Productos Elucigene® QST*R® Instrucciones de uso
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1. observarse al menos 1 pico por cada marcador analizado El rango aceptable para los picos de marcadores analizados es de entre 50 y 6000 unidades fluorescentes relativas rfu en el analizador gen tico 3130 y de entre 175 y 32 000 rfu en los analizadores gen ticos 3500 Las alturas de pico que caigan fuera de estos rangos no deben analizarse 4 Los electroforetogramas de mala calidad debido a un exceso de traspaso bleed through entre colores de colorantes o a p as electrofor ticas picos agudos presentes en m s de un colorante no deber n interpretarse Los productos para RCP deber n volverse a inyectar y a analizar 5 El an lisis se realiza mediante la evaluaci n de razones de picos A1 A2 donde A1 es el rea de pico del fragmento de menor longitud y A2 es el rea de pico del fragmento de mayor longitud La raz n resultante ofrece un diagn stico del n mero de copias del locus En el caso de los cromosomas dis micos los marcadores heterocig ticos deber n mostrar dos picos con alturas similares Para realizar un an lisis completo del estado del ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 15 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso n mero de copias de los cromosomas se lleva a cabo una comparaci n de razones de reas de picos 6 Los marcadores dial licos esto es de dos alelos heterocig ticos deber n estar dentro de un intervalo de raz n de 0 8 a 1 4 Sin embargo en los casos de dos alelos separado2. R es la t cnica RCP CF Reacci n en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente Los dispositivos est n indicados para utilizarse en DNA extra do de muestras de l quido amni tico o vellosidades cori nicas tomadas durante la amniocentesis La poblaci n diana es la de mujeres embarazadas que se han evaluado como de alto riesgo de tener un feto afectado mediante procedimientos diagn sticos bioqu micos o ecogr ficos o que se han evaluado como de riesgo debido a sus antecedentes familiares o a su edad materna El dispositivo est indicado para utilizarse junto con otros procedimientos diagn sticos para respaldar o descartar el diagn stico cl nico propuesto El dispositivo es solamente para uso profesional en entornos de laboratorios moleculares o de citogen tica ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 2 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso QST R XYv2 Para el diagn stico cuantitativo in vitro sistem tico del estado de los cromosomas sexuales incluidas las aneuploid as frecuentes El m todo empleado por el kit Elucigene QST R XYv2 es la t cnica RCP CF Reacci n en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente Los dispositivos est n indicados para utilizarse en DNA extra do de muestras de l quido amni tico o vellosidades cori nicas tomadas durante la amniocentesis La poblaci n diana es la de mujeres embarazadas que se han evaluado como de alto riesgo de tener un feto afectado mediante proce
3. dise ada para detectar trisom as cromos micas espec ficas y aneuploid as de los cromosomas sexuales de la manera detallada en las instrucciones de uso Es posible que no detecte reorganizaciones estructurales en los cromosomas analizados y no detectar anomal as en ning n otro cromosoma Es posible que no se detecte mosaicismo para los cromosomas analizados Los resultados del QST R solo pueden aplicarse directamente al tejido analizado y pueden no representar al cariotipo fetal La contaminaci n celular materna y el mosaicismo placentario confinado pueden dar lugar a discrepancias entre los resultados del QST R y del cariotipo Nota Las heterocigosidades de los marcadores utilizados se derivaron de un conjunto aleatorio de muestras provenientes de una poblaci n predominantemente de raza blanca del norte de Europa y enviadas para el an lisis sistem tico Cualquier c lculo que utilice estas heterocigosidades estrictamente solo puede aplicarse a la poblaci n de la que se tomaron las muestras Puede realizarse un peque o estudio que utilice muestras obtenidas localmente como parte de un estudio de validaci n para establecer las heterocigosidades de la poblaci n que se desee analizar No se espera que la variaci n de la poblaci n altere considerablemente la informatividad global del ensayo Descargo de responsabilidad Los resultados de este y otros ensayos diagn sticos deber n interpretarse junto con otros datos cl nicos y de labo
4. para diagn stico in vitro lt g ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 6 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Materiales suministrados Almacene todos los componentes por debajo de 20 C Cada kit contiene TA 2 x 250 ul 50 pruebas o 1 x 100 ul 10 pruebas de mezcla de reacci n QST R con cebadores para amplificar una serie de marcadores de STR repeticiones cortas en t ndem Para obtener detalles sobre los marcadores de cada kit consulte el ap ndice 2 La mezcla de reacci n QST R tambi n contiene polimerasa de DNA y trifosfatos de desoxinucle tidos en tamp n Kit Viales para RCP N de pieza de 0 2 ml del componente Elucigene QST Rplusv2 Transparentes 404454 Elucigene QST R Naranja 404442 Elucigene QST R XYv2 Rosados 404457 Elucigene QST R 13 Verdes 404445 Elucigene QST R 18 Violeta 404448 Elucigene QST R 21 Amarillos 404451 DC 1 vial de 50 ul de control de DNA diploide para los marcadores detectados por Elucigene QST R Kit N de pieza del componente Elucigene QST Rplusv2 404485 Elucigene QST R 404485 Elucigene QST R XYv2 404485 Elucigene QST R 13 404485 Elucigene QST R 18 404485 Elucigene QST R 21 404485 50 10 Viales para RCP de 0 2 ml codificados con colores como se indica m s arriba Preparaci n y almacenamiento de los kits Tras abrir el kit se recomienda dispensar la mezcla de reacci n en los viales para RCP de 0 2 ml suministrados o equivalentes en vol menes de 10 u
5. trisom a se determina por una de las dos condiciones siguientes 7 1 Dos picos de altura desigual debido a que uno de los picos representa dos alelos comunes a uno o a ambos padres En este caso la raz n entre los dos picos se clasificar como 2 1 o 1 2 de forma que A1 A2 dar un resultado en la regi n de 1 8 a 2 4 cuando el pico que represente el alelo de menor longitud tenga un rea mayor que el pico que represente el alelo de mayor longitud y un resultado en la regi n de 0 45 a 0 65 cuando el pico que represente el alelo de menor longitud tenga un rea menor que el pico que represente el alelo de mayor longitud 7 2 Presencia de tres picos de altura similar La raz n de los picos se clasificar como 1 1 1 y sus valores caer n dentro del rango normal de 0 8 a 1 4 aunque para los alelos separados por m s de 24 pb es aceptable una raz n al lica de hasta 1 5 Si esto no ocurre puede deberse a uno de los factores mencionados en el paso 6 8 Para interpretar un resultado como normal es necesario que al menos dos marcadores informativos sean indicativos de un genotipo dial lico y que todos los dem s marcadores sean no informativos Un resultado normal indica el complemento normal de dos de los cromosomas analizados 9 Las razones de reas de picos que caigan entre los rangos normal y anormal se clasifican como no concluyentes Los resultados no concluyentes pueden resolverse utilizando los kits de cromosoma nico ANOOO
