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1. n donde se localizan los Primers Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R y 76 25F2 76 2SR y generan un Fragmento de amplificaci n del Gen R1 seg n el Programa Jellyfish biowire com 2000 2002 Dentro de la secuencia Por tales explicaciones para que haya mayor especifici dad de primers y se obtengan datos m s confiables en cuanto a la presencia del gen R1 es indispensable que los marcadores se localicen a una distancia gen tica m s cercana al gen R1 Seg n esto y conforme a los nue vos hallazgos reportados por Ballvora et al 2002 fueron implementados nuevos primers espec ficos al gen R1 denominados 76 2SF2 76 2SR los cuales amplificaron un fragmento del gen R1 figuras 2 y 6 El resultado con los primers Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R fue id ntico al encontrado con los primers 76 25F2 76 2SR salvo por el peso molecular de los fragmentos 519 pb y 1353 pb respectivamen te Es de gran importancia anotar que estos dos ti pos de marcadores no se encuentran ligados al gen R1 sino que amplifican secuencias del gen R1 El tama o del fragmento de amplificaci n producido por ambos primers en el diferencial 1 fue corroborado con el Programa Jellyfish figura 6 Estos resultados son por tanto consistentes con los obtenidos por Ballvora et al 2002 en cuan to al fragmento amplificado por los primers 76 25F2 76 2SR y Sol 2749 2770F Sol3246 3267R pues estuvo presente en los materiales que contienen el gen R1 y estuvo ause2. Co lombia Facultad de Agronom a Hardy B Trognitz B Forbes B 1996 Mejoramiento para el Tiz n Tard o progresos hasta hoy En Papas colombia nas con el mejor entorno ambiental Robayo G 49 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOG A VOL V No 2 Diciembre 2003 40 50 Henfling J W 1987 El Tiz n Tard o de la papa Phytophthra infestans Bolet n de Informaci n T cnica 4 Segunda Edici n Lima Centro Internacional de la Papa CIP Hodgson W A 1961 Laboratory Testing of the Potato for Partial Resistance to Phytophthora infestans American Potato Journal 38 259 264 Huaman Z 1994 Descriptores de la Papa para caracteriza ci n b sica de colecciones nacionales Lima CIP Jaramillo S Patino L F L pez J B Buritic P M rquez M E Zapata J L Morales J G 1997 Historia y origen del Patosistema Phytophthora infestans Solanum Una Re visi n En IV Foro de Sanidad Vegetal y Primer Semi nario Nacional sobre Gota de la Papa Grupo de Sani dad Vegetal Grupo de Biotecnolog a Universidad Nacional de Colombia Sede Medell n pp 1 15 Leonards Schippers C Giefers W Salamini F Gebharat C 1992 The R1 Gene Conferring Race Specific Resistance to Phytophthora Infestans in Potato is Located on Potato Chromosome V Mol Gen Genet 233 278 283 Li X Van Eck H J Rouppe Van Der Voort J N A M Huigen D J Stam P Jacobsen E 1998 Autotetraploids and Genetic Mapping Using Common AFLP
3. Markers The R2 Al ele Conferring Resistance to Phytophthora infestans Mapped on Potato Chromosome 4 Theor Appl Genet 96 1121 1128 Malcolmson J F Black W 1966 New R Genes in Solanum demissum Lindl and their Complementary Races of Phytophthora infestans Mont de Bary Euphytica 15 199 203 Mcgregor CE Lambed C A Greyling M M Louw J H Warnich L 2000 A Comparative Assessment of DNA Fingerprinting Techniques RAPD ISSR AFLP and SSR in Tetraploid Potato Solanum tuberosum L Germplasm Euphytica 113 135 144 Meksem K Leister D Peleman J Zabeau M Salamini F Gebhardt C 1995 A High Resolution Map of the Vicinity of the R1 Locus on Chromosome V of Potato Based on RFLP and AFLP Markers Mol Gen Genet 249 74 81 M ndez S M J 1998 Cuantif caci n de componentes de resistencia a P infestans en 78 genotipos de papa pro venientes del Proyecto de Mejoramiento por Resisten cia Parcial a Gota del Instituto Colombiano Agropecuario ICA Tesis de Pregrado Bogot Universidad Nacional de Colombia Facultad de Agronom a Miller J S Johnson D A Hamm P B 1998 Agressiveness of Isolates of Phytophthora infestans from the Columbia Basin of Washington and Oregon Phytopathology 88 190 197 50 Payne S 1997 Microsatellite Analysis In Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA Crc Press pp 31 44 Ribaut J M Hoisington D 1998 Marker Assisted Selection New To
4. cia gen tica a la que se encuentran los dos primers espec ficos respecto del alelo R1 ya que de acuer do con lo estipulado por Meksem et al 1995 y Ballvora et al 2002 el alelo R1 est localizado en el intervalo comprendido entre los marcadores GP21 y GP179 en el brazo corto del cromosoma V de la papa Este intervalo tiene una distancia gen tica to tal de 3cM As mismo los marcadores GP21 y GP179 distan gen ticamente 2 2 y 0 8 cM del gen R1 res pectivamente Estos valores se refieren a su vez a la frecuencia de recombinaci n entre estos segmen tos que es 2 2 y 0 8 Ballvora et al 2002 IDENTIFICACI N DE GENES R1 Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans El resultado con los primers SPUD237 figura 3 indic que stos no son espec ficos para el alelo R1 a pesar de que Ballvora et al 2002 afirman que estos marcadores se localizan a 0 1 cM del alelo R1 Sin embargo De Jong et al 1997 digirieron todos los productos de amplificaci n con la enzima Alu y encontraron productos de digesti n ligados a resistencia Por tanto queda pendiente realizar ese procedimiento para comprobar si Sol F 2223 n 2749 2770 Ez 3246 3267 Secuencia complementaria al clon g10 10388 nucle tidos Prote na 4879 n Sol R d 76 R 5126 5147 519 pb 1400 pb esa estrategia funciona con los materiales de este trabajo Figura 6 Esquema que ilustra la regi
