Guía de referencia del kit MiSeqDx Universal 1.0 (15039610)
Contents
1. ndice 1 ndice 2 P5 P7 ndice1 ndice 2 P5 Hibridaci n de sondas de oligonucle tidos personalizados Extensi n y ligadura Adici n de ndices y adaptadores de secuenciaci n mediante PCR Amplic n final listo para secuenciaci n con MiSeqDx DOUu gt Descripci n general del proceso El proceso del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina se puede resumir en los siguientes pasos Creaci n de una hoja de muestras En primer lugar prepare una hoja de muestras que utilizar MiSeqDx para identificar cada muestra y su correspondiente ndice Para preparar la hoja de muestras utilice Gestor de la lista de trabajos de Illumina una aplicaci n basada en asistente para el registro del ID de la muestra los ndices y otros par metros A N de referencia 15036910 Rev A ESP aplicables a la placa de 96 pocillos La hoja de muestras tambi n se utiliza como gu a para configurar la placa durante el protocolo del kit pou Preparaci n de bibliotecas Prepare las bibliotecas con el protocolo que se detalla en esta gu a del usuario s 1 Secuenciaci n de muestras en MiSeqDx UOIS9N El kit MiSeqDx Universal debe secuenciarse en un sistema de secuenciaci n MiSeqDx con un experimento paired end de 150 ciclos Para obtener instrucciones sobre c mo realizar un experimento de secuenciaci n en MiSeqDx consulte la Gu a de referencia del instrumento MiSegDx N de referencia 15038353 ESP An lisis de datos y2. Cambie las puntas entre muestras Selle la placa CLP con un sello adhesivo para placas Agite la placa CLP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante dos minutos Incube a temperatura ambiente de 15 C a 30 C sin agitar durante 10 minutos Coloque la placa en un soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos o hasta que el sobrenadante desaparezca Con la placa CLP en el soporte magn tico y una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 100 ul extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante Cambie las puntas entre muestras Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 A 3 Hd ep ezaldwIM 12 13 14 15 16 17 18 NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas de nuevo en la placa deje reposar la placa sobre el soporte magn tico durante dos minutos y confirme que el sobrenadante haya desaparecido Con la placa CLP en el soporte magn tico lave las bolas con etanol al 80 reci n preparado tal y como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 200 ul de etanol al 80 reci n preparado en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas En este momento no debe resuspender las bolas b Incube la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de 30 segundos O hasta que el sobrenadante desaparezca c Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante Con la
3. obtener ayuda a la hora de elegir los ndices apropiados Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 21 xqb si ep sesan ap eloy e sap uoroejedaIJ c Manifest Manifiesto Especifique el nombre del archivo de manifiesto que contiene informaci n sobre las muestras del pocillo espec fico No incluya la extensi n del archivo como parte del nombre 2 Opcional Para registrar informaci n m s detallada sobre las muestras introduzca un nombre y una descripci n para la muestra 3 Opcional Para identificar controles en la placa seleccione Negative Negativo o Positive Positivo en el men desplegable Control Control 4 Vaya a la ficha Plate Graphic Gr fico de placa y utilice la opci n Copy to Clipboard Copiar al portapapeles o Print Imprimir para capturar una imagen de la placa de muestras Figura 4 Ficha Plate Graphic Gr fico de placa del Gestor de la lista de trabajos de Ilumina Ilumina Worklist Manager Please Enter Sample Information MSeqDx Universal Assay Pate indcates invalid samples Universal Assay T 2 3 4 5 6 7 8 g 10 11 12 ARRE RA AREAS e Ce Cs CSS RR RA ERE EDEDED EEE E EE CE zlee a Ge ee C Tabie ato Pite Gpe EEES ER RE RE E ERE RE E E AAAG cd EJE a a Ea GA GA A GA Ga a EEE CA ceca cc 5 Seleccione Finish Finalizar Producci n de muestras y representaci n de ndices Para el kit M
4. 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C Soporte magn tico Se precisa un soporte magn tico para una placa de 96 pocillos Se obtiene un mejor resultado cuando los imanes se encuentran en un lado del soporte y no en la parte inferior Pipetas de precisi n Se precisa un conjunto de pipetas de precisi n Se precisa un conjunto independiente en el rea de preamplificaci n Se precisa el uso de pipetas de precisi n para garantizar la administraci n precisa de reactivo y muestra Se pueden utilizar pipetas de un solo canal o multicanal si se calibran con frecuencia y ofrecen precisi n en el 5 de volumen indicado Consumibles Se precisan los consumibles siguientes Placas de PCR con faldones de 96 pocillos 0 2 ml polipropileno o equivalente NOTA Aseg rese de que la placa de 96 pocillos sea compatible con el soporte magn tico Placas de almacenamiento de 96 pocillos 0 8 ml placas MIDI Tubos c nicos 15 ml Tubos de microcentr fuga Eppendorf recomendados con cierre de rosca Gradillas de ocho tubos de PCR Recipiente de soluci n PVC sin ADNasa ARNasa cubeta Sello de pel cula de aluminio adhesiva Sello adhesivo para placas Puntas de pipeta resistentes a los aerosoles 1 2 N de referencia 15036910 Rev A ESP Prevenci n de contaminaci n de productos de PCR El proceso de PCR se suele utilizar en el laboratorio para amplificar secuencias de ADN espec ficas A menos que se siga una higiene de laboratorio adecuada los pr
5. 20 C durante cinco minutos 32 N de referencia 15036910 Rev A ESP 7 Deseche todo el flujo que contiene formamida recogido hasta este punto en un contenedor de residuos peligrosos adecuado y a continuaci n vuelva a montar la FPU Se puede volver a utilizar la misma placa MIDI para el resto del proceso de preamplificaci n 8 Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de tamp n de lavado universal en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas 9 Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x ga 20 C durante 10 minutos J NOTA Aseg rese de que se haya drenado todo el l quido tras el centrifugado Repita el centrifugado en caso necesario El tamp n de lavado residual puede inhibir las reacciones enzim ticas posteriores Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 3 3 Je6b1 uis sSOpnoajonuobBblo sp vols eu Extensi n ligadura de oligonucle tidos ligados Este proceso conecta los oligonucle tidos ascendentes y descendentes hibridados Una ADN polimerasa se extiende desde el oligonucle tido ascendente hasta la regi n objetivo Despu s se produce la ligadura del extremo 5 del oligonucle tido descendente mediante una ADN ligasa Esto conlleva la formaci n de productos que contienen las regiones de inter s objetivo flanqueadas por las secuencias necesarias para la amplificaci n Tiempo estimado Duraci n
6. maestra de PCR Polimerasa PCR p Cebadores de ndice NaOH Resultado Placa AMP Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 1 9 0 090 0 1d ep ofege n ap ony Preparaci n de la hoja de muestras de MiSeqDx 1 En la pantalla Welcome Bienvenida de Gestor de la lista de trabajos de Ilumina seleccione Create Worklist Crear lista de trabajo Se abre la pantalla Enter Run Parameters Introducir par metros del experimento Figura 2 Gestor de la lista de trabajos de Illumina pantalla Enter Run Parameters Introducir par metros del experimento Illumina Worklist Manager Please Enter Run Parameters 2 En el campo Test Type Tipo de prueba seleccione MiSeqDx Universal 3 En el campo Worklist Name Nombre de la lista de trabajo introduzca un nombre para la hoja de muestras Este campo es obligatorio Si se usa el ID alfanum rico del c digo de barras del cartucho de reactivo para el nombre de la hoja de muestras Software operativo de MiSeq MOS encontrar la hoja de muestras autom ticamente El ID del c digo de barras se encuentra en la etiqueta del cartucho de reactivo justo debajo del c digo de barras Si se asigna otro nombre a la hoja de muestras se puede usar el bot n Browse Examinar del Software operativo de MiSeq MOS para localizar la hoja de muestras correspondiente 4 Opcional Escriba una descripci n para identificar el experimento 2 O N de referencia 15036910 Rev A ESP 5 Aseg r
7. n de la caja 2 Componente Cantidad Contenido Almacenamiento Cartucho de 2 cartuchos Cartucho de un solo uso que Entre 25 C y 15 C reactivo de contiene reactivos para la MiSeqDx generaci n y secuenciaci n de grupos para su uso con MiSeqDx incluidos formamida 2 mercaptoetanol y DMSO lt 2 8 N de referencia 15036910 Rev A ESP Kit MiSeqDx Universal caja 3 Tabla 4 Reactivos de preamplificaci n de la caja 3A Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Tamp n de 1 botella Soluci n acuosa tamponada Entre 2 C y 8 C lavado que contiene sales 2 restrictivo mercaptoetanol y formamida Tamp n de 1 tubo 48ml Soluci n acuosa tamponada Entre 2 C y 8 C lavado universal que contiene sales Tabla 5 Reactivos de posamplificaci n de la caja 3B Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Bolas de Soluci n acuosa Entre 2 C y 8 C limpieza de tamponada que contiene PCR bolas paramagn ticas de fase s lida y polietilenglicol Lavado de 2 tubos 48ml Soluci n acuosa Entre 2 C y 8 C normalizaci n tamponada que contiene de bibliotecas sales 2 mercaptoetanol y formamida Bolas de 1 tubo 12ml1 Soluci n acuosa Entre 2 C y 8 C biblioteca tamponada que contiene bolas paramagn ticas de fase s lida Celda de flujo 2 contenedores 1celda Sustrato de cristal con Entre 2 C y 8 C MiSeqDx de flujo oligonucle tidos ligados de m
