notice technique
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1. HAIN LIFESCIENCE microDent Extraction et Amplification de l ADN de Bact ries Responsables de Parodontites Introduction Ce protocole d crit la proc dure d amplification des fragments d ADN bact riens permettant la diff rentiation par hybridation inverse de cing bact ries responsa bles de parodontites La PCR est couverte par des brevets d tenus par la soci t Hoffmann La Roche Aucune autorisation licence implicite ou explicite pour la pratique de la PCR ni aucune autre m thode utilisant la PCR ne sont couvertes en cas d acquisition de cette trousse Les informations sur l obtention d une licence pour la pratique de la PCR ou sur d autres m thodes utilisant la PCR peuvent tre obtenues en contactant F Hoffmann La Roche AG CH 4002 Basel Conservation et Pr cautions D s r ception conserver le m lange Amorces Nucl otides PNM 2 8 C et isol s de toute source d ADN potentiellement contaminante Si la dur e de conservation doit exc der 4 semaines conserver 20 C Il est recommand d aliquoter le m lange PN afin d viter les cong lations d cong lations r p t es Ne pas utiliser Les r actifs au del de leur date de p remption Tous les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux et tre manipul s comme tel Observer les pr cautions usuelles pour la pr paration de l amplification IL est essentiel que le mat riel et les r actifs utilis s pour l ex tractio2. Donn es Techniques Echantillon requis Pr l vement subgingivaux Volume n cessaire 20 pl de solution d ADN amplifi par chantillon Dur e du test approximativement 2 heures Conservation 2 8 C pour conserver gt 4 semaines le m lange PN doivent tre conserv s 20 C Art No 232 12 tests Art Nr 23296 96 tests Fabricant Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstra e 1 72147 Nehren Allemagne C http www hain lifescience de LOT in vitro pee HAIN LIF S NENCE Packungsbeilage lesen consult operating instructions Consulter le manuel d utilisation Chargennummer batch code Num ro de lot Positivkontrolle positive control Contr le positif Temperaturbereich temperature limitation Limite de temp rature Haltbar bis use by A utiliser avant Bestellnummer catalogue number R f rence Nur f r den n vitro Gebrauch for in vitro use only Pour usage jn vitro uniquement
3. temp rature ambiante Dans un tube appropri diluer le Conjugu Concentr CON C orange et le Substrat Concentr SUB C jaune au 1 100 dans un volume ad quat du tampon correspondant CON C avec CON D SUB C avec SUB D Bien homog n iser et quilibrer temp rature ambiante Pour chaque chantillon test ajouter 10 ul de concentr 1 ml de tampon Diluer CON C avant chaque utilisation Une fois dilu SUB C reste stable pendant 4 se maines conserv temp rature ambiante et l obscurit 1 D poser 20 pl de Solution de D naturation DEN bleu une extr mit de chaque puit utilis 2 Ajouter 20 pl d chantillon amplifi et m langer les deux solutions par pipetages r p t s Incuber 5 minutes temp rature ambiante Pendant ce temps l aide d une pince sortir du tube le nombre appropri de bandelettes STRIPS et inscrire au crayon leur num ro d identification dans l espace situ sous la ligne de rep re Toujours porter des gants pour manipuler se Contr le Conjugu CC ja Contr le Amplification AMP C re Actinobacillus actinomycetemcomitans Aa D Porphyromonas gingivalis Pg e Prevotella intermedia Pi me Bacteroides forsythus Bf Ta Treponema denticola Td Limitations En vue de l amplification l ADN doit avoir t extrait l aide d une m thode appro pri e L ADN cible doit avoir t correcteme
4. 2min 58 C bn 25sec 95 C 40 sec 53 C 20 cycles 40 sec 70 C 8 min 70 C 1 cycle 3 La dur e de cette tape doit tre rallong e en cas d utilisation d ADN polym rase de type hot start se r f rer au manuel de l enzyme Selon le thermocycleur utilis le profil d amplification peut demander des modi fications contacter votre distributeur Les produits de l amplification peuvent tre conserv s 4 ou 20 C La r action d amplification peut tre contr l e par lectrophor se en gel d agarose 2 en d posant directement 5 ul de chaque chantillon sans aucun tampon addi tionnel Les amplicons ont une taille approximative de 280 pb Fabricant Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstrafie 1 72147 Nehren