5. en mayor o menor grado a la resistencia Henfling 1987 Hardy et al 1996 Young 1996 Watanabe y Watanabe 2000 El prop sito de este trabajo fue identificar genes mayores R1 y R2 mediante la evaluaci n de resis tencia a P infestans en genotipos colombianos de Solanum tuberosum ssp tuberosum y su detecci n molecular por medio de PCR alelo R1 y AFLP alelo R2 Una vez se tengan identificados los genes que confieren resistencia a P infestans mediante tecno log a molecular se podr n introgresar los alelos de resistencia a materiales de papa de inter s industrial para Colombia por medio de mejoramiento conven cional y de este modo desarrollar estrategias eficien tes en la selecci n asistida por marcadores encami nadas al mejoramiento gen tico vegetal Ribaut y Hoisington 1998 MATERIALES Y M TODOS Localizaci n El presente trabajo se llev a cabo en el centro de investigaciones Tibaitat Corpoica localizado en el departamento de Cundinamarca municipio de Mosquera km 14 de Bogot D C a una latitud norte de 4 42 y una longitud oriente de 74 12 su altitud de 2543 msnm Su clasifi caci n ecol gica Holdridge es bosque seco Montano Bajo bs MB Este trabajo fue desarro llado en el Laboratorio de Biolog a Molecular y Biotecnolog a del Programa Nacional de Recursos Gen ticos y Biotecnolog a Vegetal Material vegetal Se trabaj con 12 reproduc ciones de la variedad Diacol Monserrate Solan
6. hubo foliolos con lesiones esporulantes en los diferenciales 1 y 2 bajo los aislamientos 87L y 245L La mayor producci n de foliolos con lesiones esporulantes ocurri en los dos diferenciales bajo el aislamiento 276P Se presentaron foliolos con lesiones esporulantes en Monserrate testigo con todos los aislamientos D1 Diferencial 1 D2 Diferencial 2 y M D Monserrate 44 tante esta esporulaci n fue menor comparada con la esporulaci n observada en los diferenciales excepto en el aislamiento HIN el cual esporul m s abundan temente Figura 1 Con respecto al an lisis de varianza de dos facto res con diversas muestras por grupo o an lisis factorial se determin que a s hubo diferencia en cuanto al n mero de foliolos con lesiones esporulantes bajo los cuatro aislamientos p lt 05 b s hubo diferencia en cuanto al n mero de foliolos con lesiones esporulantes en los tres materiales de papa p lt 05 y c s existi interacci n del aislamiento y el material en cuanto al n mero de foliolos con lesiones esporulantes La com binaci n de los factores influy en el n mero de foliolos con lesiones esporulantes p lt 05 Detecci n molecular del alelo R1 Con la utili zaci n de los marcadores GP179 y GP21 se visualizaron los fragmentos amplificados de ADN pro cedentes del diferencial 1 Con relaci n al marcador de peso molecular utilizado escalera de 123 pb la banda que correspondi al fragment
7. mayor inter s industrial para nuestro pa s AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a Christiane Gebharat l der de Investigaci n asociada al Instituto Max Planck para el Mejoramiento de los Cultivos Colonia Alemania por la comunicaci n oportuna de sus m s recientes publicaciones aplicadas en este trabajo BIBLIOGRAF A Agrios G N 1996 Fitopatolog a M xico D R Editorial Limusa S A Ballvora A Ercolano M R Weib J Meksem K Bormann A Oberhagemann R Salamini F Gebhardt C 2002 The R1 Gene for Potato Resistance to Late Blight Phytophthora infestans Belongs to the Leucine Zipper NBS LRR Class of Plant Resistance Genes The Plant Journal 30 3 361 371 Carvajal G H Abaunza C A Coronel B Pinz n L M 2000 Aspectos generales del cultivo de la papa y sus sistemas de producci n en Colombia En Manejo Integrado de la Papa Manual T cnico Corpoica Pp 19 38 Centro Internacional de la Papa CIP 1998 Protocolos de laboratorio de Biolog a Molecular Tipificaci n gen tica Ghislain M Zhang D Herrera M R Eds Manual de Capacitaci n Segunda edici n revisado octubre de 1998 Lima Departamentos de Recursos Gen ticos Corzo C P 1998 Curso Taller Producci n de Semilla de Papa con Alta Calidad Sanitaria por Medio de Esquejes Me morias Corpoica Sena Day P R 1974 The Gene For Gene Concept In Genetics of Host Parasite Interaction San Francisco W H Freema
8. menos dos foliolos El resultado definitivo de la evaluaci n de resistencia a P infestans se obtuvo de la moda Se llev a cabo un an lisis estad stico com plementario An lisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo Excel Windows 98 o factorial aislamientos materiales de papa con res pecto al n mero de foliolos con lesiones esporulantes Detecci n molecular Extracci n de ADN Se extrajo ADN de los materia les de papa diferencial 1 R1 diferencial 2 R2 y S phureja fue empleado como control negativo N te se que Diacol Monserrate al poseer resistencia polig nica no fue empleado como control negativo en esta secci n puesto que un QTL de resistencia a P infestans se encuentra ubicado en una regi n muy cercana al gen R1 en el cromosoma V de la papa Gebhardt y Valkonen 2001 Se evit el uso de Diacol Monserrate para evitar la presencia de falsos positi vos en contraste con los diferenciales de papa 1 R1 y 2 R2 en las pruebas moleculares Por tal motivo se escogi S phureja como control negativo mate rial susceptible a gota carece de genes mayores El aislamiento de ADN gen mico se bas en los proto colos de CIP 1998 y Wizard8 Genomic DNA Purificaron Kit Promega Procedimiento con PCR para la detecci n de alelo R1 Se realiz PCR con cinco primers espec fi cos al alelo R1 Tabla 2 GP179 y GP21 Meksem et al 1995 76 25F2 76 2SR Ballvora et al 2002 IDENTIFICA
