Ref. 4301 Ref. 4302 Ref. 4304 Ref. 4381* Ref. 4308 Ref. 4309 Ref
Contents
1. HYDRAGEL 1 IF Violet Acide Acid Violet Ref 4301 HYDRAGEL 21F Violet Acide Acid Violet Ref 4302 HYDRAGEL 4 IF Violet Acide Acid Violet Ref 4304 Ref 4381 HYDRAGEL 4 IF Amnidoschwarz Amidoblack Ref 4308 HYDRAGEL 9 IF Violet Acide Acid Violet Ref 4309 Ref 4382 Masque dynamique Dynamic mask 2009 01 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask ESPECIFICACIONES DE USO Los kits HYDRAGEL 1 IF 2 IF 4 IF y 9 IF permiten la detecci n de prote nas monoclonales en el suero y la orina humanos mediante inmunofijaci n en gel de agarosa en el sistema semiautom tico HYDRASYS El sistema HYDRASYS permite realizar todas las etapas hasta la obtenci n del gel listo para la interpretaci n Las prote nas son separadas en tamp n alcalino pH 9 1 y luego son inmunoprecipitadas con antisueros de diferentes especificidades anti cadenas pesadas gamma lg G alfa lg A y mu Ig M y anti cadenas ligeras kappa y lambda libres y ligadas Despu s de la inmunofijaci n las prote nas precipitadas son coloreadas con una soluci n de violeta cido o de negro amido El exceso de colorante es eliminado en medio cido Cada gel de agarosa est pensado para analizar 1 muestra en el kit HYDRAGEL 1 IF 2 muestras en el kit HYDRAGEL 2 IF 4 muestras en los kits HYDRAGEL 4 IF 9 muestras en los kits HYDRAGEL 9 IF Los kits HYDRAGEL 4 IF est n disponibles con el color2. introduzca dentro del contenedor de desechos vac o 15 ml de sosa al 50 soluci n comercial Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar la soluci n decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada La soluci n stock de decolorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial NO CONGELAR La soluci n decolorante de trabajo es estable una semana a temperatura ambiente en un contenedor cerrado No a adir azida s dica Desechar la soluci n decolorante de trabajo si cambia su apariencia p ej si se vuelve turbia debido a contaminaci n bacteriana Para evitar la proliferaci n microbiana en la soluci n decolorante diluida que se vaya a almacenar durante m s de una semana a ada 5 uL dL de ProClin 300 El decolorante diluido al que se ha a adido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante 3 SOLUCI N DE LAVADO HYDRASYS Preparaci n Cada vial de la Soluci n stock de lavado HYDRASYS SEBIA PN 4541 10 vials 80 ml cada una se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de trabajo de lavado contiene tamp n alcalino pH 8 8 0 3 azida s dica ATENCI N La soluci n stock de lavado contiene azida s dica 0 625 No ingerir En caso de ingesti n accidental consultar inmediatamente
3. n elevados 4 Seleccione en el men el programa de migraci n 1 IF ME MD para el HYDRAGEL 1 IF 2 4 IF ME MD para el HYDRAGEL IF 2 4 9 IF MD para el HYDRAGEL 9 IF 5 Extraer las esponjas tamponadas de su envoltorio asirlas por los extremos de pl stico Engarzar los extremos de pl stico agujereados con las puntas met licas del soporte de los electrodos los extremos de pl stico deben quedar encarados al soporte Fig 2 6 Abrir el contenedor del HYDRAGEL Extienda un papel de filtro fino de manera r pida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de l quido Retire el papel inmediatamente ADVERTENCIA Para evitar que se deshidrate no deje que el papel de filtro contacte con el gel durante mucho tiempo Dispense 120 pl de agua destilada o desionizada para el HYDRAGEL 1 IF 6 200 ul para el HYDRAGEL IF 2 4 e HYDRAGEL 9 IF en el tercio inferior del cuadro serigrafiado en la placa del m dulo de migraci n Colocar el gel la cara de agarosa hacia arriba con su lado inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado Fig 3 Aplicar el gel en la superficie haci ndolo contactar con el agua Fig 3 Asegurarse que no queden burbujas que el agua est extendida bajo toda la superficie del gel y que ste est alineado con el marco serigrafiado 7 Devolver ambos soportes a su posici n original Las esponjas tamponadas no deben tocar el gel NO FORZAR LOS SOPORTES HACIA ABAJO 8 Extraer e
4. 0 3 azida s dica aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un resultado ptimo ATENCI N El tamp nde las esponjas contiene barbital 0 92 barbital s dico 1 03 y azida s dica 0 30 No ingerir En caso de ingesti n accidental consultar inmediatamente al m dico Cuando sea posible evitar el contacto con cidos plomo o cobre ya que se conoce su tendencia a formar compuestos explosivos con la azida s dica Uso Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio de tamp n de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba Son estables hasta la techa de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora NO LAS CONGELE Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa est abierta o si las esponjas est n secas 3 DILUYENTE DEL COLORANTE Ref N 4308 Preparaci n El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el p rrafo COLORANTE NEGRO AMIDO Contiene una soluci n cida Uso Para la preparaci n del colorante negro amido Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera Es estable
5. Boss Ergot Pin Puits wells Support barrette Segment Holder Poign e Flap Encoche notch Point d appui central Central Pressure Point Ressorts Springs R ducteur de course Length Reducing Device Guide du masque dynamique Dynamic Mask Guide Poign e Flap dynamique Dynamic mask HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 IF 2009 01 Masque SCH MAS FIGURES Figure 7 Figure 9 Figure 11 Figure 6 Figure 8 Figure 10 218 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 12 Figure 13 219
6. La mayor a de las muestras de orina deben ser concentradas mediante un dispositivo apropiado para conseguir que la concentraci n proteica total sea de unos 5 g l o una concentraci n de inmunoglobulinas totales alrededor de 1 g l Si no se conoce la concentraci n proteica urinaria concentre la orina de 20 a 100 veces mediante un dispositivo apropiado IMPORTANTE Algunas orinas contienen una concentraci n importante de sales stas producen una deformaci n del gel durante la migraci n que puede alterar los perfiles despu s de la electroforesis Conviene eliminar este exceso de sales mediante di lisis En caso de orinas turbias concentradas o no se recomienda eliminar las part culas centrifugando las muestras durante 10 minutos a 3000 r p m o mediante filtraci n con un filtro de 0 45 um para obtener una buena difusi n en los aplicadores La sensibilidad puede mejorarse aumentando el tiempo de aplicaci n de las muestras y el tiempo de incubaci n con el antisuero usando el programa de migraci n BENCE JONES El l mite de detecci n de una prote na monoclonal es entonces entre 10 y 50 mg l En esta t cnica las orinas pueden analizarse sin concentrar o concentradas para mejorar la sensibilidad NOTA Una concentraci n demasiado importante de la muestra puede acarrear la aparici n de artefactos tales como falsas bandas de aspecto monoclonal Es por tanto importante no concentrar las orinas por encima de la concentraci n recomen
