MycAssay™ Aspergillus
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1. Las siguientes 3 especies f ngicas no se analizaron con el sistema AB7500 pero hab an sido analizadas con el sistema SmartCycler Pneumocystis jirovecii Histoplasma capsulatum y Alternaria alternata Las 3 dieron resultados negativos con el ensayo Reproducibilidad y repetibilidad La repetibilidad y la reproducibilidad fueron determinadas por cuatro operadores diferentes que analizaron un panel de siete plantillas diferentes por triplicado para un total de 168 ensayos Los experimentos se realizaron usando un lote fabricado del kit MycAssay Aspergillus en dos instrumentos diferentes situados en dos lugares diferentes del Reino Unido Los resultados se analizaron tomando como referencia el l mite de blanco LoB y el punto de corte cl nico CCO A una concentraci n tres veces mayor que el l mite de detecci n LoD los resultados del 100 de las muestras analizadas eran concordantes positivas en el LoB y el 83 de las muestras eran concordantes en el CCO A concentraciones m s de tres veces mayores que el LoD los resultados del 100 de las muestras eran concordantes tanto en el CCO como en el LoB Para las plantillas negativas todas las muestras analizadas fueron negativas en el CCO Transferencia del punto de corte cl nico El punto de corte cl nico de 36 0 se hab a establecido en el sistema SmartCycler Este punto de corte se transfiri anal ticamente a la plataforma AB7500 utilizando una plantilla con una concentraci n de2. placas de PCR con semifald n de 96 pocillos de 0 2 ml con pel cula de sellado de grado ptico Star Lab n de cat logo E1403 8200 y Applied Biosystems n de cat logo 4311971 4 4 Las muestras de paciente generan el resultado 3 Invalid Es probable que las muestras cl nicas extra das contengan inhibidores de la PCR gt Recomendamos extraer DNA de las muestras cl nicas usando el kit de extracci n de DNA f ngico MycXtraTM 4 5 No se obtienen resultados para ning n canal con ninguna muestra o control Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado gt Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario El equipo usado no tiene un funcionamiento ptimo gt Compruebe que el instrumento de PCR en tiempo real tiene el historial de mantenimiento actualizado y que ha sido totalmente calibrado seg n se describe en su Gu a de instalaci n y mantenimiento Se ha utilizado un protocolo incorrecto durante la preparaci n del software gt Consulte la secci n 2 y elija el archivo del protocolo correcto seg n se especifica para cada tipo versi n del software del CD ROM Myconostica Protocol S lo puede cargarse el arch
3. E1403 8200 y Applied Biosystems n de cat logo 4311971 4 2 El valor Ct del IAC del control negativo se encuentra fuera del intervalo aceptable gt Se ha inhibido la PCR Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos est n completamente secos despu s de usar agentes descontaminantes antes de proceder a la preparaci n para la PCR Las condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario No se ha a adido el reactivo de los Tubos 1 2 a la reacci n de PCR o se ha a adido una cantidad dos veces mayor del Tubo 2 Repita la serie anal tica teniendo cuidado en la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observan niveles m s altos o m s bajos de l quido en un pocillo en comparaci n con los otros Se han utilizado tubos o placas no recomendados Los umbrales s lo son v lidos cuando se utiliza el material recomendado placas de PCR con semifald n de 96 pocillos de 0 2 ml con pel cula de sellado de grado ptico Star Lab n de cat logo E1403 8200 y Applied Biosystems n de cat logo 4311971 4 3 El control positivo es negativo gt Las
4. Export Sample Setup View Exported Results Calibration Data e como ener 1 RandRPro_031209_ADS sds a 2 2 RandR_Prorun_041209_GJAE sds Dissociation gt 3RandR_Prorun_041209_GJAE sds rl 4 RandRPro_031209_ADS sds 5 30Nov09_RandR_Kate_day3 sds 6 27Nov09_RandR_Kate_dayZ2 sds 7 26Nov09_RandR_Kate_day1 sds 8 MycAssay Aspergillus y1_1 25NOV09_SAF sds 9RandR1_plate_SAF_19NOYO9 sds f mn Tu ur ju m m ul m m 3 6 Para evitar confusiones guarde el archivo con el mismo nombre utilizado para el propio archivo de la serie anal tica Recuerde guardar el archivo en un lugar apropiado 3 7 Cuando se le indique active Export only selected wells y haga clic en OK 3 8 Abra el archivo csv guardado con Excel o con un programa de hoja de c lculo similar 3 9 Analice cada muestra comenzando con los controles como se muestra en la gr fica de flujo a continuaci n tambi n encontrar detalles en la tabla que aparece bajo la gr fica de flujo Espa ol 8 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Para uso diagn stico in vitro Muestras Respiratorias Compruebe el control negativo Es el Ct de ASP de MycAssay 37 0 o no detectado z A Comprobar el control negativo Serie contaminada P il Es el Ct de IAC de MycAssay ACCI N Repetir la serie 27 7 31 9 Fallo de la serie ACCI N Repetir la serie Positivo para DNA de Aspergillus Fallo de la serie ACCI N Repetir la serie C