9. 40 Identificaci n de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa Identification of R1 and R2 Genes conferring resistance to Phytophthora infestans in Colombian potato genotypes XXX Marcela D az M Diego A Fajardo Jos Dilmer Moreno Celsa Garc a V ctor M N ez RESUMEN En Colombia actualmente existen genotipos de papa con excelente calidad industrial pero muy susceptibles a P infestans La mejor manera de combatir este problema es mediante resistencia gen tica puesto que la inversi n para controlar esta enfermedad por medios qu micos es muy costosa sin olvidar la contaminaci n ambiental que producen El objetivo de este trabajo fue la identificaci n de genes R7 y R2 en los diferenciales de papa respectivos Solanum tuberosum ssp tuberosum mediante evaluaci n de resistencia a P infestans y la detecci n molecular por medio de PCR alelo R7 y AFLP alelo R2 Para la detecci n del alelo R7 fueron empleados los primers GP179 GP21 76 25F2 76 2SR SPUD237 y Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R Los primers GP179 GP21 y SPUD237 fueron inespec ficos para RI ya que se gener un producto de amplificaci n en los diferenciales 1 y 2 as como tambi n en Solanum phureja Los primers 76 28F2 76 28SR y Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R generaron un producto de amplificaci n en los diferenciales 1 y 2 por el contrario el fragmento estuvo ausente en el ma
10. CI N DE GENES R1 Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans SPUD237 De Jong et al 1997 Ballvora etal 2002 y Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R dise ados a partir de la secuencia del gen R1 GenBank en el progra ma p blico de Internet Jellyfish versi n 2 1 biowire com 2000 2002 Los moldes de ADN fueron diferencial 1 diferencial 2 y S phureja material sin genes mayores control negativo Las condiciones de PCR y progra maci n del termociclador para los primers GP179 y GP21 fueron seg n Meksem et al 1995 para el res to de primers las condiciones y temperaturas para la amplificaci n fueron ajustadas en este trabajo An lisis para la detecci n del alelo R1 Se realiz electroforesis en gel de agarosa al 1 5 2 0 preparado en buffer TBE 1X te ido con bromuro de etidio 0 3 ug ml La presencia o ausencia de la am plificaci n de los fragmentos fue corroborada en el documentador de geles SynGene Gene Snap 4 00 as como el peso molecular empleado escalera de 123 pb y 50 pb para agarosa en el documentador de geles SynGene Gene Tools 3 00 Tabla 2 Secuencias de los primers empleados para la detecci n del Alelo R1 AT Tres R AAT TTC AGA CGA GTA GGC ACT aa e eaea r ecrecanaceameonme 76 2SR R CAACCCTGGCATGCCACG R AGC CAA GGA AAA GCT AGC ATC CAA G 50132463267 A COGCATCMACAATAACAGANTC F Forward R Reverse Procedimiento con AFLP para la detecci n del
11. T ACT CAC AGC CCA ACT CGC y ATC CGA Invitrogen reportadas por U etal 1998 Las concentraciones de los primers fueron ajustadas en las reacciones de PCR para que ocurriera la reacci n de amplificaci n puesto que unos primers proven an de kit comercial AFLP Analysis System Gibco BRL mientras que otros fueron sintetizados independientemente Invitrogen Las cinco combinaciones de primers se amplificaron en un termociclador MJ Research PTC 200 con los ciclos de temperaturas establecidas por el CIP 1998 Tabla 3 Marcadores AFLP utilizados para la detecci n del alelo R2 Coo rms E ACC M CAT GAC TGC GTA CCA ATT C AC C GAT GAG TCC TGA GTA A CA T GAC TGC GTA CCA ATT C AC T GAT GAG TCC TGA GTA A CA C GAC TGC GTA CCA ATT C AG C E ACT M CAC E AGC M CCA GAT GAGTCCTGAGTA AICC A E ACT M CGC GAC TGC GTA CCA ATT C AC T GATGAGTCCTGAGIAA CGC E ATC M CGA GAC TGC GTA CCA ATT C AT C GAT GAG TCC TGA GTA A CG A D Primera columna Nombre sint tico Segunda columna ecuencia completa de los primers EcoRI y Msel respectiva mente 43 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOG A VOL V No 2 Diciembre 2003 40 50 An lisis para la detecci n del alelo R2 Se efectu electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida al 6 Urea 7M Gonz lez etal 1995 en la c mara de secuenciaci n Modelo S2 Gibco BRL Finalmente se llev a cabo la tinci n con ni trato de plata Payne 1997 Se pr
12. aisla mientos de P infestans 276p 245L 87L y H1N Tabla 1 colectados del altiplano cundiboyacense municipios de Siecha Cucunub Toca y Antioquia facilitados por el grupo de investigaci n en papa de la Facultad de Agronom a de la Universidad Nacional de Colombia Tabla 1 Estado de avirulencia Avn virulencia avr de los aislamientos de F infestans Aislamiento Genes Avr Genes avr 87BL PE 4 7 11 245L1 276P 1 2 HIN 5 9 1 2 3 4 6 7 8 10 11 1 Genes Avr avr presentes en aislamientos 245L y 276P Grupo Investigaci n en papa Facultad de Agronom a Universidad Nacional de Colombia Genes Avr avr presentes en aislamiento 87BL M ndez 1998 3 Genes Avr avr presentes en aislamiento HIN Gualtero 1997 Activaci n de la virulencia de aislamientos de P infestans Para la multiplicaci n del pat geno se emplearon los medios de agar arveja y agar V8 Luego de tres subcultivos un subcultivo mensual de cada uno de los aislamientos se activ su viru lencia mediante la inoculaci n del pat geno en foliolos de papa Diacol Capiro muy susceptible a gota des pu s de una semana aproximadamente se observa ron las lesiones esporulantes y cada trozo de tejido de hoja enfermo se coloc debajo de una rodaja 0 5 1 00 cm de grosor de papa Tuquerre a susceptible a gota previamente desinfectada hipoclorito de sodio al 2 y etanol al 70 Al cabo de cinco d as se ob serv el crecimiento del mic
13. alelo R2 Adaptado del Centro Internacional de la Papa CIP 1998 El ADN gen mico de los materiales de papa diferencial 1 diferencial 2 y S phureja fue digerido con la enzima Mse Invitrogen en una reac ci n de 140 A compuesta por 5 ug de ADN 10 U en zima Msel y React 1 Buffer 1X Invitrogen Se digiri nuevamente cada una de las muestras con la enzima EcoRI Invitrogen en una reacci n de 200 ul compues ta por 140 ul de soluci n inicial de digesti n enzim tica Mseh 10 U de enzima EcoR y NaCl 0 1 M Se realiz la ligaci n de los adaptadores EcoA y MseA Invitrogen al ADN digerido en una reacci n de 50 ul buffer 1X Invitrogen 0 1 uM de EcoA 0 1 uM de MseA 1 U de T4 ligasa Invitrogen 35 pl de ADN digerido La soluci n se diluy 1 4 Se llev a cabo la reacci n de pre amplificaci n empleando primers m s un nucle tido selectivo Cada reacci n de 20 ul 1 5 ng de primer Eco 1 Gibco BRL 1 5 ng de primer Mse 1 Gibco BRL 0 2 mM de dNTPs buffer 1X Gibco BRL 5 ul de ADN liga do amplificada por 0 4 U de taq polimerasa Invitrogen La soluci n se diluy 1 25 Las reaccio nes de pre amplificaci n fueron sometidas a las con diciones establecidas por el CIP 1998 en el termociclador MJ Research PTC 200 Por ltimo se realiz la reacci n de amplifica ci n selectiva empleando cinco combinaciones de primers m s tres nucle tidos selectivos primer E 3 y primer M 3 Tabla 3 ACC CA