7. Los precipitados y las proteinas fijadas son visualizados mediante tinci n Para identificar de forma precisa la naturaleza de la banda monoclonal la muestra es analizada en seis carriles Despu s de la electroforesis el carril ELP sirve de referencia gracias a que la soluci n fijadora ha precipitado todas las prote nas presentes los otros cinco carriles permiten caracterizar la o las bandas monoclonales gracias a anticuerpos espec ficos anti cadenas pesadas gamma lg G alfa Ig A y mu Ig M y anti cadenas ligeras kappa y lambda libres y ligadas Esta t cnica sencilla y r pida proporciona una imagen clara y f cilmente interpretable REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL 1 IF HYDRAGEL 2 IF HYDRAGEL 4 IF E HYDRAGEL 9 IF KIT HYDRAGEL 1 IF PN 4301 KIT HYDRAGEL 2 IF PN 4302 KITS HYDRAGEL 4 IF PN 4304 PN 4308 PN 4381 KITS HYDRAGEL 9 IF PN 4309 PN 4382 Geles de Agarosa listos para su uso 10 geles 10 geles 10 geles 80 geles Esponjas tamponades listas para su uso 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 80 bolsas de 2 Diluyente del colorante soluci n stock 1 vial de 60 ml Colorante Negro Amido soluci n stock 1 vial de 20 ml Colorante Violeta Acido soluci n stock 1 vial de 75 ml 1 vial de 75 ml 8 viales de 75 ml Diluyente listo para su uso 1 vial de 3 2 ml 1 vial de 32 ml 1 vial de 32 ml 2 viales de 80 ml 3 viales de 80 ml
8. Soluci n Fijadora lista para uso 1 vial de 2 9 mi Inmunoglobulinas totales de mam fero 1 vial de 2 0 m anti cadenas pesadas gamma listo para usar Inmunoglobulinas totales de mam fero 1 vial de 2 0 m anti cadenas pesadas alfa listo para usar Inmunoglobulinas totales de mam fero 1 vial de 2 0 m anti cadenas pesadas mu listo para usar Inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas 1 vial de 2 0 m ligeras kappa libres y ligadas listo para usar Inmunoglobulinas totales de mam fero anti cadenas 1 vial de 2 0 mi ligeras lambda libres y ligadas listo para usar Applicadores listos para su uso 1 caja de 10 2 cajas de 10 2 cajas de 10 16 cajas de 10 3 cajas de 10 24 cajas de 10 Segmentos para antisueros listos para usar 1 caja de 10 1 caja de 10 1 caja de 10 8 cajas de 10 Papeles de Filtro finos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 1 paquete de 10 8 paquetes de 10 Papeles de Filtro gruesos 1 paquete de 10 1 paquete de 10 1 paquete de 10 8 paquetes de 10 HYDRAGEL 4 IF MAXI KIT HYDRAGEL 9 IF MAXI KIT NOTA La soluci n fijadora y los antisueros se comercializan por separado excepto en los MAXI KITS consulte REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 52 INSTRUCCIONES SEBIA Espa ol HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask PARA OBTENER RESULTADOS PTIMOS Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y seg n las instrucciones incluidas LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES 1 GE
9. hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente NO LO CONGELE No le a ada azida s dica 4 COLORANTE NEGRO AMIDO Ref N 4308 Preparaci n El colorante negro amido concentrado es una soluci n viscosa que puede gelificarse lo que no afecta de ning n modo a la calidad de la soluci n final y su capacidad de coloraci n Para obtener una perfecta reconstituci n del colorante siempre hay que prepararlo como se indica a continuaci n 1 A ada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado Cierre el vial con cuidado Agite el vial intensamente durante un m nimo de 5 segundos Vierta la soluci n obtenida en el recipiente de preparaci n de la soluci n de coloraci n Repita esta operaci n dos veces o tres veces si es necesario Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparaci n de la soluci n de coloraci n Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada 8 Agite esta soluci n de 5 a 10 minutos El colorante est listo para usar NOTA Una reconstituci n incompleta del colorante puede implicar una mala coloraci n de la fracci n alb mina disminuci n de su porcentaje o aparici n de un agujero blanco en el centro de la fracci n Despu s de la diluci n la soluci n colorante contiene soluci n cida pH 2 negro amido 4 g L etil n glicol 6 7 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funciona
10. mientras se produce el proceso de secado VI PREPARACI N DE LAS ETAPAS DE LAVADO COLORACI N Y DECOLORACI N DEL GEL 1 Abrir la tapa 2 Extraer el gel una vez seco para su procesado posterior 3 Abrir el soporte del gel Colocar el gel seco con la superficie mirando hacia arriba en los orificios de las dos varillas y cerrar el soporte Comprobar que el gel est colocado adecuadamente dentro del soporte Fig 13 4 Colocar el soporte en el M dulo de Procesado Coloraci n IMPORTANTE Antes de comenzar con el procesado coloraci n comprobar lo siguiente Contenedor de Soluci n de lavado contenido m nimo de 400 ml Contenedor de Colorante 300 ml de colorante Contenedor de Decolorante como m nimo 1 litro Contenedor de Deshechos vac o Los canales no utilizados deber n taparse 5 Seleccionar el programa de coloraci n IF ACID VIOLET o IF AMIDO e iniciar el proceso apretando la tecla START flecha verde situada a la derecha en el teclado Durante todas las secuencias de coloraci n decoloraci n y secado el sistema permanece bloqueado Despu s del enfriamiento de la cubeta una se al sonora bip suena y el sistema se desbloquea la ventilaci n se mantiene hasta la recuperaci n del porta films NOTAS La temperatura de la placa de migraci n puede descender hasta 20 C mientras permanezca abierta la tapa en menos de 5 minutos En este momento podremos iniciar una nueva migraci n Vol