5. causada por Aspergillus y son causadas normalmente por A fumigatus La aspergilosis pulmonar cr nica comprende el aspergiloma la aspergilosis pulmonar cavitaria cr nica y la aspergilosis fibrosa cr nica La aspergilosis invasiva Al se desarrolla en grupos de pacientes de riesgo entre los que se incluyen aqu llos tratados con corticosteroides y los que presentan neutropenia o disfunci n fagoc tica por ejemplo enfermedad granulomatosa cr nica e infecci n por el VIH Alrededor del 80 de los casos de aspergilosis invasiva afecta a los pulmones El diagn stico sistem tico de la aspergilosis pulmonar invasiva consiste en la tomograf a computarizada TC la broncoscopia y el lavado broncoalveolar microscopia y cultivo el an lisis en sangre de ant genos de Aspergillus y el examen histol gico de muestras de biopsia quir rgica En este contexto los cultivos a menudo son falsamente negativos De hecho el lavado broncoalveolar s lo es positivo en cultivo en aproximadamente el 40 de los casos incluso cuando el diagn stico se confirma por otros medios lo cual muestra la falta de sensibilidad del cultivo en la detecci n de la aspergilosis invasiva y de la aspergilosis pulmonar cr nica No obstante los cultivos son importantes si son positivos ya que muchas pruebas diagn sticas no indican ni el g nero ni la especie del hongo que causa la enfermedad ni tampoco el perfil de sensibilidad de la cepa cl nica aislada causante de la
6. de la placa 1 9 Siempre debe prepararse primero el control negativo seguido de las muestras de paciente El control positivo debe prepararse siempre en ltimo lugar 1 10 En la siguiente tabla se muestran los vol menes de reactivo y de DNA Reacci n Control Muestra Control negativo de positivo paciente Reactivo Tubo 1 tap n 7 5 uL 7 5 uL 7 5 uL naranja Tubo 2 tap n 7 5 uL 7 5 uL verde Tubo 3 tap n 10 uL transparente Muestra de paciente Tubo 4 tap n negro Volumen total 1 11 A ada los reactivos en el orden mostrado en la tabla anterior Tubo 1 y luego el Tubo 2 seguidos de la plantilla control negativo muestra de paciente o control positivo Tenga cuidado al tomar muestras parciales del Tubo 1 ya que el l quido es ligeramente viscoso y puede adherirse al borde interno del tubo Si sucediese esto vuelva a centrifugar para acumular el contenido final en la base del tubo antes de intentar extraer las muestras parciales finales 1 12 Use una nueva punta de pipeta para cada transferencia de l quido Vuelva a cerrar los tubos de reactivos despu s de usarlos y des chelos inmediatamente as como el contenido restante en un recipiente de cierre herm tico para residuos cl nicos Los reactivos no usados no pueden guardarse para un uso posterior 1 13 Tome precauciones especiales al pipetear el Tubo 4 DNA de control positivo para asegurarse de que no contamine ning n otro
7. tubo de reacci n Cierre las tapas de los otros tubos de reacci n antes de abrir el Tubo 4 para reducir el riesgo de contaminaci n cruzada 1 14 Anote las posiciones que ocupan todas las muestras en la placa en un plan de placas Selle la placa con cuidado y a conciencia con la pel cula de sellado de grado ptico tomando precauciones para garantizar que los bordes queden firmemente adheridos Centrifugue la placa en una centrifugadora a 900 g durante 1 minuto Compruebe que no haya burbujas en el fondo de los pocillos Si las hay centrifugue de nuevo 1 15 Contin e en la secci n 2 inmediatamente Las reacciones del ensayo MycAssay Aspergillus son estables en el banco durante un m ximo de 60 minutos 1 16 Despu s de la preparaci n de la PCR aseg rese de que se limpie meticulosamente el rea de trabajo usando reactivos descontaminantes de DNA Espa ol 6 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 2 Procesamiento de la serie anal tica 2 1 Abra el software SDS del sistema AB 7500 versi n 1 4 e introduzca su nombre de usuario y su contrase a 2 2 Inserte el CD ROM MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol 2 3 En el men Quick Startup seleccione la opci n de crear un documento nuevo primera opci n Create New Document 2 4 Escoja los par metros tal y como se muestra a continuaci n Seleccione la plantilla MycAssay Aspergill
8. uso 1 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 Preparaci n del sistema de PCR en tiempo real Para comenzar encienda el sistema de PCR en tiempo real el instrumento y el ordenador asociado e inicie el software correspondiente Introduzca los nombres de usuario y las contrase as requeridos Aseg rese de que se haya limpiado el rea de trabajo con reactivos descontaminantes de DNA y de que se haya dejado secar completamente evite usar estos productos durante la preparaci n del ensayo ya que un exceso de soluci n limpiadora puede inhibir las reacciones de PCR Una bolsa contiene un tubo de cada tipo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 y Tubo 4 Hay suficientes reactivos en una bolsa para realizar 8 reacciones Deben realizarse al menos una reacci n de control positivo y una reacci n de control negativo en cada serie anal tica en la que los reactivos sean del mismo lote del kit Por lo tanto con una bolsa se pueden analizar 6 muestras de paciente Si es necesario analizar m s de 6 muestras se puede usar m s de una bolsa si las bolsas usadas proceden del mismo lote del kit Se puede analizar un m ximo de 38 muestras de paciente usando las 5 bolsas de un kit Calcule el n mero de reacciones necesarias para ello consulte la tabla siguiente N mero de N mero m ximo de muestras bolsas de paciente 6 Saque el n mero apropiado de bolsas del congelador No use ninguna bolsa que ya no est sellada Si se congelaron las
