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Téléchargement du livret de l`atelier - MeetOchondrie

1. Ajustement du temps d incubation Activit lev e Activit faible Pr cipitation du sel Temps La dur e d incubation d pend du type de tissu de la question pos e sous type cellulaire comparaison individuelle Foie de souris Succinate d shydrog nase 15 minutes Foie de souris Succinate d shydrog nase x 10 Foie de souris Cytochrome c oxydase x4 Foie de souris Cytochrome c oxydase x 10 Foie de souris Cytochrome c oxydase 75 minutes Foie de souris Succinate d shydrog nase 15 minutes Foie de souris Succinate d shydrog nase 15 minutes Foie de souris Cytochrome c oxydase 75 minutes Rein de souris Succinate d shydrog nase 15 minutes glom rule tube contourn distal proximal Rein de souris h mat ine osine Rein de souris Succinate d shydrog nase 30 minutes x 20 x4 Rein de souris Succinate d shydrog nase 15 minutes x 20 Art rioles Glom rules Tubes contourn s Tubes collecteurs Rein de souris Cytochrome c oxydase 75 minutes x 20 Fibres Fibres IIA Fibres IIB Fibres IIC Fibres Fibres IIA Fibres IIB Fibres IIC Rein de souris Cytochrome c oxydase 60 minutes x 20 Art rioles Glom rules Tubes contourn s Tubes collecteurs Quadriceps de souris Succinate d shydrog nase 15 minutes Quadriceps de souris Cytochrome c oxydase 15 minutes Quadriceps de souris 15 minutes Cytochrome c oxyda
2. 4 2 The proposed standardized protocols are only part of the enzymatic evaluation of mitochondrial diseases Our work evaluated the most commonly used protocols but left aside a number of other useful techniques such as the evaluation of oxygen consumption ATP synthesis and the preparation of iso lated mitochondria Despite their obvious usefulness these meth ods were initially left aside because they were used in only some of the diagnostic centers Even within the framework of the present standardization we did not address every aspect of the techniques In the homogenate preparation for example we only evaluated the homogenization buffer composition and not procedures of homog enization and centrifugation that were very similar in all French centers The development of standard protocols for all respiratory chain analyses is a monumental task that we do not intend to ad dress before having proven the feasibility of a quality control pro gram based on the present standardized protocols Indeed only a quality control will be able to evaluate if the present standardiza tion is sufficient to obtain comparable data in all centers 4 3 Clinical practice has been the essential objective of the work Our work is an additional demonstration of the complexity of the enzymatic behavior of the respiratory chain complexes which has been extensively shown in numerous excellent previous pa pers B nit et al 2006 Birch Machin et al 198
3. O 20 40 60 80 100 Cyt c uM Fig 3 A narrow range of optimal substrate concentration was observed for several respiratory complex activities Complex III activity ubiquinol cytochrome c oxidoreductase in mouse muscle was measured by the rate of cytochrome c reduction at 550 nm in the presence of various concentrations of cytochrome c Cyt c 25 ug mouse muscle homogenate 100 mM potassium phosphate buffer pH 7 5 200 uM decylubiquinol 1 mM KCN 5 uM rotenone 0 25 mM EDTA and 1 mg mL BSA Total activity right panel total activity was measured in the absence of antimycin while the specific antimycin sensitive complex III activity left panel antimycin sens was calculated by subtraction of the activity measured in the presence of 5 ug mL antimycin from the total activity It was expressed as the percent of total activity due to the antimycin sensitive activity Complex IV activity was measured as the rate of cytochrome c oxidation at 550 nm in the presence of various concentrations of reduced cytochrome c Cyt c and either 50 mM potassium phosphate buffer pH 7 0 and 50 ug human muscle homogenate or 10 mM potassium phosphate buffer pH 7 0 and 30 ug suspension of sonicated human fibroblasts Activities were expressed as nanomoles cytochrome c oxidized per minute and per milligram protein Cytochrome c concentration had a biphasic effect on the respiratory complex III and IV activity thus leading to a narrow range for its optimal concentration
4. Standards 3 5 M Toggle Axis ETS 4 Graphs Figure 8 Onglet Quantitation Graph du logiciel Opticon Monitor Bio Rad Les r sultats obtenus pour les gammes d talonnage des trois genes tudi s figurent ci dessous COXI r Data and Standard M AlOvs LogScale FF Auto Scale Smooth Both lt Data Fluorescence LEE EIN twa 8 amp 14 ND4 Data and Standards r All Dyes T Log Seale WF Auto Scale Smooth AA Se ved 3du 3782 2 0 997 D Use Rephcates Selected Wells E ca oo a a J 5 iG Oo 5 LL eu 8 i 3 iv Toggle Axis e point aberrant supprim Data and Standards All Dyes I Log Scale M Auto Scale Smooth T l y 3 2188 36 07 2 0 987 Use Replicates Selected Wells g co a e z g g a o 5 i ES 5 E w E x i js Toggle Axis _ 4 Une interpr tation des gammes d talonnage est propos e aux participants COXI ND4 B2M 15 1 7 3 R sultats quantitatifs les r sultats des Ct ou Cp et du nombre de copies d ADN des chantillons peuvent tre visualis s dans l onglet Quantitation Calculations du logiciel Opticon Figure 9 Ces donn es peuvent tre export es dans un fichier Excel par Copier Coller en cliquant sur Copy to clipboard I Opticon Monitor Quantitation 050913 MTDNA 64 VAL tad Default b File Edit View Instrument Tools Quantitation User H
5. 10 10 10 et 10 copies ul Pour cela 5 ul d ADN de la concentration 10 fois sup rieure sont ajout s a 45 ul d eau DEPC 1 6 2 Pr paration du m lange r actionnel Pour chaque gene quantifi on pr pare 19 ul de m lange r actionnel dans un bloc froid On ajoute a ce m lange 1 ul d ADN du patient a 50 ng ul ou d une dilution de plasmide React initiale finale 1 puit n puits eee ee supermix AmorceFor 10pM_ 500mM_ Ip AmorceRev 10uM 500nM Ip H2O DEPC RS PS PE OS V du m lange 19 ul r acionne ADN ta Vfinal_ pt C Y Distribuer 19 ul de m lange r actionnel dans les puits suivant le plan de plaque fourni et ajouter 1 ul d ADN plasmidique ou d ADN du patient Sceller la plaque l aide du film plastique optique en prenant garde ne pas le repositionner risque de contamination Centrifuger brievement la plaque pour faire tomber toutes les gouttes au fond des puits Placer dans l appareil de PCR quantitative Lancer le logiciel Opticon Monitor l onglet Master File s ouvre et permet d avoir acces au plan de plaque et au protocole utilis Figure 5 1 Opticon Monitor Master File 050913 MTDNA 64 VAL tad CO File Edit View Instrument Tools User Help Quick Load User Prepare New Run CM Data_File_ Master Data Shared hd ES Data Fil Repeat This Run el Save z Stop 473 ___Bevest Tris 9p i 7 Instrument Instrument Type Chro
6. 20 C reduit les diluer dans du 50 mM K phosphate pH Poudre Sigma C 7 0 raison de 0 930 mL mg puis r duire la 7752 FW 12384 preparation cf protocole complexe IV corrig 12900 1 mM cytochrome c Peser au moins 20 mg de cytochrome c si Cong lateur 20 C Poudre Sigma C l on ne dose pas l activit I II sinon au 7752 FW 12384 moins 30 mg les diluer dans de l eau corrig 12900 distill e raison de 75 3 uL mg 10 mM oxaloacetate Peser au moins 2 mg d oxalo ac tate et les Cong lateur 20 C Poudre Sigma O diluer dans du 0 1 M Tris HCI pH 8 1 4126 FW 132 1 raison de 0 758 mL mg corrig 134 8 2 mM NADH Peser au moins 2 mg de NADH et les diluer R frig rateur Poudre Sigma N dans de l eau distillee a raison de 0 685 8129 FW 709 4 mL mg corrig 86 8 100 dithionite ou Peser au moins 200 mg de dithionite et les Dessicateur hydrosulfite de diluer dans de l eau distill e raison de 1 temp rature sodium uL mg Faire chauffer au bain Marie ambiante Poudre Sigma S bouillant jusqu dissolution compl te et 1256 FW 174 1 s en servir imm diatement pour la r duction corrig 197 8 de la d cylubiquinone 21 3 mM R duire un aliquote de 176 uL de 25 mM Cong lateur 20 C d cylubiquinol d cylubiquinone gard au cong lateur en Poudre Sigma D ajoutant 30 uL de solution de 100 7911 FW 322 4 dithionite voir ci dessus Agiter au vortex corrig 329 0 puis incuber a 37 C bain Marie la
7. Paris F 75005 France d AP HP Laboratoire de Biochimie m tabolique GHU Piti Salp tri re Paris F 75651 France e INSERM U688 Universit Bordeaux II F 33076 Bordeaux cedex France f Centre de Biologie et de Pathologie Est Service des Maladies H r ditaires du M tabolisme F 69677 Bron France 8 AP HP Laboratoire de Biochimie H pital de Bic tre F 94275 Le Kremlin Bic tre France h Laboratoire de Biochimie et G n tique Mol culaire Centre hospitalier et universitaire F 38043 Grenoble cedex France ARTICLE INFO ABSTRACT Article history Received 27 November 2008 Received in revised form 30 April 2009 Accepted 4 May 2009 Available online 9 May 2009 Diversity of respiratory chain spectrophotometric assays may lead to difficult comparison of results between centers The French network of mitochondrial diseases diagnostic centers undertook compari son of the results obtained with different protocols in the French diagnostic centers The diversity of pro tocols was shown to have striking consequences which prompted the network to undertake standardization and optimization of the protocols with respect to clinical diagnosis i e high velocity while maintaining linear kinetics relative to time and enzyme concentration Assays were set up on ani mal tissues and verified on control human muscle and fibroblasts Influence of homogenization buffer and narrow range of optimal concentration of phosphate substrate and