11. ntico al descrito para el suero Una gammapat a presencia de una inmunoglobulina monoclonal se caracteriza por una banda estrecha detectada con uno de los anti cadenas pesadas gamma alfa o mu y con uno los anti cadenas ligeras kappa o lambda La fracci n monoclonal detectada generalmente estrecha y bien visible debe estar situada en el mismo nivel de migraci n que la banda detectada en el carril de referencia ELP Una prote na de Bence Jones se caracteriza por una banda monoclonal detectada con un anti cadenas ligeras libres y ligadas kappa o lambda carriles K o L la ausencia de banda monoclonal con los anti cadenas pesadas gamma alfa o mu carriles G A o M Una prote na de Bence Jones que presenta diferentes estados de polimerizaci n se caracteriza por varias bandas detectadas con un anti cadenas ligeras libres y ligadas kappa o lambda carriles K o L la ausencia de banda monoclonal con los anti cadenas pesadas gamma alfa o mu carriles G A o M Habr que realizar un tratamiento reductor con B mercaptoetanol a la muestra para despu s volver a hacer la inmunofijaci n usando antisueros anti cadenas ligeras libres anti kappa libre o anti lambda libre Una paraprote na s rica que pasa a la orina con ausencia de prote na de Bence Jones se caracteriza por una banda monoclonal detectada con los anti cadenas pesadas gamma alfa o mu carriles G A o M la misma banda detectada con un anti cadenas lige
12. LES DE AGAROSA Preparaci n Los geles de agarosa est n listos para el uso Cada gel contiene agarosa 8 g l tamp n tris barbital pH 9 1 0 1 aditivos inocuos a las concentraciones usadas ATENCION Los geles de Agarosa contienen barbital 0 31 barbital s dico 0 34 No ingerir Si se ingiere accidentalmente consultar inmediatamente al m dico Uso Medio de soporte para la electroforesis de proteinas e inmunofijaci n Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar los geles horizontalmente en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente 15 a 30 C o refrigerados 2 a 8 C Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en sus recipientes protectores La flecha situada en la cara frontal de la caja del kit debe apuntar hacia arriba Evitar su almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor Evitar variaciones importantes de temperatura durante su almacenamiento NO CONGELAR Desechar cuando i haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda consecuencias de la congelaci n del gel ii se observe crecimiento bacteriano o f ngico iii se videncie una cantidad excesiva de l quido en el recipiente del gel consecuencia de la exudaci n del tamp n debida a un almacenamiento inadecuado 2 ESPONJAS TAMPONADAS Preparaci n Las esponjas tamponadas est n listas para su uso Contienen tamp n tris barbital pH 9 1
13. a En la pantalla aparece el mensaje Y PAP NOTA Durante la incubaci n la tapa del m dulo de migraci n permanece bloqueada IV ABSORCI N CON PAPEL 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Aplique un papel de filtro grueso sobre el gel incline el papel de filtro grueso unos 45 y alinee el borde inferior del papel de filtro con el borde inferior del gel coloque el papel encima del gel ATENCI N Presione sobre toda la superficie del papel de filtro para asegurar un contacto perfecto entre el gel y el papel 3 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 4 Inicie el procedimiento apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado ABSORCI N CON PAPEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Absorci n a 40 C controlados por efecto Peltier durante 3 minutos En la pantalla aparece el mensaje ABSORCION Suena un pitido En la pantalla aparece el mensaje 4 PAP V SECADO DEL GEL 1 Abrir la tapa del m dulo de migraci n 2 Extraer el papel de filtro dejando el gel en su posici n actual 3 Cerrar la tapa 4 Apretar la tecla START flecha verde situada a la izquierda en el teclado SECADO DEL GEL DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Secado a 50 C controlado mediante efecto Peltier durante 6 minutos Un pitido nos indica que debemos levantar la tapa El gel permanecer a 50 C mientras la tapa permanece cerrada NOTA El m dulo de migraci n permanece cerrado
14. a Fig 7 equipada con un reductor de superficie para el an lisis de 1 6 2 muestras y luego ponga la gu a de referencia coloreada que indica los lugares en los que aplicar los reactivos correspondiente a la t cnica sobre el soporte del segmento delante de los pocillos del segmento para antisueros Fig 8 4 Aplique los reactivos cuyo color se indica en la tabla inferior en el segmento para antisueros Segmento de 6 pocillos para HYDRAGEL 1 IF 8 pl por pocillo Segmento de 15 pocillos para HYDRAGEL IF 2 4 8 pl por pocillo para el an lisis de 2 muestras 12 pl por pocillo para el an lisis de 4 muestras Segmento de 18 pocillos para HYDRAGEL 9 IF 8 pl por pocillo CARRIL REACTIVO COLOR ELP Soluci n Fijadora Amarillo G antisuero anti cadenas pesadas gamma Rosa A antisuero anti cadenas pesadas alfa azul oscuro M antisuero anti cadenas pesadas mu verde amarillento K antisuero anti cadenas ligeras kappa libres y ligadas verde claro k antisuero anti cadenas ligeras lambda libres y ligadas azul claro NOTA Para evitar errores en la aplicaci n los reactivos est n coloreados y el color del carril a rellenar aparece en la gu a de referencia coloreada IMPORTANTE En el an lisis hecho con HYDRAGEL IF 2 4 no utilice los pocillos del segmento de antisueros que est n en las posiciones 1 8y15 Aspire los reactivos sin que se formen burbujas de aire en la punta de la pipeta Para apli
15. a el HYDRAGEL 1 IF 2 4 muestras para el HYDRAGEL IF 2 4 seg n el kit y 9 muestras para el HYDRAGEL 9 IF Diluirlos sueros antesde su aplicaci n para prevenir el efecto prozona consecuencia de elevados niveles de ant geno mezclando de forma homog nea CARRIL SUERO pl DILUYENTE pl Carril inmunol gico G 20 100 Perfil electrofor tico ELP y los otros carriles inmunol gicos 30 60 Casos particulares Sila concentraci n de inmunoglobulinas es superior a 20 g l en caso hipergammaglobulinemia se recomienda aumentar el factor de diluci n de las muestras excepto en el carril ELP con el fin de obtener una concentraci n de inmunoglobulinas normal Si la concentraci n de inmunoglobulinas es inferior a 5 g l en caso de hipogammaglobulinemia se recomienda disminuir el factor de diluci n de las muestras Para realizar una investigaci n de la presencia de cadenas ligeras libres s ricas o urinarias se recomienda usar el programa de migraci n BENCE JONES Para ello el an lisis podr realizarse con el kit IF y con los antisueros ANTI KAPPA LIBRE SEBIA referencia N 4370 y ANTI LAMBDA LIBRE SEBIA referencia N 4371 o con el kit HYDRAGEL 1 2 4 BENCE JONES SEBIA referencias N 4321 4322 4324 En caso de b squeda de cadenas libres s ricas diluya el suero con salina o con el diluyente para inmunofijaci n prediluido a 1 4 1 volumen de diluyente 3 vol menes de agua destilada o desioniz