8. para la microcentr fuga Coloque los cebadores en una gradilla de acuerdo con la siguiente disposici n a Disponga los tubos de cebadores Cebadores de ndice A A501 H A508 tapones blancos y soluci n clara en posici n vertical alineados por filas de la Aa la H b Disponga los tubos de cebadores Cebadores de ndice 1 A701 12 A712 tapones naranjas y soluci n amarilla en posici n horizontal alineados por columnas de la 1 a la 12 Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 37 y Od Uoroeoyauuy Figura 6 Fijaci n de la placa de ndices A Cebadores de ndice A A501 H A508 tapones blancos B Cebadores de ndice 1 A701 12 A712 tapones naranjas C Placa AMP 6 Asigne la etiqueta AMP a una nueva placa de PCR de 96 pocillos 7 A ada cebadores de ndice a la placa AMP como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 4 ul de cebadores de ndice seleccionados A A501 H A508 soluci n clara al pocillo correspondiente en una columna de la placa AMP No es necesario cambiar las puntas entre columnas b Para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices deseche los tapones blancos originales y coloque tapones blancos nuevos c Con una pipeta multicanal a ada 4 ul de cebadores de ndice seleccionados 1 A701 12 A712 soluci n amarilla a la fila correspondiente de la placa AMP Se deben cambiar las puntas despu s de cada fila para evitar la contaminac
9. secuenciaci n automatizados MiSeq Reporter procesa las llamadas de bases que genera el sistema de secuenciaci n MiSeqDx Se trata de un software integrado en el instrumento que est incorporado en los procesos del instrumento Para obtener m s informaci n sobre este software consulte la Gu a del usuario del software de MiSeg Reporter N de referencia 15038356 ESP Herramientas de seguimiento Illumina proporciona las siguientes herramientas para la gu a y el seguimiento de muestras en el laboratorio Se puede utilizar el formulario de seguimiento de laboratorio para registrar informaci n como por ejemplo el nombre del operador la informaci n de la muestra y del ndice las horas de inicio y detenci n los n meros de los lotes de reactivos y los c digos de barras Gestor de la lista de trabajos de Illumina se utiliza para crear la hoja de muestras mediante una aplicaci n basada en asistente Gestor de la lista de trabajos de Illumina ofrece una funci n para el registro de par metros de la placa de muestras tales como el ID de la muestra los ndices dobles y otras caracter sticas aplicables al experimento Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 5 NOTA Puede descargar los documentos del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina anteriores en el sitio web de Illumina en http support illumina com Vaya a la p gina de asistencia t cnica del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina y haga clic en la ficha Docu
10. total 50 minutos Tiempo de participaci n activa 5 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Mezcla de extensi n 1 tubo Entre 25 C y 15 C ligadura Sello de pel cula de 1 sello Entre lo XE ONE aluminio adhesiva Cubetas Seg n sea Entre 15 C y 30 C necesario Procedimiento Suministrado por Ilumina Usuario Usuario 1 Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de mezcla de extensi n ligadura en cada pocillo de muestra de la placa del filtro La reacci n de extensi n ligadura se produce en la membrana de la placa del filtro Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas 34 N de referencia 15036910 Rev A ESP 2 Selle la placa del filtro con pel cula de aluminio adhesiva y a continuaci n c brala con la tapa para asegurar la pel cula durante la incubaci n 3 Incube todo el conjunto de la FPU en la incubadora precalentada a 37 C durante 45 minutos 4 Mientras la placa de la FPU se incuba prepare la placa AMP tal y como se describe en la secci n siguiente Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 3 5 soopeli sopnosjonuoblo sp enmpebl uosuajx3 Amplificaci n PCR En este paso los productos de extensi n ligadura se han amplificado con cebadores que a aden secuencias de ndice para el multiplexado de muestras as como los adaptadores comunes necesarios para la generaci n de grupos Tiempo estimado Duraci n
11. una amida alif tica que es una toxina reproductiva probable Evite su inhalaci n o ingesti n o el contacto con la piel o los ojos pues podr an producirse lesiones Deseche los contenedores y los contenidos no utilizados de acuerdo con las normativas de seguridad oficiales de su zona Para obtener informaci n adicional consulte la hoja de datos de seguridad de materiales de este kit en http www illumina com msds Tiempo estimado Duraci n total 20 minutos Tiempo de participaci n activa 20 minutos Consumibles Art culo Cantidad Mezcla de extensi n 1 tubo ligadura Tamp n de lavado 1 botella restrictivo Tamp n de lavado 1 tubo universal Placa del filtro 1 placa Collar adaptador 1 placa Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 Almacenamiento Entre 25 C y 15 C Entre eye e Entre 2 C y 8 C Entre SE 301G Entre 15 C y 30 C Suministrado por Ilumina Ilumina Ilumina Ilumina Ilumina 29 13 Ole uuu 4 uis sopnoajonuobo sp u Jebl Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Placa MIDI 1 placa Entrei CUE Usuario Cubetas Seg n sea Entre 15 C y 30 C Usuario necesario Preparaci n 1 Retire la mezcla de extensi n ligadura de su almacenamiento a una temperatura de entre 25 C y 15 C y descongele a temperatura ambiente Mezcla de extensi n ligadura se utiliza en el paso de extensi n ligadura y tarda aproximadamente 20 minutos
12. una cu a de sellado Centrifugue a 1000 x ga 20 C durante un minuto Coloque la placa HYB en el bloque precalentado a 95 C e inc bela durante un minuto Reduzca la temperatura del bloque precalentado a 40 C y s galo incubando hasta que el bloque caliente alcance los 40 C El tiempo de reducci n es de unos 80 minutos NOTA Durante la incubaci n la temperatura del bloque caliente desciende gradualmente de 95 C a 40 C Ese proceso suele demorarse unos 80 minutos Esta refrigeraci n gradual es fundamental para una correcta hibridaci n por lo tanto no se recomiendan los cicladores t rmicos para PCR con refrigeraci n activa por ejemplo efecto Peltier refrigeraci n termoel ctrica para este proceso PUNTO DE DETENCI N DE SEGURIDAD Cuando el bloque de calor alcanza 40 C la placa HYB permanece estable a 40 C durante dos horas 2 8 N de referencia 15036910 Rev A ESP Eliminaci n de oligonucle tidos sin ligar Este proceso elimina oligonucle tidos sin ligar del ADN gen mico con un filtro con capacidad de selecci n de tama o Dos pasos de lavado con el tamp n de lavado restrictivo garantizan una eliminaci n completa de los oligonucle tidos sin ligar Un tercer paso de lavado con el tamp n de lavado universal elimina el tamp n de lavado restrictivo residual y prepara las muestras para el paso de extensi n ligadura Y ADVERTENCIA Este grupo de reactivos contiene formamida
13. ACCCA TGTGACCA AGGGTCAA AGGAGTGG 20 xqb sIWN Sp sensenu ap eloy e ap uoloeseda ly Hibridaci n de grupo de oligonucle tidos En este paso el grupo de oligonucle tidos personalizados proporcionado por el usuario que contiene oligonucle tidos en secuencia arriba y abajo espec ficos de la regi n de inter s se hibrida en muestras de ADN gen mico Y ADVERTENCIA Este grupo de reactivos contiene formamida una amida alif tica que es una toxina reproductiva probable Evite su inhalaci n o ingesti n o el contacto con la piel o los ojos pues podr an producirse lesiones Deseche los contenedores y los contenidos no utilizados de acuerdo con las normativas de seguridad oficiales de su zona Para obtener informaci n adicional consulte la hoja de datos de seguridad de materiales de este kit en http www illumina com msds Tiempo estimado Duraci n total 1 hora 35 minutos Tiempo de participaci n activa 15 minutos Consumibles Art culo Cantidad Tamp n de hibridaci n 1 tubo Grupo de 5 ul por pocillo oligonucle tidos de muestra personalizados ADN gen mico se 5 ul recomienda 50 ng ul Placa de PCR con 1 placa faldones de 96 pocillos Sello de pel cula de 2 juntas aluminio adhesiva Cubetas est riles Seg n sea necesario 26 Almacenamiento Entre 15 C y 25 C Determinado por el usuario Entre 15 C y 25 C EntrelosCSS05 Entre 15 C y 30 C Entre os S05 Suministrad
14. Gu a de referencia del kit universal MiSeqDx 1 0 PARA USO DIAGN STICO IN VITRO Introducci n 3 Primeros pasos 7 Flujo de trabajo del protocolo 19 Preparaci n de la hoja de muestras de MiSeqDx 20 Hibridaci n de grupo de oligonucle tidos 26 Eliminaci n de oligonucle tidos sin ligar 29 Extensi n ligadura de oligonucle tidos ligados 34 Amplificaci n PCR 36 Limpieza de PCR 42 Normalizaci n de bibliotecas 46 Agrupaci n de bibliotecas 51 Novedades 57 Asistencia t cnica Ti Tem A A a sr A r A T ATE gt gt EO ra I PROPIEDAD DE ILLUMINA o o N de referencia 15036910 Rev A ESP l u m l n a Febrero de 2014 Este documento y su contenido son propiedad de Illumina Inc y sus afiliados Illumina y est n previstos solamente para el uso contractual de sus clientes en conexi n con el uso de los productos descritos en l y no para ning n otro fin Este documento y su contenido no se utilizar n ni distribuir n con ning n otro fin ni tampoco se comunicar n divulgar n ni reproducir n en ninguna otra forma sin el consentimiento previo por escrito de Illumina Illumina no transfiere mediante este documento ninguna licencia bajo sus derechos de patente marca comercial copyright ni derechos de autor ni similares derechos de terceros Para asegurar el uso correcto y seguro de los productos descritos en este documento personal cualificado y adecuadamente capacitado debe seguir las instrucciones