6. 181409 21q21 2 0 74 191 239 rojo D21S1442 21q21 3 0 85 290 349 verde D21S1435 21q21 3 0 74 167 204 azul D21S1411 21q22 3 0 83 283 344 amarillo D21S1446 21q22 3 0 76 205 235 verde ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 34 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Tabla 5 Marcadores utilizados en el Elucigene QST R 18 Marcador Ubicaci n Heterocigosidad Rango de tama o Color del observada de los alelos pb colorante del marcador D18S391 18p11 31 0 70 205 225 verde D18S1002 18q11 2 0 76 337 365 azul D18S819 18q11 2 0 73 400 425 rojo D18S847 18q12 1 0 71 204 232 azul D18S535 18q12 3 0 77 466 498 azul D18S978 18q12 3 0 71 207 223 amarillo D18S977 18921 31 0 70 248 285 rojo D18S386 18q22 1 0 92 332 405 verde D18S390 18q22 3 0 69 356 394 amarillo Tabla 6 Marcadores utilizados en el Elucigene QST R 13 Marcador Ubicaci n Heterocigosidad Rango de tama o Color del observada de los alelos pb colorante del marcador D138252 13q12 2 0 74 274 311 rojo D135305 13q13 3 0 79 424 466 verde D13S325 13q14 11 0 80 272 309 verde D135634 13q21 33 0 84 380 428 azul D13S800 13q22 1 0 72 284 320 amarillo D135628 13q31 1 0 75 426 465 amarillo D13S762 13q31 3 0 75 302 331 azul D13S797 13q33 2 0 77 178 250 azul ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 35 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Limitaciones del procedimiento Esta prueba est
7. 8 13q31 1 0 75 426 465 amarillo D18S391 18p11 31 0 70 205 225 verde D18S819 18q11 2 0 73 400 425 rojo D18S535 18q12 3 0 77 466 498 azul D18S978 18q12 3 0 71 207 223 amarillo D18S386 18q22 1 0 92 332 405 verde D18S390 18q22 3 0 69 356 394 amarillo D21S11 21q21 1 0 82 228 279 azul D2181437 21q21 1 0 76 307 347 azul D2181409 21q21 2 0 74 191 239 rojo D2181435 21q21 3 0 74 167 204 azul D2181411 21q22 3 0 83 283 344 amarillo ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 33 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Tabla 3 Marcadores utilizados en el Elucigene QST R XYv2 Marcador Ubicaci n Heterocigosidad Rango de tama o Color del observada de los alelos pb colorante del marcador DXYS218 Xp22 32 Yp11 3 0 74 376 392 azul AMEL Xp22 22 Yp11 2 n a 104 110 amarillo DXYS267 Xq21 31 Yp11 31 0 75 240 280 rojo DXS6807 Xp22 3 0 66 326 351 azul DXS981 Xq13 1 0 73 226 260 azul DXS6803 Xq21 31 0 86 131 153 azul DXS6809 Xq21 33 0 78 392 436 amarillo DXS1187 Xxq26 2 0 73 123 165 verde XHPRT Xq26 2 0 72 266 298 verde DXS7423 Xq28 0 67 360 388 verde SRY Yp11 31 n a 248 amarillo DYS448 Yq11 223 n a 349 372 rojo Tabla 4 Marcadores utilizados en el Elucigene QST R 21 Marcador Ubicaci n Heterocigosidad Rango de tama o Color del observada de los alelos pb colorante del marcador D21S11 21q21 1 0 82 228 279 azul D2181437 21q21 1 0 76 307 347 azul D2
8. A Antonarakis SE Detection of aneuploidies by paralogous sequence quantification Journal of Medical Genetics 2004 41 908 915 ELUCIGENE y QST R son marcas comerciales de Delta Diagnostics UK Ltd GENEMAPPER GENESCAN VIC PET NED LIZ POP 7 y HI DI son marcas comerciales de Life Technologies Corporation QIAAMP es una marca comercial de Qiagen Gmbh GENEMARKER es una marca comercial de SoftGenetics Corporation INSTAGENE es una marca comercial de Bio Rad Laboratories Inc Nota al comprador Licencia limitada Los polinucle tidos marcados con los colorantes VIC NED y PET as como su uso podr an estar cubiertos por una o m s de las patentes propiedad de Applied Biosystems LLC El precio de compra de este producto incluye derechos limitados no transferibles bajo determinadas reclamaciones de ciertas patentes propiedad de Applied Biosystems LLC para usar solo esta cantidad del producto nicamente para actividades del comprador en detecci n de dianas dentro del campo del diagn stico humano No se transfieren otros derechos Si desea informaci n adicional sobre la compra de licencias en referencia a los colorantes anteriormente mencionados p ngase en contacto con el director de licencias en la direcci n siguiente outlicensingOlifetech com Copyright O 2014 Delta Diagnostics UK Ltd ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 37 de 37
9. BYES 001 Sep 2014 P gina 16 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso 10 Si se obtienen patrones al licos tanto normales como anormales para un cromosoma se recomienda realizar estudios de seguimiento para identificar la raz n de los resultados discrepantes antes de llegar a ninguna conclusi n 11 En casos infrecuentes los rangos de los tama os de los alelos correspondientes a los marcadores pueden solaparse Si se sospecha esto el an lisis con los kits de cromosoma nico pueden resolver esto Espec fico para los marcadores QST R XYv2 y de los cromosomas sexuales en QST Rplusv2 1 El marcador AMEL amplifica secuencias no polim rficas de los cromosomas X 104 pb e Y 110 pb puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un cromosoma Y y representa la cantidad relativa de secuencia de X a Y Tenga en cuenta que en raras ocasiones se ha observado un fallo de la amplificaci n debido a la mutaci n de la secuencia AMEL Y 2 TAF9L es un marcador par logo invariante con secuencias en los cromosomas 3 y X Por ello el pico espec fico del cromosoma 3 116 pb que representa 2 copias del cromosoma 3 puede utilizarse como un pico de referencia para facilitar la determinaci n del n mero de cromosomas X presentes pico de 121 pb Analizado en combinaci n con la amelogenina y los otros marcadores de los cromosomas sexuales es particularmente til en el diagn stico de la aneuploid a de los cromosomas s
10. Cinco muestras no ofrecieron un resultado interpretable a pesar de la amplificaci n repetida Todas las muestras analizables mostraron una especificidad y una sensibilidad del 100 con resultados obtenidos previamente mediante cariotipificaci n ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 18 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso QST R 21 Se analizaron a ciegas 152 muestras utilizando Elucigene QST R 21 De estas 148 fueron normales y 2 mostraron trisom a 21 Dos muestras no ofrecieron un resultado interpretable a pesar de la amplificaci n repetida Todas las muestras analizables mostraron una especificidad y una sensibilidad del 100 con resultados obtenidos previamente mediante cariotipificaci n ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 19 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso AP NDICE 1 EJEMPLOS Elucigene QST Rplusv2 Los marcadores est n etiquetados de la forma siguiente DXS6803 AMEL D21S1435 TAF9L D218S11 D18S978 D21S1437 SRY D13S634 D13S800 D18S535 D18S390 D13S628 Consulte el ap ndice 2 para obtener m s detalles de los marcadores de STR incluidos los rangos de tama o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 20 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST Rp usv2 GENEMAPPER Ejemplo de un perfil AST Rplusv2 de var n normal que muestra la posici n relativa de los marcador
11. Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene Y Diagnostics Productos Elucigene QST RY Instrucciones de uso Producto Tama o C digo de cat logo Elucigene QST Rplusv2 50 pruebas ANOPLB2 Elucigene QST R 50 pruebas AN003B2 Elucigene QST R XYv2 50 pruebas ANOXYB2 Elucigene QST R 13 10 pruebas ANO13BX Elucigene QST R 18 10 pruebas AN018BX Elucigene QST R 21 10 pruebas AN021BX Para uso diagn stico in vitro rr por Elucigene Diagnostics Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Para ventas servicio al cliente y asistencia t cnica T 44 0 161 669 8122 F 44 0 161 669 8129 E enquiriesCelucigene com E techsupportOelucigene com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics UK Limited a company registered in England and Wales registration number 8696299 ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 1 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R La l nea de productos Elucigene QST R son ensayos multiplexados basados en DNA para la determinaci n prenatal r pida del estado de aneuploid a en las tres trisom as autos micas viables m s frecuentes y en los cromosomas sexuales X e Y Los kits Elucigene QST R est n disponibles en los formatos indicados a continuaci n Para obtener m s informaci n sobre los kits de la l nea QST R visite www elucigene com products Uso indicado QST Rplusv2 Par
12. a el diagn stico cuantitativo in vitro sistem tico de las tres trisom as autos micas viables m s frecuentes la trisom a 13 s ndrome de Patau la trisom a 18 s ndrome de Edwards y la trisom a 21 s ndrome de Down El kit tambi n incluye marcadores de los cromosomas X e Y y el marcador TAF9L para la determinaci n del sexo El m todo empleado por el kit Elucigene QST Rplusv2 es la t cnica RCP CF Reacci n en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente Los dispositivos est n indicados para utilizarse en DNA extra do de muestras de l quido amni tico o vellosidades cori nicas tomadas durante la amniocentesis La poblaci n diana es la de mujeres embarazadas que se han evaluado como de alto riesgo de tener un feto afectado mediante procedimientos diagn sticos bioqu micos o ecogr ficos o que se han evaluado como de riesgo debido a sus antecedentes familiares o a su edad materna El dispositivo est indicado para utilizarse junto con otros procedimientos diagn sticos para respaldar o descartar el diagn stico cl nico propuesto El dispositivo es solamente para uso profesional en entornos de laboratorios moleculares o de citogen tica QST R Para el diagn stico cuantitativo in vitro sistem tico de las tres trisom as autos micas viables m s frecuentes la trisom a 13 s ndrome de Patau la trisom a 18 s ndrome de Edwards y la trisom a 21 s ndrome de Down El m todo empleado por el kit Elucigene QST
13. al positivo control de DNA suministrado y control de trisom a positivo DNA no suministrado 3 Descongele suficientes viales de mezcla de reacci n QST R prealicuotada para el n mero de muestras y controles que se vayan a procesar vea la nota en Materiales suministrados y centrifugue los viales a 12 000 g durante 10 segundos 4 Utilizando puntas de pipeta diferentes a ada 2 5 ul de DNA anal tico a un vial para muestras con 10 ul de mezcla de reacci n QST R y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo Haga esto con todas las muestras que desee analizar No a ada DNA sino 2 5 ul de agua est ril destilada al vial para RCP del control negativo Nota Tenga cuidado para no contaminar la reacci n de RCP con alguna resina InstaGene 5 Centrifugue brevemente los viales hasta que todo el l quido se encuentre en el fondo de cada vial 6 Coloque todos los viales firmemente en el bloque del termociclador Inicie el programa de activaci n a 95 C seguido del programa de amplificaci n consulte el paso 1 7 Una vez terminado el programa de amplificaci n las muestras pueden almacenarse a temperatura ambiente de un d a a otro o a 2 8 C durante hasta 7 d as antes de realizar el an lisis mediante electroforesis capilar ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 11 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Electroforesis capilar Se recomienda que cada usuario se asegure de que el equipo elegido se utilice de ac
14. altamente polim rficas de la secuencia de DNA denominadas repeticiones cortas en t ndem STR que se encuentran en los cromosomas de inter s Cada marcador de STR diana es espec fico del cromosoma en el que se encuentra y as el n mero de copias del marcador de STR puede ofrecer un diagn stico del n mero de copias del cromosoma Se han seleccionado marcadores de STR informativos que muestran una alta heterogeneidad de forma que pueda determinarse f cilmente el n mero de copias Una muestra diploide normal tiene el complemento normal de dos de cada uno de los cromosomas som ticos as dos alelos de una STR espec fica de un cromosoma son determinados por la t cnica de RCP CF como dos picos en una raz n 1 1 La observaci n de un alelo de STR extra como un patr n de tres picos en una raz n 1 1 1 0 un patr n de dos picos en una raz n de picos 2 1 o 1 2 es un indicador diagn stico de la presencia de una secuencia adicional que a su vez puede representar un cromosoma adicional como en el caso de una trisom a Los productos amplificados de la t cnica de RCP CF se analizan cuantitativamente en un analizador gen tico de electroforesis capilar para determinar el n mero de copias de los marcadores de STR analizados Advertencias y precauciones 1 El control de DNA normal incluido en los kits se ha analizado independientemente y se ha observado que da negativo para el virus de la hepatitis B VHB el virus de la hepatitis C VHC y l