16. acci n con uno de los antisueros anti cadenas ligeras eso puede significar a la presencia de una gammapat a de lg D Ig E que habr que confirmar con los antisueros anti cadenas pesadas detla o psilon b la presencia de una cadena ligera libre que habr que confirmar con los antisueros espec ficos anti cadenas ligeras libres kappa o lambda La presencia de bandas en alguna de las pistas correspondientes a los antisueros anti cadenas ligeras y a su vez en las pistas corresponcdientes a los antisueros cadenas pesadas puede indicarnos una Gammapat a de cadenas pesadas muy poco frecuente Presencia de dos o m s componentes monoclonales En algunos casos la proliferaci n de varios clones de c lulas B se muestran como varias bandas al realizar una inmunofijaci n Una gammapat a biclonal se caracteriza por la presencia de dos bandas en la zona correspondiente al las cadenas pesadas iguales o diferentes y dos bandas en la correspondiente a las cadenas ligeras iguales o diferentes Las inmunoglobulinas polimerizadas se caracterizan por la presencia de varias bandas en la misma cadena pesada y la misma cadena ligera Habr que realizar un tratamiento reductor con B mercaptoetanol a la muestra para despu s volver a hacer la inmunofijaci n para confirmar la presencia de una sola anomal a monoclonal Vea Muestras para el an lisis Un perfil oligoclonal se caracteriza por la presencia de m ltiples bandas en una o varias cadena
17. ada a 1 10 para los carriles ELP GAM K y L 1 volumen de suero 9 vol menes de diluyente prediluido o de salina y a 1 3 1 volumen de suero 2 vol menes de diluyente prediluido o de salina para los carriles revelados con los antisueros anti kappa libre y anti lambda libre Si la concentraci n de inmunoglobulinas es inferior a 5 g l se recomienda diluir menos el suero por ejemplo a 1 5 para los carriles ELP GAM K y L y a 1 2 para los carriles KI y LI Despu s de la conservaci n en la nevera entre 2 y 8 C o de la congelaci n algunos sueros en particular los que contienen una crioglobulina o un criogel se vuelven viscosos o turbios Estos sueros presentan dificultades de aplicaci n cuando se usa el aplicador de HYDRASYS ya que no difunden bien en los dientes del aplicador Hay que tratar estos sueros con Fluidil antes de aplicarlos a ada 25 pl de Fluidil a 75 yl de suero agite 15 segundos en el v rtex y luego siga con el procedimiento normal Algunas paraprote nas est n polimerizadas y el suero presenta entonces una banda de aspecto monoclonal en todos los carriles Prepare una soluci n reductora a adiendo un 1 de B mercaptoetanol BME en Fluidil Trate estos sueros antes de aplicarlos con esta soluci n a ada 25 pil de soluci n reductora a 75 yl de suero puro agite en el v rtex y deje en reposo durante 15 minutos como m nimo m ximo 30 minutos y luego siga con el procedimiento normal Orinas concentradas
18. ado el l mite de detecci n de una paraprote na puede variar de 0 12 a 0 25 g L 62 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY Pour des informations compl mentaires sur l interpr tation des profils obtenus par immunofixation voir For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to 1 Le Carrer Didier lectrophor se des Prot ines et Immunofixation Guide d interpr tation Laboratoires SEBIA 1994 Hatier Paris 2 Keren D F High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation Butterworth Heinemann Woburn Ma USA 2nd ed 1994 397 pp Su L Keren DF Warren JS Failure of anti lambda immunofixation reagents mimics alpha heavy chain disease letter Clin Chem 41 121 122 1995 Wendling A Proc dures de diagnostic ou de d pistage Justification et validit d un test de diagnostic ou de d pistage sensibilit sp cificit Impact Internat 1986 Sept 93 97 3 215 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 216 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask SCH MAS FIGURES Figure 5 Rep re couleurs Colored Reference Guide Barrette antis rums Antisera Segment Bossage
19. ador para el HYDRAGEL 1 IF 6 HYDRAGEL IF 2 4 2 muestras dos aplicadores para el HYDRAGEL IF 2 4 4 muestras 6 3 aplicadores para el HYDRAGEL 9 IF en una superficie plana con los n meros de los pocillos hacia arriba Fig 1 Aplique 10 yl de muestra suero diluido u orina concentrada en cada pocillo La carga de cada aplicador debe hacerse en menos de 2 minutos CARRIL MIGRACION IMMUNOFIJACION POCILLOS DE APLICACION ELP G A M HYDRAGEL 1 IF 1 2 3 4 5 6 HYDRAGEL IF 2 4 MUESTRA No 10 3 2 3 4 5 6 7 MUESTRA No 2 0 4 9 10 11 12 13 14 HYDRAGEL 9 IF MUESTRA No 1 407 1 2 3 4 5 6 MUESTRA No 2 508 7 8 9 10 11 12 MUESTRA No 3 609 13 14 15 16 17 18 IMPORTANTE En el an lisis hecho con HYDRAGEL IF 2 4 no utilice los pocillos 1 8 y 15 se recomienda identificarlos previamente con un rotulador para evitar aplicar muestra en ellos por error Colocar cada aplicador en la c mara h meda con el peine hacia arriba asirlos por el pl stico protector del peine Ver la hoja de instrucciones de la c mara h meda para m s detalles Deje que las muestras difundan durante 5 minutos despu s de la aplicaci n de la ltima muestra Para una conservaci n prolongada 8 horas como m ximo coloque la c mara h meda en la nevera 3 Abrir la puerta del M dulo de migraci n y elevar los soportes de los electrodos y el aplicador ATENCI N Nunca cerrar la puerta cuando los soportes est