14. banda nica en este material con un peso de 196 pb y diferencial 1 respectivamente 400 pb 350 pb 45 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOG A VOL V No 2 Diciembre 2003 40 50 gen de resistencia R en la planta interact a con un gen de avirulencia Avr en el pat geno dando lugar a una reacci n incompatible que se mani fiesta por una respuesta hipersensitiva Por el con trario si el pat geno carece del gen Avro la plan ta carece del gen A la interacci n planta pat geno causa enfermedad Del aislamiento 276p se conoc a su avirulencia de acuerdo con evaluaciones realizadas por otros in vestigadores Tabla 1 pero en este trabajo se demos tr que no presenta los genes Avr 1 y Avr2 Es posible que este aislamiento se haya vuelto patog nico para estos genes teniendo en cuenta que fue colectado de campo y por tanto no es monozoosp rico Las lesiones esporulantes observadas en Diacol Monserrate con todos los aislamientos se explican por la resistencia polig nica de este material Estrada 2000 Hodgson 1961 Esto significa que los genes menores de la planta muestran una fuerte resisten cia al pat geno pero le permiten una ligera esporulaci n a excepci n del aislamiento HIN que es una raza muy compleja Tabla 1 Es preciso se alar que para evidenciar la pre sencia de los genes R1 y R2 fueron empleados ais lamientos de P infestans mientras que en las investi gaciones reportadas por Leonards Sc
15. ci n de los esporangios en suspensi n debido a su gran peso lo cual pudo haber afectado en el momento de apli car la gota o inoculo c haya habido germinaci n desigual de los esporangios Se debe descartar el efecto de las condiciones ambientales ya que stas fueron controladas y el material vegetal se recolect luego de cinco a seis meses de desarrollo de la por ci n media de las plantas Tooley 1990 Stewart 1990 Hodgson 1961 No obstante que para contra rrestar el margen de error en este trabajo se tuvie ron en cuenta diez repeticiones de inoculaciones por aislamiento de P infestans con el fin de tener mayor seguridad en los resultados moda conforme con el Grupo de Investigaci n en papa de la Facultad de Agronom a de la Universidad Nacional de Colombia Bogot D C Detecci n molecular de alelo R1 Los alelos de los marcadores GP21 y GP179 ligados a R1 fue ron inespec ficos para la presencia del gen R1 pues tambi n fueron encontrados en los genotipos que portan el gen R2 y genotipos susceptibles Estos resultados equiparados con los resulta dos de Meksem et al 1995 fueron id nticos en cuanto a la amplificaci n de fragmentos con estos primers en genotipos R1 y en las variedades susceptibles La interpretaci n a la amplificaci n de los primers GP179 y GP21 en los tres materiales dife rencial 1 diferencial 2 y S phureja para que sean inespec ficos al alelo R1 tiene que ver con la distan
16. das por lo que se deber a implementar en pr ximos estudios detec ci n radiactiva o detecci n quimioluminiscente Los dos marcadores ACT CAC 189 y AGC CCA 369 reconocidos visualmente figuras 4 y 5 reiteran la validez del mapa consenso construido por los investigadores Li et al 1998 salvo por la com binaci n ATC CGA 186 que no fue encontrada en este estudio Esto ltimo quiz se debe a que los mapas de ligamiento y de consenso est n basados en poblaciones de papa producidas en los pa ses bajos B lgica Holanda y Luxemburgo y exista la posibilidad de que tal marcador no sea tan espec fi co al R2 en los materiales nacionales posiblemen 47 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOG A VOL V No 2 Diciembre 2003 40 50 te por variaci n gen tica De todas formas el uso de este marcador podr a verificarse mediante de tecci n radiactiva Por ltimo se demostraron algunas de las pro piedades de los AFLP Vos et al 1995 McGregor et al 2000 En primer lugar son una herramienta molecular de alta eficiencia pues se genera un gran n mero de fragmentos polim rficos por cada combi naci n en segundo lugar son reproducibles Marcadores moleculares como m todo de identificaci n de genes de resistencia R1 y R2 Es muy evidente que los resultados indicaron una co rrespondencia fenot pica y genot pica en cuanto a la presencia de los genes R1 y R2 en los diferenciales de papa mediante la presencia de los marca
17. dores li gados a estos genes de resistencia ACT CAC 189 y AGC CCA 369 ligados a R2 los marcadores 76 2SF2 76 25SR y Sol 2749 2770F Sol3246 3267R espec ficos al gen R1 en referencia a la respuesta hipersensitiva encontrada en los genotipos de papa R1 y R2 hacia los aislamientos de P infestans 245L y 87BL Conforme a lo referido anteriormente se obser v una gran similitud entre el diferencial 1 y el dife rencial 2 no s lo en el aspecto fenot pico donde la respuesta hipersensitiva hacia los aislamientos 87BL y 245L fue la misma sino tambi n en el molecular Primero el producto de amplificaci n dado por los primers espec ficos 76 25F2 76 2SR y Sol 2749 2770F Sol3246 3267R en el diferencial 1 se present en el diferencial 2 segundo los fragmentos produci dos en los dos diferenciales en cada una de las com binaciones de marcadores AFLP utilizadas fueron muy similares entre s El asunto en cuesti n plantea la posibilidad de que alguno de estos genes haya evolucionado lo cual explica que sean diferenciales y que algunas de las secuencias se hayan conservado como puede ser el caso de los motivos de prote na Garc a Mas et al 2001 tomando en consideraci n que estos genes provienen de plantas silvestres S demissum Cuan do se trabaj con el material vegetal se emplearon descriptores morfol gicos Huaman 1994 y el tem de floraci n no se tuvo en cuenta car cter de gran valor taxon mico pues el materia