15. OTA Resulta muy importante resuspender completamente el pellet de las bolas de la biblioteca del fondo del tubo Si utiliza una P1000 se asegurar de que las bolas queden resuspendidas de manera homog nea y de que no quede masa de bolas en el fondo del tubo Esto resulta fundamental para lograr una densidad de grupos homog nea en la celda de flujo 3 Para 96 muestras pipetee 800 ul de bolas de biblioteca en el tubo que contiene diluyente de normalizaci n de bibliotecas D la vuelta al tubo entre 15 y 20 veces para mezclar bien el contenido 4 NOTA Para resuspender completamente las bolas en el paso 2 se precisa una pipeta P1000 con configuraci n de pipeteo a 1000 ul Mezcle solo las cantidades especificadas de diluyente de normalizaci n de bibliotecas y bolas de biblioteca Debe almacenar los restos de diluyente de normalizaci n de bibliotecas y bolas de biblioteca por separado a las temperaturas recomendadas respectivas Para preservar la estabilidad no se deben congelar las bolas de bolas de biblioteca ni mezclarlas con diluyente de normalizaci n de bibliotecas si no se van a utilizar de manera inmediata 4 Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de la soluci n de trabajo Diluyente de normalizaci n de bibliotecas bolas de biblioteca combinada en cada pocillo de la placa LNP que contiene bibliotecas Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas 5 Selle la placa LNP con u
16. _ Placa_ID a una nueva placa de PCR de 96 pocillos A ada 30 ul de tamp n de almacenamiento de biblioteca a cada pocillo que se debe utilizar en la placa SGP Tras la eluci n de cinco minutos aseg rese de que todas las muestras de la placa LNP est n resuspendidas por completo Si las muestras no est n completamente resuspendidas pipetee con cuidado las muestras arriba y abajo o golpee ligeramente la placa contra la mesa para resuspender las bolas y a continuaci n agite cinco minutos m s Coloque la placa LNP en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos Con una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 30 ul transfiera el sobrenadante de la placa LNP a la placa SGP Pipetee con cuidado arriba y abajo cinco veces para mezclar NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas de nuevo en la placa deje reposar la placa sobre el soporte magn tico durante dos minutos y confirme que el sobrenadante haya desaparecido Selle la placa SGP con un sello adhesivo para placas y a continuaci n centrifugue a 1000 x ga 20 C durante un minuto PUNTO DEDETENCI N DE SEGURIDAD Sino se procede de manera inmediata a la agrupaci n de bibliotecas y la consiguiente secuenciaci n en MiSeqDx almacene la placa SGP sellada a una temperatura de entre 25 C y 15 C hasta tres d as 50 N de referencia 15036910 Rev A ESP Agrupaci n de bibliotecas En la prepar
17. a de 96 pocillos sea compatible con el soporte magn tico Placas de almacenamiento de 96 pocillos 0 8 ml placas MIDI Recipiente de soluci n PVC sin ADNasa ARNasa cubeta Sello de pel cula de aluminio adhesiva Sello para placas de PCR adecuado Puntas de pipeta resistentes a los aerosoles Materiales y equipo de la posamplificaci n 1 Ciclador t rmico Se precisa un ciclador t rmico El ciclador t rmico debe tener una tapa caliente y cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Rango de control de temperatura Entre 4 C y 99 C Precisi n de control 0 25 C de 35 C a 99 C Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 1 1 Agitador de microplacas Se precisa un agitador de microplacas en el rea de posamplificaci n del laboratorio El agitador de placas debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Velocidad de mezcla m x 3000 rpm Rango de velocidad de mezcla De 200 a 3000 rpm Centr fuga de sobremesa Se precisa una centr fuga de sobremesa que pueda mantener 20 C Se precisa una centrifuga independiente en el rea de preamplificaci n Se admite cualquier centr fuga de placas que alcance las velocidades indicadas en el protocolo de 280 a 2400 x g Bloque de calor Se precisa un bloque de calor para tubos El bloque de calor debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Rango de temperatura Ambiente de 5 Ca 99 C Regulaci n de temperatura
18. aci n para la secuenciaci n y la generaci n de grupos se combinan vol menes iguales de bibliotecas normalizadas diluidas en tamp n de hibridaci n y desnaturalizadas mediante calor antes de su secuenciaci n en el instrumento MiSeqDx PhiX se utiliza como control interno para la secuenciaci n Tiempo estimado Duraci n total 10 minutos Tiempo de participaci n activa 10 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Tamp n de diluci n de 1 tubo Entre 25 C y 15 C Ilumina biblioteca Control interno PhiX de 2 ul Entre Oy loe Ilumina 10 nM NaOH 0 1 N reci n 1ml Entre 15 C y 30 C Usuario preparado 1 tamp n TE 8 ul Entre S05 Usuario Tubos Eppendorf se 2 tubos Entre 15 C y 30 C Usuario recomienda con tap n roscado Gradilla de ocho tubos 1 Entreis sE iS0NE Usuario de PCR Hielera de 2 5 1 1 Entre 15 C y 30 C Usuario Preparaci n para agrupaci n de bibliotecas 1 Caliente un bloque de calor apto para tubos de centr fuga de 1 5 ml a 96 C Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 5 sexa 01qiq ap vo oedn1by 2 En una hielera prepare un ba o de agua con hielo Enfr e el tamp n de diluci n de biblioteca en el ba o de agua con hielo 3 Empiece a descongelar el cartucho de reactivo de MiSeqDx Preparaci n de una diluci n nueva de NaOH x PRECAUCI N El uso de una soluci n nueva de NaOH diluida es esencial para desnaturalizar completamente las muestras para la
19. adaptador met lico se debe limpiar y guardar para su uso en el futuro Cubra la placa AMP con el sello para placas adecuado y aseg rela con un rodillo de goma Centrifugue a 1000 x ga 20 C durante un minuto Transfiera la placa AMP al rea de posamplificaci n Ejecute el proceso de PCR mediante el uso del siguiente programa en un ciclador t rmico 95 C durante 3 minutos 25 ciclos de 95 C durante 30 segundos 62 C durante 30 segundos 72 C durante 60 segundos 72 C durante 5 minutos Mantenga la temperatura a 10 C 40 N de referencia 15036910 Rev A ESP PUNTO DEDETENCI N DE SEGURIDAD Sino se procede de manera inmediata a la limpieza de PCR la placa AMP puede permanecer en el ciclador t rmico toda la noche o se puede almacenar a una temperatura de 2 C a 8 C hasta 48 horas Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 4 y Od Uoroeoyauuy Limpieza de PCR Este proceso utiliza las bolas de limpieza de PCR para purificar los productos de PCR de los dem s componentes de las reacciones Tiempo estimado Duraci n total 50 minutos Tiempo de participaci n activa 20 minutos Consumibles Art culo Tamp n de eluci n Bolas de limpieza de PCR Etanol al 80 reci n preparado Placas MIDI de 96 pocillos Sello adhesivo para placas Cubetas Preparaci n 4 NOTA Cantidad 1 tubo 400 ul por cada 8 muestras 5 ml por cada 8 muestras 2 Seg n sea necesario S
20. aild Tabla 11 Combinaciones de cebadores de ndice para experimentos de secuenciaci n de ocho muestras Cebador de ndice 1 A701 Cebador de ndice Muestra 1 C A503 Cebador de ndice Muestra 4 D A504 Cebador de ndice Cebador de ndice 2 A702 Muestra 2 Muestra 5 10 A710 Muestra 3 Muestra 6 Cebador de ndice Muestra 7 Muestra 8 E A505 Secuencias del cebador de ndice Tabla 12 Secuencias para cebadores de ndice A A501 H A508 Cebador de ndice Cebador de ndice A A501 Cebador de ndice B A502 Cebador de ndice C A503 Cebador de ndice D A504 Cebador de ndice E A505 Cebador de ndice F A506 Cebador de ndice G A507 Cebador de ndice H A508 24 Secuencia TGAACCTT TGCTAAGT TGTTCTCT TAAGACAC CTAATCGA CTAGAACA TAAGTTCC TAGACCTA N de referencia 15036910 Rev A ESP Tabla 13 Secuencias para cebadores de ndice 1 A701 12 A712 Cebador de ndice Cebador de ndice 1 A701 Cebador de ndice 2 A702 Cebador de ndice 3 A703 Cebador de ndice 4 A704 Cebador de ndice 5 A705 Cebador de ndice 6 A706 Cebador de ndice 7 A707 Cebador de ndice 8 A708 Cebador de ndice 9 A709 Cebador de ndice 10 A710 Cebador de ndice 11 A711 Cebador de ndice 12 A712 Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 Secuencia ATCACGAC ACAGTGGT CAGATCCA ACAAACGG ACCCAGCA AACCCCTC CCCAACCT CACCACAC GAA
21. anera covalente Kit MiSeqDx Universal caja 4 Tabla 6 Reactivos de posamplificaci n de la caja 4 Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Soluci n SBS de 2 botellas 353 1 ml Soluci n acuosa tamponada Entre 2 C y 8 C MiSeqDx PR2 Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 Q sosed soJ wld Kit MiSeqDx Universal caja 5 Tabla 7 Reactivos de preamplificaci n de la caja 5 Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Placa del filtro 2 placas N A Placa de microtitulaci n de Entre 15 C y 30 C polipropileno con una membrana de polietersulfona modificada Tabla 8 Reactivos de posamplificaci n de la caja 5 Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Tamp n de 1 tubo 48ml Soluci n acuosa tamponada Entre 15 C y 30 C eluci n Tamp n de 1 tubo 3 5 ml Soluci n acuosa tamponada Entre 15 C y 30 C almacenamiento de biblioteca Materiales y equipo Materiales y equipo suministrados vendidos por separado 1 Instrumento MiSeqDx n de cat logo DX 410 1001 2 Kit TruSeq Index Plate Fixture n de cat logo FC 130 1005 3 Kit TruSeq Index Plate Fixture amp Collar n de cat logo FC 130 1007 4 Tapones de recambio para el adaptador de ndices n de cat logo DX 502 1003 Materiales y equipo necesarios no suministrados Materiales y equipo de la preamplificaci n 1 Bloque de calor Se pr
22. antizar una representaci n de bibliotecas equitativa en la muestra agrupada Tiempo estimado Duraci n total 1 hora 20 minutos Tiempo de participaci n activa 30 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Diluyente de 1 tubo Entre 25 C y 15 C Ilumina normalizaci n de bibliotecas Bolas de biblioteca 1 tubo Entrena 556 Ilumina Lavado de 2 tubos Entre 2 C y 8 C Ilumina normalizaci n de bibliotecas Tamp n de 1 tubo Entre lb Cy 305 Ilumina almacenamiento de biblioteca NaOH 0 1 N reci n 2 ml por cada Entre 15 C y 30 C Usuario preparado 48 muestras Placa de PCR con 1 placa Entrels XE ONE Usuario faldones de 96 pocillos Tubo c nico de 15 ml 1 tubo Entre 15 C y 30 C Usuario Sello adhesivo para Seg n sea Entre CUE Usuario placas necesario 46 N de referencia 15036910 Rev A ESP ADVERTENCIA y Este grupo de reactivos contiene formamida una amida alif tica que es una toxina reproductiva probable Evite su inhalaci n o ingesti n o el contacto con la piel o los ojos pues podr an producirse lesiones Deseche los contenedores y los contenidos no utilizados de acuerdo con las normativas de seguridad oficiales de su zona Para obtener informaci n adicional consulte la hoja de datos de seguridad de materiales de este kit en http www illumina com msds Preparaci n 1 Prepare NaOH 0 1 N nuevo a adiendo 30 ul de NaOH 10 N a 2970 ul de agua est ril 2 Retir