Allemagne C http www hain lifescience de HAIN LIFESCIE NGE microDent Test G n tique pour l Identification Combin e de Cinq Esp ces Bact riennes Responsables de Parodontites Principe Le test microDent est bas sur la technologie DNA STRIP qui permet l identi fication combin e de cinq esp ces bact riennes responsables de parodontites savoir Actinobacillus actinomycetemcomitans Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Bacteroides forsythus et Treponema denticola La proc dure compl te comporte trois phases extraction de l ADN partir d chantillons de patients ma t riel requis pour l extraction de l ADN non fourni une amplification multiplex l ai
5. e vers le haut Les ban delettes mal orient es doivent tre remises en position l aide de pincettes pro pres Afin d viter toute contamination bien nettoyer les pincettes apr s chaque utilisation Cella vaut aussi pour tous les tapes suivantes 5 Placer la plaque dans bain marie agitateur TwinCubator et incuber 30 minu tes 45 C Pour le bain marie agitateur s lectionner une fr quence d agitation suffisante pour assurer un bon brassage de tampon Ajuster Le niveau de l eau dans le bain marie agitateur mi hauteur des puits de fa on assurer un bon transfert de chaleur Cela vaut aussi pour tous les tapes suivantes 6 Aspirer le contenu des puits Utiliser par exemple une pipette pasteur reli e une pompe vide 7 Ajouter chaque puit 1 ml de Solution de Lavage Stringent STR rouge et incuber 15 minutes 45 C dans bain marie agitateur TwinCubator 8 A partir de cette tape travailler temp rature ambiante Eliminer la Solution de Lavage Stringent Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container d chets Eliminer tout le liquide r siduel en retournant Les puits sur du papier absorbant effectuer de m me pour les autres tapes de lavage 9 Laver chaque puit avec 1 ml de Solution de Rincage RIN et incuber pendant une minute sous agitation Vider la Solution de Rincage 10 Ajouter chaque puit 1 ml de Conjugu dilu voir ci dessus et incuber sous agitation 30 minutes
6. du conjugu et du bon d roulement de la r v lation Contr le Amplification AMP C Le d veloppement d une ligne dans cette zone confirme le bon d roulement de l amplification cf paragraphe Contr le de Qualit Le seuil de d tection pour chacune des cinq esp ces bact riennes correspond leur seuil de pathog nicit Solution de Lavage Stringent STR pr t l emploi contient gt 25 d un sel d ammonium quaternaire lt 1 d tergent anionique colorant 20 ml 120 ml Solution de Rin age RIN pr t l emploi Milieu tamponn lt 1 NaCl lt 1 de d tergent anionique 50 ml 360 ml Conjugu Concentr CON C concentr contient de la phosphatase alcaline conjugu la streptavidine colorant 0 2 ml 1 2 ml Tampon Conjugu CON D Milieu tamponn 1 agent bloquant lt 1 NaCl 20 ml 120 ml Substrat Concentr SUB C concentr contient Dimethyl Sulfoxide compos chromog nique 0 2 ml 1 2 ml Tampon Substrat SUB D Milieu tamponn lt 1 NaCl lt 1 MgCl 20 ml 120 ml portoir feuille de lecture 1de chaque 4 de chaque manuel d utilisation matrice 1de chaque 1 de chaque Mat riel Requis mais Non Fourni Bain marie agitateur TwinCubator Gants usage unique Chronom tre Papier absorbant Eau distill e Pincettes Embouts de pipettes Pipettes r glables pour 10 20 200 de pr f rence st riles avec filtre et 1000 pl Eprouvette Plateau agitateur Thermom tre calibr
7. du test et le bon fonctionnement des r actifs chaque bandelette comporte deux zones de contr le une zone Contr le Conjugu pour contr ler la fixation du conjugu sur la ban delette et Le bon d roulement de la r v lation chromog nique une zone Contr le Amplification pour contr ler le bon d roulement de l amplification Lorsque l amplification s est correctement d roul e un amplicon de contr le est produit et vient s hybrider sur cette zone Ce contr le permet de d tecter les erreurs ventuelles durant la pr paration de la PCR ou la contamination de l ADN extrait par des inhibiteurs de l amplification Lorsqu aucune des sondes sp cifiques d esp ces sonde 3 7 ne d veloppe de sig naux positifs les deux zones de contr le doivent d velopper un signal positif afin de s assurer de l absence de r sultats faux n gatifs Sinon un nouveau test doit tre r alis Si une plusieurs esp ces bact riennes sont d tect es le signal du contr le d amplification peut tre faible IL est inutile dans ce cas de r p ter le test Proc dure Pr paration Pr chauffer bain marie agitateur TwinCubator exactement 45 C 1 C Pr chauffer les solutions HYB et STR 37 45 C avant utilisation Les r actifs ne doivent pr senter aucun pr cipit noter cependant que la solution CON D est opaque Si besoin agiter Equilibrer les autres r actifs l exception de les solu tions CON C et SUB C