9. 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 3 An lisis e interpretaci n de los datos 3 1 Una vez finalizada la serie anal tica haga clic en la flecha verde situada en la barra de men superior para actualizar 3 2 Abra la vista Amplification Plot de la ficha Result En el lado derecho establezca los umbrales para cada canal de la forma siguiente Asp MycAssay 12000 IAC MycAssay 4000 Los valores para Manual Baseline deben permanecer en 3 15 para ambos detectores 3 3 Haga clic en el bot n Analyze para activar estos cambios Por ejemplo Data Deta An vs Cycle Y Data Deta An vs Cycle y Detector Mychssay ASP v Detector MpcAssaylAC Line Color Detector Colorz Line Color Detector Color Analysis Settings Analysis Settings C Auto Ct Auto Ct Manual Ct 5 Manual Cr Threshold 1 28 004 Threshold 402003 C Auto Baseline Auto Baseline Stateyoles E Stat cycle 3 End cyole 15 Erd eycie i5 Analyze Analyze 3 4 Guarde los cambios 3 5 Seleccione los pocillos que contienen las muestras y exporte el archivo de informe siguiendo la secuencia File gt Export gt Results como se muestra a continuaci n 24 7500 System SDS Software RandRPro_031209_ADS sds Standard Curve Ol ES view Tools Instrument Analysis Window Help New Ctrl El Open Ctro E Close ral Save As ju Import Sample Setup Cerler m
10. 37 0 y que el LoD era lt 25 copias de DNA diana utilizando la cepa AF293 de A fumigatus Selectividad anal tica El DNA gen mico extra do de especies de Penicillium genera resultados positivos Esto se debe al hecho de que las secuencias de las dianas moleculares tienen un grado de conservaci n alto entre Aspergillus y Penicillium Por consiguiente debe se alarse que un resultado positivo con este ensayo puede deberse a una infecci n por Penicillium en lugar de a una infecci n por Aspergillus La selectividad anal tica se analiz usando DNA extra do de diversas especies f ngicas y no f ngicas Las siguientes especies no presentaron un resultado positivo Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis especies de Cladosporium Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermium S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Las siguientes especies bacterianas no presentaron un resultado positivo Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius El DNA gen mico humano no presenta un resultado positivo con este ensayo
11. 992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 5 Greub G and Bille J 1998 Aspergillus species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance Clin Microbiol Infect 4 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 7 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 Tillie Leblond Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 S147 54 Espa ol 1 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 cultivos son positivos s lo en el 40 65 de los casos confirmados mediante radiolog a y serolog a Dado que el diagn stico diferencial es amplio e incluye enfermedades tales como tuberculosis mic
12. Aspergillus que hab a demostrado presentar gt 95 de resultados positivos en el CCO con la plataforma SmartCycler Se determin un valor Ct de 33 5 que a continuaci n fue confirmado utilizando plantillas de 3 concentraciones diferentes Espa ol 12 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Para uso diagn stico in vitro Muestras Respiratorias Se establecieron las siguientes afirmaciones sobre el rendimiento utilizando el sistema Cepheid SmartCycler Sustancias que producen interferencia contraindicaciones de uso Los siguientes compuestos fueron analizados a concentraciones cl nicamente relevantes y se comprob que no inhiben el ensayo acetilciste na anfotericina dipropionato de beclometasona budesonida colistimetato s dico propionato de fluticasona fumarato de formoterol dihidrato bromuro de ipratropio lidoca na manitol sulfato de salbutamol salmeterol cloruro s dico cromoglicato s dico terbutalina y tobramicina Evaluaci n del rendimiento Se utilizaron muestras respiratorias BAL obtenidas de dos hospitales extra das con el kit MycXtra y almacenadas para evaluar el rendimiento del kit MycAssay Aspergillus con muestras cl nicas Se realizaron comparaciones con el diagn stico cl nico y con el cultivo Se determin el valor de corte de un Ct de 36 0 despu s de la revisi n del conjunto de datos de muestras procedentes de diferentes lugares y de diferentes pob
13. Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 myconos I ca Muestras Respiratorias MycAssay Aspergillus Applied Biosystems 7500 Muestras Respiratorias REF 080 045 Uso previsto MycAssay Aspergillus est indicado para su uso por profesionales de laboratorio cualificados para la detecci n cualitativa del DNA gen mico del g nero Aspergillus en muestras respiratorias de las v as respiratorias inferiores p ej muestras bronquiales como ayuda para el diagn stico de pacientes adultos que se sospecha que podr an padecer una alergia o una infecci n por Aspergillus MycAssay Aspergillus ha sido validado para el uso con el sistema Applied Biosystems 7500 con la versi n del software SDS 1 4 Resumen y explicaci n El g nero Aspergillus est constituido por mohos oportunistas ubicuos que causan s ndromes tanto al rgicos como invasivos Este g nero comprende aproximadamente 300 especies de las cuales 41 se han asociado a enfermedades humanas La mayor a de las infecciones son causadas por A fumigatus A flavus A terreus y A niger menos frecuentemente tambi n intervienen A nidulans y otras especies poco comunes como A sydowii A versicolor A lentulus y A pseudofischeri La mayor a de las infecciones y alergias causadas por el g nero Aspergillus afecta a las v as respiratorias Las reacciones al rgicas incluyen aspergilosis broncopulmonar al rgica ABPA y sinusitis al rgica
14. are SDS 1 4 Placas con fald n borde elevado de 96 pocillos y pel cula de sellado de grado ptico Star Lab n de cat logo E1403 8200 y Applied Biosystems n de cat logo 4311971 Gradilla de soporte para placas de 96 pocillos Centrifugadora dotada de asientos para placas de 96 pocillos B Equipo com n necesario Microcentrifugadora Agitadora vorticial v rtex Micropipetas vol menes requeridos 7 5 20 uL Puntas con filtro de baja retenci n est riles Guantes desechables sin polvo Soluci n comercial descontaminante de DNA Rotulador permanente Kit de aislamiento de DNA v ase m s adelante Muestra La muestra para el ensayo MycAssay Aspergillus es DNA gen mico total extra do de muestras cl nicas de lavado broncoalveolar BAL y de otras muestras de las v as respiratorias inferiores Se recomienda con este fin el siguiente equipo y kit de aislamiento utilizados durante la validaci n Kit de extracci n de DNA f ngico MycXtra REF 080 005 disponible en Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc Nueva York EE UU Plato adaptador para agitadora vorticial REF 080 015 disponible en Myconostica Espa ol 4 030 150 Versi n 1 2 01IMAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 Notas del procedimiento Lea el protocolo completo antes de comenzar El proceso completo del ensayo MycA
15. cAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 Limitaciones del procedimiento La principal limitaci n de este procedimiento es la calidad de la muestra primaria Si la muestra es muy peque a o no se obtuvo de la zona afectada del pulm n la prueba ser menos sensible y puede dar un resultado falsamente negativo Las muestras obtenidas mediante lavado broncoalveolar deben centrifugarse antes de la extracci n del DNA del sedimento Los datos tambi n demostraron que una reducci n del volumen de sobrenadante usado en el proceso de extracci n que se obtiene en el paso de centrifugaci n reduce la proporci n de inhibidores que entran en el sistema Pueden producirse resultados positivos falsos si el agente infeccioso pertenece al g nero Penicillium que no puede distinguirse del g nero Aspergillus con este kit Aunque el procedimiento de extracci n de DNA f ngico MycXtra M se ha dise ado para eliminar los inhibidores de la PCR no se han evaluado todos los f rmacos ni poblaciones de pacientes El procedimiento no se ha evaluado de forma exhaustiva con esputos ni se ha evaluado con muestras salinas inducidas ni en muestras procedentes de ni os Pueden obtenerse resultados positivos falsos por contaminaci n externa de la muestra original o de la prueba Esta contaminaci n podr a provenir de aire contaminado con Aspergillus de una t cnica experimental deficiente con respecto al control positivo o d
16. condiciones de conservaci n del kit no cumpl an las instrucciones presentadas en el apartado Conservaci n de estas instrucciones de uso o el kit ha caducado Compruebe que se hayan seguido las condiciones de conservaci n correctas del kit Compruebe la fecha de caducidad de los reactivos en la etiqueta de la bolsa caja del kit y repita el proceso con un kit que no haya caducado en caso necesario Se produjo un error durante el paso 1 12 y la plantilla de control positivo Tubo 4 se coloc en el tubo de reacci n err neo Repita la serie anal tica teniendo extremo cuidado durante la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observa un nivel m s alto de l quido en un tubo de reacci n y un nivel m s bajo en otro en comparaci n con el nivel normal No se ha a adido el reactivo de los Tubos 1 2 a la reacci n Repita la serie anal tica teniendo cuidado en la fase de preparaci n Estos errores pueden detectarse si se observan niveles m s bajos de l quido en este pocillo que en los otros Se ha colocado incorrectamente el control positivo en el instrumento Tenga cuidado de que los pocillos est n correctamente anotados en el software Se han utilizado tubos o placas no recomendados Espa ol 10 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 gt Los umbrales s lo son v lidos cuando se utiliza el material recomendado