23. ce B A502 Cebador de ndice 2 A702 Cebador de ndice 7 A707 Cebador de ndice C A503 Cebador de ndice 3 A703 Cebador de ndice 8 A708 Cebador de ndice D A504 Cebador de ndice 4 A704 Cebador de ndice 9 A709 Cebador de ndice E A505 Cebador de ndice 5 A705 Cebador de ndice 11 A711 Cebador de ndice F A506 Cebador de ndice 10 A710 Cebador de ndice 12 A712 Cebador de ndice G A507 Cebador de ndice H A508 Si la secuenciaci n es inferior a 48 muestras en un experimento de secuenciaci n seleccione los ndices apropiados de acuerdo con sus secuencias para mantener el equilibrio de color en los canales verde y rojo Consulte la Tabla 12 y la Tabla 13 Como m nimo los experimentos que emplean entre 8 y 48 muestras deben incluir las combinaciones de cebadores de ndice que se muestran en la Tabla 11 Para procesar con precisi n experimentos m s peque os como m nimo se debe disponer de ocho muestras Si no se dispone de seis muestras nicas excluidos los controles positivos y negativos se puede llenar el experimento con duplicados de muestras o de cualquier muestra de ADN gen mico humano Consulte la Tabla 11 para obtener informaci n sobre el conjunto m nimo de ndices con equilibrio de color que utilizar para los experimentos de secuenciaci n de ocho muestras Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 23 xqb si ep sesan ap eloy e sap u ppeJed
24. cu a de sellado Si no se alcanzan los 40 C en 80 minutos siga con la incubaci n hasta que el bloque de calor se haya enfriado hasta los 40 C Retire la placa HYB del bloque de calor y centrifugue a 1000 x g a 20 C durante un minuto para recoger la condensaci n Con una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 60 pl transfiera el volumen ntegro de cada muestra al centro de los pocillos de prelavado correspondientes de la placa del filtro Cambie las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x ga 20 C durante cinco minutos Lave la placa del filtro como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de tamp n de lavado restrictivo en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas b Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos Repita el lavado como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de tamp n de lavado restrictivo en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas b Cubra la placa del filtro con la tapa y centrifugue a 2400 x g a 20 C durante cinco minutos c Siel tamp n de lavado no se drena completamente vuelva a centrifugar la placa del filtro a 2400 x ga
25. e el diluyente de normalizaci n de bibliotecas de su almacenamiento a una temperatura de entre 25 C y 15 C y deje que alcance la temperatura ambiente Utilice un ba o de agua a una temperatura de entre 20 C y 25 C seg n sea necesario NOTA El diluyente de normalizaci n de bibliotecas puede formar precipitados o cristales visibles Antes de su uso agite con vigor y a continuaci n sujete el tubo delante de una luz e inspecci nelo visualmente para asegurarse de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo 3 Retire las bolas de biblioteca y el lavado de normalizaci n de bibliotecas de su almacenamiento a una temperatura de 2 C a 8 C y deje que alcancen la temperatura ambiente Utilice un ba o de agua a una temperatura de entre 20 C y 25 C seg n sea necesario 4 Agite las bolas de biblioteca con vigor durante un minuto invirti ndolo de manera intermitente hasta que las bolas se resuspendan y no quede pellet en el fondo del tubo cuando este se invierte Procedimiento 1 Para 96 muestras a ada 4 4 ml de diluyente de normalizaci n de bibliotecas en un tubo c nico nuevo de 15 ml Si se van a procesar menos de 24 muestras utilice un tubo nuevo de 1 5 ml Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 47 sexajol ala ap UVIDEZIELWION 2 Utilice una pipeta P1000 con configuraci n de pipeteo a 1000 ul para resuspender las bolas de biblioteca completamente pipeteando arriba y abajo 10 veces N
26. ecisa un bloque de calor para una placa de 96 pocillos El bloque de calor debe cumplir con las especificaciones de rendimiento 1 O N de referencia 15036910 Rev A ESP siguientes Los bloques de calor con tapas calientes se pueden utilizar Rango de temperatura Ambiente de 5 C a 99 C Regulaci n de temperatura 0 1 C a 37 C 0 4 C a 60 C 2 Incubadora de muestras Se precisa una incubadora horno de hibridaci n La incubadora debe cumplir con las especificaciones de rendimiento siguientes Rango de temperatura Entre 10 C y 100 C Regulaci n de temperatura 0 2 C 3 Centr fuga de sobremesa Se precisa una centr fuga de sobremesa que pueda mantener 20 C Se precisa una centrifuga independiente en el rea de posamplificaci n Se admite cualquier centr fuga de placas que alcance las velocidades indicadas en el protocolo de 280 a 2400 x g sosed soJeuulq 4 Pipetas de precisi n Se precisa un conjunto de pipetas de precisi n Se precisa un conjunto independiente en el rea de posamplificaci n Se precisa el uso de pipetas de precisi n para garantizar la administraci n precisa de reactivo y muestra Se pueden utilizar pipetas de un solo canal o multicanal si se calibran con frecuencia y ofrecen precisi n en el 5 de volumen indicado 5 Consumibles Se precisan los consumibles siguientes Placas de PCR con faldones de 96 pocillos 0 2 ml polipropileno o equivalente NOTA Aseg rese de que la plac
27. eg n sea necesario Almacenamiento Entre 15 C y 30 C Entre eyre Entre 15 C y 30 C Entre los 0E Entre 15 C y 30 C Entrellos SUE Suministrado por Ilumina Illumina Usuario Usuario Usuario Usuario Consulte la secci n Precauciones al inicio del presente protocolo en relaci n con la manipulaci n de bolas magn ticas y el lavado con etanol al 80 durante la limpieza de PCR 1 Deje que las bolas de limpieza de PCR alcancen la temperatura ambiente 42 N de referencia 15036910 Rev A ESP Prepare una soluci n nueva con etanol al 80 a partir de una soluci n de etanol absoluta NOTA Para el procedimiento de lavado prepare siempre una soluci n nueva con etanol al 80 El etanol puede absorber agua del aire y repercutir en los resultados Procedimiento 1 10 11 Centrifugue la placa AMP a 1000 x g a 20 C durante un minuto para recoger la condensaci n Asigne la etiqueta CLP_Plate_ID CLP_Placa_ID a una nueva placa MIDI Invierta las bolas de limpieza de PCR 10 veces Agite con vigor y a continuaci n vuelva a invertir 10 veces Inspeccione visualmente la soluci n para garantizar que las bolas est n bien resuspendidas Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de bolas de limpieza de PCR en cada pocillo de la placa CLP Con una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 60 ul transfiera todo el producto de PCR de la placa AMP a la placa CLP
28. en descongelarse 2 Retire el tamp n de lavado restrictivo y el tamp n de lavado universal de su almacenamiento a una temperatura de 2 C a 8 C y res rvelos a temperatura ambiente 3 Monte el conjunto de la unidad de la placa del filtro FPU en el orden siguiente desde la parte superior hasta la parte inferior 30 N de referencia 15036910 Rev A ESP Figura 5 Conjunto de la unidad de la placa del filtro A Tapa B Placa del filtro C Collar adaptador D Placa MIDI 4 Asigne la etiqueta FPU_Plate_ID FPU Placa ID a la placa del filtro El ID de la placa debe coincidir con el ID utilizado para la placa HYB 5 Realice un lavado previo a la membrana de la placa del filtro como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de tamp n de lavado restrictivo en cada pocillo b Cubra la placa FPU con la tapa de la placa del filtro y d jela cubierta durante cada paso del centrifugado c Centrifugue la FPU a 2400 x ga 20 C durante cinco minutos Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 31 Je61 uis sOproaj9nuoBo sp UVIDeeUIwWIIq NOTA Illumina recomienda encarecidamente disponer de placas del filtro de repuesto FC 130 1006 como suministros generales del laboratorio Procedimiento 1 Al finalizar la hibridaci n confirme que el bloque de calor se haya enfriado hasta los 40 C Mientras la placa HYB todav a est en el bloque de calor refuerce el sello con un rodillo de goma o una
29. enda encarecidamente la cuantificaci n del material gen mico de inicio Cuantificaci n de ADN de entrada Cuantifique el material gen mico de inicio con ayuda de m todos de espectrometr a UV basados en lecturas de densidad ptica A260 A280 Valoraci n de calidad de ADN Las mediciones de absorbancia a 260 nm se suelen utilizar para cuantificar el ADN El ndice de absorbancia entre 260 nm y 280 nm se utiliza como indicador de la pureza de una muestra Este protocolo est optimizado para un ADN con unos valores de ndice de absorbancia superiores a 1 5 Controles de calidad Las pr cticas recomendadas de laboratorio indican que se incluya una muestra de ADN de control positivo y una muestra de control negativo sin plantilla en cada experimento La muestra de ADN de control positivo debe contar con unas caracter sticas bien definidas con variantes conocidas en la regi n de inter s Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 1 T Acr nimos Tabla 9 Acr nimos del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina 18 Acr nimo AMP CIR COP DAL FPU LNP NTC PAL POS SGP Definici n Placa de amplificaci n Placa de limpieza Grupo de oligonucle tidos personalizados Biblioteca de amplicones diluida Unidad de la placa del filtro Placa de hibridaci n Placa de normalizaci n de bibliotecas Control de plantilla negativo Biblioteca de amplicones agrupados Control positivo Placa de almacenamiento N de refere