8. Stabilit journ e Palmytoylcarnitine 20 mM diluer dans EtOH eau stabilit 1 mois 20 C Octanoylcarnitine 20 mM diluer dans EtOH eau stabilit 1 mois 20 C Aliquoter les diff rents substrats pour chaque jour de manipulation et conserver 20 C Ne pas recongeler les aliquots 3 Pr paration du mat riel 3 A Pr cautions particuli res Pendant les oxygraphies porter des gants nitriles Les inhibiteurs de la cha ne respiratoire sont des toxiques 3 B Automate et ou petits mat riels Oxygraphe O2K Block chauffant Bain sec Bioblock Agitateur bascule bioblock 3 C Pr paration des r actifs Equilibrer les tampons de respiration sans et avec BSA a temp rature ambiante Sortir l avance et conserver sur la glace Substrats malate 0 5M pyruvate 0 5M succinate 0 5M glutamate 0 5M Inhibiteurs Rot none 2 5 mM antimycine 1 mg ml oligomycine 8 mg ml KCN 0 2 M Azide 100 mM FCCP 1mM Allumer le bloc chauffant a 95 C 3 Calibration des oxygraphes Allumer l ordinateur puis l oxygraphe Quand tous les voyants sont allum s double cliquer sur l ic ne Datlab 4 La fen tre oxygraph setup doit s ouvrir directement sinon F7 cette touche permet a tout moment de connecter d connecter loxygraphe S lectionner le type d analyse d sir 37 C agitation a 750 rpm pour cellules ou mitochondries isol es Cliquer sur
9. connect La fen tre Edit Experiment apparait Verifier les facteurs AO et BO renseign s et corrig s ci besoin cf fiche de maintenance des oxygraphes Vider les chambres et les laver a l EtOH 100 Rincer ensuite soigneusement l eau bidistill e puis remplir les chambres de 2 ml de tampon Respiration sans BSA Fermer compl tement les chambres et ajouter 100 ul de solution satur e en dithionite pour obtenir le 0 oxyg ne Quand le flux est stable rincer soigneusement l oxygraphe a l eau distill e puis ajouter 1 9 ml de tampon Rustin BSA Laisser le flux se stabiliser chambres ouvertes pour obtenir le 100 Faire une marque au 100 O sur une zone o le flux est stable en appuyant sur shift clic gauche sur la souris et faire glisser la souris jusqu la taille de marque d sir e Marquer de la m me fa on le z ro Cliquer en haut sur la marque pour la nommer 100 ou 0 F5 pour effectuer la calibration la chambre active sur laquelle va s effectuer la calibration est celle en blanc o appara t le logo Oroboros Air calibration rentrer le nom de la marque correspondant au 100 Os Z ro calibration rentrer le nom de la marque du z ro Le voltage correspondant la temp rature et la pression en oxyg ne doivent s afficher automatiquement O2 solubility factor of medium 37 C 0 834 pour le tampon Rustin toutes les valeurs en fonction de la temp rature sont indiqu es dans la table oxygen s
10. uL d homog nat tissulaire pr par a une concentration finale de prot ines de 2 mg mL ou de mitochondries de coeur de boeuf dilu es a 0 2 mg mL soit 1 200 Melanger 3 Transf rer 950 pL du m lange dans chacune de 2 cuves de 1 ml qui seront analysees en parallele 4 Ajouter 5 uL de 2 5 mM rotenone dans l une des cuves de 1 mL m langer Reaction 1 Lecture au spectrophotometre 37 C longueur d onde 340 nm Calibration initiale de la lecture sur l air 2 Incuber les cuves a 37 C durant 5 min dans le spectrophotometre thermostate 3 D marrer la r action avec 50 uL de 2 mM NADH gard temp rature ambiante 4 Lecture toutes les 15 secondes durant 3 minutes Les 2 cuvettes correspondant au m me chantillon sont lues en m me temps On peut lire 4 cuvettes en m me temps Si la d croissance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu Calcul 1 L activite sp cifique est calcul e et rendue en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le NADH est 6 2 3 Le facteur de correction est donc 4032 3 pour 40 ug de prot ines dans l essai homog nat et 40323 pour 4 ug de prot ines dans l essai mitochondries isol es Dosage du complexe Il succinate ubiquinone oxydo r ductase Principe Le complexe II de la cha ne respiratoire permet l oxydation du succinate dont il transf re les lectrons au coenzyme Q ou ubiquinone Cette mo
11. 0 05 0 19 0 05 0 27 0 06 0 48 0 28 0 50 0 17 II CS 0 59 0 12 0 29 0 07 0 27 0 07 0 40 0 11 2 27 1 30 2 10 0 18 0 36 0 10 III CS 0 46 0 29 0 76 0 25 1 21 0 31 1 33 0 46 1 53 0 79 1 08 0 26 0 79 0 25 IV CS 4 90 0 56 0 90 0 24 0 86 0 21 1 02 0 32 1 28 0 66 0 95 0 19 1 12 0 22 IV I 7 30 1 54 4 87 1 51 4 99 1 20 3 79 1 30 2 91 1 03 2 11 0 79 n number of samples data provided by the diagnostic center in La Salp tri re hospital Paris in CHU d Angers and in CHU de Caen values of activities are expressed as mean standard deviation and as nanomoles per minute and per milligram protein I respiratory complex I activity i e rotenone sensitive NADH ubiquinone oxidoreductase activity II respiratory complex II activity i e succinate cytochrome c oxidoreductase activity III respiratory complex III activity i e antimycin sensitive ubiquinol cytochrome c oxidoreductase activity IV respiratory complex IV activity i e cytochrome c oxidase activity I III rotenone sensitive NADH cytochrome c oxidoreductase activity II III succinate cytochrome c oxidoreductase activity CS citrate synthase activity I CS II CS III CS IV CS and IV I are the ratios of the corresponding activities data not available Whatever the experimental conditions tested rotenone sensitive I activity in control human skin fibroblasts suspension could appear to be null This assay was therefo
12. 10 40 7 46 7 88 7 56 13 27 13 07 13 51 copies 1 99E 07 1 92E 07 2 00E 07 3 34E 05 3 41E 05 7 32E 04 2 32E 06 2 33E 06 2 20E 06 3 53E 08 2 88E 08 2 52E 08 4 83E 08 3 49E 08 3 71E 08 5 45E 06 6 37E 06 3 82E 06 B2M Content Description Efficiency C t copies Blank Neg N A N A OO ibroblastes Sample Temoin fibro 96 15 21 55 5 77E 04 Sample Temoin fibro 98 26 21 70 5 18E 04 Sample Temoin fibro 83 55 21 41 6 01E 04 Sample Patient 1 148 32 17 95 6 93E 05 Sample Patient 1 105 19 18 05 6 47E 05 Sample Patient 1 107 71 18 03 6 55E 05 Sample Patient 2 93 55 21 01 8 37E 04 Sample Patient 2 90 89 21 13 7 70E 04 Sample Patient 2 106 51 20 96 8 63E 04 Sample Temoin muscle 107 12 19 26 1 07E 05 Sample Temoin muscle 100 30 19 29 1 05E 05 Sample Temoin muscle 107 85 19 23 1 09E 05 Sample Patient 3 129 57 18 52 1 77E 05 Sample Patient 3 130 94 18 48 1 82E 05 Sample Patient 3 116 44 18 41 1 91E 05 Sample Patient 4 124 72 18 49 1 80E 05 Sample Patient 4 133 45 18 36 1 97E 05 Sample Patient 4 128 95 18 48 1 82E 05 Interpr tation des r sultats Examen critique des triplicates Rapports du nombre de copies des patients contrdles internes Moyenne du nombre de copies des genes mitochondriaux Rapport du nombre de copies de l ADNmt g ne nucl aire Rapport des g nes ADNmt intra d l tion genes ADNmt extra d l tion Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 19 lll REFER
13. Concentration 4 nmol mi on 00 00 00 00 10 00 00 15 00 00 20 00 25 00 0 30 00 ri h N NINN NAD app STE Succinate Rot none Oligo FCCP ENV MPa Ell MPa EI MPS Eu SR EIV Oligo FCCP Cliquer sur le graphique de la chambre d int r t puis F2 Les r sultats apparaissent pour cette chambre les r sultats indiqu s pour la chambre non active ne veulent rien dire Copier ensuite les donn es dans Excel Cliquer sur copy to clipboard et coller dans un fichier Excel Le graphique peut galement tre export Cliquer sur l onglet Graph copy to clipboard BMP Il peut alors tre coll dans Excel ou Powerpoint Les analyses ou copies peuvent galement tre r alis es en cours de mesures ou ult rieurement en r ouvrant le graphique File Open Corriger les valeurs obtenues par le dosage de prot ines Ces valeurs sont alors en pmol s mg de prot ines Les convertir en nmol min mg de prot ines soit multiplier par 1000 et diviser par 60 Calculer la respiration li e au complexe IV Respirations en pr sence de TMPD ascorbate Calculer ensuite les RCR ratio de contr le respiratoire en pr sence des diff rents substrats EN malate pyruvate EIV Malate pyruvate respiration avant l ajout d ADP Elll succinate rot none oligo succinate rot none La stimulation ventuelle par le cytochrome c Cyt c ENT SR La stimulation par le FCCP FCCP ENT
14. JN 5000 ii 5 LJ Citrate synthase a Dr a L Complex IV Se Wp eee en S E nand lt 2 2000s ee E A ODI E _ o MAN CPT CCA Fig 1 Influence of the homogenization buffer on mitochondrial activities of beef heart mitochondria An identical sample of isolated beef heart mitochondria was diluted to its working concentration with three different homogenization buffers MAN CPT CCA as described in the text Citrate synthase activity grey bars was measured as the rate of appearance of thionitrobenzoic acid followed by the increase of absorbance at 412 nm during 3 min in the presence of 10 ug of isolated mitochondria proteins 100 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 Triton X 100 300 mM acetylCoA 100 uM DTNB and 500 uM oxaloacetate Respiratory complex IV activity white bars was measured as the rate of cytochrome c oxidation at 550 nm during the first minute of the assay in the presence of 4 ug of isolated mitochondria 50 mM K phosphate pH 7 0 and 80 uM of reduced cytochrome c The results are shown as the mean values of two assays the range of which is shown with the error bars activities are expressed as nanomoles per minute per milligram protein Dilution of the sample in CCA buffer was associated with a significant decrease of citrate synthase twofold decrease and of complex IV threefold decrease activities In contrast to pH and composition the phosphate concentration varied between French diagnostic