15. ci n cl nica integrada del riesgo que se realiza entre las semanas 10 y 13 5 del embarazo Esta combina dos marcadores bioqu micos la hCG gonadotropina cori nica humana beta libre y la PAPP A prote na A plasm tica asociada al embarazo con la medici n del grosor del pliegue de la nuca fetal translucidez de la nuca 1 La combinaci n de ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 3 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso los resultados de estas tres pruebas ofrece una cifra de riesgo global A continuaci n a las mujeres identificadas como con mayor riesgo de tener un hijo con s ndrome de Down se les ofrece una amniocentesis para comprobar directamente la anomal a La amniocentesis es una prueba invasiva e incluye la introducci n de una aguja guiada por ecograf a en el saco amni tico que rodea al feto Se extrae y analiza una peque a muestra normalmente de 10 20 ml de l quido amni tico que contiene c lulas fetales El nombre de s ndrome de Down viene del Dr John Langdon Down y se introdujo en 1866 aunque ya se hab a descrito anteriormente Es causado por una trisom a de la totalidad o de parte del cromosoma 21 2 Adem s de una discapacidad cognitiva de mayor o menor grado los individuos con s ndrome de Down suelen compartir una serie de caracter sticas comunes como hipoton a bajo tono muscular lengua prominente ojos en forma de almendra debido a un pliegue epic ntico fisuras palpebrales oblicuas a
16. con esta prueba ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 8 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Extracci n del DNA Los kits Elucigene QST R est n validados mediante el m todo de extracci n de DNA de la matriz InstaGene y permiten realizar la prueba en un solo tubo lo que elimina la necesidad de transferencias de un tubo a otro Se ha demostrado que otros m todos de extracci n p ej los kits Qiagen QlAamp ofrecen resultados igualmente fiables El m todo InstaGene de extracci n de DNA se describe a continuaci n M todo de extracci n InstaGene L quido amni tico Deber n utilizarse aproximadamente 1 2 ml de l quido amni tico Vellosidades cori nicas Las muestras de vellosidades cori nicas deber n limpiarse con cuidado para retirar la decidua materna adherente que pueda haber Es importante analizar c lulas de m s de una regi n de la muestra y que est n representadas las c lulas del n cleo mesenquimatoso Para el an lisis QAST R se recomienda una peque a al cuota de la suspensi n celular como suele hacerse para la preparaci n de los cultivos celulares ordinarios Esto garantiza que el resultado del QST R se obtenga a partir de la misma poblaci n de c lulas empleada para el an lisis cariot pico 1 Vuelva a suspender la matriz InstaGene en el agitador magn tico y aj stelo a una velocidad mediana durante un m nimo de 5 minutos 2 Centrifugue la muestra de l quido amni tico o vellosidade
17. des para los 3 cromosomas analizados Una muestra mostr contaminaci n de c lulas maternas que impidi el an lisis y una muestra no arroj un resultado interpretable a pesar de la amplificaci n repetida En total 310 muestras arrojaron resultados analizables Todas las muestras analizables mostraron una especificidad y una sensibilidad del 100 con resultados obtenidos previamente mediante cariotipificaci n QST R XYv2 Se analizaron a ciegas 321 muestras utilizando Elucigene QST R XYv2 De estas 160 fueron varones normales 147 fueron mujeres normales 3 mostraron monosom a X 2 mostraron XXY 2 mostraron XYY y 1 mostr XXX Seis muestras no arrojaron un resultado interpretable a pesar de la amplificaci n repetida En total 315 muestras arrojaron resultados analizables Todas las muestras analizables mostraron una especificidad y una sensibilidad del 100 con resultados obtenidos previamente mediante cariotipificaci n QST R 13 Se analizaron a ciegas 152 muestras utilizando Elucigene QST R 13 De estas 144 fueron normales y 2 mostraron trisom a 13 Seis muestras no arrojaron un resultado interpretable a pesar de la amplificaci n repetida Todas las muestras analizables mostraron una especificidad y una sensibilidad del 100 con resultados obtenidos previamente mediante cariotipificaci n QST R 18 Se analizaron a ciegas 152 muestras utilizando Elucigene QST R 18 De estas 143 fueron normales y 4 mostraron trisom a 18
18. dimientos diagn sticos bioqu micos o ecogr ficos o que se han evaluado como de riesgo debido a sus antecedentes familiares o a su edad materna El dispositivo est indicado para utilizarse junto con otros procedimientos diagn sticos para respaldar o descartar el diagn stico cl nico propuesto El dispositivo es solamente para uso profesional en entornos de laboratorios moleculares o de citogen tica QST R 13 QST R 18 QST R 21 Kits complementarios que contienen marcadores autos micos adicionales para uso junto con QST R o QST Rplusv2 para el diagn stico in vitro cuantitativo sistem tico de las tres trisom as autos micas viables m s frecuentes la trisom a 13 s ndrome de Patau la trisom a 18 s ndrome de Edwards y la trisom a 21 s ndrome de Down respectivamente Estos kits est n disponibles para an lisis cromos micos ampliados cuando sean necesarios y para la confirmaci n de resultados positivos El m todo empleado por estos kits es la t cnica RCP CF Reacci n en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente Los dispositivos est n indicados para utilizarse en DNA extra do de muestras de l quido amni tico o vellosidades cori nicas tomadas durante la amniocentesis La poblaci n diana es la de mujeres embarazadas que se han evaluado como de alto riesgo de tener un feto afectado mediante procedimientos diagn sticos bioqu micos o ecogr ficos o que se han evaluado como de riesgo debido a sus a
19. es detectados 40 8220 D13004 Sdi a MIN ar 10170 Ip pres 70 10413 DRIST E s s m e a B HE QT 15170 f 12310 PERETE EEE AP TALARA Ao CEDAS RS EER JI QSTAL QS IINR do ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 21 de 37 Elucigene QST R Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Los marcadores est n etiquetados de la forma siguiente D21S1435 D18S978 D218S11 D21S1411 D21S1437 D18S390 D13S634 D13S628 D18S535 Consulte el ap ndice 2 para obtener m s detalles de los marcadores de STR incluidos los rangos de tama o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 22 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R GENEMAPPER Ejemplo de un perfil AST R normal que muestra la posici n relativa de los marcadores detectados EL N e QST DUSOMY ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 23 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R XYv2 Los marcadores est n etiquetados de la forma siguiente DXS6803 AMEL DXS981 SRY DXS6807 DXS6809 DXYS218 Consulte el ap ndice 2 para obtener m s detalles de los marcadores de STR incluidos los rangos de tama o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 24 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R XYv2 GENEMAPPER Ejempl