30. ese de que la fecha coincida con la fecha de inicio del experimento La fecha actual se muestra de forma predeterminada 6 Seleccione Next Siguiente Se abre la pantalla Enter Sample Information Introducir informaci n de muestras Figura 3 Pantalla Enter Sample Information Introducir informaci n de muestras del Gestor de la lista de trabajos de Illumina Please Enter Sample Information basaan Omens Joey Pao OIE Sorcle K Soria llame index OTF Sarge ES axe Sargia ao Sargozo axa Ans AO A proa AE AS sor soan son son sos sos 20 son sos aw an IRABRBRAAARARAA ESE o ME ad Introducci n de informaci n de la muestra 1 En la ficha Table Tabla o la ficha Plate Placa introduzca la siguiente informaci n de cada pocillo que contiene muestra a Sample ID ID de muestra Introduzca un ID de muestra nico El ID de muestra se utiliza para realizar el seguimiento de la muestra desde la preparaci n hasta la secuenciaci n y el an lisis Aunque el ID suele ser un c digo de barras cualquier valor es aceptable b Index 1 ndice 1 e Index 2 ndice 2 Especifique el adaptador de ndices que se utilizar para cada lectura del ndice Illumina recomienda utilizar combinaciones que den como resultado al menos una base A o C rojo y al menos una base G o T verde en cada ciclo J NOTA Consulte Producci n de muestras y representaci n de ndices en la p gina 22 para
31. etas entren en contacto con la membrana y a continuaci n pipetee NaOH arriba y abajo cinco o seis veces Debe cambiar las puntas tras cada columna Cubra e incube la placa del filtro a temperatura ambiente durante cinco minutos Mientras la placa del filtro se incuba utilice una pipeta multicanal para transferir 22 ul de la soluci n de trabajo de PCR a cada pocillo de la placa AMP que contiene cebadores de ndice Cambie las puntas entre muestras Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 3 9 Hod Uoroeoyauuy 10 Transfiera muestras eluidas desde el filtro hasta la placa AMP como se indica a continuaci n a Configure una pipeta multicanal P20 a 20 ul b Pipetee las muestras en la primera columna de la placa del filtro arriba y abajo cinco o seis veces c Transfiera 20 ul desde la placa del filtro a la columna correspondiente de la placa AMP d Pipetee con cuidado arriba y abajo cinco o seis veces para combinar bien el ADN con la soluci n de trabajo de PCR 4 NOTA Incline ligeramente la placa FPU para garantizar una aspiraci n completa y evitar la formaci n de burbujas de aire e Transfiera las columnas restantes desde la placa del filtro a la placa AMP de una manera similar Se deben cambiar las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices y muestras f Una vez transferidas todas las muestras se puede desechar la placa MIDI de recogida de residuos de la FPU El collar
32. generaci n de grupos en MiSeqDx e Para desnaturalizar las muestras prepare 1 ml de NaOH 0 1 N La preparaci n de un volumen de 1 ml evita que los peque os errores de pipeteo afecten a la concentraci n final de NaOH 1 Combine los vol menes siguientes en un tubo de microcentr fuga Agua sin ARNasa ADNasa 900 ul Preparado de NaOH 1 0 N 100 ul 2 Invierta el tubo varias veces para mezclar Desnaturalizaci n y diluci n de Control interno PhiX 1 Combine los siguientes vol menes para diluir la biblioteca Control interno PhiX a2nM Biblioteca Control interno PhiX de 10 nM 2 ul 1 tamp n TE 8 ul 2 Combine los siguientes vol menes de biblioteca Control interno PhiX de 2 nM y NaOH 0 1 N en un tubo de microcentr fuga para que d como resultado una biblioteca Control interno PhiX de 1 nM Biblioteca Control interno PhiX de 2 nM 10 ul NaOH 0 1 N 10 ul 3 Agite brevemente para mezclar la soluci n de la biblioteca Control interno PhiX de 1 nM 4 Centrifugue la soluci n de plantilla a 280 x ga 20 C durante un minuto 5 Inc bela durante 4 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca Control interno PhiX en cadenas individuales 5 2 N de referencia 15036910 Rev A ESP 6 A ada el siguiente volumen de tamp n de diluci n de biblioteca previamente refrigerado en el tubo que contiene la biblioteca Control interno PhiX desnaturalizada para obtener una biblioteca Control interno PhiX de 20
33. i n cruzada entre ndices 3 3 N de referencia 15036910 Rev A ESP d Para evitar la contaminaci n cruzada entre ndices deseche los tapones naranjas originales y coloque tapones naranjas nuevos Retire todos los tubos de cebadores de ndice del rea de trabajo Prepare la soluci n de trabajo de PCR de mezcla maestra de PCR Polimerasa de PCR tal y como se indica a continuaci n a Para 96 muestras a ada 56 ul de polimerasa de PCR a 2 8 ml de mezcla maestra de PCR b Invierta la soluci n de trabajo de PCR preparada 20 veces para mezclarla En la siguiente secci n a adir la soluci n de trabajo a la placa AMP La soluci n de trabajo de PCR permanece estable a temperatura ambiente durante 10 minutos j NOTA A ada siempre polimerasa de PCR a mezcla maestra de PCR justo antes de su uso Nunca almacene la soluci n de trabajo de PCR combinada Procedimiento 1 Tras finalizar la reacci n de extensi n ligadura de 45 minutos retire la FPU de la incubadora Retire el sello de pel cula de aluminio y sustit yalo por la tapa de la placa del filtro Se recomienda retirar el sello de pel cula de aluminio antes del centrifugado para garantizar el drenaje ptimo del sobrenadante de la reacci n en la placa de residuos Centrifugue la FPU a 2400 x ga 20 C durante dos minutos Con una pipeta multicanal a ada 25 ul de NaOH 0 05 N en cada pocillo de muestra de la placa del filtro Aseg rese de que las puntas de las pip
34. iSeqDx Universal 1 0 de Illumina la producci n de muestras por experimento MiSeqDx es de entre 8 y 48 muestras Los cebadores de ndice utilizados durante la amplificaci n PCR se deben elegir en funci n de la producci n final de muestras deseada con el fin de garantizar la diversidad de la secuencia de ndice 2 a N de referencia 15036910 Rev A ESP L NOTA Para una eficacia de producci n m xima proceda con la preparaci n de bibliotecas de hasta 96 muestras y a continuaci n divida las muestras en dos experimentos de secuenciaci n con un m ximo de 48 muestras cada uno MiSeqDx utiliza un LED verde para secuenciar bases G T y un LED rojo para secuenciar bases A C En cada ciclo se debe leer como m nimo uno de los dos nucle tidos de cada canal de color para garantizar un registro adecuado Es importante mantener el equilibrio de colores de cada base de la lectura de ndice que es objeto de secuenciaci n puesto que de lo contrario se podr a producir un fallo de registro durante la secuenciaci n de la lectura del ndice Consulte la Tabla 10 para elegir las combinaciones de cebadores de ndice para experimentos de 48 o 96 muestras Tabla 10 Combinaciones de cebadores de ndice para experimentos de secuenciaci n de 48 muestras o 96 muestras Filas de la A a la H Columnas de la 1 a la 6 Columnas de la 7 a la 12 Cebador de ndice A A501 Cebador de ndice 1 A701 Cebador de ndice 6 A706 Cebador de ndi
35. ibridaci n que contiene sales y formamida Mezcla de 1 tubo 48ml Soluci n acuosa tamponada Entre 25 C y 15 C extensi n que contiene una mezcla ligadura patentada de ADN polimerasas ADN ligasa y dNTP Cebadores de 1 tubo 192 ul Cebadores de PCR con Entre 25 C y 15 C ndice A por secuencias de ndice y A501 H cebador adaptadores de secuenciaci n A508 Cebadores de 1 tubo 128 ul Cebadores de PCR con Entre 25 C y 15 C ndice 1 A701 por secuencias de ndice y 12 A712 cebador adaptadores de secuenciaci n Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 T sosed soJ wld Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Polimerasa de ADN polimerasa patentada Entre 25 C y 15 C PCR Mezcla 1 tubo 2 8ml1 Soluci n acuosa tamponada Entre 25 C y 15 C maestra de que contiene sales y ANTP PCR Tabla2 Reactivos de posamplificaci n de la caja 1B Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Diluyente de y Soluci n acuosa Entre 25 C y 15 C normalizaci n tamponada que de bibliotecas contiene sales 2 mercaptoetanol y formamida Tamp n de 1 o 45 ml Soluci n acuosa Entre 25 C y 15 C diluci n de tamponada biblioteca Control interno 1 ia 10ul Soluci n acuosa Entre 25 C y 15 C PhiX tamponada que contiene ADN gen mico PhiX Kit MiSeqDx Universal caja 2 Tabla3 Reactivos de posamplificaci
36. incluidas en este de manera rigurosa y expresa Se debe leer y entender completamente todo el contenido de este documento antes de usar estos productos SINO SE LEE COMPLETAMENTE EL DOCUMENTO Y NO SE SIGUEN EXPRESAMENTE TODAS LAS INSTRUCCIONES DESCRITAS EN ESTE PODR AN PRODUCIRSE DA OS AL PRODUCTO LESIONES A LAS PERSONAS INCLUIDOS LOS USUARIOS Y OTROS Y DA OS A OTRA PROPIEDAD ILLUMINA NO ASUME RESPONSABILIDAD ALGUNA QUE SURJA DEL USO INCORRECTO DE LOS PRODUCTOS AQU DESCRITOS INCLUIDAS LAS PIEZAS O EL SOFTWARE NI DEL USO DE DICHOS PRODUCTOS FUERA DEL MBITO DE LAS LICENCIAS EXPRESAS ESCRITAS O PERMISOS OTORGADOS POR ILLUMINA EN CONEXI N CON LA ADQUISICI N DE DICHOS PRODUCTOS POR PARTE DE LOS CLIENTES PARA USO DIAGN STICO IN VITRO O 2012 2014 Illumina Inc Todos los derechos reservados Ilumina y MiSeqDx son marcas comerciales o marcas comerciales registradas de Illumina Inc Todas las dem s marcas y nombres mencionados en el presente documento pertenecen a sus respectivos propietarios AMPure Beckman y Beckman Coulter son marcas comerciales o marcas comerciales registradas de Beckman Coulter Inc Introducci n pou Uso previsto El kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina est formado por un conjunto de reactivos y consumibles que se utilizan en el procesamiento de muestras de ADN gen mico humano obtenidas a partir de sangre total perif rica y en la posterior secuenciaci n selectiva de las bibliotecas de muestras re