8. 11 Vider Le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute l aide de 1 ml de Solution de Rin age RIN Vider RIN R p ter ce rin age une nouvelle fois puis rincer une fois avec environ 1 ml d eau distill e l aide d une pissette Bien liminer toute trace d eau dans les puits apr s cette derni re tape 12 Ajouter 1 ml de Substrat dilu voir ci dessus dans chaque puit et incuber sans agitation l obscurit Le temps de r v lation peut varier en fonction des conditions de d roulement du test de 3 20 minutes notamment de la temp rature de la pi ce Des temps de r v lation trop longs peuvent entrainer un bruit de fond qui peut g ner l inter pr tation des r sultats 13 Arr ter la r action en rincant bri vement deux fois l eau distill e 14 A l aide de pincettes r cup rer Les bandelettes et les s cher entre deux cou ches de papier absorbant Lecture et Interpr tation des R sultats Classer et ranger les bandelettes l abri de la lumi re Une feuille de lecture est fournie avec le kit mais peut galement tre t l charg e l adresse suivante http www hain lifescience de pdf md_evaluation pdf La matrice fournie avec la trousse permet d identifier chaque zone r actionnelle par superposition Chaque bandelette comprend 7 zones r actionnelles voir figure Contr le Conjugu CC Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone Cette ligne t moigne de la bonne fixation
9. de d amorces biotinyl es ADN polym rase thermostable non fournie et d tec tion de l ADN amplifi par hybridation inverse Cette derni re phase comporte les tapes suivantes d naturation chimique de l ADN amplifi hybridation des ampli cons simples brins biotinyl s aux sondes pr immobilis es sur la membrane la vage stringent et enfin addition d un conjugu streptavidine phosphatase alcaline suivie d une r v lation chromog nique Les signaux obtenus sont facilement et ra pidement interpr t s l aide d une matrice fournie avec chaque trousse Pr cautions Tous les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux et tre manipul s comme tel Les chantillons pr lev s sur des patients risques doivent tre identifi s et manipul s dans des conditions de s curit ad quates Suivre les recommandations f d rale nationale locale d hygi ne de s curit et d environment Se prot ger l aide de v tements ad quats et de gants Lors de la manipulation du kit tenir compte des indications de s curit suivantes La Solution de D naturation DEN contient du NaOH lt 2 et est irritante pour la peau et les yeux R36 38 et S26 537 39 S45 Le Substrat Concentr SUB C contient Dimethyl Sulfoxide et est irritante R36 37 38 S23 26 36 Pour des informations suppl mentaires consulter les fiches de s curit Contr le de Qualit Afin de contr ler le bon d roulement
10. n de l ADN et pour la pr paration de la PCR soient exempts de DNases Ne pas m langer les r actifs provenant de diff rents lots de trousses Mat riel Requis mais Non Fourni ADN polym rase thermostable avec tampon taux d extension gt 1 kb min demi vie 35 min 97 C fid lit 2 5 3 0 x 10 Bloc chauffant pr cision 1 C Centrifugeuse de paillasse Eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire Embouts de pipettes st riles avec filtre Gants usage unique Huile min rale niveau de puret pour Biologie Mol culaire pour thermocycleur sans couvercle chauffant Kit pour l extraction de l ADN et r actifs associ s Micro tubes pour extraction de l ADN 1 5 ml et tubes pour thermocycleur ex empt de contamination par DNase et RNase Pipettes r glables pour 10 20 200 et 1000 pl Thermocycleur taux de chauffage 3 C sec taux de refroidissement 2 C sec pr cision 0 2 C Extraction de l ADN L espace de travail doit tre exempt de toute trace d ADN amplifi Utiliser comme mat riel de d part les m ches de papier utilis es pour le pr l vement des chan tillons subgingivaux Les m ches s ches peuvent tre conserv es au moins 7 jours avant Le d but de l analyse Toutes les proc dures d extraction de l ADN partir de bact ries et produisant de l ADN capable d tre amplifi peuvent tre employ es Un protocole d taill peut tre obtenu chez votre distrib