20. al autom tico como el HYDRAPLUS SEBIA referencia N 1216 6 HYDRAPLUS 2 SEBIA referencia N 1217 para la carga de los aplicadores o de los segmentos para antisueros C mara h meda referencia N 1270 suministrada con el sistema HYDRASYS Contenedores de reactivo de pl stico suministrados con el sistema HYDRASYS Gu a met lica de la plantilla SEBIA suministrada con el sistema HYDRASYS Plantilla din mica SEBIA referencia N 1255 Pipetas de 8 l 10 pl 12 pl 20 pul 100 pul y 200 pul MUESTRAS PARA EL ANALISIS Extracci n y almacenamiento de las muestras Se recomienda analizar muestras frescas El suero y la orina deben obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en los laboratorios cl nicos Refrigere las muestras 2 a 8 C tan pronto como sea posible despu s de su obtenci n durante una semana Para per odos de almacenamiento m s prolongados almacene las muestras congeladas son estables durante un mes al menos Congelar los sueros con azida s dica 0 2 g l mejora la estabilidad del almacenaje La conservaci n de las orinas congeladas mejora a adiendo a la muestra tamp n HEPES 0 1 M pH 6 75 y o azida s dica 0 2 g l IMPORTANTE No utilice conservantes que contengan cido b rico Las muestras descongeladas pueden dar lugar a ligeras marcas de aplicaci n debidas a la desnaturalizaci n de prote nas o lipoprote nas Preparaci n de las muestras Te Sueros Diluya 1 muestra par
21. al m dico Cuando sea posible evitar el contacto con cidos plomo o cobre ya que se conoce su tendencia a formar compuestos explosivos con la azida s dica Lavar siempre con gran cantidad de agua Uso Sirve patra limpiar el Compartimento de Tinci n del HYDRASYS Usar peri dicamente p ej si el instrumento se usa a diario lavar el compartimento de tinci n semanalmente Ver la hoja de instrucciones para las indicaciones de uso Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar ambas soluciones de lavado stock y de trabajo a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados La soluci n stock de lavado es estable hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas del vial Desechar la soluci n de trabajo de lavado si cambia su apariencia p ej si se vuelve turbia debido a contaminaci n bacteriana 4 FLUIDIL Preparaci n El Fluidil SEBIA PN 4587 5 ml est listo para su uso Uso Para diluir muestras turbias o viscosas p ej sueros que contienen crioglobulinas o criogeles Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar a temperatura ambiente es estable hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas del vial de Fluidil El Fluidil debe mostrar ausencia de precipitados 55 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS na Non Sistema HYDRASYS SEBIA referencia N 1210 6 N 1211 Pipeteador manu
22. ante violeta cido o con negro amido Para uso diagn stico In Vitro PRINCIPIO DEL TEST Las bandas anormales de las separaciones electrofor ticas de prote nas de suero y orina principalmente aquellas situadas en las fracciones de beta globulinas y de gamma globulinas son siempre sospechosas de ser prote nas monoclonales prote nas M paraprote nas inmunoglobulinas monoclonales y por lo tanto son un indicio de gammapat as monoclonales Para identificar esas bandas anormales se aplica la t cnica de la inmunofijaci n La electroforesis seguida de inmunofijaci n es una t cnica sencilla que permite que una prote na sea retenida despu s de la electroforesis in situ mediante la formaci n de un complejo insoluble con su anticuerpo Es f cil de realizar en cuatro etapas y de f cil interpretaci n 1 Separaci n de prote nas mediante electroforesis en gel de agarosa 2 Inmunofijaci n inmunoprecipitaci n de las prote nas separadas electrofor ticamente los carriles de migraci n electrofor tica apropiados son recubiertos con los antisueros individuales Los antisueros difunden dentro del gel y precipitan los ant genos correspondientes cuando est n presentes Las prote nas del carril de referencia son fijadas con una soluci n fijadora 3 Las prote nas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado La precipitaci n del complejo ant geno anticuerpo queda ifijado en la matriz del gel 4
23. car los reactivos Fig 9 sostenga la pipeta inclinada apoye ligeramente la punta de la pipeta en un lado del pocillo y dispense la gota de reactivo en el pocillo 5 Retire la gu a de referencia coloreada Il INMUNOFIJACI N 1 Abra la tapa del m dulo de migraci n 2 Saque el los aplicador es y t relo s 3 Eleve los soportes de los electrodos y los aplicadores y saque las esponjas tamponadas cogi ndolas por las leng etas y tirelas Saque los soportes de los electrodos y los aplicadores Limpie los electrodos con un pa uelo de papel humedecido Deje el gel en su lugar en el m dulo de migraci n 4 Ponga en su lugar la plantilla din mica de aplicaci n de reactivos de la forma siguiente Fig 10 coloque la barra met lica destinada al enganche de la plantilla din mica con ayuda de los pernos de anclaje Una vez colocada la barra met lica puede permanecer en el HYDRASYS coloque las muescas de la plantilla en las se ales de la barra cogiendo la plantilla por la leng eta gire la plantilla para colocarla en la placa del HYDRASYS IMPORTANTE Ajuste previamente la posici n de la plantilla para obtener una correspondencia perfecta entre los perfiles electrofor ticos del gel y los carriles de inmunofijaci n de la plantilla 5 Ponga el soporte del segmento en el punto m s bajo de la gu a dirigido hacia el operario Sostenga el conjunto soporte segmento por el asa situada a la derecha y presione en el pu
24. dad de los diferentes reactivos del kit as como las informaciones relativas a la eliminaci n de los desechos est n disponibles en el Servicio de Asistencia T cnica de su distribuidor CARACTERISTICAS TECNICAS Reproducibilidad intraserial T cnica HYDRAGEL 4 IF Migraci n de tres 3 muestras de suero patol gicas Dos sueros con una fuerte gammapat a monoclonal y un suero que presenta dos paraproteinas d biles La migraci n y la inmunofijaci n de cada muestra se ha realizado con 2 lotes diferentes de geles HYDRAGEL IF 2 4 a raz n de 4 an lisis por gel seguidos de una coloraci n con violeta cido T cnica HYDRAGEL 9 IF Migraci n de tres 3 muestras de suero patol gicas con una fuerte gammapat a monoclonal presentando cada muestra una paraprote na La migraci n y la inmunofijaci n de cada muestra se ha realizado con 2 lotes diferentes de geles HYDRAGEL 9 IF a raz n de 9 an lisis por gel seguidos de una coloraci n con violeta cido Todas las muestras analizadas proporcionan los mismos resultados para los 2 lotes de geles probados Los perfiles obtenidos son caracter sticos de cada una de las muestras analizadas En la t cnica HYDRAGEL 4 IF la inmunofijaci n s lo detecta una banda monoclonal en las dos primeras muestras y detecta las dos bandas monoclonales esperadas en la tercera muestra patol gica En la t cnica HYDRAGEL 9 IF la inmunofijaci n s lo detecta una banda monoclonal en cada una de las tres mue