37. late ID LNP_Placa_ID a una nueva placa MIDI Con una pipeta multicanal P20 y puntas finas transfiera con cuidado 20 ul del sobrenadante de la placa CLP a la placa LNP Cambie las puntas entre muestras para evitar la contaminaci n cruzada p NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas de nuevo en la placa deje reposar la placa sobre el soporte magn tico durante dos minutos y confirme que el sobrenadante haya desaparecido Opcional Transfiera los 10 ul de sobrenadante restante de la placa CLP a una nueva placa y asigne una etiqueta a la placa que incluya un nombre de experimento y la fecha Almacene la placa a una temperatura de entre 25 C y 15 C hasta la finalizaci n del experimento de secuenciaci n y el an lisis de los datos Los productos de PCR limpios se pueden utilizar con fines de soluci n de problemas en caso de que se produzcan fallos en las muestras Si se detiene en este punto selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas y a continuaci n centrifugue a 1000 x ga 20 C durante un minuto para garantizar que todo el sobrenadante est en el fondo del pocillo PUNTO DEDETENCI N DE SEGURIDAD Tras la limpieza de PCR la placa permanece estable hasta tres horas a una 1 temperatura de entre 2 C y 8 C Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 A 5 Hd ep ezaldwIM Normalizaci n de bibliotecas Este proceso normaliza la cantidad de cada biblioteca para gar
38. mentation amp Literature Documentaci n y literatura Documentaci n Existe documentaci n adicional como la Gu a de referencia del instrumento MiSegDx N de referencia 15038353 ESP disponible para descargar en el sitio web de Ilumina Si desea obtener m s informaci n consulte el interior de la contraportada de esta gu a 6 N de referencia 15036910 Rev A ESP Primeros pasos Esta secci n describe el contenido del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina los consumibles y el equipo utilizados as como las recomendaciones de entrada de ADN y las pr cticas recomendadas que aplicar durante el protocolo Contenido del kit MiSeqDx Universal El kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina contiene los componentes enumerados en la Tabla 1 y la Tabla 8 Almacene los componentes del kit a la temperatura especificada y en las reas de preamplificaci n y posamplificaci n designadas Dado que los reactivos de preamplificaci n y los de posamplificaci n se suministran juntos es importante que desembale los reactivos en el rea del laboratorio de preamplificaci n y que a continuaci n traslade los reactivos de posamplificaci n al rea de almacenamiento de posamplificaci n adecuado Kit MiSeqDx Universal caja 1 Tabla 1 Reactivos de preamplificaci n de la caja 1A Volumen Componente Cantidad de Principios activos Almacenamiento llenado Tamp n de 1 tubo 4 32 ml Soluci n acuosa tamponada Entre 25 C y 15 C h
39. n sello adhesivo para placas 6 Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante 30 minutos NOTA Esta incubaci n de 30 minutos es fundamental para garantizar una normalizaci n de bibliotecas adecuada Las incubaciones superiores o inferiores a 30 minutos pueden afectar a la representaci n de bibliotecas y la densidad de grupos 7 Coloque la placa en un soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos o hasta que el sobrenadante desaparezca 48 N de referencia 15036910 Rev A ESP 8 Con la placa LNP en el soporte magn tico utilice una pipeta multicanal con configuraci n de pipeteo a 80 ul para extraer y desechar con cuidado el sobrenadante en un contenedor de residuos peligrosos adecuado NOTA En caso de aspirar bolas con las puntas sin darse cuenta coloque las bolas de nuevo en la placa y deje reposar la placa durante dos minutos o hasta que el sobrenadante haya desaparecido 9 Retire la placa LNP del soporte magn tico y lave las bolas con lavado normalizaci n de bibliotecas como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de lavado de normalizaci n de bibliotecas en cada pocillo de muestra Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante cinco minutos Coloque la placa en el sopor
40. ncia 15036910 Rev A ESP Flujo de trabajo del protocolo En el siguiente diagrama se muestra el flujo de trabajo del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina Los puntos de detenci n segura se marcan entre los pasos Figura 1 Flujo de trabajo del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina ra reno Limpieza mediante PCR oligonucie tidos Tiempo de participaci n activa 20 min Tiempo de participaci n activa 15 min Procesamiento 30 min incubaci n 80 min Reactivos Tamp n de eluci n Grupo de oligonucie tidos personalizados po Bolas de limpieza mediante PCR Tamp n de hibridaci n EIOH Resultado Resultado Placa HYB Placa LNP Eliminaci n de Normalizaci n de bibliotecas oligonucle tidos sin ligar mimo de pentcicaci n asta 30 aa Tiempo de participaci n activa 20 min Procesamiento 50 min Reactivos Reactivos Tamp n de lavado meticuloso Diluyente de normalizaci n de bibliotecas Tamp n de lavado universal Bolas de biblioteca R AS Lavado de normalizaci n de bibliotecas Placa de la FPU A sica A aai NaOH Resultado Placa SGP y Ligadura de extensi n de ligados empo de participaci n activa 5 min incubaci n 45 min Agrupaci n de bibliotecas Reactivos Tiempo de participaci n activa 10 min Mezcla de ligadura de extensi n Reactivos Resultado Tamp n de diluci n de biblioteca Placa de la FPU Resultado Tubos DAL y PAL Uy 4 Amplificaci n PCR Tiempo de participaci n activa 30 min Duraci n del ciclo 90 min Reactivos Mezcla
41. ngeladores y frigor ficos para consumibles de preamplificaci n y de posamplificaci n Dado que los reactivos de preamplificaci n y los de posamplificaci n se suministran juntos es importante que desembale los reactivos en el rea del laboratorio de preamplificaci n y que a continuaci n mueva los reactivos de posamplificaci n al rea de almacenamiento de posamplificaci n adecuado Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 1 3 Procedimientos de laboratorio de preamplificaci n y posamplificaci n Para evitar la contaminaci n de productos de PCR es importante que establezca los procedimientos de laboratorio y siga las pr cticas recomendadas Illumina recomienda realizar una limpieza diaria y semanal de las reas de laboratorio con hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 x y PRECAUCI N Para evitar la degradaci n de las muestras o los reactivos aseg rese de que se hayan disipado por completo todos los vapores de la soluci n de limpieza antes de comenzar cualquier proceso Limpieza diaria del rea de preamplificaci n Una limpieza diaria del rea de preamplificaci n con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 ayuda a eliminar producto de PCR que se ha introducido en el rea de preamplificaci n Identifique las reas de preamplificaci n que constituyan el mayor riesgo de contaminaci n y l mpielas con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 antes de comenzar c
42. o por Ilumina Usuario Usuario Usuario Usuario Usuario N de referencia 15036910 Rev A ESP Preparaci n 1 Deje que el grupo de oligonucle tidos personalizados el tamp n de hibridaci n las muestras de ADN gen mico y la muestra de control positivo alcancen la temperatura ambiente 2 Agite el grupo de oligonucle tidos personalizados y el tamp n de hibridaci n con fuerza para asegurarse de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo y a continuaci n centrifugue brevemente los tubos para recoger el l quido NOTA Antes de utilizar el tamp n de hibridaci n sujete el tubo delante de una luz e inspecci nelo visualmente para asegurarse de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo 3 Caliente un bloque de calor de 96 pocillos a 95 C 4 Precaliente una incubadora a 37 C para prepararse para el paso de extensi n ligadura 5 Cree la placa de muestras de acuerdo con el gr fico de la placa impreso en IEM Verifique la ubicaci n de las coincidencias de controles positivos y negativos Illumina recomienda procesar las muestras en lotes no inferiores a ocho NOTA El uso de controles permite al servicio de asistencia t cnica de Illumina proporcionar una asistencia eficaz para la soluci n de problemas El servicio de asistencia t cnica de Illumina no proporcionar asistencia a menos que estas reacciones de control estuvieran incluidas en el an lisis Procedimien
43. o para recoger la condensaci n Asigne la etiqueta PAL Plate ID PAL_Placa_ID a un tubo Eppendorf nuevo Determine las muestras que se deben agrupar para la secuenciaci n Se puede agrupar un m ximo de 48 muestras para su secuenciaci n 54 N de referencia 15036910 Rev A ESP 6 Sila placa SGP se ha almacenado congelada con una pipeta multicanal P200 con configuraci n de pipeteo a 40 ul mezcle cada biblioteca que se deba secuenciar pipeteando arriba y abajo entre tres y cinco veces Cambie las puntas entre muestras 7 Transfiera 5 ul de cada biblioteca que se deba secuenciar de la placa SGP columna por columna a un portagradillas de ocho tubos de PCR Selle la placa SGP con un sello adhesivo para placas y res rvela NOTA Tras su uso almacene la placa SGP sellada a una temperatura de entre 25 C y 15 C La placa SGP sellada permanece estable hasta tres d as 8 Combine y transfiera el contenido de la gradilla de ocho tubos de PCR al tubo PAL Mezcle bien el tubo PAL 9 Asigne la etiqueta DAL Plate ID DAL Placa ID a un tubo Eppendorf nuevo 10 A ada 585 ul de tamp n de diluci n de biblioteca al tubo DAL 11 A ada 6 ul de 20 pM de Control interno PhiX al tubo DAL Con la misma punta pipetee arriba y abajo entre tres y cinco veces para enjuagar la punta y garantizar una transferencia completa 12 Transfiera 9 ul de PAL al tubo DAL que contiene tamp n de diluci n de biblioteca Con la misma punta pi