11. nt amplifi Le test fonctionne dans les limites de la r gion du g nome choisie pour chaque sonde Causes d Erreurs R sultats faibles ou absence de signal incluant la zone de contr le conjugu Temp rature ambiante trop basse ou r actifs mal quilibr s CON C et ou SUB C trop dilu ou CON D et ou SUB D utilis sans dilution pr alable R sultats faibles ou absence de signal except dans la zone de contr le conjugu La qualit et ou la quantit de l ADN extrait n ont pas permis une amplification correcte Analyser l ADN amplifi sur un gel agarose 2 Si aucun amplicon n est visible r p ter les tapes d extraction et d amplification Essayer ventuellement une autre m thode d extraction de l ADN se reporter au manuel Extraction et Amplification de l ADN de Bact ries Responsables de Parodontites Temp rature d incubation trop lev e Signaux positifs sur toutes les bandelettes Temp rature d incubation trop basse Tampon d Hybridation et ou Solution de Lavage Stringent incorrectement qui libr s ou homog n is s Contamination de l ADN extrait et ou des r actifs d amplification avec de l ADN pr c demment extrait ou amplifi Lorsque les r actifs d amplification sont con tamin s un chantillon de contr le n gatif entra ne galement le d veloppe ment des lignes tests Dans certaines conditions de test une forte concentration d ADN amplifi peut entra ner une
12. r action chromog nique tr s rapide En pareil cas afin de pr venir le d veloppement de bandes dues des r actions d hybridation crois es arr ter la r action chromog nique d s que les premi res lignes color es de viennent visibles Coloration non homog ne Les bandelettes n ont pas t suffisamment immerg es lors des diff rentes in cubations Le portoir n a pas t correctement agit Bruit de fond important CON C et ou SUB C trop concentr Les tapes de lavage n ont pas t correctement effectu es Les solutions de lavage taient trop froides lors de leur utilisation Composition du Kit Quantit Bandelettes sensibilis es avec les sondes sp cifiques STRIPS 12 96 M lange PN PNM contient amorces sp cifiques nucl otides colorant 0 5 ml 4ml Solution de D naturation DEN pr t l emploi contient lt 2 NaOH colorant 0 3 ml 2 4 ml Solution d Hybridation HYB pr t l emploi contient 8 10 de d tergent anionique colorant 20 ml 120 ml les bandelettes 3 Ajouter dans chaque puit 1 ml de Tampon d Hybridation HYB vert pr chauff et homog n is Homog n iser jusqu ce que le m lange devienne une couleur homog ne Eviter les claboussures vers les autres puits 4 D poser une bandelette dans chaque puit utilis Les bandelettes doivent tre enti rement recouvertes par le liquide avec la face sensibilis e identifiable par la ligne de rep re tourn
13. uteur ou l adresse internet http www hain lifescience de pdf dnaisol_paperpoint pdf Pr paration de La PCR Pr parer le m lange r actionnel 45 ul dans une pi ce exempte d ADN L chan tillon d ADN doit tre rajout dans une pi ce s par e Pr parer Le m lange suivant par tube 35 ul de m lange Amorces Nucl otides PNM 5 ul de tampon d incubation de la polym rase 10x non fourni x pl de MgC non fourni 1 2 unit s d ADN polym rase thermostable se r f rer au manuel non fourni y d eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire qsp 45 pl hors volume de l enzyme non fourni Ajouter 5 ul de solution d ADN pour atteindre un volume final de 50 pl hors volume de l enzyme 1 Selon le syst me tampon enzyme utilis la concentration optimale de MgCl peut varier de 1 5 2 5 mM A noter que certains tampons contiennent d j le MgCL D terminer le nombre d chantillons amplifier nombre d chantillons analyser contr les Pour un contr le n gatif par exemple la solution d ADN amplifier est remplac e par 5 pl d eau contr le n gatif Pr parer une solution m re de m lange r actionnel contenant tous les r actifs l exception de l ADN et bien homog n iser ne pas vortexer Si Le thermocycleur ne poss de pas de couvercle chauffant recouvrir les chan tillons d huile min rale Profil d Amplification 5min 95 C 1 cycle 30 sec 95 C 10 cycl
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