15. SR Les ratios des diff rentes respirations maximales entre elles EN SR EN MP ENT MPS Elll MP COX Elll MP COX EI SR 7 Documents associ s Manuel d utilisation de l oxygraphe Oroboros site web www oroboros at Rustin P Chretien D Bourgeron T G rard B Rotig A Saudubray JM Munnich A 1994 Biochemical and molecular investigations in respiratory chain deficiencies Clin Chim Acta 228 1 35 51 Sperl W Skladal D Gnaiger E Wyss M Mayr U Hager J Gellerich FN 1997 High resolution respirometry of permeabilized skeletal muscle fibers in the diagnosis of neuromuscular disorders Mol Cell Biochem 174 1 2 71 8 Pesta D Gnaiger E 2012 High resolution respirometry OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle Methods Mol Biol 2012 810 25 58 ATELIER B Dosage spectrometrique des activites des complexes de la chaine respiratoire Christophe ROCHER et Stephane ALLOUCHE Piece 3512 Pr paration des chantillons tissulaires pour les dosages des complexes de la cha ne respiratoire Principe Dans le cadre du diagnostic des maladies mitochondriales les activites des complexes de la cha ne respiratoire sont mesur es r guli rement sur des fragments de muscle foie des fibroblastes cutanes en culture ou des lymphomonocytes isoles sur Ficoll Tous ces chantillons doivent avoir ete congel s de fa on tr s rapide cf proto
16. au flux passif retour vers la matrice mitochondrial Ce dernier est d des fuites de protons et la synth se d ATP A l quilibre synthese hydrolyse d ATP par exemple en absence d ADP il n y a pas de flux net de protons associ a la synthese d ATP mais simplement a la fuite de protons La force protomotrice est maximale et la cha ne respiratoire est frein e au maximum c est l tat 4 Si l on ajoute de ADP on d place l quilibre et la synth se d ATP d marre ce qui diminue la force protomotrice et acc l re le flux respiratoire c est l tat 3 La synth se d ATP s arr te lorsque l quilibre est nouveau atteint nouvel tat 4 par exemple apr s inhibition de ATP synthase par de l oligomycine On a alors a nouveau une forte valeur de la force protomotrice et une faible valeur du flux respiratoire Enfin si l on ajoute un d couplant qui rend la membrane permeable aux protons tel que le FCCP la force protomotrice s effondre et la respiration s emballe pour attendre son niveau maximum pour un substrat donne Les apports en substrats Complexe malate pyruvate Pyruvate Ht Le pyruvate permet laprrovisionnement Du cycle de Krebs en acetylCoA Malates Cette d carboxylation est d pendante de l activit De la PDH L entr de malate s effectue contre la sortie d oxoglutarate et citrate transporteur dicarboxylate by passant ainsi la formation Acetyl CoA
17. centers This was shown to have significant influence on all the respiratory chain activities with some differences between tissues Fig 2 The sensitivity to phos phate concentration was particularly important for complex IV activity and is shown in Fig 2 The optimal buffer concentrations chosen for each assay are summarized in Table 2 F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 3 5 A narrow range of optimal substrate concentration was observed for several respiratory complex activities Some substrates showed a biphasic effect activation followed by inhibition on the respiratory complex activity which led to a very narrow range for their optimal concentrations This was par ticularly true for respiratory complexes III and IV Fig 3 It was also observed for the combined I II and II II activities see experimental data at http Ibbma univ angers fr fmdn The activity of respiratory complex III is calculated after mea suring ubiquinol cytochrome c oxidoreductase activity in the pres ence and in the absence of antimycin a specific respiratory complex III inhibitor The specific complex III activity is obtained by subtracting the antimycin insensitive activity from the total activity The optimal substrate concentration differed slightly be tween the two activities being higher 75 125 uM for the total activity than for the antimycin sensitive activity 50 75 uM Fig 3 The concentration of 50 uM cytochrome c was chosen
18. d amplicons produits pendant la r action Il existe deux principes g n raux pour la d tection quantitative des amplicons les agents se liant a ADN double brin ex SYBR Green et les sondes fluorescentes 1 1 M thodologie de d tection C est le principe du SYBR Green se liant a FADN double brin qui a t choisi dans la pr sente m thodologie Figure 1 L mission fluorescente augmente lorsque le SYBR Green est li a l ADN double brin SYBRgreen non fluorescent Amorce Dm 3 D naturation Hybridation Tm B xn cycles Elongation mme ra Fluo e tecure 2 A A ves D tection de la fluorescence Figure 1 Principe de la d tection de la fluorescence du SYBR Green I 2 L augmentation du signal de fluorescence mise par le SYBR Green est observ e pendant l tape de polym risation de la PCR lorsque cette mol cule est fix e l ADN et l mission fluorescente d croit compl tement lorsque l ADN est denature l tape suivante L mission de fluorescence est mesur e la fin de chaque tape d longation pour chacun des cycles par un syst me de lecture int gr l appareil de PCR en temps r el ce qui permet de suivre augmentation de la quantit d ADN amplifi durant la r action de PCR On obtient alors la fin du programme de PCR une courbe exponentielle repr sentant l augmentation de la fluorescence en fonction du nombre de c
19. de rotenone La partie sp cifique respiratoire de l activit NADH cytochrome c oxydo r ductase est mesur e par la diff rence entre l activit totale et celle r sistante a la rot none L oxydation du cytochrome c r duit par le complexe IV est inhib e par le cyanure de potassium KCN En pratique 6 determinations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d une m me s rie soit 12 dosages Composition du milieu de r action 200 uM NADH 100 uM cytochrome c 50 mM K Phosphate pH 7 5 1 0 mg ml d albumine bovine 1 mM KCN Tissu 40 ug de prot ines surnageant post nucl aire foie ou muscle ou suspension cellulaire ou 4 ug de mitochondries isol es Inhibition par 12 5 uM rotenone Preparation du milieu de reaction 1 Dans un tube de 50 ml pr parer le m lange pour effectuer 7 dosages soit 14 cuves globale H20 2 Dans une cuvette de 2 ml mettre 1936 uL du milieu de r action et ajouter 44 uL d homog nat tissulaire pr par a une concentration finale de prot ines de 2 mg ml ou de mitochondries de c ur de b uf dilu es a 0 2 mg mL soit 1 200 M langer 3 Transf rer 900 uL du m lange dans chacune de 2 cuves de 1 ml qui seront analys es en parall le 4 Ajouter 5 ul de 2 5 mM rot none dans l une des cuves de 1 mL m langer R action 1 Lecture au spectrophotometre 37 C longueur d onde 550 nm Calibration initiale de la lecture sur l air 2 I
20. des cuvettes contenant 980 uL de la solution de cytochrome c r duit 3 Incuber les cuvettes 5 minutes a 37 C dans le spectrophotometre thermostate 4 D clencher la r action par l ajout de 20 uL d homog nat tissulaire ou de suspension cellulaire pr par a une concentration finale de prot ines de 2 mg mL ou de mitochondries de c ur de boeuf dilu es a 0 05 mg ml soit 1 800 M langer 5 Lecture toutes les 10 secondes durant 3 minutes On peut lire 2 cuvettes en m me temps Si la d croissance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu Calcul 1 L activit sp cifique est calcul e et rendue en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le cytochrome c est 18 5 3 Le facteur de correction est donc 1351 4 pour 40 ug de prot ines dans l essai homog nat et 54054 pour 1 ug de prot ines dans l essai mitochondries isol es 20 uL au 1 800 Dosage des complexes Ill NADH cytochrome C oxydo r ductase Principe Les complexes et Ill de la cha ne respiratoire permettent l oxydation du NADH en NAD et transferent les lectrons au cytochrome c Cette activit est valu e par l augmentation de l absorbance du cytochrome c r duit 550 nm L activit parall le non respiratoire d oxydation du NADH est insensible la rotenone inhibiteur sp cifique du complexe Elle est mesur e par un dosage parall le en pr sence
21. e M langer les potassium hydrog no solutions sous contr le du pH en phosphate k2 Prolabo ajoutant la solution acide K1 dans 33612 268 FW 174 18 la solution alcaline K2 jusqu obtention du pH 7 0 Aliquotes de 50 mL 1M Tris HCI pH 8 1 Peser 6 06 g de poudre de Tris Poudre temp rature Prolabo 28811 295 FW base diluer dans 30 mL d eau ambiante 121 14 distill e ajuster le pH 8 1 avec de l acide chlorhydrique 5N puis 1N compl ter le volume 50 mL avec de l eau distill e 100 mM Tris HCI pH 8 1 Peser 6 06 g de poudre de Tris Poudre temp rature Prolabo 28811 295 FW base diluer dans 400 mL d eau ambiante 121 14 distill e ajuster le pH 8 1 avec de l acide chlorhydrique 5N puis 1N compl ter le volume 500 mL avec de l eau distill e 10 Triton X100 solution Diluer 5 mL de Triton X100 avec 45 Solution 100 Sigma X 100 ml d eau distill e temp rature ambiante Tampon Mannitol pH 7 2 Peser 2 05 g de mannitol 1 28 g Poudres de mannitol 225 mM mannitol de saccharose 60 6 mg de Tris de saccharose de Tris 75 mM saccharose ajouter 10 uL de solution0 5 M et solution d EDTA a 10 mM Tris HCI EDTA diluer avec 40 mL d eau temperature ambiante 0 1 mM EDTA distill e ajuster le pH a 7 2 et Mannitol Sigma M 9546 FW compl ter le volume 50 mL avec 182 2 Saccharose Fluka de l eau distill e 84105 FW 342 3 EDTA Sigma E 7889 solution 0 5 M Dosage du complexe NADH ubiquin