44. oductos de PCR pueden contaminar los reactivos los instrumentos y las muestras de ADN gen mico lo que se traduce en unos resultados imprecisos y poco fiables La contaminaci n de productos de PCR puede detener los procesos de laboratorio y retrasar de forma significativa las operaciones normales Aseg rese de que el laboratorio est convenientemente preparado para reducir el riesgo de contaminaci n de productos de PCR Separaci n f sica de reas de preamplificaci n y posamplificaci n Separe f sicamente el espacio del laboratorio en el que se realizan los procesos de preamplificaci n extracci n cuantificaci n y normalizaci n de ADN del espacio del laboratorio en el que se realizan los procesos de posamplificaci n sosed soJeuulq No utilice nunca el mismo fregadero para limpiar las cubetas de preamplificaci n y de posamplificaci n No utilice nunca el mismo sistema de purificaci n de agua en los procesos de preamplificaci n y posamplificaci n Almacene todos los suministros utilizados en los protocolos del rea de preamplificaci n y transfi ralos al rea de posamplificaci n seg n resulte necesario Equipo y suministros espec ficos Dedique conjuntos completos e independientes de equipos y suministros pipetas centr fugas hornos bloques de calor etc a los procesos de laboratorio de preamplificaci n y posamplificaci n y no los intercambie nunca entre procesos Emplee reas de almacenamiento independientes co
45. ogeneidad entre las muestras utilice una pipeta multicanal siempre que sea posible Calibre las pipetas peri dicamente Coherencia para preparaciones de muestras de menor tama o Cada tubo de reactivo que se suministra con el kit contiene volumen suficiente para generar resultados utilizando pipetas manuales y cubetas de reactivos conforme a las t cnicas de laboratorio est ndar Para garantizar unos vol menes de reactivo precisos pipetee un reactivo en cada pocillo o pipetee desde una gradilla de ocho tubos de PCR Manipulaci n de bolas magn ticas Utilice a temperatura ambiente Antes de su utilizaci n deje que las bolas alcancen la temperatura ambiente Agite hasta que est bien suspendido Inmediatamente antes de su uso agite las bolas hasta que est n bien suspendidas y el color sea homog neo Mezcle las muestras completamente Despu s de a adir las bolas a las muestras mezcle pipeteando arriba y abajo diez veces Illumina tambi n recomienda utilizar un agitador para mezclar bien las muestras Permita la m xima ligadura Para obtener unos resultados ptimos incube las mezclas de bolas muestras a temperatura ambiente durante todo el per odo que se indique en el protocolo Aspire lentamente la soluci n aclarada Despu s de colocar la placa en el soporte magn tico espere a que la soluci n se aclare antes de continuar Mantenga la placa en el soporte magn tico cuando aspire lentamente la soluci n aclarada y evite alterar la
46. pM Biblioteca Control interno PhiX desnaturalizada 20 ul Tamp n de diluci n de biblioteca enfriado previamente 980 ul NOTA Puede almacenar la biblioteca Control interno PhiX de 20 pM desnaturalizada hasta tres semanas a una temperatura de entre 25 C y 15 C como al cuotas de un solo uso Despu s de tres semanas los n meros de grupos tienden a disminuir Preparaci n del cartucho de reactivo Las instrucciones siguientes describen c mo descongelar el cartucho de reactivo con un ba o de agua a temperatura ambiente Este m todo conlleva aproximadamente una hora 1 Extraiga el cartucho de reactivo almacenado a una temperatura de entre 25 C y 15 C 2 Coloque el cartucho de reactivo en un ba o de agua con suficiente agua desionizada a temperatura ambiente como para sumergir la base del cartucho reactivo hasta la l nea de agua impresa en este No permita que el agua supere la l nea de agua m xima Figura 7 L nea de agua m xima 3 Descongele el cartucho de reactivo en el ba o de agua a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora o hasta que se haya descongelado por completo 4 Saque el cartucho del ba o de agua y d unos suaves toques en la mesa para que el agua salga de la base del cartucho Seque la base del cartucho Aseg rese de que no haya salpicaduras de agua en la parte superior del cartucho de reactivo Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 5 3 sexa 01q1
47. petee arriba y abajo entre tres y cinco veces para enjuagar la punta y garantizar una transferencia completa 13 Mezcle la DAL agitando el tubo tan r pido como pueda L NOTA Si desea guardar los restos de PAL para su uso en el futuro almacene el tubo PAL a una temperatura de entre 25 C y 15 C La PAL almacenada permanece en buenas condiciones durante tres d as La DAL de la biblioteca diluida debe estar reci n preparada y debe utilizarse de manera inmediata para la carga de MiSeqDx El almacenamiento de DAL reducir considerablemente la densidad de grupos 14 Centrifugue el tubo DAL a 1000 x g a 20 C durante un minuto para recoger el contenido 15 Con un bloque de calor incube el tubo DAL a 96 C durante dos minutos Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 5 5 sexa 01q1q ap vo oedn1By 16 Tras la incubaci n invierta el tubo DAL una o dos veces para mezclar y a continuaci n col quelo inmediatamente en el ba o de agua con hielo 17 Mantenga el tubo DAL en el ba o de agua con hielo durante cinco minutos L NOTA Debe realizar el paso de desnaturalizaci n t rmica inmediatamente antes de cargar la DAL en el cartucho de reactivo de MiSeqDx para garantizar una carga eficaz de cadenas molde en la celda de flujo de MiSeqDx 5 6 N de referencia 15036910 Rev A ESP Novedades Despu s de que se haya agrupado la biblioteca de amplicones con el PhiX diluido y desnaturalizado las bibliotecas esta
48. placa CLP en el soporte magn tico ejecute un segundo lavado con etanol como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 200 ul de etanol al 80 reci n preparado en cada pocillo de muestra b Incube la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de 30 segundos O hasta que el sobrenadante desaparezca c Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante Utilice una pipeta multicanal P20 con configuraci n de pipeteo a 20 ul para extraer el exceso de etanol Retire la placa CLP del soporte magn tico y deje secar las bolas durante 10 minutos Con una pipeta multicanal a ada 30 ul de tamp n de eluci n en cada muestra y a continuaci n agite brevemente Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas Selle la placa con un sello adhesivo para placas Agite la placa CLP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante dos minutos 44 N de referencia 15036910 Rev A ESP 19 20 21 22 23 24 NOTA Aseg rese de que todas las muestras est n resuspendidas por completo Si hay muestras cuyas bolas no est n completamente resuspendidas pipetee con cuidado arriba y abajo para resuspender las bolas y repita los dos pasos anteriores Incube a temperatura ambiente de 15 C a 30 C durante dos minutos Coloque la placa CLP en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos o hasta que el sobrenadante desaparezca Asigne la etiqueta LNP P
49. q ap vo oedn1By Inspecci n del cartucho de reactivo 1 Invierta el cartucho de reactivo diez veces para mezclar los reactivos descongelados y para comprobar visualmente que todas las posiciones est n descongeladas NOTA Es esencial que los reactivos del cartucho est n completamente descongelados y mezclados para garantizar una correcta secuenciaci n Inspeccione visualmente el reactivo de la posici n 1 para asegurarse de que se haya mezclado completamente y no presente precipitados Golpee suavemente el cartucho en la mesa para reducir las burbujas de aire en los reactivos p NOTA Los tubos del dispensador MiSeqDx acceden al fondo de cada dep sito para aspirar los reactivos de modo que resulta importante que estos no presenten burbujas de aire Coloque el cartucho de reactivo en hielo o res rvelo a una temperatura de entre 2 C y 8 C hasta seis horas hasta que est listo para configurar el experimento Para obtener unos resultados ptimos proceda directamente con la carga de la muestra y la configuraci n del experimento Preparaci n de muestras para secuenciaci n 1 Deje que el bolas de limpieza de PCR alcance la temperatura ambiente Agite el tamp n de diluci n de biblioteca y aseg rese de que todos los precipitados se hayan disuelto por completo Si la placa SGP se ha almacenado congelada descongele la placa SGP a temperatura ambiente Centrifugue la placa SGP a 1000 x ga 20 C durante un minut
50. r n listas para cargarse en el cartucho de reactivo de MiSeqDx en el dep sito designado con la etiqueta Load Samples Muestras de carga A continuaci n el experimento de secuenciaci n se configura con la interfaz del software operativo de MiSeq MOS Consulte la Gu a de referencia del instrumento MiSegDx N de referencia 15038353_ESP para obtener instrucciones Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 5 S9Pepanon Notas Asistencia t cnica Si necesita asistencia t cnica p ngase en contacto con el servicio de asistencia t cnica de Illumina Tabla 14 Informaci n de contacto general de Illumina Sitio web de www illumina com Illumina Correo electr nico techsupport illumina com Tabla 15 N meros de tel fono del servicio de asistencia al cliente de Ilumina Zona N mero de contacto Zona N mero de contacto Norteam rica 1 800 809 4566 Irlanda 1 800 812949 Alemania 0800 180 8994 Italia 800 874909 Austria 0800 296575 Noruega 800 16836 B lgica 0800 81102 Pa ses Bajos 0800 0223859 Dinamarca 80882346 Reino Unido 0800 917 0041 Espa a 900 812168 Suecia 020790181 Finlandia 0800 918363 Suiza 0800 563118 Francia 0800 911850 Otros pa ses 44 1799 534000 Hojas de datos de seguridad P ngase en contacto con el servicio de asistencia t cnica de Illumina para obtener las hojas de datos de seguridad Documentaci n del producto La documentaci n del producto en PDF est disponible para su descarga en el