18. elio Este micelio fue nue vamente sembrado en medio de cultivo Inoculaci n Se prepar una suspensi n de esporangios a partir del inoculo contenido en la caja de Petri 10 20 d as de crecimiento y patog nicamente activo al cual se le agreg 1 0 ml de agua destilada el lavado se filtr para separar el micelio Se realiz un conteo de esporangios del filtrado mediante el hematocit metro m nimo seis conteos La concen 42 traci n final de esporangios fue de 4 2 5 1 E esp ml En el env s de cada fol olo se aplic una al cuota de la suspensi n 10 ul Se montaron diez repeticiones para la inoculaci n con cada uno de los aislamientos La incubaci n se realiz a 18 C con 12 horas diarias de luz y 100 de humedad relativa An lisis de la Evaluaci n de Resistencia a P infestans La evaluaci n se realiz cinco d as des pu s de la inoculaci n donde se observ la presencia o ausencia de genes R en el material de papa Se utiliz Diacol Monserrate como material testigo por que presenta resistencia polig nica y carece de genes R no se emple Solanum phureja como testigo por ser susceptible a gota Se registr la reacci n de com patibilidad o de incompatibilidad teniendo en cuenta el n mero de foliolos con lesiones esporulantes o no esporulantes respectivamente por cada una de las diez repeticiones Se registr una reacci n com patible cuando se observ esporulaci n del hongo en al
19. hippers et al 1992 Meksem et al 1995 Li et al 1998 y Ballvora et al 2002 fueron utilizadas razas puras del pat geno Sin embargo tanto con los aislamientos de P infestans utilizados de este trabajo Tabla 1 como con las razas de P infestansse conoc a su avirulencia y virulencia Se debe clarificar que la t cnica de inocula ci n de P infestans en foliolos desprendidos de papa ha sido til en investigaciones con P infestans para identificar genes R Leonards Schippers et al 1992 Meksem et al 1995 Li et al 1998 Ballvora etal 2002 y que fue el objeto de este trabajo Pero tam bi n ha sido aplicada para determinar la virulencia del pat geno Jaramillo etal 1997 Forbes 1997 cuantificar resistencia parcial en cultivares y clones de papa M ndez 1998 identificar aislamientos agresivos de P infestans probar niveles de infec ci n y respuesta a la concentraci n de esporangios Millar et al 1998 Se debe tener en cuenta un margen de error en la evaluaci n de resistencia puesto que en determi 46 nadas ocasiones en las series de repeticiones de inoculaciones por aislamiento se observ cierta va riaci n en el n mero de foliolos esporulados tres dos o uno Esto pudo deberse a que a aunque las concentraciones de esporangios utilizadas se encuen tren dentro del rango establecido por el CIP Forbes 1997 el conteo de esporangios no haya sido exac to b se haya presentado precipita
20. iedades y Genotipos de la Papa Pautas Quimiotaxon micas Universidad Austral de Chile Fa cultad de Ciencias Agrarias Instituto de Producci n y Sanidad Vegetal lt http www agrarias uach cl webpapa mpapa html gt Nustez C E 1999 Phytophthora infestans Situaci n en Latinoam rica Universidad Nacional de Colombia lt http redepapa org patologiared html gt
21. l se colect antes de esta etapa Por tal raz n es pertinente realizar es tudios complementarios por ejemplo secuenciaci n de los fragmentos amplificados ligados a cada uno de 48 los genes hibridaci n de la secuencia del gen R1 se cuencia disponible en el GenBank Ballvora et al 2002 con la secuencia del R2 para comparar estos dos materiales en el nivel molecular adem s de estu dios bioqu micos como electroforesis de prote nas y esterasas Contreras 1999 En el presente estudio aunque no era el objeti vo del trabajo se evidenci el concepto de gen por gen Flor 1971 Agrios 1997 con la presencia de los marcadores ligados al alelo R2 ACT CAC 189 y AGC CCA 369 y marcadores espec ficos para el alelo R1 76 25F2 76 25SR y Sol 2749 2770F Sol3246 3267R en referencia a 1 la reacci n de compatibilidad entre el material de papa R1 R2 y los aislamientos 276P HIN 2 la respuesta hipersensitiva encontrada entre los genotipos de papa R1 R2y los aislamientos 245L 87BL Pese a que los aislamientos de P infestans ex hibieron similar morfolog a macrosc pica y microsc pica y de acuerdo con Gualtero 1997 los aislamien tos estudiados aqu y otros m s fueron homog neos para la enzima glucosa 6 fosfato isomerasa y para prote nas solubles Sus respuestas variaron ante su inoculaci n en los materiales de papa Por ltimo por raz n del an lisis factorial comentado se verific que s existi interacci
22. la respuesta hipersensitiva observada bajo los aislamientos 87BI y 245L de P infestans Se demostr la presencia del alelo R1 median te los marcadores espec ficos 76 25F2 76 2SR Ballvora et al 2002 y Sol 2749 2770F Sol3246 3267R Jellyfish Se determin la presencia del alelo R2median te los marcadores espec ficos AFLP ACT CAC y AGC CCA Li et al 1998 Se encontr una correspondencia fenot pica y genot pica en cuanto a la presencia de los alelos R1 y R2 en los diferenciales de papa 1 y 2 respectiva mente As mismo se evidenci el concepto de gen por gen expuesto por Flor 1971 Ser a deseable realizar estudios complementa rios de las secuencias de los diferenciales para com probar si existe similitud entre stas por ejemplo secuenciaci n hibridaci n Southern Northern Western y Elisa Por otro lado se deber a implementar detecci n radiactiva o detecci n quimioluminiscente para la t cnica de AFLP en los pr ximos estudios para facilitar la visualizaci n de las bandas Los resultados del presente trabajo son de gran importancia para el estudio y control de la gota de los cultivos de papa en las zonas productoras de Colom bia La identificaci n de los genes que confieren re sistencia a P infestans mediante tecnolog a molecular permitir desarrollar con mayor eficiencia programas de mejoramiento gen tico que beneficien de manera directa los rendimientos de los cultivos en especial los de