22. est mesur e par un dosage parall le en pr sence d antimycine A En pratique 6 d terminations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d une m me s rie soit 12 dosages Composition du milieu de reaction 200 uM d cylubiquinol 50 uM cytochrome c 100 mM K Phosphate pH 7 5 250 UM EDTA Tissu 30 ug de prot ines Surnageant post nucl aire foie ou muscle ou suspension cellulaire et 0 75 ug de mitochondries isol es Inhibition par 12 5 ug mL d antimycine A Preparation du milieu de reaction 1 Dans un tube de 50 mL preparer le m lange pour effectuer 7 dosages soit 14 cuves 2 Dans une cuvette de 2 mL mettre 2149 uL du milieu de r action et ajouter 33 uL d homog nat tissulaire pr par a une concentration finale de prot ines de 2 mg mL ou de mitochondries de coeur de boeuf dilu es 0 05 mg mL soit 1 800 Melanger 3 Transf rer 992 uL du m lange dans chacune de 2 cuves de 1 ml qui seront analysees en parallele 4 Ajouter 5 uL de 2 5 mg mL antimycine A dans l une des cuves de 1 mL melanger Reaction 1 Lecture au spectrophotometre 37 C longueur d onde 550 nm Calibration initiale de la lecture sur l air 2 Incuber les cuves a 37 C durant 5 min dans le spectrophotometre thermostate 3 D marrer la reaction avec 8 uL de 25 mM d cylubiquinol gard a 37 C 4 Lecture toutes les 10 secondes durant 3 minutes Les 2 cuvettes correspondant au m me chantillon sont lues en
23. et al 1998 The extent of the latter phenomenon greatly depends on the qual ity of cytochrome c preparation even from the same manufacturer The difficulties in the measurement of isolated complex III activity cannot be overcome by measuring the combined II III or I III activities First a partial defect of complex III can be masked in the combined activities Taylor et al 1993 1994 and second 338 F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 Beef heart mitochondria 10000 15000 To 8000 12000 BE Zg 6000 Z a 9000 sE sE E 4000 gt E 6000 2000 3000 0 0 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 Protein ug assay Protein ug assay Human muscle 800 500 ae 600 p 400 gt 300 5 5 400 Ss SE E 200 p Z 0 0 0 10 20 30 40 50 O 10 20 30 40 50 60 Protein assay Protein assay Human fibroblasts 160 120 gg 120 zE 90 SE SE s amp 80 x E 60 5 gt amp g 40 30 0 0 0 10 20 30 40 50 O 10 20 30 40 50 60 70 Protein assay Protein assay Fig 5 Narrow range of protein content in the assay showed linear relationship with activity The influence of the amount of protein in the assay is shown for complex III III activity antimycin sensitive ubiquinol cytochrome c activity and complex IV cytochrome c oxidase activity IV activity in beef heart mitochondria upper panel human muscle homogenate middle panel and sonicated human fibroblasts lower panel Activities were expressed as nanomoles
24. la javel et rincer l eau Jeter les ponges kleenex et autres papiers absorbants dans les poubelles jaunes Renversement important r pandre l absorbant appropri et traiter comme D chets DAB Javel Solides En cas d incendie formation de gaz et ou de vapeurs toxiques Avertir vos coll gues et interdire l acc s Retirer imm diatement les v tements souill s Laver soigneusement les parties touch es l eau et au savon petites surfaces touch es Douche de s curit grandes surfaces touch es Douche oculaire En cas d ingestion faire boire sauf si la personne est inconsciente NE PAS FAIRE VOMIR Elimination des d chets des d chets Neutralisation la javel 1 3 javel 13 14 2 3 eau Recueillir dans un contenant en plastique type PEHD libell D chets DAB Javel Recueillir galement le premier rin age apres neutralisation dans le contenant libell D chets DAB Javel Encasd limination du produit pur laisser dans le contenant d origine Informations compl mentaires V rifier les VME VLE Stockage armoire ventil e et bac de r tention Incompatible avec les oxydants Ne pas m langer avec d autres substances cause de la r activit de la javel d gagement de chlore gazeux toxique
25. les dosages 1 Pr parer 12 a 13 mL de solution de 100 uM cytochrome c dans 50 mM K phosphate pH 7 0 2 Pr parer la Solution 100 oxyd e en transf rant 1 mL de la solution initiale de 100 uM cytochrome c dans une cuvette de 1 mL et en loxydant avec quelques grains de ferricyanure de potassium la solution devient orange sombre 3 Pr parer la Solution 100 r duite en transf rant 1 mL de la solution initiale de 100 uM cytochrome c dans une cuvette de 1 mL et en la r duisant avec quelques grains de dithionite de sodium bisulfite la solution devient rose saumon 4 Dans le spectrophotom tre 37 C longueur d onde 550 nm faire le blanc sur l air puis mesurer l absorbance de la Solution 100 oxyd e qui doit tre autour de 0 7 pour la solution 100 UM 5 Refaire le blanc sur la Solution 100 oxyd e pour avoir une absorbance nulle pour une r duction nulle 6 Mesurer l absorbance de la Solution 100 r duite la noter R duire progressivement la solution initiale de 100 uM de cytochrome c avec des aliquotes de la Solution 100 r duite on commence par 50 100 uL le degr de r duction est suivi par la mesure de l absorbance 550 nm On doit obtenir une absorbance entre 90 et 95 de labsorbance mesur e avec la solution 100 r duite Reaction 1 Lecture au spectrophotom tre 37 C longueur d onde 550 nm Calibration initiale de la lecture sur l air 2 Pr parer
26. m me temps On peut lire 4 cuvettes en m me temps Si la croissance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu La lin arit obtenue est m diocre avec les mitochondries isol es pour lesquelles l activit est mesur e pendant la premiere minute Calcul 1 L activit sp cifique est calcul e et rendue en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le cytochrome c est 18 5 3 Le facteur de correction est donc 1801 8 pour 30 ug de prot ines dans l essai homog nat et 72072 pour 0 75 ug de prot ines dans l essai mitochondries isol es Dosage du complexe IV cytochrome c oxydase Principe Le complexe IV de la cha ne respiratoire permet l oxydation du cytochrome c son activit sera donc valu e par la disparition du cytochrome c r duit qui absorbe a 550 nm L accepteur naturel des lectrons du complexe IV est l oxyg ne En pratique 6 d terminations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d un m me s rie Composition du milieu de r action 50 mM K phosphate pH 7 0 25 mM pour les fibroblastes 100 uM cytochrome c r duit 50 uM pour les fibroblastes Tissu 40 ug prot ines homog nat post nucl aire ou suspension cellulaire ou 1 ug de mitochondries purifi es Pr paration des solutions de r f rence de cytochrome c r duit de cytochrome c oxyde et de la solution qui sera utilis e pour
27. oxaloacetate DTNB 5 5 dithiobis 2 nitrobenzoic acid I CS II CS HI CS IV CS and IV I are the ratios of the corresponding activities Corresponding author Present address Inserm U975 Groupe hospitalier Piti Salp tri re 47 83 Boulevard de l H pital 75651 Paris cedex 13 France Tel 33 1 42 16 57 17 fax 33 1 42 16 57 00 E mail addresses medja aliceadsl fr F Medja allouche s chu caen fr S Allouche paule frachon free fr P Frachon claude jardel psl aphp fr C Jardel monique malgat orange fr M Malgat benedicte mousson de camaret chu ly on fr B M de Camaret abdel slama bct aphp fr A Slama jlunardi chu greno ble fr J Lunardi jp mazat u bordeaux2 fr J P Mazat a lombes institut myolo gie org A Lomb s an inherited alteration of the oxidative phosphorylation pathway are highly complex disorders with diverse clinical presentation with respect to age of onset symptoms and rate of progression DiMauro and Hirano 2005 Their diagnosis relies upon a series of metabolic morphological and biochemical investigations the results of which are disputable in terms of specificity they may be altered in non mitochondrial diseases as well as sensitivity they may be normal in authentic mitochondrial disorders Taylor et al 2004 Trijbels et al 1993 Identifying the genetic cause therefore represents the ultimate proof of the diagnosis but this is an extraordinary challenge for the medical com
28. per minute and per milligram protein The rate of cytochrome c oxido reduction was followed at 550 nm For beef heart mitochondria III activity was measured in the presence of 100 uM cytochrome c 75 mM potassium phosphate pH 7 5 200 uM decylubiquinol 1 5 mM KCN 5 uM rotenone 0 25 mM EDTA and 1 mg mL BSA 5 ug mL antimycin while IV activity was measured in the presence of 80 uM reduced cytochrome c and 50 mM potassium phosphate pH 7 0 For human muscle homogenate III activity was measured in the presence of 50 uM cytochrome c 100 mM potassium phosphate pH 7 5 150 uM decylubiquinol 0 5 mM KCN and 0 5 mg mL BSA 5 ug mL antimycin while IV activity was measured in the presence of 100 uM reduced cytochrome c and 50 mM potassium phosphate pH 7 0 For sonicated human fibroblasts III activity was measured in the presence of 50 uM cytochrome c 100 mM potassium phosphate pH 7 5 200 uM decylubiquinol 1 mM KCN and 1 mg mL BSA 5 ug mL antimycin while IV activity was measured in the presence of 80 uM reduced cytochrome c and 25 mM potassium phosphate pH 7 0 Narrow ranges of protein concentration with linear relationship between activity and amount of protein in the assay could be observed in human muscle homogenate and sonicated fibroblasts In contrast such a linear relationship was never observed in beef heart mitochondria with very high activities of respiratory complex III and IV some of the complications that arise when measuring isolated tion wil