51. s bolas apartadas Procedimientos para evitar la contaminaci n cruzada Cambie las puntas entre las dispensaciones de reactivos y muestras Utilice siempre puntas de pipetas nuevas entre las dispensaciones de reactivos y de muestras Mezcle las placas seg n se indique Mezcle las muestras con una pipeta multicanal y centrifugue la placa cuando se indique No agite las placas 1 6 N de referencia 15036910 Rev A ESP Utilice puntas resistentes a los aerosoles Al utilizar puntas resistentes a los aerosoles se reduce el riesgo de contaminaci n cruzada entre muestras y de restos de amplicones Lavado con etanol al 80 durante el paso de limpieza de PCR Prepare etanol nuevo al 80 Prepare siempre etanol nuevo al 80 para los pasos de lavado El etanol puede absorber agua del aire y repercutir en los resultados Retire todo el etanol de los pocillos Aseg rese de extraer todo el etanol del fondo de los pocillos ya que pueden contener contaminantes residuales Utilice una pipeta multicanal P20 para retirar el etanol residual y acelerar el secado sosed soJeuulq Permita una evaporaci n completa Emplee al menos diez minutos para el secado fuera del soporte magn tico a temperatura ambiente para una evaporaci n completa Los restos de etanol pueden afectar al rendimiento de las reacciones posteriores Requisitos de entrada de ADN El protocolo del kit MiSeqDx Universal 1 0 de Illumina requiere 250 ng de ADN gen mico Illumina recomi
52. sitio web de Illumina Vaya a www illumina com support seleccione un producto y a continuaci n haga clic en Documentation amp Literature Documentaci n y literatura Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 go1U99 EIOUBISISY Ilumina Emergo Europe San Diego 92122 Califomia EE UU Molenstraat15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH La Haya 1 858 202 4566 fuera de Norteam rica Pa ses Bajos techsupport ilumina com www ilumina com
53. sultantes Para la preparaci n de bibliotecas centradas en regiones de inter s gen micas espec ficas se requieren reactivos de analitos espec ficos proporcionados por el usuario El kit MiSeqDx Universal est previsto para su uso con el instrumento MiSeqDx UO0IDan Acerca de esta gu a Esta gu a de referencia proporciona instrucciones m s detalladas sugerencias de t cnicas y tiles consejos para usuarios que han recibido una formaci n reciente con el objeto de servirle de gu a para una ejecuci n adecuada del protocolo del kit MiSeqDx Universal Se ha concebido para servir de complemento y no con el fin de reemplazar a la informaci n del prospecto C mo funciona el kit Se ha dise ado un par de oligonucle tidos personalizados para cada amplic n La hibridaci n de estos oligonucle tidos en ADN gen mico se produce en una placa de 96 pocillos seguida de la extensi n y la ligadura para formar las plantillas de ADN que se componen de las regiones de inter s flanqueadas por secuencias del cebador universal Al utilizar los cebadores indexados suministrados con el kit las plantillas de ADN se amplifican mediante PCR se agrupan en un solo tubo y se secuencian en el instrumento MiSeqDx Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 3 Sonda Regi n de Sonda a personalizada 1 inter s personalizada 24 To STS dede tete E Pont a e e e e Sonda Sonda personalizada 1 personalizada 2 gt O Pe
54. te magn tico durante un m nimo de dos minutos O hasta que el sobrenadante desaparezca Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante en un contenedor de residuos peligrosos adecuado 10 Retire la placa LNP del soporte magn tico y repita el lavado con Lavado de normalizaci n de bibliotecas como se indica a continuaci n a Con una pipeta multicanal a ada 45 ul de Lavado de normalizaci n de bibliotecas en cada pocillo Si tiene cuidado de evitar la contaminaci n cruzada no es necesario cambiar las puntas entre columnas Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante cinco minutos Coloque la placa en el soporte magn tico durante un m nimo de dos minutos Extraiga y deseche con cuidado el sobrenadante en un contenedor de residuos peligrosos adecuado 11 Utilice una pipeta multicanal P20 con configuraci n de pipeteo a 20 ul para extraer el exceso de lavado de normalizaci n de bibliotecas Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 A 9 sexajol alq ap UVIDEZIELWION 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Retire la placa LNP del soporte magn tico y a ada 30 ul de NaOH 0 1 N en cada pocillo para eluir la muestra Selle la placa LNP con un sello adhesivo para placas Agite la placa LNP en un agitador de microplacas a 1800 rpm durante cinco minutos Durante los cinco minutos de eluci n asigne la etiqueta SGP_Plate_ID SGP
55. to 1 Asigne la etiqueta HYB_Plate_ID HYB_Placa_ID a una nueva placa de PCR de 96 pocillos 2 A ada 5 ul de muestra o control a 50 ng ul 250 ng total en los pocillos correspondientes de la placa HYB Siga la disposici n de placas generada para una selecci n correcta de los pocillos p NOTA Verifique que la disposici n de muestras de ADN y las posiciones de controles positivos y negativos coincidan con el gr fico de la placa Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 z T sopnos 9nuoblio sp odn16b sp UVIDepLIAIH Con una pipeta multicanal a ada 5 ul de grupo de oligonucle tidos personalizados en todos los pocillos que contienen ADN gen mico Cambie las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada Con una pipeta multicanal a ada 40 ul de tamp n de hibridaci n en cada muestra de la placa HYB Pipetee con cuidado arriba y abajo entre tres y cinco veces para mezclar Cambie las puntas despu s de cada columna para evitar la contaminaci n cruzada NOTA Aseg rese de que se hayan disuelto todos los cristales y precipitados en el tamp n de hibridaci n NOTA No mezcle el grupo de oligonucle tidos personalizados y el tamp n de hibridaci n para el almacenamiento Al combinarse el grupo de oligonucle tidos personalizados se vuelve inestable incluso si se almacena congelado Selle la placa HYB con una pel cula de aluminio adhesiva y asegure la junta con un rodillo de goma o
56. total 90 minutos Tiempo de participaci n activa 30 minutos Consumibles Art culo Cantidad Almacenamiento Suministrado por Mezcla maestra de PCR 1 tubo Entre 25 C y 15 C Ilumina Cebadores de ndice A 1 tubo por Enme 25k Cy oe Ilumina A501 H A508 cebador Cebadores de ndice 1 1 tubo por Entre 25 C y 15 C Ilumina A701 12 A712 cebador Polimerasa de PCR 1 tubo Ene 25L Cy OE Ilumina Sello para placas de PCR 1 Entre 15 C y 30 C Usuario adecuado NaOH 0 05 N reci n Seg n sea Entten k eyo 0RE Usuario preparado necesario Placa de PCR con 1 placa Entre 15 C y 30 C Usuario faldones de 96 pocillos Cubetas Seg n sea Entrels k SUE Usuario necesario 36 N de referencia 15036910 Rev A ESP Preparaci n 1 Prepare NaOH 0 05 N nuevo a adiendo 25 ul de NaOH 10 N a 4975 pul de agua est ril Determine los cebadores de ndice que se deben utilizar de acuerdo con la impresi n del gr fico de la placa de Gestor de la lista de trabajos de Illumina Retire la mezcla maestra de PCR y los cebadores de ndice adecuados de su almacenamiento a una temperatura de entre 25 C y 15 C y descong lelos en una mesa a temperatura ambiente Espere unos 20 minutos hasta que los reactivos se descongelen Cuando los cebadores de ndice est n completamente descongelados agite cada tubo para mezclarlo y centrifugue brevemente los tubos en una microcentrifuga Utilice tubos Eppendorf de 1 7 ml como adaptadores
57. ualquier proceso de preamplificaci n Las reas de alto riesgo pueden ser entre otros los siguientes componentes Partes superiores de las mesas Mangos de puertas Mangos de las puertas de los refrigeradores o los congeladores Rat n del ordenador Teclados Limpieza diaria del rea de posamplificaci n Si se reduce la cantidad de producto de PCR en el rea de posamplificaci n se contribuye a reducir el riesgo de contaminaci n en el rea de preamplificaci n La limpieza diaria del rea de posamplificaci n con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 ayuda a lograrlo Identifique las reas de posamplificaci n que constituyan el mayor riesgo de contaminaci n y l mpielas con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 todos los d as Las reas de alto riesgo pueden ser entre otros los siguientes componentes 1 A N de referencia 15036910 Rev A ESP Cicladores t rmicos Espacio de la mesa utilizado para procesar ADN amplificado Mangos de puertas Mangos de las puertas de los refrigeradores o los congeladores Rat n del ordenador Teclados Limpieza semanal de todas las reas del laboratorio Una vez a la semana realice una limpieza profunda de las reas de preamplificaci n y posamplificaci n con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a el 10 Limpie todas las partes superiores de las mesas y las superficies del laboratorio Limpie todos los instrumentos q
58. ue no se limpien diariamente Limpie bien el suelo del laboratorio Aseg rese de haber formado correctamente al personal responsable de la limpieza semanal sobre la prevenci n de la contaminaci n de productos de PCR Elementos que caen al suelo El suelo est contaminado con producto de PCR que se transfiere a los zapatos de las personas que proceden del rea de posamplificaci n por lo tanto cualquier elemento que caiga al suelo debe tratarse como un objeto contaminado Los elementos desechables que se han ca do al suelo tales como tubos vac os puntas de pipetas guantes y perchas de batas de laboratorio deben desecharse Los art culos no desechables que se caigan al suelo como las pipetas o un contenedor de muestras importante deben limpiarse concienzudamente de manera inmediata con una soluci n de hipocloruro s dico al 0 5 lej a al 10 para evitar la contaminaci n de productos de PCR Limpie cualquier superficie del laboratorio que haya entrado en contacto con el elemento contaminado Las personas que manipulen cualquier objeto que haya ca do al suelo desechable o no siempre deber n desechar los guantes que est n utilizando y utilizar unos nuevos Precauciones Siga estas recomendaciones cuando prepare bibliotecas para la secuenciaci n utilizando este protocolo Gu a de referencia del kit MiSeqDx Universal 1 0 1 5 sosed soJeuulq Garant a de la homogeneidad Utilice pipetas multicanal Para garantizar la hom
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