23. n and Co pp 92 110 De Jong W Forsyth A Leister D Gebhardt C Baulcombe D C 1997 A Potato Hypersensitive Resistance Gene Against Potato Virus X Maps to A Resistance Gene Clus ter on Chromosome 5 Theor Appl Genet 95 246 252 Del Valle A 1997 La Gota Revista Papa Organo Informati vo de Fedepapa 17 3 Estrada R N 2000 La biodiversidad en el mejoramiento gen tico de la papa La Paz CIP IRGRI PRACIPA IBTA PROINPA COSUDE CID pp 159 183 Flor H H 1971 Current Status of the Gene For Gene Concept Ann Rev Phytopathol 9 275 296 Forbes A G 1997 Manual for Laboratory Work on Phytophthora infestans Quito Centro Internacional de la Papa CIP Training Manual Garcia Mas J Leeuwen H V Monfort A Carmen de Vi cente M Puigdomenech P Arus P 2001 Cloning and Mapping of Resistance Gene Homologues in Melon Plant Science 161 165 172 Gebhardt C Valkonen J P T 2001 Organization of Genes Controlling Disease Resistance in the Potato Genome Annu Rev Phytopathol 39 79 102 Gonz lez D O Palacios N Gallego G Tohme J 1995 Protocolos para marcadores moleculares Cali Unidad de Investigaci n de Biotecnolog a Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT Gualtero E J 1997 Caracterizaci n aloenzim tica de pobla ciones de P infestans en papa en el altiplano cundiboyacense de los Andes de Colombia Tesis de Maestr a Bogot D C Universidad Nacional de
24. n de fragmentos generada por marcadores AFLP en gel de poliacrilamida 6 rea 7M secci n A E fragmentos producidos por la combinaci n de primers AGC CCA A S phureja B y C Diferencial 2 n tese la flecha que se ala la presencia nica de un fragmento de peso 365 pb D y E diferencial 1 F 1 K bandas originadas por la coimbinaci n de primers ACC CAT F S phureja G y H diferencial 2 y K diferencial 1 J fragmentos producidos por la combinaci n de primers ATC CGA en el diferencial 1 L marcador de peso molecular o escalera de 50 pb W lt o 9 3 16 lt ron un fragmento de fuerte tonalidad mientras que el marcador AGC CCA produjo un fragmento tenue Fi guras 4 y 5 DISCUSI N Evaluaci n de resistencia a P infestans La ex presi n fenot pica observada cumple con la teor a del gen por gen expuesta por Flor 1971 que no es el objetivo de este trabajo seg n la cual un ACTCAC 196 200 pb 150 pb Figura 4 Amplificaci n de fragmentos generada por marcadores AFLP en gel de poliacrilamida 6 rea 7M secci n A marcador de peso molecular o escalera de 50 pb B D fragmentos producidos por la combinaci n de primers ACC CAT en los materiales de S phureja diferencial 2 y diferencial 1 respectivamente E G fragmentos originados por la combinaci n de primers ACT CAC en los materiales de S phureja diferencial 2 obs rvese la flecha que indica la presencia de la
25. n entre cada uno de los aislamien tos y los diferenciales de papa en cuanto al n mero de foliolos con lesiones esporulantes Para tener la absoluta certeza de que los genes R1 y R2 est n presentes en los materiales de papa respectivos aunque los resultados lo confirmen prue ba biol gica y marcadores al licos espec ficos se necesita estudiar la expresi n g nica de estos lo cual significa que se deben establecer cruzamientos entre materiales resistentes y susceptibles con el fin de evi denciar la segregaci n de los alelos de resistencia Estos resultados implican que si se comprue ba la expresi n de los genes de resistencia en la po blaci n segregante se justifica la aplicaci n inme diata de los marcadores moleculares estudiados en la selecci n de plantas que contienen genes de re sistencia a P infestans para fitomejoramiento selec ci n asistida por marcadores moleculares dirigido a los distintos materiales de papa colombianos sobre todo en los materiales con excelente calidad indus trial pero que son susceptibles y altamente suscepti bles a P infestans Para el primer caso se encuen tran parda pastusa yema de huevo o criolla y tuquerre a o sabanera para el segundo caso se ha bla de Diacol Capiro N stez 1999 IDENTIFICACI N DE GENES R1 Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans CONCLUSIONES Se determin la presencia de genes R1 y R2 en los diferenciales de papa 1 y 2 mediante
26. nte en los materiales suscep tibles que no poseen el gen R1 No obstante el frag mento amplificado estuvo presente en el diferencial 2 R2 Este resultado indica que estos marcadores no hacen distinci n entre los diferentes genes ma yores lo cual sugiere que debe existir cierta homolog a entre las secuencias de estos genes Lo complementaria al clon g10 10388 nucle tidos se ubica la secuencia del gen A1 Ballvora et al 2002 El fragmento amplificado por los primers SolF SolR se encuentra en la regi n donde se codifica la prote na del gen R1 El fragmento generado por los primers 76F 76R se encuentra dentro y fuera de la secuencia del gen R1 confirma el art culo de Ballvora et al 2002 donde dice que el gen R1 secuencia complementaria al clon g10 presentaba secuencias similares marco abierto de lectura con genes de resistencia de otras plantas Se requiere realizar estudios complemen tarios de las secuencias de los diferenciales para comprobar si existe similitud entre stas por ejem plo secuenciaci n hibridaci n Southern Northern Western y Elisa para comprobar si existe similitud entre las secuencias de estos genes Detecci n molecular de alelo R2 En cuanto al reconocimiento visual de las bandas respectivas se puede afirmar que fue posible gracias a la detec ci n no radiactiva o tinci n con nitrato de plata Payne 1997 Sin embargo se percibi una gran variaci n entre cada una de las tinciones realiza