17. ducir la amplificaci n del DNA mediante un proceso de termociclado El ensayo tambi n contiene un control de amplificaci n interno IAC internal amplification contro que es un fragmento de DNA que no est presente en el genoma de Aspergillus ni en otros genomas f ngicos ni tampoco en genomas bacterianos ni humanos y cuya finalidad es detectar sustancias inhibidoras de la PCR y confirmar la funcionalidad de los reactivos del ensayo Las dianas de DNA amplificadas se detectan por medio de la tecnolog a de balizas moleculares Las balizas moleculares son sondas de hibridaci n compuestas de un oligonucle tido de cadena sencilla que forma una estructura de horquilla La porci n curva de la horquilla contiene una secuencia sonda que es complementaria de una secuencia diana y la porci n recta de la horquilla est formada por hibridaci n de secuencias de brazo complementarias que se encuentran a cada lado de la secuencia sonda Un extremo del brazo est unido de forma covalente a un fluor foro que emite fluorescencia cuando es excitado por una luz de la longitud de onda apropiada mientras que el otro extremo del brazo est unido de forma covalente a un extintor de fluorescencia que suprime la fluorescencia del fluor foro cuando se encuentra en estrecha proximidad f sica Las balizas moleculares no emiten fluorescencia cuando est n libres en soluci n Sin embargo cuando se hibridan con una cadena de cido nucleico que contiene una secuenc
18. e contaminaci n externa especialmente de la pipeta con DNA de Aspergillus Dado que se puede obtener un resultado positivo verdadero en pacientes con una colonizaci n transitoria o persistente por el g nero Aspergillus se requiere aplicar el criterio cl nico para interpretar los resultados de la prueba en el contexto de la enfermedad AUTORIZACI N DE COMERCIALIZACI N TopTaq Hot Start es suministrado por QIAGEN QIAGEN es una marca registrada de Qiagen GmbH Hilden Alemania Este producto se vende bajo autorizaci n del Public Health Research Institute Newark New Jersey Estados Unidos y puede usarse bajo los derechos de la patente del PHRI exclusivamente para diagn stico in vitro en seres humanos SmartCycler es una marca registrada de Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale CA 94089 Estados Unidos Parte de este producto est cubierta por una licencia exclusiva a una solicitud de patente propiedad del Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle Estados Unidos Applied BioSystems es una marca registrada de Applera Corporation o sus filiales en Estados Unidos y o en ciertos otros pa ses Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 OGA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupport lab21 com Espa ol 14 030 150 Versi n 1 2 01MAR12
19. ia diana experimentan un cambio conformacional que las separa f sicamente del fluor foro y del extintor de fluorescencia lo cual les permite emitir fluorescencia al ser excitadas La cantidad de fluorescencia en cualquier ciclo dado o despu s del ciclo depende de la cantidad de amplicones espec ficos que est n presentes en ese momento El sistema de PCR en tiempo real mide simult neamente la fluorescencia emitida por cada baliza Precauciones El kit est dise ado para ser usado solamente por profesionales de laboratorio Es preciso poner en pr ctica procedimientos para la manipulaci n de muestras que no generen aerosoles Deben seguirse las precauciones habituales y las directrices del centro para la manipulaci n de todas las muestras Myconostica Ltd tiene a su disposici n una Hoja de datos sobre la seguridad de los materiales Esta prueba est dise ada exclusivamente para uso diagn stico in vitro Esta prueba s lo debe utilizarse con el sistema Applied Biosystems 7500 con la versi n del software SDS 1 4 No use los reactivos ni los controles si las bolsas protectoras llegan abiertas o rotas Los reactivos y los controles no son intercambiables entre kits con n meros de lote diferentes Nunca mezcle reactivos o controles de tubos diferentes aunque sean del mismo lote Nunca use los reactivos ni los controles despu s de su fecha de caducidad Los reactivos y los controles no deben volver a congelarse ni a uti
20. infecci n La aspergilosis broncopulmonar al rgica complica el asma y la fibrosis qu stica y de forma infrecuente puede aparecer sin una enfermedad subyacente La mayor a de los casos se asocia a A fumigatus en algunos casos hay otros hongos implicados La enfermedad se caracteriza por obstrucci n epis dica de las v as respiratorias con tapones de esputo espeso llenos de hifas de Aspergillus IgE total en suero gt 1 000 Ul mL y anticuerpos detectables IgE e IgG espec ficos para Aspergillus fumigatus o una prueba de punci n cut nea positiva para Aspergillus Los cultivos de esputo pueden ser positivos para A fumigatus y existe la posibilidad de observar bronquiectasias en una TC del t rax Los m todos actuales de diagn stico de la aspergilosis pulmonar cr nica son la combinaci n de la radiolog a que no es espec fica y la serolog a anticuerpos IgG frente a Aspergillus o precipitinas que es positiva en la mayor a de las formas de aspergilosis y que por tanto no es espec fica de ninguna manifestaci n particular de la aspergilosis Los Base de datos de especies en www aspergillus org uk 2 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 suppl 1 S207 38 3 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 1 Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1