20. exuales En una mujer normal los marcadores deber n estar dentro de un intervalo de raz n de 0 8 a 1 4 En un var n normal o monosom a X los marcadores dar n una raz n gt 1 8 En la Guide to Interpretation Gu a de la interpretaci n se ofrecen m s detalles sobre la interpretaci n del marcador TAF9L 3 Los marcadores de las STR polim rficas DXYS267 y DXYS218 est n presentes en los cromosomas X e Y y representan el n mero total de cromosomas sexuales En el caso de los resultados informativos de varones no es posible determinar qu alelo representa el cromosoma X o el Y 4 Los marcadores informativos espec ficos de X DXS981 DXS1187 XHPRT DXS6807 DXS7423 DXS6803 y DXS6809 representan el n mero de cromosomas X 5 El marcador espec fico de Y SRY dar un solo pico en varones normales y no se amplificar en las mujeres normales 6 En la mayor a de los casos el marcador espec fico de Y DYS448 dar un solo pico en varones normales y no se amplificar en las mujeres normales Se ha observado que en raras ocasiones este marcador puede demostrar un patr n dial lico hereditario duplicaci n submicrosc pica seguida de deslizamiento de cadena durante la replicaci n replication slippage o no mostrar amplificaci n alelo nulo 7 Un resultado que no presente amplificaci n para los marcadores espec ficos de Y y que sea homocig tico en todos los dem s marcadores no es necesariamente un indicador diagn st
21. ico de s ndrome de Turner Sobre la base de los datos publicados aproximadamente 1 de cada 170 000 mujeres ser n homocig ticas para los 7 marcadores polim rficos espec ficos de X Esto arroja una probabilidad bayesiana de aproximadamente 1 en 1400 de que un perfil homocig tico para todos los marcadores espec ficos de X represente un genotipo de monosom a X verdadero en vez de una mujer homocig tica normal ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 17 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Caracter sticas de rendimiento VALIDACI N INTERNA QST Rplusv2 Se analizaron a ciegas 98 muestras utilizando Elucigene QST Rplusv2 De estas 22 fueron normales XY 17 fueron normales XX 12 fueron trisom a 21 XY 7 fueron trisom a 21 XX 9 fueron trisom a 18 XY 8 fueron trisom a 18 XX 2 fueron trisom a 13 XY 4 fueron trisom a 13 XX 8 fueron normales X0O 1 fue normal XYY y 1 fue triploide para todos los cromosomas analizados Una muestra arroj un resultado no informativo Seis muestras no arrojaron resultados analizables debido a la mala calidad de las muestras Todos los resultados analizables mostraron una especificidad y una sensibilidad del 100 con resultados obtenidos previamente mediante un m todo alternativo establecido QST R Se analizaron a ciegas 312 muestras utilizando Elucigene QST R De estas 286 fueron normales 2 mostraron trisom a 13 7 mostraron trisom a 18 13 mostraron trisom a 21 y 2 fueron triploi
22. l y congelados a 20 C Aseg rese de que los contenidos de los viales se hayan descongelado y mezclado bien antes de la dispensaci n ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 7 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Materiales necesarios pero no suministrados Generales Consumibles de laboratorio guantes y puntas de pipeta Equipo de laboratorio pipetas de precisi n 2 juegos 1 para la manipulaci n preamplificaci n y 1 para la manipulaci n postamplificaci n preferentemente pipetas de desplazamiento positivo ropa protectora mezclador v rtex microcentrifugadora y centrifugadora de placas de microvaloraci n de 96 pocillos Extracci n del DNA Preparaci n del DNA matriz InstaGene Bio Rad Laboratories n de cat 732 6030 agua desionizada est ril Amplificaci n por RCP Termociclador para alojar placas de microvaloraci n de 96 pocillos o viales de 0 2 ml con un margen de error en la temperatura de 1 C entre 33 C y 100 C y una uniformidad de temperatura est tica de 1 C Electroforesis capilar Electroforesis capilar est ndar de tama o GeneScan 500 LIZ ABI n de cat 4322682 GeneScan 600 LIZ ABI n de cat 4366589 o GeneScan 600v2 LIZ ABI n de cat 4408399 est ndar de matriz DS 33 juego de colorantes G5 ABI n de cat 4345833 pol mero POP 7 ABI n de cat 4352759 10x Genetic Analyzer Buffer tamp n de analizador gen tico ABI n de cat 402824 y forma
23. mida Hi Di ABI n de cat 4311320 Analizadores gen ticos Applied Biosystems ABI 3130 y 3500 con software GeneMapper arsenal capilar de 36 cm arsenal capilar de 50 cm para analizador gen tico 3500 placas pticas de 96 pocillos tabiques de 96 pocillos casetes de 96 pocillos An lisis de los datos Es necesario uno de los siguientes paquetes de software de an lisis de datos GeneMapper 3 7 Applied Biosystems Inc o superior o GeneMarker 1 65 SoftGenetics LLC o superior Documentaci n adicional de Elucigene QST R Estas instrucciones de uso incluyen una secci n b sica sobre la interpretaci n de los resultados obtenidos Hay una Guide to Interpretation Gu a de la interpretaci n complementaria con ejemplos y un glosario y una Guide to Analysis Gu a del an lisis disponibles en el sitio web de Elucigene Diagnostics www elucigene com products Recogida y almacenamiento de las muestras Deber n utilizarse muestras de vellosidades cori nicas o de l quido amni tico Se ha informado de que los dispositivos de recogida de muestras en ocasiones han resultado perjudiciales para la integridad de determinados analitos y podr an interferir con algunas tecnolog as metodol gicas Se recomienda que cada usuario se asegure de que el dispositivo elegido se utilice de acuerdo con las instrucciones del fabricante y de que tanto los dispositivos de recogida de muestras como los m todos de preparaci n de DNA sean compatibles
24. ntecedentes familiares o a su edad materna El dispositivo est indicado para utilizarse junto con otros procedimientos diagn sticos para respaldar o descartar el diagn stico cl nico propuesto El dispositivo es solamente para uso profesional en entornos de laboratorios moleculares o de citogen tica Resumen y explicaci n El s ndrome de Down el s ndrome de Edwards y el s ndrome de Patau son las tres trisom as autos micas viables m s frecuentes Las incidencias en nacidos vivos son aproximadamente 1 700 1 3000 y 1 21 700 respectivamente Las aneuploid as de los cromosomas sexuales m s frecuentes son el s ndrome de Turner en mujeres y el s ndrome de Klinefelter en varones La causa m s frecuente del s ndrome de Turner es la monosom a del cromosoma X cariotipo 45 X y la del s ndrome de Klinefelter una copia adicional del cromosoma X cariotipo 47 XXY Las incidencias en nacidos vivos son entre 1 2000 y 1 5000 mujeres en el caso del s ndrome de Turner y entre 1 500 y 1 650 varones en el del s ndrome de Klinefelter El riesgo de tener un hijo con s ndrome de Down aumenta considerablemente con la edad de la madre de aproximadamente 1 1600 a los 20 24 a os a 1 200 a los 35 a os y a 1 19 a m s de 45 a os A las mujeres embarazadas se les ofrece siempre una prueba de s ndrome de Down en el primer trimestre del embarazo Una prueba est ndar es la denominada prueba OSCAR One Stop Clinical Assessment of Risk Evalua
