30 dias ou na data de validade a situa o que ocorrer primeiro Os agentes residuais abertos ou reconstitu dos podem ser usados em ensaios seguintes caso tenham sido armazenados adequadamente ap s a utiliza o inicial O reagente residual pode ser associado a reagente preparado de fresco ou outro reagente residual do mesmo lote N o troque n o misture nem combine reagentes Ensaio PROGENSA PCA3 13 501377PT Rev D Requisitos de armazenamento e
65. ure os frascos atrav s de invers o suave assim que o gelo dentro do frasco esteja suficientemente descongelado para se soltar e poder mover se livremente Continue a aquecer at o esp cimen estar completamente descongelado e misture novamente os frascos atrav s de invers o suave a Se se formar um tamp o e se os espec menes forem pipetados com o instrumento TECAN Freedom EVO 100 4 congele novamente o esp cimen repita as instru es de descongela o e assegure se de que n o se formam tamp es Se for incapaz de eliminar o tamp o o esp cimen deve ser pipetado manualmente b Se se formar um tamp o e os espec menes forem pipetados manualmente com um micro pipetador n o s o necess rias mais medidas mas assegure se de que o tamp o n o impede a distribui o do esp cimen B Pipetagem de controlos calibradores e espec menes 1 2 O volume de calibrador controlo ou esp cimen adicionado TTU dever ser de 400 ul Recomenda se a inspec o visual do volume pipetado para a TTU para assegurar uma transfer ncia adequada do volume E necess rio um volume adequado para fornecer resultados exactos Assegure se de que a ponta da pipeta est correctamente encaixada no pipetador e verifique se a defini o do volume est correcta Recomenda se uma verifica o visual da defini o do volume no final de cada TTU de 10 em 10 tubos Liberte lentamente o mbolo da pipeta a uma velocidade est vel quando retirar a

Ensaio PROGENSA PCA3

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