27. o amplificado e iniciado por los primers GP179 dos bandas present la ma yor movilidad electrofor tica 550 pb aproximadamen te mientras que la banda correspondiente al fragmento amplificado e iniciado por los primers GP21 fue m s pesada aproximadamente 1230 pb Figura no mostra da En los materiales usados como controles negati vos te ricamente no poseen el gen R1 es decir el diferencial 2 y S phureja tambi n se encontraron las mismas bandas Figura no mostrada En el presente trabajo con los primers 76 2SF2 762SR se obtuvo una banda nica con un tama o de 1353 pb en rela ci n con el marcador de peso molecular o escalera 123 pb gel de agarosa al 1 5 evidenciado en los di ferenciales de papa uno y dos que contie nen los genes R1 yR2 respectivamente El fragmento amplificado estuvo ausente en el material susceptible S phureja Figura 2 Figura 2 Amplificaci n por PCR con los primers 76 2SF2 76 2SR en el gel de agarosa al 1 5 en moldes de ADN de A Diferencial 1 fragmento de 1353 pb del gen R1 B Diferencial 2 fragmento de 1353 pb C S phureja fragmento ausente y D marcador de peso molecular escalera de 123 pb IDENTIFICACI N DE GENES R1 Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans AS am 376 pb 519 pb Figura 3 Amplificaci n por PCR con los primers SPUD237 y Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R en gel de agarosa al 1 5 B D amplificaci n por lo
28. ocedi al recono cimiento visual de la presencia o ausencia de marca dores utilizados en este trabajo tomando como referencia los pesos moleculares obtenidos por Li et al 1998 y fueron comparados con el marcador de peso molecular empleado escalera de 50 pb para poliacrilamida en el documentador de geles Syngene Gene Tools 3 00 RESULTADOS Evaluaci n de resistencia a P infestans Con los aislamientos H1N y 276p las lesiones esporulantes observadas en los materiales de papa diferenciales 1 y 2 Diacol Monserrate correspondieron a una reac ci n de compatibilidad El aislamiento HIN produjo la mayor esporulaci n en todos los materiales Figura 1 Fue observada una respuesta hipersentitiva le siones necr ticas o puntos necr ticos sin esporulaci n en los diferenciales de papa inoculados con los aisla mientos 87BL y 245L Esta reacci n reflej la presen cia de los genes R1 y R2 en el hospedante diferen ciales 1 y 2 as como de los genes Avr 1 y Avr2 en el pat geno Figura 1 Se encontr esporulaci n con todos los aisla mientos del pat geno en Diacol Monserrate No obs 3 25 No Promedio 1 i oDi foliolos esporula 1 m02 dos 0 5 OM 0 j 87L 24 amp 5L 276p HIN Aislamientos P infestans Figura 1 Evaluaci n de resistencia a P infestans en genotipos tetraploides de papa basada en la media aritm tica del n mero de foliolos con lesiones esporulantes del total de las repeticiones N tese que no
29. ols And Strategies Trends in Plant Science 3 6 236 239 Stewart H E 1990 Effect of Plant Age and Inoculum Concentration on Expression of Major Gene Resistance to Phytophthora infestans in Detached Potato Leaflets Mycological Research 94 6 823 826 Tooley P W 1990 Variation in Resistance to Phytophthora infestans among 21 Solanum verrucosum Plant Introductions American Potato Journal 67 8 491 498 Vanderplank J E 1984 Horizontal and Vertical Resistance In Disease Resistance in Plants Second edition Orlando Academic Press Vos R Hogers R Bleeker M Reijans M Van Der Lee T Hornes M Frijters A Pot J Peleman J Kuiper M Zabeu M 1995 AFLP A New Concept for DNA Fingerprinting Nucleic Acid Research 23 21 4407 4414 Watanabe J A y Watanabe K N 2000 Pest Resistance Traits Controlled by Quantitative Loci and Molecular Breeding Estrategies in Tuber Bearing Solanum Plant Biotechnology 17 1 1 16 Young N D 1996 QTL Mapping and Quantitative Disease Resistance in Plants Annu Rev Phytopathol 34 479 501 Zapata J L 2000 Manejo integrado de las enfermedades de la papa En Manejo Integrado de la Papa Manual T c nico Corpoica pp 130 140 Recursos electr nicos Biowire Com 2000 2002 Labvelocity 2002 Jellyfish Sim ple Practical Gene Analysis Versi n 2 1 lt http www biowire com gt Contreras A 1999 Bot nica de la papa Identificaci n de Var
30. ountry Key words Molecular markers Phytophthora infestans resistant genes Solanum tuberosum ssp tuberosum INTRODUCCI N La papa es un producto agr cola de consumo masivo para la poblaci n colombiana especialmente en los estratos con menores ingresos El consumo de papa en el pa s se encuentra hoy alrededor de 71 kg per sona a o Su producci n total disponible se destina b sicamente a dos usos el consumo en fresco 80 a 92 y la industria 7 a 8 Carvajal et al 2000 La gota causada por Phytophthora infestans Mont de Bary produce en Am rica Latina la destruc ci n o quemaz n del follaje y la pudrici n seca de los tub rculos de papa Estrada 2000 Zapata 2000 En Colombia los fungicidas son el principal mecanismo de control de la gota su inversi n representa el 8 de los costos de producci n totales Del Valle 1997 El mejoramiento gen tico como mecanismo de control de P infestans est basado en la resisten cia monog nica y la resistencia polig nica La re sistencia monog nica solamente es efectiva contra ciertas razas del pat geno controlada por genes do minantes R provenientes de Solanum demissum Malcomsom y Black 1966 En este tipo de resis tencia se ha demostrado el concepto gen por gen Agrios 1996 Flor 1971 Day 1974 Vanderplank 1984 Gebhardt y Valkonen 2001 La resistencia polig nica es cuantitativa controlada por muchos genes cada uno de los cuales puede contribuir