25. o de un perfil AST R XYv2 de var n normal que muestra la posici n relativa de los marcadores detectados a la 360 2al pass wo EE o o m a m a m A a E a E E E A a i i po o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 25 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R 21 Los marcadores est n etiquetados de la forma siguiente D21S1435 D21S11 D21S1437 D21S1411 Consulte el ap ndice 2 para obtener m s detalles de los marcadores de STR incluidos los rangos de tama o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 26 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R 21 GENEMAPPER Ejemplo de un perfil AST R 21 normal que muestra la posici n relativa de los marcadores detectados 3 Las 17550 Le 70525 gsmn ANOOOBYES 001 E qsm g De a ja asma Sep 2014 asma omn ar vaes E P gina 27 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R 18 Los marcadores est n etiquetados de la forma siguiente D18S847 D185S1002 D18S535 D18S978 D18S390 Consulte el ap ndice 2 para obtener m s detalles de los marcadores de STR incluidos los rangos de tama o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 28 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R 18 GENEMAPPER Ejemplo de
26. os virus de la inmunodeficiencia humana VIH 1 y 2 2 Debe tenerse precauci n al manipular material de origen humano Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas Ning n m todo de prueba puede ofrecer una garant a total de que el VHB el VHC el VIH u otros agentes infecciosos est n ausentes 3 La manipulaci n de muestras y componentes de pruebas as como su uso almacenamiento y eliminaci n deben realizarse de acuerdo con los procedimientos definidos por la pauta o normativa de seguridad nacional pertinente relativa a peligros biol gicos 4 En l nea con las buenas pr cticas de laboratorio actuales los laboratorios deben procesar sus propias muestras de control de calidad interno de genotipos conocidos en cada ensayo para as poder evaluar la validez del procedimiento 5 Si la caja del kit est da ada es posible que el contenido est da ado tambi n no utilice el kit y p ngase en contacto con el servicio al cliente ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 5 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso S mbolos utilizados en las etiquetas Los s mbolos utilizados en todas las etiquetas y envases se ajustan al est ndar armonizado 15015223 Fabricante N mero de pruebas Ej lt E Consultar las instrucciones de uso E Almacenar por debajo de la temperatura indicada Usar antes de la fecha indicada C digo de cat logo HELa LOT N mero de lote Dispositivo m dico
27. pietario predeterminado correspondiente al laboratorio e Run Protocol Protocolo del ciclo ASTR contiene m dulo de ciclo QST R 3130 v ase m s abajo Nota Es necesario crear un m dulo de ciclo que detalle los ajustes del instrumento y asignarlo posteriormente a un protocolo de ciclo en el que se haya seleccionado el juego de colorantes G5 Para m s informaci n sobre la creaci n de m dulos de ciclos consulte el manual del usuario del instrumento 3130 RUN MODULE M DULO DE CICLO PARA POL MERO POP7 M dulo capilar de 36 cm QSTR Parameter Name Value Range 1 Oven Temperature 60 int 18 65 Deg C 2 Poly_fill_Vol 6500 6500 38000 steps 3 Current Stability 5 0 int 0 2000 uAmps 4 PreRun_Voltage 15 0 0 15 kvolts 5 Pre_Run_Time 180 1 1000 sec 6 Injection_Voltage 3 0 1 15 kvolts 7 Injection_Time 15 1 600 sec 8 Voltage_Number_of_Steps 20 1 100 nk 9 Voltage_Step_Interval 15 1 60 sec 10 Data_Delay_Time 60 1 3600 sec 11 Run_Voltage 15 0 0 15 kvolts 12 Run_Time 1200 300 14000 sec ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 13 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso ABI3500 GENETIC ANALYZER ANALIZADOR GEN TICO Es necesario crear un protocolo de instrumento QSTR que luego pueda utilizarse para cada ciclo QSTR Cree el protocolo de instrumento QSTR usando la biblioteca de protocolos de instrumento 3500 Aseg rese de que est
28. plicarse m s amplic n a la columna para an lisis aumentando el tiempo o el voltaje de inyecci n Las muestras amplificadas previamente pueden reinyectarse en m ltiples ocasiones para nuevos an lisis Protocolo de prueba Procedimiento de amplificaci n Cuando las muestras se extraigan empleando el m todo InstaGene se recomienda utilizar sobrenadante sin diluir directamente en la reacci n de RCP Nota Para reducir al m nimo el riesgo de contaminaci n los pasos del 3 al 5 deben llevarse a cabo en un rea libre de DNA Tambi n tienen que tomarse las medidas necesarias para evitar la contaminaci n con el producto para RCP 1 Programe el termociclador para un ciclo de paso nico para activar la polimerasa DNA a 95 C durante 15 minutos unido a un programa de ciclado de amplificaci n de 30 minuto a 95 C desnaturalizaci n 1 minutos y 30 segundos a 59 C hibridaci n y 1 minuto y 30 segundos a 72 C extensi n durante 26 ciclos Esto deber asociarse a un archivo de retardo de tiempo de 30 minutos a 72 C extensi n en el ciclo final ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 10 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Activaci n enzim tica Ciclado Extensi n final 95 C 15 min 72 C 30 min Temperatura ambiente 1 min 30 s lt 26 ciclos gt 2 Debe incluirse un control negativo agua en cada ciclo de RCP Tambi n puede considerarse adecuado incluir otros controles p ej norm
29. ratorio de los que disponga el m dico Estos reactivos de Elucigene se suministran para pruebas de diagn stico in vitro Hay m s detalles de los productos Elucigene QST R disponibles en www gen probe com global products services ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 36 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Referencias 1 CG Antenatal Care full guidelines Corrected June 2008 UK National Institute for Health and Clinical Excellence 2 O Connor C 2008 Trisomy 21 Causes Down syndrome Nature Education 1 1 3 Mansfield E S Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms Human Molecular Genetics 1993 2 1 43 50 4 Mann K Fox SP Abbs SJ Yau SC Scriven PN Docherty Z Mackie Ogilvie C Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis The Lancet 2001 358 9287 1057 1061 5 Mann K Donaghue C Fox SP Docherty Z Mackie Ogilvie C Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy European Journal of Human Genetics 2004 12 907 915 6 Mackie Ogilvie C Donaghue C Fox SP Docherty Z Mann K Rapid prenatal diagnosis of an aneuploidy using Quantitative Fluorescence PCR QF PCR Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2005 53 3 285 288 7 Deutsch S Choudhury U Merla G Howald C Sylvan