29. solution doit devenir blanche avec la reduction de la d cylubiquinone en 15 a 20 min 10 mM KCN Peser un grain de KCN et le diluer dans de Armoire Poisons Poudre Fluka 60179 l eau distillee raison de 1 536 mL mg temperature FW 65 12 ambiante REACTIFS GARDES CONGELES 20 C R actifs Rangement 5 mM DTNB Peser du DTNB et le dissoudre dans Poudre dans le Poudre Sigma D l thanol 95 raison de 0 505 mL mg dessiccateur a 8130 FW 396 3 Aliquotes de 500 uL temp rature ambiante 10 mM ac tylCoA Peser l ac tylCoA et le diluer dans l eau Poudre au cong lateur Poudre Sigma A distillee raison de 0 112 mL mg 20 C 2181 FW 827 4 corrig 891 4 25 mM Ajouter 1 216 mL de DMSO dans un Poudre au cong lateur d cylubiquinone flacon de 100 mg aspect liquide 20 C Poudre Sigma D solution 250 mM Puis diluer 1 10 avec 7911 FW 322 4 du DMSO pour atteindre la concentration corrig 329 0 de 25 mM Aliquoter en deux volumes diff rents 88 et 176 uL 200 mM succinate Peser 472 4 mg et les diluer dans 15 mL Poudre dans le Poudre Sigma S d eau distill e ajuster le pH 7 4 puis dessiccateur 7501 FW 118 1 compl ter le volume 20 mL Aliquotes temp rature ambiante de 500 uL 50 mg mL albumine Peser la poudre d albumine et la diluer Poudre au r frig rateur bovine sans acides dans de l eau distillee a raison de 20 gras Poudre Sigma uL mg Aliquotes de 1 mL A 2153 2 5 mg mL antim
30. standardized protocols for spectrophotometric assays of the respiratory chain Activity I Il Il pH 7 5 75 75 Phosphate 50 25 100 Tris Inhibitor in 12 5 uM rot 1 mM KCN 1 mM KCN 12 5 pg mL the antim assay Substrates 100 uM NADH 20 mM succ 200 uM dUb H 100 uM dUb 100 uM dUb 50 uM cyt c 50 uM DCPIP Adjuvants 3 75 mg mL 2 mg mL BSA 100 uM 250 uM EDTA BSA ATP nm 340 600 550 Subtraction rot Baseline tantim Start NADH Dub dUb H Reading 3 3 B Tissue 40 4 40 4 30 0 75 Calculation 4032 3 1308 9 13 089 1801 8 72 072 factor 40 323 Phosphate concentration of potassium phosphate expressed as mmol L Tris concentration of Tris buffer expressed as mmol L inhibitor rot rotenone KCN potassium cyanide antim antimycin A Substrates dUb decylubiquinone succ succinate DCPIP 2 6 dichlorophenolindophenol dUb H decylubiquinol cyt c cytochrome c red cyt c reduced cytochrome c ACoA acetylCoenzyme A OA oxaloacetate DTNB 5 5 dithiobis 2 nitrobenzoic acid adjuvants reagents that are not substrates nor inhibitors BSA bovine serum albumin subtraction rot or antim the activity is measured in two parallel cuvettes with and without the specified inhibitor and the specific activity is calculated by subtracting the activity measured in the presence of the inhibitor from that measured in its absence baseline the specific activity is calculated by subtracting the activity in the absence of subst
31. uL pour 50 mg 5 Homog n iser en chambre froide ou dans la glace pil e a l aide du piston en verre rode a bout conique a une vitesse de 500 a 1000 RPM en 3 a 5 passages Il est important d viter la surchauffe de l chantillon 6 Transf rer le broyat l aide d une pipette pasteur dans un tube 1 5 mL Eppendorf de la premi re s rie de tubes num rot s 7 Centrifuger 0 4 C pendant 20 min 650 g soit 2000 RPM pour la centrifugeuse de paillasse 8 RANGER LE RESTE DE LA BIOPSIE AU CONGELATEUR 9 Transf rer le surnageant dans le tube Eppendorf 1 5 mL correspondant dans la deuxi me s rie de tubes num rot s 10 Reprise du culot dans le volume de tampon Mannitol utilis initialement transfert dans le tube de l homog n isateur de type Potter utilis initialement et seconde homog n isation dans les m mes conditions 11 Centrifugation 0 4 C pendant 20 min 650 g 2000 RPM centrifugeuse de paillasse 12 Le surnageant de cette deuxi me centrifugation est ajout celui obtenu apr s la premi re centrifugation On obtient un surnageant dit post nucl aire 5 final 13 Les tubes contenant le surnageant sont ensuite gard s dans un portoir r frig r pour toute la dur e des dosages Suspension cellulaire dans le tampon Mannitol culots de fibroblastes ou de cellules mononucl es sanguines Resuspendre le culot cellulaire conserv congel dans le tampon Mannitol par exemple le culot corr
32. 2 mg ml albumine bovine Tissu 40 ug de prot ines surnageant post nucl aire ou suspension cellulaire ou 4 ug de mitochondries isol es Pr paration du milieu de r action 1 Dans un tube de 15 ml pr parer le m lange pour effectuer 7 dosages globale 2 Dans une cuvette de 1 ml mettre 880 uL du milieu de r action et ajouter 20 uL d homog nat tissulaire ou de suspension cellulaire pr par a une concentration finale de prot ines de 2 mg ml ou de mitochondries de coeur de boeuf dilu es a 0 2 mg ml soit 1 200 M langer Reaction 1 Lecture au spectrophotometre 37 C longueur d onde 550 nm Calibration initiale de la lecture sur l air 2 Incuber les cuves a 37 C durant 5 min dans le spectrophotometre thermostat 3 D clencher la r action par 100 pL de 1 mM cytochrome c gard a temp rature ambiante On peut lire 6 cuves en m me temps 4 Lecture toutes les 20 secondes durant 3 minutes si augmentation d absorbance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu Calcul 1 L activite sp cifique est calcul e en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le cytochrome c est 18 5 3 Le facteur de correction est donc 1351 4 pour 40 ug de prot ines dans l essai et 13514 pour 4 ug de prot ines dans l essai mitochondries isol es Dosage de la Citrate synthase Principe La citrate synthase est une enzyme du cycle de Krebs
33. 5 51 Smith A 1967 Preparation properties and conditions for assay of mitochondria slaughterhouse material small scale Method Enzymol 10 81 86 Taylor R W Birch Machin M A Bartlett K Lowerson S A Turnbull D M 1993 Succinate cytochrome c reductase assessment of its value in the investigation of defects of the respiratory chain Biochem Biophys Acta 1181 261 265 Taylor R W Birch Machin M A Bartlett K Turnbull D M 1994 The control of mitochondrial oxidations by complex III in rat muscle and liver mitochondria Implications for our understanding of mitochondrial cytopathies in man J Biol Chem 269 5 3523 3528 Taylor R W Schaefer A M Barron M J McFarland R Turnbull D M 2004 The diagnosis of mitochondrial muscle disease Neuromusc Disord 14 4 237 245 Touati G Rigal O Lomb s A Frachon P Giraud M Ogier de Baulny H 1997 In vivo functional investigations of lactic acid in patients with respiratory chain disorders Arch Dis Child 76 16 21 Trijbels J M Scholte H R Ruitenbeek W Sengers R C Janssen A J Busch H F 1993 Problems with the biochemical diagnosis in mitochondrial encephalo myopathies Eur J Pediatr 152 3 178 184 Trounce I A Kim Y L Jun A S Wallace D C 1996 Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patient muscle biopsies lymphoblasts and transmitochondrial cell lines Method Enzymol 264 484 509 Wibom R Ha
34. 9 Chretien et al 2004 Estabrook and Pullman 1967 Kirby et al 2007 Rustin et al 1994 Trounce et al 1996 Zheng et al 1990 To our knowl edge however such a comprehensive study has never been per formed to try and find the simplest and optimal conditions to assess respiratory chain complexes activities for use in clinical practice It is important to note that in most instances the huge initial discrepancy in the recorded activities between different cen ters Table 1 could be explained by the influence of only two fac tors namely differences in the homogenization buffers and in phosphate concentration in the assays The protocols we present in this paper represent compromises between several factors The wish to have linear kinetics both as a function of time and as a function of enzyme concentration requires the use of low amounts of tissue but not too low otherwise the re sults become less reproducible The search for the simplest proto cols consistent temperatures buffers common to most assays addition of the sole inhibitors or adjuvants with significant and reproducible impact on the recorded activity is essential for a rou tine diagnostic procedure to be applied in different centers The fi nal protocols are therefore a compromise between these practical considerations and the optimal conditions identified in research laboratories In the end we have been able to find a good compro F Medja et al Mitochondrio
35. DTA and 10 mM Tris HCl pH 7 4 Letel lier et al 1992 Buffer CPT is 150 mM KCI and 50 mM Tris HCI pH 7 4 Lomb s et al 1991 The composition of the homogenization buffer had an unex pected great impact on the observed activities For example respi ratory complex IV and citrate synthase activity levels in the beef heart mitochondria were significantly lower when CCA buffer was used to dilute the mitochondrial pellet as compared to the activities obtained with the two other buffers Fig 1 In contrast the results obtained using either MAN or CPT buffer did not significantly differ Fig 1 The MAN buffer was more generally utilized in the different diagnostic centers than the CPT buffer and was therefore chosen for subsequent sample preparations 3 4 Phosphate concentration of the reaction buffer had significant impact on mitochondrial activities All French diagnostic centers used phosphate buffer for the as say of respiratory complex activities and Tris buffer for citrate syn thase analysis summarized in Table 2 A consistent pH was used The influence of pH was systematically re evaluated see experi mental data at http Ibbma univ angers fr fmdn These experi ments confirmed that pH has a strong influence on respiratory chain activities and that the pH values in use in all the French diag nostic centers were optimal values listed in Table 2 Impact on the activities measured by spec