21. ivo apropiado para el software Repita la serie anal tica usando el archivo del protocolo correcto Si tiene m s preguntas o experimenta cualquier problema p ngase en contacto con el servicio de atenci n al cliente productsupportOlab21 com Espa ol 11 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 Caracter sticas de rendimiento y limitaciones Datos de rendimiento anal tico del sistema AB7500 El kit se valid inicialmente utilizando el sistema Cepheid SmartCycler Ciertas afirmaciones sobre el rendimiento del ensayo se volvieron a validar con la plataforma AB7500 utilizando placas de PCR con semifald n de 96 pocillos de 0 2 ml con pel cula de sellado de grado ptico Star Lab n de cat logo E1403 8200 y Applied Biosystems n de cat logo 4311971 y se describen a continuaci n En los casos en los que no se esperaba que las diferencias entre las plataformas afectaran al rendimiento del ensayo y por consiguiente a la afirmaci n relativa al rendimiento el estudio no se repiti Estos resultados obtenidos utilizando la plataforma SmartCycler se consideran transferibles a la plataforma AB7500 Sensibilidad anal tica Utilizando el protocolo protocolo del sistema AB7500 anteriormente descrito y las plantillas para PCR generadas en Myconostica se determin que el LoB para el ensayo MycAssay Aspergillus estaba en un valor Ct de
22. izas moleculares verde lt 0 0001 de control de amplificaci n interno IAC El control de amplificaci n interno es un pl smido de DNA recombinante que contiene una secuencia no infecciosa no relacionada con la secuencia diana Aspergillus Amortiguador Tris HCI Tubo 3 control negativo 25 uL tap n Agua transparent e Tubo 4 Control positivo 25 uL tap n lt 0 0001 de DNA de control positivo negro La mol cula de control positivo es un pl smido recombinante que contiene la secuencia diana de Aspergillus Amortiguador Tris HCI El kit tambi n contiene CD ROM MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol Protocolo del ensayo MycAssay Aspergillus de Myconostica Instrucciones de uso Certificado de an lisis Espa ol 3 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 Conservaci n El kit debe guardarse congelado a una temperatura de 15 C a 25 C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja del kit momento en el cual debe desecharse de acuerdo con la normativa local Una vez abierta una bolsa debe usarse su contenido inmediatamente no se puede volver a congelar ni a reutilizar m s adelante Equipo y materiales necesarios pero no incluidos A Equipo necesario Sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosystems incluyendo el manual de usuario ordenador asociado y versi n del softw
23. laciones de pacientes Se evaluaron diferentes puntos de corte con respecto a la probabilidad de diferenciar entre el estado de de enfermedad y el estado de ausencia de enfermedad PCR frente al diagn stico cl nico Positivo Negativo cl nico cl nico Positivo 31 1 0 97 VPP con PCR Negativo 2 10 0 83 VPN con PCR 0 94 0 91 Sensibilidad Especificidad PCR frente al cultivo de Aspergillus Positivo en Negativo en cultivo cultivo Positivo 29 3 0 91 VPP con PCR Negativo 2 10 0 83 VPN con PCR 0 94 0 77 Sensibilidad Especificidad De las muestras analizadas el 0 8 conten a inhibidores de la PCR tal como indic el IAC tras la extracci n con el kit MycXtra Generaci n de informes cl nicos El kit MycAssay Aspergillus se ha dise ado para ser utilizado como ayuda para el diagn stico Los resultados deben considerarse en el contexto del estado cl nico del paciente y de los resultados de otras pruebas diagn sticas Los siguientes son informes recomendados que dependen de la interpretaci n del resultado del ensayo Resultado n 1 Especies de Aspergillus no detectadas Resultado n 2 Especies de Aspergillus detectadas resultado positivo Este ensayo tambi n detecta especies de Penicillium Resultado n 3 La prueba fracas inhibidores u otra sustancia desconocida presentes Espa ol 13 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro My
24. lizarse una vez abiertos Use ropa protectora y guantes desechables cuando manipule los reactivos del kit Evite la contaminaci n microbiana y con desoxirribonucleasa DNAasa de los reactivos cuando tome muestras parciales de los tubos Se recomienda usar puntas de pipeta de desplazamiento positivo o con filtro desechables de baja retenci n libres de DNAasa y est riles 19 Denning DW Riniotis K Dobrashian R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 S265 80 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A Bazelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 E Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons Probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 Espa ol 2 030 150 Versi n 1 2 0IMAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 Use una nueva punta para cada muestra o reactivo Deseche los reactivos no usados y el material de desecho de acuerdo con las normativas nacionales federales estatales y locales Para evitar la contaminaci n con amplicones del IAC o Aspergillus no abra los tubos de reacci n despu s de la amplificaci n Pueden analizarse controles adicionales de acuerdo con las directrice