30. rner acabar n en aborto espont neo Las ni as supervivientes muestran una serie de caracter sticas t picas como corta estatura amenorrea primaria y cuello palmeado derivado de higroma qu stico un saco relleno de l quido en el tero Tambi n suelen sufrir cardiopat a cong nita y pueden tener ri ones en forma de herradura El s ndrome de Klinefelter en varones es causado por la presencia de una copia adicional del cromosoma X Los varones con s ndrome de Klinefelter son est riles y pueden tener una discapacidad cognitiva leve Suelen ser m s altos que la media pueden presentar ginecomastia que requiera reducci n quir rgica y tienen un mayor riesgo de osteoporosis debido a los menores niveles de testosterona La prueba QST Rplusv2 incluye marcadores para los tres autosomas y para X e Y Est dise ada para detectar aneuploid as de cromosomas completos en estos cromosomas pero no detectar reorganizaciones estructurales equilibradas ni distinguir entre la aneuploid a causada por un evento de no disyunci n y una reorganizaci n no equilibrada ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 4 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Principios del procedimiento El m todo empleado por los kits Elucigene QST R utiliza la t cnica RCP CF Reacci n en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente 3 7 Utilizando amplificaci n por RCP los cebadores marcados con colorante fluorescente se dirigen a regiones diana
31. s cori nicas a 12 000 g durante 1 minute para sedimentar las c lulas 3 Extraiga las muestras de la centrifugadora y examine visualmente el sedimento para comprobar si presenta tinci n hem tica Registre el porcentaje de tinci n hem tica si la hay 4 Retire y deseche con cuidado el sobrenadante del sedimento asegur ndose de no alterar el sedimento Deje aproximadamente 10 20 ul de sobrenadante detr s para volver a suspender la sedimentaci n 5 Mezcle bien la muestra con un mezclador v rtex 6 Si se observa una tinci n hem tica de m s del 50 vaya al paso 7 Si se observa una tinci n hem tica de menos del 50 vaya al paso 8 7 A ada 200 ul de agua desionizada est ril al sedimento celular Mezcle bien con un mezclador v rtex Centrifugue a 12 000 g durante 1 minuto y retire el sobrenadante dejando 10 20 ul de sobrenadante detr s para volver a suspender el sedimento Nota Este paso de lavado adicional ayuda a lisar los gl bulos rojos y a eliminar el hemo que podr a inhibir la RCP 8 A ada 200 ul de matriz InstaGene del paso 1 a las muestras utilizando una punta de pipeta de calibre grande como 1000 ul Nota Para optimizar el protocolo de extracci n el volumen a adido de matriz InstaGene resina Chelex 100 puede variarse utilizando 100 ul de matriz InstaGene para sedimentos celulares peque os de l quido amni tico apenas visibles o 300 ul para sedimentos grandes que cubran la base del tubo vello
32. s por m s de 24 pb en tama o es aceptable una raz n de hasta 1 5 Se considera que cualquier valor que caiga dentro de esta regi n tiene una raz n de 1 1 Si el equilibrio de la raz n cae fuera de este intervalo ello puede deberse a diversos factores tales como Trisom a total del cromosoma Trisom a parcial del cromosoma incluidas las duplicaciones submicrosc picas Mosaicismo Segundo genotipo contaminante p ej materno gemelo o externo Bandas sombra stutters que causan razones alteradas skewing Amplificaci n preferente de un alelo que produce razones alteradas skewing Polimorfismos de los lugares de los cebadores Mutaciones de microsat lites som ticos La Guide to Interpretation Gu a de la interpretaci n ofrece ejemplos de perfiles t picos de muchos de estos Los marcadores homocig ticos son no informativos ya que no puede determinarse una raz n 7 Para interpretar un resultado como anormal esto es con presencia de trisom a es necesario que al menos dos marcadores informativos sean indicativos de un genotipo trial lico y que todos los dem s marcadores sean no informativos No se recomienda interpretar un resultado como anormal sobre la base de informaci n de un solo marcador Si es necesario los an lisis de seguimiento con los kits de cromosoma nico esto es Elucigene QST R 13 Elucigene QST R 18 y Elucigene QST R 21 pueden ofrecer informaci n suficiente para la interpretaci n La
33. scendentes pliegue palmar nico y extremidades m s cortas de lo normal Tambi n tienen un mayor riesgo de defectos cardiacos cong nitos y de presentar una forma de la enfermedad de Alzheimer al envejecer El s ndrome de Edwards fue descrito por primera vez por el Dr John Edwards en 1960 Es causado por una trisom a de la totalidad o de parte del cromosoma 18 Como en el s ndrome de Down el riesgo de tener un ni o con s ndrome de Edwards aumenta con la edad materna Las caracter sticas cl nicas t picas incluyen bajo peso al nacer defectos cardiacos malformaci n gastrointestinal malformaci n urogenital problemas neurol gicos y anomal as craneofaciales La mediana del tiempo de supervivencia es de unos 4 d as El nombre s ndrome de Patau viene del Dr Klaus Patau que describi la enfermedad con la asociaci n cromos mica Es causado por una trisom a de la totalidad o de parte del cromosoma 13 Los beb s con s ndrome de Patau est n gravemente afectados por diversas anomal as Las caracter sticas t picas incluyen retraso del crecimiento intrauterino bajo peso al nacer defectos cardiacos cong nitos microcefalia holoprosencefalia con fisura palatina y microftalmia apnea central polidactilia y pies en mecedora La mediana del tiempo de supervivencia es de unos 2 5 d as El s ndrome de Turner en mujeres es causado por una monosom a del cromosoma X Aproximadamente el 98 de los embarazos de fetos con s ndrome de Tu
34. seleccionado lo siguiente e Run Module M dulo de ciclo FragmentAnalysis50_POP7 e Introduzca los ajustes detallados en la siguiente imagen LE Eda instrument Protocol OSTR Setup an Instrument Protocol 4 Applicabon Type fragment v Capillary Length 4 cm Polymer POP Dye Set 657 Instrument Protocol Properties Run Module FragmentAnalyses5d POPT X Protocol Name QSTR Descnption Oven Temperature Ch 69 Run Voltage Volts 195 Prefun Voltage kVolts 15 Injection Voltage HVolts 3 9 Run Teme sec 1300 PreRun Time sec 150 Injection Time sec 15 Data Delay sec 1 Advanced Options Para procesar las muestras cree una placa de muestras haciendo clic en Create Plate from Template Crear placa a partir de plantilla en el Dashboard Panel de control y aseg rese de que se haya asignado el protocolo de instrumento correcto para QSTR v ase m s arriba ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 14 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso An lisis e interpretaci n de los resultados Se recomienda que cada laboratorio desarrolle sus propios procedimientos y criterios de interpretaci n y notificaci n La Asscociation for Clinical Genetic Science del Reino Unido han elaborado unas pautas de pr cticas ptimas de RCP CF que pueden consultarse en www acgs uk com Los productos para RCP se observan como un sistema marcado con 5 colorantes utilizando un juego de fil