36. ENCE Quantification of mitochondrial DNA deletion depletion and over replication Application to diagnosis Chabi B Mousson de Camaret B Duborjal H Issartel J P Stepien G Clinical Chemistry 2003 49 1309 1317 IV LE GENOME MITOCHONDRIAL COIHI K ATPases ef G pat origine de r plication du brin lourd H dans la D loop origine de r plication du brin l ger L dans la zone WANCY codant pour 5 ARNt 20 ATELIER D Analyse histologique de la cha ne respiratoire Anne LOMBES et Veronique LENOIR Piece 3514 Mise en place de l analyse histochimique des activit s succinate d shydrog nase et cytochrome c oxydase dans les tissus Anne Lomb s V ronique Lenoir Atelier du GDR Meetochondrie 17 19 octobre 2013 Institut Cochin Facult de m decine Avec l aide de Maryline Favier Plateforme Histologie de l Institut Cochin Milieux de reaction Succinate d shydrog nase 200 mM tampon phosphate 80 Na HPO 20 KH PO 0 1 Nitrobleu Tetrazolium 200 mM Succinate Ajuster le pH a 7 6 et filtrer Cytochrome c oxydase 100 mM tampon phosphate pH a 7 6 1mg mL 80 uM cytochrome c type IV 1 comprim 10 mL de DAB canc rog ne 20 ug ml catalase 0 25 DMSO Ajuster le pH a 7 6 et filtrer Materiel Echantillons Coupes tissulaires cryostat Cellules en culture fixation par s chage Etuve Chambres humides ou r cipient adapte Lames dans cuve de Coplin Lamelles dans cuves de Columbia
37. NN NN Pa de succinate et donc le complexe Il Complex II is not required for respiration on pyruvate malate Complexe malate pyruvate glutamate NADH Fn Malate Oxaloacetate aan Le glutamate permet galement le fonctionnement enen a HE T w du cycle de Krebs Son entr e n est pas contr l e Pyruvate EBS i ig par la PDH par contre elle est d pendante du TEN KERSE y potentiel de membrane Fe En NN DH CA Succinate Aspartate Complexe Il malate pyruvate succinate Pyruvate En presence de succinate le cycle de Krebs reprend avant le complexe II les complexes et Il peuvent oxyder leur substrat et le cycle est pratiquement complet L ajout de rotenone inhibe le complexe I L accumulation de NADH en r sultant entra ne une accumulation d ac tylCoA qui inhibe la PDH _ 2 Oxoglutarate Le succinate entre en echange de Pi pe a ve Fumarate2 ai NADH Ey Succinate ms Succinate N Malate2 L analyse par oxygraphie L analyse par oxygraphie permet de mesurer la consommation d oxyg ne a l aide d une lectrode de Clark Sur cellules perm abilis es ou mitochondries isol es l apport en substrats a la cha ne respiratoire peut tre contr l afin de cibler les diff rents tats respiratoires et les diff rents complexes de la cha ne et tester ainsi les respirations maximales li es aux diff rents
38. Piece 3012 ANALYSE DE LA CHAINE RESPIRATOIRE PAR OXYGRAPHIE FIBROBLASTES PERMEABILISES 1 Objet Ce Mode Op ratoire explique comment analyser les respirations maximales li es aux diff rents segments complexes de la cha ne respiratoire sur fibroblastes perm abilis s Cette Analyse se fait sur oxygraphe Oroboros 02k La perm abilisation des fibroblastes se fait selon le protocole de Greco et al 1996 le tampon de respiration et les concentrations en substrats correspondent a ceux de Rustin et al 1994 2 Rappels g n raux La phosphorylation oxydative La cha ne respiratoire transf re les lectrons du NADH partir du complexe ou du FADH complexe Il ETF l oxyg ne La membrane interne est imperm able au NADH et au FADH2 Le pouvoir r ducteur interne ne peut donc venir que du m tabolisme matriciel navettes oxydation du pyruvate cycle de Krebs aliment par des substrats externes sp cifiques Le transfert des lectrons par la cha ne respiratoire est coupl a un transport vectoriel de protons Dans les mitochondries intactes ceci s accompagne de la formation d une diff rence transmembranaire de potentiel lectrochimique du proton appel e plus simplement force protomotrice Celle ci freine le flux d lectrons qui lui donne naissance c est le contr le respiratoire A l tat stationnaire le flux actif transmembranaire de protons transfert par la cha ne respiratoire est gal
39. R seau meet fondrie http meetochondrie ibgc enrs fr D GDR 3159 d passer les fronti res a AMMA Atelier Techniques d investigation appliquees au diagnostic des pathologies mitochondriales Institut Cochin Paris 17 19 Octobre 2013 Accueil 3 me tage Faculte de Medecine pi ce 3529 PLANNING Atelier MeetOchondrie Techniques d investigation appliqu es au diagnostic des pathologies mitochondriales Paris 17 19 octobre 2013 GDR 3159 CNRS R seau MeetOchondrie Jeudi 17 Vendredi 18 Samedi 19 8h00 Plateau repas B IC De 8h30 Mise en place gr gr 12h30 intervenants 4 1 12h 13h Accueil des 12h30 participants Plateau repas 14h Plateau repas reprise 13h C gr 2 C gr 3 C De 14h Expos s gr a 18h th oriques 4 Fin 17h00 De 19h Diner a 20h30 FIAP 4 groupes de participants 1 2 3 4 4 ateliers B C D A Respiration cellulaire N Gueguen C Wetterwald Pi ce 3012 B Activit s des complexes respiratoires C Rocher S Allouche Pi ce 3512 C Quantification de l ADNmit B Mousson de Camaret V Desquiret Piece 3012 D Analyse histologique de la cha ne respiratoire A Lombes V Lenoir Piece 3514 ABRIAL Maryline BONY GARAYT Claire CORTI Olga CROCHEMORE Cl ment DALOYAU Marl ne DUROUX RICHARD Isabelle HARDONNIERE K vin HOET Delphine LAMBERT Mireille MAHMUDI Nasire MALGOYRE Alexandra PANO
40. SP 50 ml de tampon Rustin sans BSA conservation 1 mois 4 C 2 D Pr paration des substrats et inhibiteurs diluer dans l H 0 milliQ sauf cas sp cifiques indiqu s Pyruvate 0 5 M Malate 0 5 M Glutamate 0 5 M Succinate 0 5 M Cytochrome c 320 uM Rot none 2 5 mM FCCP 1 mM Oligomycine 8 mg ml Antimycine A 1 mg ml KCN 200 mM Azide 100 mM A pr parer le jour m me ADP 0 15 M Ascorbate 0 4 M NAD 50 mM Digitonine 5 mg ml TMPD cellules 20 mM Exceptionnellement stabilit 3 mois 20 C amener a pH 7 avec du KOH stabilit 3 mois a 20 C amener pH 7 avec du KOH stabilit 3 mois 20 C amener a pH 7 avec du KOH stabilit 3 mois a 20 C aliquoter en 120 ul stabilit 3 mois 20 C diluer dans l EtOH 100 conservation 3 mois 20 C diluer au 1 40 la solution m re conservation 1 mois 20 C diluer dans EtOH stabilit 1 mois 20 C diluer dans l thanol partir de la solution m re 10 mg ml stabilit 1 mois 20 C stabilit 1 mois 20 C stabilit 1 mois 20 C Stabilit 1 jour 4 C diluer dans l eau au dernier moment Stabilit 10 minutes une fois repris Stabilit 1 jour 4 C Peser dans un cryotube joint pas plus de 3 mg Pr parer le jour m me diluer dans l eau Chauffer 95 C pendant 2 minutes 30 Stabilit journ e temp rature ambiante Chauffer 37 C l avance
41. ZZO Cristina PECQUEUR HELLMAN Claire RENVOISE Margaux ROUBERT Christine ZOUYENE Nidya LISTE DES PARTICIPANTS maryline_abrial_1 hotmail com claire bony inserm fr olga corti upmc fr clement crochemore2 univ rouen fr marlene daloyau univ tlse3 fr isabelle richard inserm fr kevin hardonniere univ rennes1 fr delphine hoet sanofi com mireille lambert inserm fr nasire mahmudi sanofi com alexandra malgoyre irba fr panozzo cgm cnrs gif fr claire pecqueur univ nantes fr margaux renvoise cea fr christine roubert sanofi com nidya zouyene sanofi com Lyon Montpellier Paris Rouen Toulouse Montpellier Rennes Vitry sur Seine Paris Chilly Mazarin Br tigny sur Orge Gif sur Yvette Nantes Gif sur Yvette Montpellier Toulouse gr1 gr1 gr1 gr1 gr2 gr2 gr2 gr2 gr3 gr3 gr3 gr3 gr4 gr4 gr4 gr4 ENCADRANTS Noms Naig Gueguen C line Wetterwald Christophe Rocher St phane Allouche B n dicte Mousson de Camaret Val rie Desquiret Anne Lomb s V ronique Lenoir Email NaGueguen chu angers fr CeWetterwald chu angers fr crocher u bordeaux2 fr allouche s chu caen fr benedicte mousson de camaret chu lyon fr VaDesquiret chu angers fr anne lombes inserm fr veronique lenoir inserm fr ATELIER A Respiration cellulaire analyse de la chaine respiratoire par oxygraphie Naig GUEGUEN et C line WETTERWALD
42. ank Neg N A N A Sample Temoin fibro 120 29 13 88 1 61E 05 Sample Temoin fibro 106 6 14 31 1 19E 05 Sample Temoin fibro 131 24 13 88 1 61E 05 Sample Patient 1 134 94 19 96 2 20E 05 Sample Patient 1 99 71 20 07 2 03E 05 Sample Patient 1 126 44 19 93 2 24E 05 Sample Patient 2 142 84 16 82 2 02E 04 Sample Patient 2 154 26 16 81 2 04E 04 Sample Patient 2 93 24 17 72 1 24E 04 Biospies musculaires Sample Temoin muscle 111 37 10 08 3 53E 08 Sample Temoin muscle 121 34 10 32 2 91E 08 Sample Temoin muscle 121 29 9 15 5 37E 08 Sample Patient 3 111 37 10 08 3 53E 08 Sample Patient 3 121 34 10 32 2 91E 08 Sample Patient 3 146 04 9 89 3 94E 08 Sample Patient 4 132 31 7 93 2 10E 09 Sample Patient 4 111 46 8 04 1 92E 09 Sample Patient 4 148 43 7 74 2 48E 09 Content Blank Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Sample Description Neg Temoin fibro Temoin fibro Temoin fibro Patient 1 Patient 1 Patient 1 Patient 2 Patient 2 Patient 2 Temoin muscle Temoin muscle Temoin muscle Patient 3 Patient 3 Patient 3 Patient 4 Patient 4 Patient 4 Efficiency N A 93 26 93 09 93 25 113 21 115 27 87 22 97 22 99 64 96 55 111 37 121 38 177 77 206 39 170 56 96 39 118 51 106 21 89 12 17 C t N A 13 48 13 54 13 47 19 40 19 37 20 01 16 60 16 59 16 67 10 08 10 34
43. arvested using standard protocols For the assays a pellet from a T75 flask kept at 80 C was suspended in 300 uL of homogenization buffer and sonicated during 5 s on ice All assays were performed in temperature controlled single wavelength spectrophotometer with a multi cuvette sampler 2 3 Methods To establish optimal reaction conditions each parameter was separately assayed beginning with the conditions proposed during initial discussions These parameters were assay buffer concentra tion pH substrate s concentration possible inhibitor s and adju vant s such as magnesium bovine serum albumin BSA and EDTA The last parameter verified was the linearity of the assay F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 333 with respect to time and protein concentration Additional tissue preparations were tested only for the assay of respiratory complex las they were reported to improve the proportion of rotenone sen sitive activity Chretien et al 1990 They were a supplementary cycle of freezing and or an osmotic shock performed by incubation of the tissue sample in water at 37 C during 5 min weight volume from 0 05 to 0 00025 depending on the tissue The nature prep aration and source of all reagents are indicated on the website of the network of French laboratories which is accessible at http Ibbma univ angers fr fmdn Protein concentration was evaluated with the BCA protein assay Pierce or the Lowry meth