31. s primers SPUD237 en B diferencial 1 403 pb C diferencial 2 403 pb y D S phureja 376 pb F G amplificaci n por los primers Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R en F diferencial 1 519 pb G diferencial 2 519 pb y H fragmento ausente en S phureja A y E marcador de peso molecular o esscalera de 50 pb Con los primers SPUD237 se obtuvo un pro ducto de amplificaci n en los tres materiales con un peso aproximado de 403 pb Figura 3 Con los primers Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R se eviden ci un fragmento de amplificaci n de 519 pb en el diferencial 1 y en el diferencial 2 por el contrario el fragmento estuvo ausente en el material susceptible S phureja Figura 3 Detecci n molecular del alelo R2 Los pesos moleculares citados por Li et al 1998 para cada una de las combinaciones de primers son ACC CAT 535 ACT CAC 189 AGC CCA 369 ACT CGC 250 ATC CGA 186 De las cinco combinaciones emplea das en este estudio se evidenciaron los productos de amplificaci n de dos combinaciones de primers ACT CAC y AGC CCA cuyos pesos moleculares est n muy cercanos a los reportados por Li et al 1998 stos fueron 196 pb y 365 pb respectivamente Figuras 4 y 5 en relaci n con el marcador de peso molecular o escalera de 50 pb utilizado Estas ban das se observaron nicamente en el diferencial 2 por el contrario estuvieron ausentes en el diferencial 1 y S phureja Los marcadores ACT CAC produje Figura 5 Amplificaci
32. terial susceptible Para la detecci n del alelo R2 fueron implementados cinco marca dores AFLP de los cuales s lo dos fueron reconocidos visualmente en el diferencial 2 Los resultados mostra ron una evidente correspondencia fenot pica y genot pica con respecto a la presencia de los genes RI y R2 La identificaci n molecular de genes de resistencia a P infestans permitir desarrollar programas de mejoramiento gen tico que beneficien directamente los rendimientos de los cultivos de papa sobre todo los de mayor inter s industrial para nuestro pa s Palabras clave genes de resistencia marcadores moleculares Phytophthora infestans Solanum tuberosum ssp tuberosum ABSTRACT Excellent industrial quality potato genotypes are currently available in Colombia however they are very sus ceptible to P infestans The best way of fighting this problem is by genetic resistance given that the expense of controlling this disease through chemicals is high plus the environmental contamination provoked This work try to identify R7 and R2 major genes in respective potato differentials Solanum tuberosum ssp tuberosum by evaluating P infestans resistance and their molecular detection by PCR allele R7 and AFLP allele R2 GP179 GP21 76 2SF2 76 2SR SPUD237 and Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R markers were used for R allele detection GP179 GP21 and SPUD237 markers were non specific for RI because an amplification product was generated in differen
33. tials 1 and 2 as well as S phureja 76 2SF2 76 2SR and Sol 2749 2770F Sol 3246 3267R markers created an amplification product in differentials 1 and 2 whilst the fragment was absent in the susceptible material Five AFLP markers were used for R2 allele detection only two of these were visually recognised in differential 2 The Bi loga Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Bogot Colombia Bi logo Esp Corpoica Programa Nacional de Recursos Gen ticos y Biotecnolog a Vegetal Tibaitat Ingeniero Agr nomo Ph D Corpoica Programa Agr cola Regional Uno Tibaitat Ingeniera Agr noma Ph D Universidad Nacional de Colombia Facultad de Agronom a Bogot Colombia e Ingeniero Agr nomo Ph D Corporaci n Colombiana de Investigaci n Agropecuaria CORPOICA Programa Nacional de Recursos Gen ticos y Biotecnolog a Vegetal Tibaitat km 14 v a Mosquera Cundinamarca A A 240142 Las Palmas Bogot Colombia e mail vnunezOcorpoica org co Recibido Febrero 24 de 2003 Aceptado Julio 15 de 2003 IDENTIFICACI N DE GENES R Y R2QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans results showed evident phenotypic and genotypic correspondence respecting R7 and R2 gene presence Molecular identification of P infestans resistant genes will allow breeding programmes to be developed directly benefiting potato crop yields above all those having the greatest industrial interest for our c
34. um tuberosum ssp andigena presenta resistencia polig nica y carece de genes mayores cinco repro ducciones del diferencial 1 reproducciones de Solanum tuberosum ssp tuberosum con gen espec fico R1 siete reproducciones del diferencial 2 reproducciones de S tuberosum ssp tuberosum con gen espec fico R2 Tambi n se trabaj con 75 reproducciones de la variedad Diacol Capiro material muy susceptible a gota exclusivamente para la activaci n de la virulen cia de los aislamientos de P infestans as como tam bi n con tub rculos de la variedad Tuquerre a mate rial susceptible a gota Los diferenciales fueron multiplicados mediante esquejes de tallo juvenil Cor zo 1998 As mismo fueron colectadas hojas de 69 plantas de Diacol Monserrate multiplicadas por esque jes de tallo juvenil y suministradas por el Programa Regional Agr cola de la Regional Uno de Corpoica El material vegetal fue caracterizado con la ayuda de descriptores morfol gicos del CIP Huaman 1994 Evaluaci n de resistencia a P infestans Recolecci n de material vegetal Tres foliolos de hojas sanas completas Diacol Monserrate y diferen ciales de papa con un mes de desarrollo aproxima 41 REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOG A VOL V No 2 Diciembre 2003 40 50 damente fueron montados con el env s hacia arriba en cajas de Petri con papel absorbente humedecido con agua destilada en su interior Obtenci n del inoculo Se utilizaron los
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