25. dada Caso particular Algunas cadenas ligeras tienden a polimerizarse y a formar agregados y la orina presenta entonces una banda de aspecto monoclonal en todos los carriles Trate las muestras como sigue mezcle 100 pl de orina y 5 ul de B mercaptoetanol diluido previamente a 1 10 con agua destilada o desionizada o con soluci n salina agite en el v rtex y deje que incube de 10 a 15 minutos y luego siga con el procedimiento habitual 56 HYDRAGEL 1 2 4 amp 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask Muestras a descartar No utilice plasma El fibrin geno da lugar a una banda cerca del punto de aplicaci n Esta banda puede falsear la interpretaci n del resultado ya que puede confundirse con una gammapat a No use muestras hemolizadas No use muestras de orina antiguas o mal conservadas ya que pueden haber sido alteradas por degradaciones enzim ticas PROCEDIMIENTO El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautom tico multiparam trico Las etapas autom ticas incluyen el procesamiento de los geles de agarosa HYDRAGEL en la siguiente secuencia aplicaci n de la muestra migraci n electrofor tica secado tinci n destinci n y secado final Las etapas manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles y la puesta en marcha del instrumento para la operaci n LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS l PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACI N 1 Encender el HYDRASYS 2 Coloque un aplic
26. en conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera 11 PAPELES DE FILTRO GRUESOS Uso Papeles de filtro gruesos de un solo uso para la eliminaci n de prote nas no precipitadas del gel despu s de haber realizado la inmunofijaci n Conservaci n Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 1 CAJA DE ANTISUEROS Y SOLUCI N FIJADORA PARA IF para los kits 4301 4302 4304 4308 y 4309 La Caja de Antisueros y Soluci n Fijadora para inmunofijaci n IF SEBIA referencia N 4315 contiene cinco viales de antisueros y un vial de soluci n fijadora de 1 ml cada uno espec ficos de la t cnica de inmunotfijaci n realizada con la plantilla din mica 1 1 ANTISUEROS Vea el p rrafo precedente 7 1 1 2 SOLUCI N FIJADORA Vea el p rrafo precedente 7 2 2 SOLUCI N DECOLORANTE Preparaci n Cada vial de Soluci n Decolorante stock SEBIA PN 4540 10 viales de 100 ml se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada Es conveniente diluir s lo 5 ml de la soluci n stock hasta 5 litros volumen del contenedor de la soluci n decolorante Despu s de la diluci n la soluci n decolorante de trabajo contiene cido c trico 0 5 g l Uso Para la destinci n eliminaci n del exceso de tinci n y de fondo de los geles Para el lavado del compartimento de coloraci n Para neutralizar la acidez del decolorante
27. endo la temperatura controlada por efecto Peltier El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos Un pitido audible se produce al finalizar la migraci n En pantalla aparece el siguiente mensaje Y AS NOTA El m dulo de migraci n permanece con la puerta cerrada durante los pasos de migraci n correspondientes I PREPARACI N DE LA INMUNOFIJACI N Los diferentes elementos de la plantilla din mica gu a de referencia coloreada segmento para antisueros soporte del segmento gu a y reductor de superficie aparecen en la figura 5 Durante la migraci n prepare la plantilla din mica de la forma siguiente 1 Ponga la gu a de la plantilla din mica en una superficie plana IMPORTANTE El an lisis de una o dos muestras con la plantilla din mica necesita la utilizaci n del reductor de superficie que debe colocarse en la gu a de la plantilla din mica 2 Ponga un segmento para antisueros en el soporte del segmento Fig 6 Incline el segmento 45 y col quelo en las patillas del soporte del segmento Apoy ndose en estos resortes gire el segmento para fijarlo en las muescas del soporte del segmento ATENCI N Compruebe que el segmento est fijado correctamente en el soporte del segmento los salientes situados en los extremos del segmento deben estar bien encajados en las dos muescas del soporte del segmento 3 Coloque el conjunto segmento soporte del segmento en la gu a de la plantilla din mic
28. han sido analizados en paralelo en geles HYDRAGEL IF 2 4 y con otro sistema comercial de geles de agarosa T cnica HYDRAGEL 9 IF Violeta cido Noventa y cinco 95 muestras diferentes de sueros patol gicos cuatro 4 sueros normales y doce 12 orinas concentradas han sido analizados en paralelo en geles HYDRAGEL 9 IF y con otro sistema comercial de geles de agarosa En las tres t cnicas los resultados obtenidos muestran una correlaci n perfecta entre los dos sistemas de an lisis y se han detectado las mismas bandas en todas las muestras patol gicas analizadas con una sensibilidad del 100 y una especificidad del 100 respecto a esta ltima t cnica calculadas seg n el m todo recomendado Wendling 1986 61 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask Sensibilidad Cuatro sueros con una gammapat a han sido diluidos serialmente y analizados con la t cnica HYDRAGEL 4 IF con coloraci n con violeta cido y con negro amido Los resultados se resumen a continuaci n BANDA MONOCLONAL LIMITE DE DETECCION g l HYDRAGEL 4 IF HYDRAGEL 4 IF MUESTRA No Tipo CONC g VIOLETA ACIDO NEGRO AMIDO 1 gamma 10 9 0 12 0 12 kappa 0 12 0 12 2 gamma 7 8 0 12 1 lambda 0 12 1 3 alfa 5 8 0 12 0 25 lambda 0 12 0 25 4 mu 3 4 0 12 0 12 kappa 0 12 0 12 Seg n la posici n de la banda monoclonal el fondo policlonal de la fracci n de las gammaglobulinas y el colorante us
29. ial si se ingiere Uso Para la tinci n de los geles con separaci n electrofor tica de prote nas y posterior inmunofijaci n IMPORTANTE El colorante est destinado para la coloraci n de 10 geles Cambie el colorante despu s de su utilizaci n en 10 coloraciones Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar ambas soluciones stock y de trabajo del colorante a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n stock de colorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial La soluci n de trabajo de colorante es estable 6 meses 6 DILUYENTE Preparaci n El Diluyente de muestras es listo para su uso Contiene tamp n alcalino pH 7 5 0 3 azul de bromofenol aditivos no t xicos a las conecentraciones utilizadas necesarias para la obtenci n de resultados ptimos Uso Diluci n de muestras El azul de bromofenol act a como marcador de la aplici n y migraci n posterior Almacenamiento estabilidad y se ales de deterioro Almacenar a temperatura ambiente o refrigerado Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o la etiqueta del vial El diluyente debe estar exento de precipitados 7 CAJA DE ANTISUEROS Y SOLUCI N FIJADORA Ref N 4381 y 4382 7 1 ANTISUEROS Preparaci n Los antisueros est n listos para su uso Contienen inmunoglobulinas totales de mam fero anti humanas Cada reactivo t