44. bre et placer dans un tube Eppendorf pour le dosage des prot ines par la m thode PRBCA voir BIO 9014 0147 dosage des prot ines par la m thode B C A Rincer les cuves eau puis thanol 100 et remettre 2 ml d EtOH 100 Rincer soigneusement les bouchons avec de l eau puis de l EtOH 100 et les laisser sur les chambres pour viter l vaporation de l EtOH Centrifuger les aliquots pr lev s 1 minute 16000g Retirer le surnageants et laver le culot avec du NaCl 0 9 vol vol Doser ensuite les prot ines sur les diff rents aliquots Si le disage ne peut tre r alis imm diatement congeler 20 C 6 Analyse de l exp rience En bas de l cran dans l onglet graphique v rifier que le graphique est bien en corrected 5 Flux per Volume corrected Tracer une marque sur chaque palier d int r t au niveau o le flux est stable en appuyant sur shift clic gauche sur la souris et faire glisser la souris jusqu la taille de marque d sir e Pour enlever la marque shift clic droit et repasser sur la marque l envers de la droite vers la gauche Exemple olmi 150 100 Concentration A nm 02 U2 50 Complexes Complexe 00 10 00 00 15 00 00 30 00 j n bn Ge ouden non Be mn NAD ADP DO Succinate 2 90 Rot none EN MPa Elll MP Ell MPS ligo FCCP EIV Oligo FCC Pus O Ell SR Zou N oh on o eN o 02
45. brin se dissocie une temp rature qui lui est propre Tm temp rature a laquelle 50 de l ADN double brin est dissoci et qui d pend notamment de sa composition nucl otidique A cette temp rature appel e temp rature de fusion intercalant SYBR Green est lib r et la fluorescence chute brutalement Un seul pic au niveau de la courbe de fusion signifie qu un seul produit a t amplifi et que la PCR est sp cifique Figure 3A En revanche si l amplification n est pas sp cifique un ou plusieurs autres pics seront mis en vidence sur la courbe de fusion La pr sence ventuelle de dimeres d amorces peut tre galement rep r e sur la courbe de fusion Figure 3B A Melting Curve Graph Smooth ieee th thane RD B TE Primer an www bbioocom ames T w TJ pl 510 Eis LL 17 55 ril F5 80 85 90 g5 Temperature C Figure 3 Exemple de courbe de fusion A Amplification d un seul produit B Amplification de deux produits 4 1 2 3 L aspect quantitatif la quantification proprement dite des produits de qPCR peut se faire selon deux conceptions quantification relative elle s effectue par mesure d un gene cible par rapport a un gene de r f rence et on tablit un rapport entre les Ct ou Cp du g ne cible et du gene de reference pour chaque chantillon en tenant compte des efficacites des deux PCR quantification avec standard exte
46. chantillons d ADNs Les ADNs des contr les et des patients sont extraits a partir soit de fibroblastes cutan s cultiv s soit de muscle squelettique contr les ADNs t moins extraits de fibroblastes ou de muscle patients ADNs de patients correspondant a trois types de situation 1 d pl tion de l ADNmt fibroblastes des patients 1 et 2 2 d l tion h t roplasmique de l ADNmt muscle du patient 4 porteur de la d l tion commune de 4977 paires de base nt 8482 nt 13460 3 ni deletion ni d pl tion muscle du patient 3 1 2 Precautions pr liminaires La qPCR est une technique tres sensible permettant de d tecter seulement quelques copies d ADN mitochondrial ou nucl aire Il est donc imp ratif de travailler dans un environnement totalement exempt d ADN contaminant Pour cela avant chaque manipulation le plan de travail ainsi que les pipettes seront nettoy s avec une solution DNA away ou toute autre solution permettant d liminer toutes traces d ADN Il est aussi indispensable d utiliser des pointes a filtres pour viter les a rosols pouvant contaminer les pipettes Le port de gants et eventuellement d une blouse a manches resserrees est galement imp ratif Les plasmides utilis s pour les gammes d talonnage tant tres concentr s en ADN ils repr sentent une source importante de contamination Il est indispensable de les manipuler avec le maximum de pr cautions centrifuger brievement les t
47. cole pr l vement et conservation Ils ne doivent pas avoir t expos s a une rupture de la chaine du froid Toutes les manipulations sont r alis es en chambre froide Les pr l vements sont conserv s en tubes a 80 C Ils doivent tre transport s dans la carboglace En pratique 5 echantillons de patients peuvent tre analyses au cours d une m me s rie Un echantillon de mitochondries isol es de coeur de boeuf est toujours analyse en parall le et sert de t moin interne de la qualit des dosages Pr parer 2 s ries de 5 tubes Eppendorf de 1 5 mL num rot s et les placer dans la glace pil e Foie et muscle Homog nat a 5 dans le tampon Mannitol 1 Mettre les 5 tubes d homog n isateur de type Potter verre verre taille 20 chez Kontes a refroidir dans la glace pil e 2 Prendre une petite quantit du fragment biopsique 20 a 50 mg Si besoin couper le fragment de biopsie en vitant sa d cong lation Soit en le coupant au scalpel Refroidir une boite en plastique en la posant sur la carboglace Y d poser le fragment biopsique sur un papier d aluminium Remonter les bords du papier d aluminium de chaque cot du fragment Couper l aide d un scalpel en maintenant le fragment avec une pince Soit en le cassant dans un mortier refroidi l azote liquide 3 Le placer dans l homog n isateur de type Potter 4 Ajouter 9 volumes de tampon Mannitol par exemple 270 uL pour 30 mg de biopsie ou 450
48. complexes Cependant les r sultats ont montr que dans la plupart des cas la manifestation ph notypique de l anomalie g n tique se produit lorsqu un seuil est d pass et ce ph nom ne a t nomm l effet de seuil ph notypique pour revue cf Rossignol et al 2003 Ceci signifie qu il est parfois possible d inhiber consid rablement l activit d un complexe de la cha ne respiratoire jusqu une valeur critique sans affecter la vitesse de respiration maximale ou la synth se d ATP Ce ph nom ne est appel effet de seuil biochimique Ceci est en particulier le cas pour le complexe IV cytochrome oxidase dernier complexe de la cha ne respiratoire et dont l activit est donc en exc s par rapport celle des autres complexes Ces effets de seuil peuvent tre tres diff rents d un tissu l autre ex muscle versus fibroblastes pour le complexe IV muscle ou fibroblastes versus foie pour le complexe et tres diff rents galement en fonction de la mutation impliqu e par exemple les mutations dans des sous unit s du complexe impliqu es dans la translocation de protons ne modifie que peu l activit catalytique de l enzyme isol e mais conduisent g n ralement a une diminution de la consommation d oxyg ne D autre part les tudes oxygraphiques peuvent permettent de d tecter non seulement des d ficits de la phosphorylation oxydative mais galement des d ficits en pyruvate d shydrog nase en en
49. ctase activity in mitochondria isolated from minute amount of human skeletal muscle Biochem Biophys Res Commun 173 1 26 33 Chretien D Slama A Briere J J Munnich A Rotig A Rustin P 2004 Revisiting pitfalls problems and tentative solutions for assaying mitochondrial respiratory chain complex III in human samples Curr Med Chem 11 2 233 239 DiMauro S Hirano M 2005 Mitochondrial encephalomyopathies an update Neuromusc Disord 15 4 276 286 Estabrook R W Pullman M E 1967 Oxidation and Phosphorylation Academic Press New York London Gellerich F N Mayr J A Reuter S Sperl W Zierz S 2004 The problem of interlab variation in methods for mitochondrial disease diagnosis enzymatic measurement of respiratory chain complexes Mitochondrion 4 5 6 427 439 Janssen A J Trijbels F J Sengers R C Smeitink J A van den Heuvel L P Wintjes L T Stoltenborg Hogenkamp B J Rodenburg R J 2007 Spectrophotometric assay for complex I of the respiratory chain in tissue samples and cultured fibroblasts Clin Chem 53 4 729 734 Kirby D M Thorburn D R Turnbull D M Taylor R W 2007 Biochemical assays of respiratory chain complex activity Method Cell Biol 80 93 119 Krahenbuhl S Talos C Wiesmann U Hoppel C L 1994 Development and evaluation of a spectrophotometric assay for complex III in isolated mitochondria tissues and fibroblasts from rats and humans Clin Ch
50. d identification of mitochondrial diseases This paper describes the development of standardized protocols for the most frequently used assays of the respiratory chain activ ities It has been an indispensable step in the improvement of the screening and identification of mitochondrial diseases which is the goal of the network of French diagnostic centers for mitochondrial diseases Previously results from the assays of respiratory chain activities were difficult to compare between centers as shown in Table 1 and in Gellerich et al 2004 Kirby et al 2007 Asking a second advice from a different diagnostic center might have there fore led to repeated invasive procedures such as biopsies repeated analyses and conflicts between centers all of which were detri mental for the patient Standardized assays of respiratory chain activities are mandatory because they allow sharing the results of patients investigations among different diagnostic centers as well as developing procedures for quality control 336 F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 Complex III Mouse muscle homogenate 100 75 a O Pha 2 25 as ss 0 0 50 100 150 200 Cyt c uM Complex IV Human muscle fibroblasts 300 gt jn 200 5 a T 2 100 En 0 0 50 100 150 200 Cyt c uM Muscle homogenate 80 60 IV activity A O 20 0 50 100 150 200 Cyt c uM IV activity Sonicated fibroblasts 60 20