25. muestras de paciente despu s de la extracci n s quelas tambi n del congelador Rasgue el n mero de bolsas necesarias para abrirlas y saque los tubos Si se va a usar m s de una bolsa pero solamente se va a procesar un conjunto de controles positivo y negativo s lo es necesario extraer los Tubos 3 y 4 de una bolsa Deben tomarse precauciones al manipular el Tubo 4 Este tubo contiene material de DNA de control positivo y la contaminaci n podr a dar lugar a resultados positivos falsos en la prueba Deje que se descongele el contenido de los tubos coloc ndolos en el banco de laboratorio durante 5 10 minutos asegur ndose de que se haya descongelado totalmente el contenido de todos los tubos antes de continuar Mezcle en la agitadora vorticial el contenido de los tubos y las muestras de paciente y a continuaci n 5 For example see Mifflin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA Espa ol 5 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 centrif guelos en una microcentrifugadora mediante un ciclo corto para asegurarse de que todo el contenido se acumule en el fondo de los tubos antes de usarlos 1 8 Coloque la placa de 96 pocillos en una gradilla de soporte Tome precauciones para tocar con las manos nicamente el borde
26. obacteriosis at pica sarcoidosis histoplasmosis coccidioidomicosis neumoconiosis pulm n reumatoide y espondiloartritis anquilosante entre otras es importante documentar la presencia de especies de Aspergillus en las muestras respiratorias para evitar un retraso en la identificaci n de la aspergilosis pulmonar y su tratamiento err neo MycAssay Aspergillus es un kit de diagn stico molecular para la detecci n del DNA gen mico del g nero Aspergillus mediante la tecnolog a de la reacci n en cadena de la polimerasa PCR polymerase chain reaction en tiempo real con baliza molecular El procedimiento completo del ensayo incluida la extracci n de DNA de la muestra cl nica puede realizarse en 4 horas mientras que el cultivo de hongos puede requerir varios d as para generar resultados positivos Este ensayo ofrece ventajas sobre los m todos de diagn stico actualmente disponibles para la aspergilosis pulmonar invasiva aguda y para la aspergilosis pulmonar cr nica Estas ventajas incluyen una detecci n m s r pida del g nero Aspergillus y la posibilidad de una mayor sensibilidad para el g nero Aspergillus en pacientes con una inmunodepresi n intensa que se sospecha que padecen aspergilosis pulmonar invasiva Principios del procedimiento Despu s de mezclar los reactivos del kit MycAssay Aspergillus con una muestra que contenga la secuencia diana de DNA de Aspergillus una secci n del gen ribos mico 18S de Aspergillus se pro
27. omprobar el control positivo Es el Ct de ASP de MycAssay 15 0 20 0 ACCI N Comunicar Resultado Comprobar la muestra de paciente n22 Es el Ct de ASP de MycAssay 2 Negativo para DNA de Comprobar la muestra de paciente Aspergillus Es el Ct de IAC de MycAssay 27 7 31 9 ACCI N Comunicar Resultado n 21 Fallo del IAC ACCI N Repetir la muestra Si se obtiene el mismo resultado de nuevo Comunicar Resultado n 3 Muestra Ct de ASP de Ct de IAC de Interpretaci n Acci n que MycAssay MycAssay debe realizarse Control 37 00 no Entre 27 7 y Control negativo Los resultados negativo detectado 31 9 aceptable del paciente son validos Control 37 00 no lt 27 70 gt 31 9 Fallo en el Repetir toda la negativo detectado control negativo serie anal tica Control lt 37 0 Entre 27 7 y Contaminaci n Repetir toda la negativo 31 9 serie anal tica Control Entre 15 0 N A Control positivo Los resultados positivo 20 0 aceptable del paciente son validos Control lt 15 00 N A Fallo en el Repetir toda la positivo gt 20 0 control positivo serie anal tica Paciente gt 33 5 Entre 27 7 31 9 Negativo para Comunicar Aspergillus en el resultado Ccco Resultado n 1 Paciente lt 33 5 N A Positivo para Comunicar Aspergillus en el resultado Ccco Resultado n 2 Paciente 37 00 no lt 27 70 gt 31 9 Fallo del IAC en Repetir la detectado la muestra muestra Resultado n 3 CCO