35. sidades cori nicas y muestras de tejido Registre la cantidad de matriz InstaGene a adida a cada muestra ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 9 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso 9 Mezcle bien las muestras en un mezclador v rtex e inc belas a 100 C durante 8 minutos en un bloque t rmico o un ba o de agua 10 Mezcle bien de nuevo en un mezclador v rtex a alta velocidad durante 10 segundos 11 Centrifugue las muestras a 12 000 g durante 3 minutos El sobrenadante contiene el DNA extra do 12 Proceda a la preparaci n de la RCP o almacene el DNA extra do a 20 C hasta que sea necesario Concentraci n del DNA Se recomienda evaluar exhaustivamente los m todos de extracci n de DNA y los tipos de muestras alternativos con la prueba Elucigene QST R antes de que los resultados se utilicen para fines diagn sticos Cuando las condiciones de la RCP sean ptimas y se utilicen los ajustes de inyecci n de muestras recomendados indicados en el m dulo de ciclo de columnas capilares p gina 13 se obtendr n regularmente resultados aceptables con cantidades de DNA de entrada de 1 25 ng a 10 ng Nota Los ajustes de inyecci n de muestra pueden modificarse para adaptarse a la cantidad de amplic n producida durante la RCP que puede variar debido a la cantidad a adida de DNA gen mico de entrada Puede aplicarse menos amplic n a la columna para an lisis reduciendo el tiempo de inyecci n A la inversa puede a
36. tros G5 El juego de filtros G5 detecta los fragmentos marcados con 6 FAM azul VIC verde NED amarillo y PET rojo m s el marcador de est ndar de tama o marcado con LIZ naranja en un electroforetograma y en el programa GeneMapper o GeneMarker Las gu as de an lisis por software de GeneMarker y GeneMapper est n disponibles en el sitio web de Elucigene Diagnostics www elucigene com products La gu a de an lisis de GeneMapper ofrece detalles de los ajustes del software e instrucciones para la importaci n de datos analizados en una plantilla de informe de Excel GeneMarker tiene una aplicaci n de an lisis de trisom as que es compatible con Elucigene QST R Nota importante Las diferentes combinaciones de instrumento pol mero y est ndar de tama o pueden hacer que la identificaci n de tama os var e ligeramente Durante la validaci n del kit los usuarios deber n comprobar que los ajustes de bines predeterminados den lugar a un etiquetado adecuado de los picos y ajustarlos si es necesario Si hay alguna dificultad p ngase en contacto con la asistencia t cnica para obtener ayuda Pautas generales de an lisis para todos los kits QST R 1 El control negativo no deber mostrar picos agudos dentro del rango de lectura de 100 a 510 pb 2 El control positivo debe mostrar los resultados esperados y todos los picos deben satisfacer los criterios indicados m s abajo 3 Para el an lisis de muestras de DNA deber
37. ucigene QST Rplusv2 Marcador Ubicaci n Heterocigosidad Rango de tama o Color del observada de los alelos pb colorante del marcador D138252 13q12 2 0 74 274 311 rojo D138305 13q13 3 0 79 424 466 verde D13S634 1321 33 0 84 380 428 azul D13S800 13q22 1 0 72 284 320 amarillo D13S800 13q22 1 0 75 426 465 amarillo D18S819 18q11 2 0 73 400 425 rojo D18S535 18q12 3 0 77 466 498 azul D18S978 18q12 3 0 71 207 223 amarillo D18S386 18q22 1 0 92 332 405 verde D18S390 18q22 3 0 69 356 394 amarillo D21511 21q21 1 0 82 228 279 azul D21S1437 21q21 1 0 76 307 347 azul D21S1409 21q21 2 0 74 191 239 rojo D21S1442 21q21 3 0 85 332 389 rojo D2181435 21q21 3 0 74 167 204 azul D2181446 21q22 3 0 76 205 235 verde AMEL Xp22 22 Yp11 2 n a 104 110 amarillo TAF9L 3p24 2 Xq21 1 n a 116 121 amarillo DXS6803 Xq21 31 0 86 131 153 azul XHPRT Xq26 2 0 72 266 298 verde DXS1187 Xq26 2 0 73 123 165 verde SRY Yp11 31 n a 248 amarillo ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 32 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Tabla 2 Marcadores utilizados en el Elucigene QST R Marcador Ubicaci n Heterocigosidad Rango de tama o Color del observada de los alelos pb colorante del marcador D13S252 13q12 2 0 74 274 311 rojo D13S305 13q13 3 0 79 424 466 verde D13S325 13q14 11 0 80 272 309 verde D13S634 13q21 33 0 84 380 428 azul D13S62
38. uerdo con las instrucciones del fabricante y sea compatible con esta prueba En este contexto los par metros clave son el pol mero y el arsenal capilar Pueden obtenerse resultados ptimos utilizando las siguientes condiciones de electroforesis capilar en un analizador gen tico ABI3130 o ABI3500 1 Combine 6 85 ul del est ndar de tama o con 250 ul de formamida Hi Di y mezcle bien mezcla suficiente para 16 pocillos Dispense 15 ul de la mezcla en el n mero necesario de pocillos de una placa ptica de 96 pocillos 2 A ada 3 ul de producto para RCP para muestras anal ticas a la mezcla de est ndar de tama o del paso 1 ya dispensada en la placa y mezcle utilizando la pipeta Cierre herm ticamente la placa 3 Desnaturalice el producto para RCP dispensado en la placa ptica en un termociclador utilizando los par metros siguientes 94 C durante 3 minutos seguidos por 4 C durante 30 segundos 4 Centrifugue la placa a 1000 g durante 10 segundos para eliminar las burbujas de los pocillos y c rguela en el analizador gen tico ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 12 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso ABI3130 GENETIC ANALYZER ANALIZADOR GEN TICO Cree una hoja de muestra utilizando el software de recogida de datos 3130 con los siguientes ajustes Sample Name Nombre de la muestra Este debe ser el mismo nombre o n mero espec ficos de la muestra e Run Owner Propietario del ciclo Seleccione el pro
39. un perfil AST R 18 normal que muestra la posici n relativa de los marcadores detectados 1 78 15 latino A EH jae luai EE m m a C m 2 a 3 E E ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 29 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R 13 Los marcadores est n etiquetados de la forma siguiente D13S797 D13S762 D135634 D13S800 D13S628 Consulte el ap ndice 2 para obtener m s detalles de los marcadores de STR incluidos los rangos de tama o ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 30 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso Elucigene QST R 13 GENEMAPPER Ejemplo de un perfil AST R 13 normal que muestra la posici n relativa de los marcadores detectados omu omu CAE G0 _2010 02 42 31 o8 ANOOOBYES 001 Sep 2014 P gina 31 de 37 Elucigene QSTR Productos Instrucciones de uso AP NDICE 2 TABLAS DE LOS MARCADORES UTILIZADOS Nota El colorante NED utilizado en los kits se identifica espectralmente como un colorante amarillo Se muestra normalmente en caracteres negros para ofrecer mayor claridad Las heterocigosidades observadas se basan en el n mero de alelos observados con el panel de validaci n de Elucigene Diagnostics Por lo tanto estas cifras pueden diferir de los datos publicados y tambi n pueden variar de acuerdo con la poblaci n que se est analizando Tabla 1 Marcadores utilizados en el El
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