30. iene un color espec fico para evitar errores al utilizarlos El color es el mismo que el de las etiquetas de los viales Cuando los antisueros presentan una ligera turbidez o precipitados generalmente basta con poner los viales a temperatura ambiente unos 10 minutos antes de su utilizaci n Si la turbidez persiste no perturbar la reacci n inmunol gica Si hay un precipitado insoluble se recomienda centrifugar los antisueros durante 5 minutos a 3000 r p m Utilizaci n Para la inmunoprecipitaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis Los antisueros pueden ser de or genes animales diferentes Es por tanto imperativo no mezclar dos viales diferentes de antisueros incluso si son de la misma especificidad y SIEMPRE hay que cambiar la punta de la pipeta al cambiar de vial IMPORTANTE Para evitar cualquier contaminaci n entre los diferentes reactivos es imperativo poner cada tap n sobre el vial correspondiente despu s de usarlo Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Los antisueros deben ser conservados en la nevera entre 2 y 8 C Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas de los viales de antisuero NOTA Durante el transporte los antisueros pueden permanecer a temperatura ambiente entre 15 y 30 C durante 15 d as sin que esto afecte a la calidad del test 7 2 SOLUCI N FIJADORA Preparaci n La soluci n fijadora est lista para su uso Contiene una so
31. l los aplicador es de la c mara h meda Asirlo s po el pl stico protector Romper el pl stico protector precortado del peine Ponga el los aplicador es en el soporte de los aplicadores HYDRAGEL 1 IF 6 HYDRAGEL IF 2 4 2 muestras posici n N 6 HYDRAGEL IF 2 4 4 muestras posiciones N 3 y 9 HYDRAGEL 9 IF posiciones N 2 6 y 10 IMPORTANTE Los n meros impresos en el los aplicador es deben quedar de cara al usuario Fig 4 Para una perfecta reproducibilidad de la zona de aplicaci n desplace los aplicadores hacia uno de los lados del soporte de los aplicadores por ejemplo hacia la izquierda Cerrar la puerta del m dulo de migraci n 10 Iniciar el procedimiento inmediatamente presionando la tecla START flecha verde en el lado izquierdo del teclado IMPORTANTE Asegurarse que la toma de aire en el lado derecho del instrumento no est bloqueada 57 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask MIGRACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Los dos soportes descienden con lo cual esponjas tamponadas y aplicador es entran en contacto con la superficie del gel El soporte del aplicador se eleva Migraci n a 10 W constantes para el HYDRAGEL 1 IF y a 20 W constantes para el HYDRAGEL IF 2 4 hasta que se hayan acumulado 42 Vh durante unos 9 minutos y a 20 W constantes hasta que se hayan acumulado 36 Vh durante unos 7 minutos para el HYDRAGEL 9 IF a 20 C si
32. luci n cida y aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo Tiene un color espec fico para evitar errores al usarlo Utilizaci n Para la fijaci n de las prote nas separadas mediante electroforesis en el carril de referencia ELP IMPORTANTE Para evitar cualquier contaminaci n entre los diferentes reactivos es imperativo poner cada tap n sobre el vial correspondiente despu s de usarlo Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro La soluci n fijadora puede conservarse a temperatura ambiente o refrigerada Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de soluci n fijadora Debe estar exenta de precipitados 8 APLICADORES Uso Aplicadores precortados de un solo uso para la aplicaci n de la muestra Almacenamiento Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados 9 SEGMENTOS PARA ANTISUEROS Utilizaci n Segmentos coloreados de un solo uso para la aplicaci n de la soluci n fijadora y de los antisueros en la inmunofijaci n ATENCI N Manipule con cuidado los segmentos que contengan antisueros 54 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask 10 PAPELES DE FILTRO FINOS Uso Papeles finos absorbentes precortados de un solo uso para secar el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicaci n de la muestra Conservaci n Les papeles de filtro finos deb
33. miento ptimo ATENCI N Nocivo en caso de ingesti n Uso Para la coloraci n de los geles despu s de la separaci n electrofor tica de las prote nas IMPORTANTE El colorante est destinado para colorear s lo 10 geles Cambie el colorante despu s de 10 usos NoOgAapOnN 53 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask Conservaci n estabilidad y se ales de deterioro Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera en contenedores cerrados para evitar la evaporaci n La soluci n concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante La soluci n diluida es estable durante 1 mes El per odo de estabilidad puede prolongarse a 3 meses si la soluci n diluida se conserva en nevera Es imperativo colocar el contenedor cerrado en nevera inmediatamente despu s de cada uso No almacene la soluci n de colorante diluida cerca de una fuente de calor 5 COLORANTE VIOLETA CIDO Ref N 4301 4302 4304 4309 4381 y 4382 Preparaci n El vial de la soluci n stock de colorante se diluye hasta 300 ml con agua destilada o desionizada Despu s de la diluci n la soluci n de trabajo del colorante contiene soluci n cida pH 2 violeta cido 0 2 g dL etil n glicol 3 25 aditivos inocuos a las concentraciones usadas necesarios para un funcionamiento ptimo ATENCI N Es perjudic