28. punto de corte cl nico Todos los resultados que se encuentren en ese valor o por debajo del mismo se consideran cl nicamente positivos En otras muestras se pueden informar valores de Ct gt 33 5 pero stos reflejan niveles normales o de fondo de la carga de Aspergillus en la muestra respiratoria V ase la generaci n de informes cl nicos Resultado n 1 2 3 Espa ol 9 030 150 Versi n 1 2 01MAR12 Para uso diagn stico in vitro MycAssay Aspergillus Muestras Respiratorias Applied Biosystems 7500 Resoluci n de problemas 4 1 El control negativo ha generado una se al positiva en el canal FAM gt Se produjo contaminaci n durante la preparaci n No pueden considerarse precisos los resultados de toda la serie anal tica Repita toda la serie anal tica teniendo gran cuidado al a adir las plantillas en particular el control positivo Tubo 4 para asegurarse de que no se produzca una contaminaci n cruzada Aseg rese de que el rea de trabajo y los instrumentos sean debidamente descontaminados antes y despu s de su uso Se ha colocado incorrectamente el control negativo en el instrumento Aseg rese de que los pocillos est n correctamente anotados en el software Se han utilizado tubos o placas no recomendados Los umbrales s lo son v lidos cuando se utiliza el material recomendado placas de PCR con semifald n de 96 pocillos de 0 2 ml con pel cula de sellado de grado ptico Star Lab n de cat logo
29. s o las normativas locales estatales provinciales y federales o de las organizaciones responsables de la acreditaci n No coma beba ni fume en reas donde se manipulen las muestras o los reactivos del kit Las concentraciones bajas de DNA pueden ser inestables si no se conservan correctamente Se recomienda almacenar las extracciones de DNA de muestras cl nicas a una temperatura de 80 C para preservar su integridad Siempre que sea posible debe evitarse tambi n realizar varias secuencias de descongelaci n y congelaci n Este kit ha sido validado utilizando placas de PCR con semifald n de 96 pocillos de 0 2 ml con pel cula de sellado de grado ptico Star Lab n de cat logo E1403 8200 y Applied Biosystems n de cat logo 4311971 La utilizaci n de otras fuentes tipos de pl stico podr a invalidar los umbrales y por consiguiente las afirmaciones recogidas en las instrucciones de uso En caso de utilizar una fuente alternativa se recomienda realizar la validaci n local con las reacciones de controles positivo y de control negativo Contenido del kit Descripci n El kit consta de cinco bolsas selladas de aluminio con 3 compartimentos cada una que se pueden sacar de la caja y usar por separado Cada bolsa contiene reactivos suficientes para 8 reacciones Volumen Tubo 1 dNTPs 66 uL tap n MgCl naranja Soluci n amortiguadora del complejo de la DNA polimerasa Tubo 2 lt 0 01 de cebadores 66 uL tap n lt 0 01 de bal
30. ssay Aspergillus excluida la extracci n de DNA dura aproximadamente 2 horas seg n el n mero de muestras analizadas La preparaci n de la prueba debe realizarse en una zona de trabajo espec fica para PCR o en un laboratorio de procedimientos previos a la PCR Si no se dispone de una zona de trabajo espec fica para PCR la prueba debe realizarse en un rea del laboratorio dedicada separada de las reas utilizadas para la extracci n de DNA y que se limpie peri dicamente con agentes descontaminantes de DNA No obstante evite el uso de reactivos descontaminantes de DNA cuando est realizando la preparaci n del sistema de PCR en tiempo real ya que pueden inhibir el ensayo Utilice micropipetas para transferir l quidos Deben utilizarse micropipetas de uso exclusivo para la preparaci n de estas reacciones estas micropipetas deben descontaminarse con regularidad Se recomienda utilizar puntas con filtro de baja retenci n para asegurarse de que no se pierda DNA durante el procedimiento de preparaci n Deben tomarse precauciones al manipular el Tubo 4 Este tubo contiene material de DNA de control positivo y la contaminaci n podr a dar lugar a resultados positivos falsos en la prueba Use guantes siempre Todos los tubos de reactivos deben cerrarse despu s de usarlos y antes de desecharlos Aseg rese de anotar con exactitud las posiciones que ocupan las muestras en la placa de 96 pocillos en un plan de placas Procedimiento de
31. us v1_2 sdt del CD ROM haciendo clic en Browse 2 5 Introduzca en el campo Plate Name un nombre de placa adecuado para la serie anal tica A continuaci n se muestra un ejemplo New Document Wizard Define Document Select the assay container and template for the document and enter the operator name and comments Assay Standard Curve Absolute Quantitation Container 96Well Clear Template MycAssay Aspergillus v1_2 sdt Browse Run Mode Dperator your namel Comments Plate Name Aspergillus_04JAN10_name Finish Cancel 2 6 Haga clic en Finish Se abrir un documento nuevo que contendr los par metros de PCR y los detectores establecidos autom ticamente para este ensayo En la vista Plate de la ficha Setup utilice Well Inspector seleccione un pocillo y pulse Ctrl 1 o haga clic con el bot n secundario del rat n para nombrar los pocillos seg n las posiciones de las muestras en 1 12 Por ejemplo gey T sarene Benty A Na 2 7 Cuando haya nombrado correctamente todos los pocillos guarde la serie anal tica manteniendo el nombre de placa Plate Name como nombre de archivo 2 8 Inicie la serie anal tica en la ficha Instrument haciendo clic en el bot n Start 2 9 Para determinar cu nto tiempo tardar en finalizar la serie anal tica se muestra una cuenta atr s junto al bot n Start Espa ol 7 030
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