34. nto de apoyo central de forma que el segmento contacte con el gel Deje de presionar y entonces los reactivos se extender n bajo cada carril Fig 11 6 Inmediatamente con ayuda del asa situada a la derecha reparta los reactivos efectuando un movimiento lento y regular de ida y vuelta de la plantilla din mica por encima del gel la aplicaci n debe durar unos 5 segundos Fig 12 ATENCI N Durante esta operaci n la plantilla s lo debe cogerse por el asa sin tocar la gu a No presione nunca por segunda vez los reactivos podr an mezclarse 58 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask 7 Saque la gu a y la plantilla din mica Coja la gu a por el asa Gire la gu a alrededor de la barra met lica y s quela Saque el segmento del soporte y tirelo ATENCI N Manipule con cuidado los segmentos que contengan antisueros Queda un ligero exceso de reactivos sobre el gel en forma de gota a la altura de los orificios de los pocillos al quitar la plantilla sin ning n efecto en los resultados 8 Cierre la tapa del m dulo de migraci n 9 Inicie el procedimiento inmediatamente apretando la tecla INICIO flecha verde del lado izquierdo del teclado En la pantalla aparece el mensaje INCUBACION INMUNOFIJACI N DESCRIPCI N DE LAS ETAPAS AUTOM TICAS Incubaci n a 20 C controlados por efecto Peltier durante 5 minutos Suena un pitido y la tapa del m dulo de migraci n se desbloque
35. ras libres y ligadas kappa o lambda carriles K o L Una paraprote na s rica que pasa a la orina asociada a una prote na de Bence Jones se caracteriza por una banda monoclonal detectada con un anti cadenas pesadas gamma alfa o mu carriles G A o M dos bandas detectadas con uno o los dos anti cadenas ligeras kappa y o lambda libres y ligadas 60 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask Interferencias y limitaciones Vea MUESTRAS PARA ANILISIS La presencia de fibrin geno o de fibrina residual puede implicar que aparezca una banda artefactual en todos los carriles la intensidad de la banda puede variar seg n el carril y generalmente es m s intensa en el carril revelado con el antisuero anti lg A La utilizaci n de antisueros distintos a los espec ficos para la t cnica de inmunofijaci n realizada con la plantilla din mica puede afectar a la calidad de los resultados Teniendo en cuenta los principios anal ticos de las t cnicas actuales principios de la electroforesis de zona resoluci n y sensibilidad no puede darse ninguna garant a respecto a la detecci n de la totalidad de todos los componente monoclonales Resoluci n de problemas Avisar al Servicio de Atenci n T cnica del distribuidor cuando el test no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la preparaci n y almacenaje de los materiales y para el procedimiento a seguir Las hojas de seguri
36. s pesadas y en una o las dos cadenas ligeras Casos especiales Cuando se observa una banda monoclonal en la electroforesis pista ELP mas no se confirma mediante inmunofijaci n debe sospecharse la presencia de fibrin geno plasma como muestra Cuando se aprecia una nica banda en todas las pistas podemos pensar en la presencia de una crioglobulina o una Ig M polimerizada Despolimerizar con un agente reductor y repetir el procedimiento ver Muestras para an lisis En algunos casos de gammapat as de Ig A el antisuero anti cadenas ligeras puede presentar baja afinidad por la inmunoglobulina monoclonal lo que dificulta su detecci n En ese caso se aconseja realizar la inmunofijaci n con el programa BENCE JONES en el que la reacci n est amplificada debido a un tiempo de incubaci n con el antisuero m s largo vea las instrucciones de uso de los kits HYDRAGEL BENCE JONES para saber c mo diluir los sueros En caso de fondo policlonal importante se aconseja aumentar la diluci n de la muestra en los carriles de antisueros especialmente en el carril lg G HYDRAGEL 9 IF En los casos de gammapat as oligoclonales se recomienda realizar las inmunofijaciones usando las t cnicas HYDRAGEL 1 2 4 IF para obtener una mejor resoluci n en la zona gamma ya que la zona de las gammaglobulinas es m s alargada y facilita la visualizaci n de bandas m ltiples Orinas concentradas El principio de interpretaci n es id
37. stras patol gicas Reproducibilidad interserial T cnica HYDRAGEL 4 IF Migraci n de cuatro 4 muestras diferentes de sueros patol gicos Dos sueros con una fuerte gammapat a monoclonal un suero que presenta dos paraprote nas d biles y un suero que presenta una paraprote na fuerte y otra d bil La migraci n y la inmunofijaci n de cada muestra han sido realizadas en 10 geles de HYDRAGEL IF 2 4 de 3 lotes diferentes seguidas de una coloraci n con violeta cido T cnica HYDRAGEL 9 IF Migraci n de nueve 9 muestras de suero patol gicas que presentan una o varias paraprote nas La migraci n y la inmunofijaci n de cada muestras han sido realizadas en 10 geles de HYDRAGEL 9 IF de 3 lotes diferentes seguidas por una coloraci n con violeta cido En las dos t cnicas todas las muestras analizadas proporcionan los mismos resultados para los 3 lotes de geles probados Los perfiles obtenidos son caracter sticos de las muestras analizadas y la inmunofijaci n pone en evidencia las bandas monoclonales esperadas en todas las muestras Exactitud T cnica HYDRAGEL 4 IF Violeta cido Setenta y tres 73 muestras diferentes de sueros patol gicos once 11 sueros normales y doce 12 orinas concentradas han sido analizados en paralelo en geles HYDRAGEL IF 2 4 y con otro sistema comercial de geles de agarosa T cnica HYDRAGEL 4 IF Negro amido Veintiocho 28 muestras diferentes de sueros patol gicos y cuatro 4 sueros normales
38. ver a colocar el portaaplicadores en su ubicaci n original Lavar la placa de migraci n con un trapo suave ligeramente humedecido 59 HYDRAGEL 1 2 4 8 9 IF 2009 01 Masque dynamique Dynamic mask VILFINAL DE LA COLORACI N DEL GEL 1 Saque el soporte del gel del compartimento de coloraci n abra el soporte del gel y saque el gel seco 2 Sies necesario limpie el respaldo del gel el lado de soporte de pl stico con un pa uelo de papel humedecido NOTA En los geles con varias filas de muestras 2 6 3 las longitudes de migraci n pueden ser ligeramente diferentes sin ninguna repercusi n en los resultados RESULTADOS Interpretacion 1 Suero Ausencia de componentes monoclonales Un suero normal muestra una tinci n tenue y difusa de las inmunoglobulinas policlonales en todas las pistas Una hipergammaglobulinemia se caracteriza por una tinci n fuerte y difusa en la zona de las gamma sin presentar bandas claramente definidas Presencia de componentes monoclonales La presencia de una proteina monoclonal gammapat a se caracteriza por una banda monoclonal en las pistas gamma alfa o mu y en la pista kappa o lambda indistintamente La banda monoclonal detectada normalmente bien definida y focalizada deber estar posicionada a la misma altura que la previsible banda monoclonal localizada en la pista de referencia ELP Si no hay reacci n con uno de los antisueros anti cadenas pesadas aplicados y hay re
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