51. d in the presence of 100 uM reduced cytochrome c and 50 mM potassium phosphate pH 7 0 Only the lowest amount of mitochondria gave a decrease of absorbance with pseudo linear kinetics with time mise for all the assays despite the fact that complex III assay re mained unsatisfactory with respect to its reproducibility Table 2 The precise protocols as well as the complete set of experimental data may be found at http Ibbma univ angers fr fmdn Automation of respiratory chain assays have been described in several papers Kramer et al 2005 Wibom et al 2002 Williams et al 1998 It obviously implied standardization to make sure the conditions were optimal with respect to maximal velocity and linearity with time Although essentially similar the published protocols differ from those set up in the present work for example in the presence of additional reagents such as EDTA or magne sium or in the chosen substrate and buffer concentration These differences may in part be due to the material assayed Cultured fibroblasts were most often the only tissue assayed in these reports whereas we assayed several tissues and chose the simplest proto col compatible with muscle and fibroblasts analysis In addition the striking influence of the homogenization buffer composition was shown by the comparison between centers that initiated our work whereas it could not have been taken into account in a single center standardization process We did not
52. e considered to act as a Safeguard against errors with human specimens exhibiting very high activities 4 4 The standardization already brought a set of comparable data The standardized protocols are now progressively applied in six centers in France which allows for comparison and management of larger sets of results on mitochondrial diseases Proper quality control process has not yet been established It will require to pro duce sufficient quantity of a set of cell lines with diverse enzymatic defect that will be sent to the diagnostic centers in order to serve as blind test samples Aur et al 2007 The similarity of the results obtained on control samples in three different centers Table 3 is a good indication that the network will be able to gather results from numerous control samples analyzed in several diagnostic centers It will therefore be possible to define normal values for en zyme activities using appropriate large data sets a situation which is rarely possible in a single center Complex III remained a most difficult respiratory complex to as sess Chretien et al 2004 Krahenbuhl et al 1994 The difficulties are due to the necessity to prepare reduced ubiquinone to the high specific activity of the enzyme and to direct redox interactions be tween substrates and products of the complex since auto oxidized quinone produces both superoxide and hydrogen peroxide which can directly modify reduce cytochrome c Nohl
53. elp C Show All Wells and Sets Show Selected Ony MV Efficiency as Copy to Clipboard r Sets Well Dye Content Description Efficiency Cit copies a A3 SBG1 Blank N A N A NA Bl SBG1 Standard 10000000 106 03 14 20 1e 007 B2 SBG1 Standard 10000000 101 10 14 06 1e 007 B3 SBGI Standard 10000000 101 54 14 03 1e 007 ct sBG1 Standard 1000000 108 87 17 30 1e 006 c2 SBG1 Standard 1000000 100 62 1717 1e 006 C3 SBG1 Standard 1000000 109 69 17 57 1e 006 Status D2 SBG1 Standard 100000 112 05 20 74 1e 005 Br Instrument an a Standard 100000 107 13 20 49 1e 005 un lle SBGI Standard 10000 101 96 2415 1e 004 E2 SBG1 Standard 10000 115 59 2393 1e 004 E3 SBG1 Standard 10000 98 62 24 07 1e 004 FL SBG1 Standard 1000 105 52 27 50 1000 F2 SBG1 Standard 1000 104 53 27 28 1000 F3 SBG1 Standard 1000 121 71 26 98 1000 G1 SBG1 sample T 123 98 14 00 1 04e 007 A ens Le i 125 25 1227 1 19122007 2 Graphs Calculations Figure 9 Onglet Quantitation Calculations du logiciel Opticon Monitor Bio Rad Le retraitement des donn es figure dans le tableau extrait du fichier Excel Une interpretation des r sultats quantitatifs pour les trois genes COXI ND4 et B2M est propos e aux participants 16 Tableau Retraitement des donn es quantitatives Content Description Efficiency C t copies Bl
54. emical and genetic diagnosis of human mito chondrial diseases was initiated to improve identification of the causes of mitochondrial diseases to establish a national register of patients and to set up inter laboratory quality controls for the diverse diagnostic investigations The first analyses to be proposed for evaluation were the spectrophotometric assays of respiratory chain activities The reasons for that choice was that these assays were reputed very diverse and were used in all the centers either in isolation or in addition to other biochemical assays such as polarography or ATP measurements To simplify the matter the as says of respiratory complexes I II IH and IV as well as citrate syn thase activity were first evaluated because they can be applied on homogenates as well as on mitochondrial fractions The consequences of the diversity of the protocols on the range of experimental results was initially analyzed it was shown to be striking as previously reported Gellerich et al 2004 Kirby et al 2007 That observation prompted members of the network to try and standardize the assays protocols To spare human samples animal tissues beef heart mitochondria and mouse quadriceps homogenate were first assayed Experimental conditions were then verified in human control muscle homogenates and sonicated human fibroblasts Even though the biochemistry of the respira tory chain poses intrinsic difficulties mainly due to the fact tha
55. escription Al SBG1 Blank A2 SBG1 Blank A3 sBG1 Blank A4 sBa1 Blank AS SBG1 Blank A6 sBG1 Blank B1 sBG1 Standard B2 sBa1 Standard B3 SBG1 Standard B4 sBG1 Standard ir mou Standard 1000000 Plate Type MI Clear Empty Blank Standard 2 Sample B6 SBG1 Standard 1000000 m Dyes Contents C1 SBG1 Standard 1000000 Status C2 sBG1 Standard 1000000 No Instrument ns A Step wc C3 SBG1 Standard 1000000 Ca sBa1 Standard 100000 C5 sBG1 Standard 100000 D1 sBG1 Standard 100000 D2 sBG1 Standard 100000 D3 sBG1 Standard 100000 D5 SBG1 Standard 10000 Select InUse Deselect All D6 SBG1 Standard 10000 Fs Specify Quant Standards Figure 6 Onglet Plate Setup du logiciel Opticon Monitor Dans l onglet Protocol Setup on introduit les conditions du programme PCR line 1 95 C 10 minutes line 2 95 C 30 secondes line 3 64 C 1 minute Puis plate read revenir la line 2 et ajouter 49 more times soit 50 cycles en tout melting curve 55 C to 95 C read plate every 1 C hold 1 seconde Le programme de 50 cycles de PCR dure environ deux heures 11 11 7 Interpr tation des r sultats Les r sultats obtenus apres amplification des genes mitochondriaux COX et ND4 et du g ne nucl aire B2M comportent trois volets 1 la courbe de fusion de chaque g ne 2 les courbes d amplificat
56. espondant a une flasque T75 de fibroblastes peut tre repris dans 200 uL de tampon Sonication br ve 5 secondes puissance mod r e pour obtenir une solution homog ne Mitochondries de c ur de b uf utilis es comme contr le de qualit dans chaque s rie de dosages On utilise les billes de mitochondries fournies par le Prof Jo l Lunardi de Grenoble Dans un tube 1 5 mL Eppendorf mettre une bille et la laisser d congeler 4 C Pr parer la dilution des mitochondries au 1 200 dans le tampon Mannitol d abord dilution 1 40 10 uL de suspension mitochondriale dans 390 uL puis dilution 1 5 200 uL de dilution 1 40 dans 800 uL de tampon Cette dilution au 1 200 est utilis e pour tous les dosages sauf ceux du complexe Ill et du complexe IV o l on utilise une dilution au 1 800 50 uL de la dilution 1 200 dans 150 uL de tampon Mannitol Dosage des prot ines On doit doser les prot ines des diff rents surnageants tissulaires ou des suspensions cellulaires dilu s 1 5 dans du PBS et de la suspension de mitochondries dilu e au 1 40 mesur e pure Ce calcul permet d ajuster la concentration prot ique 2 mg mL et de v rifier la concentration des billes au 1 40 elle est proche de 1 mg mL R actifs pour dosages des complexes de la cha ne respiratoire DOSAGES DE 5 ECHANTILLONS ET UN CONTROLE REACTIFS A PREPARER LE JOUR MEME 100 uM cytochrome c Peser au moins 15 mg de cytochrome cet Cong lateur
57. genfeldt L von Dobeln U 2002 Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples Anal Biochem 311 2 139 151 Williams A J Coakley J Christodoulou J 1998 Automated analysis of mitochondrial enzymes in cultured skin fibroblasts Anal Biochem 259 2 176 180 Zheng X Shoffner J M Voljavec A S Wallace D C 1990 Evaluation of procedures for assaying oxidative phosphorylation enzyme activities in mitochondrial myopathies muscle biopsies Biochem Biophys Acta 1019 1 10 ATELIER C Quantification de g nes mitochondriaux et nucl aires par PCR quantitative en temps reel Application la quantification des deletions et depletions de ADN mitochondrial Val rie DESQUIRET B n dicte MOUSSON de CAMARET CHU Angers CHU Lyon VaDesquiret chu angers fr benedicte mousson de camaret chu lyon fr Institut Cochin INSERM U1016 CNRS UMR 8104 Universit Paris Descartes Paris 17 19 octobre 2013 Principe de la technique de PCR quantitative en temps r el La quantification de genes de l ADN mitochondrial ADNmt dans les tissus et cellules est r alis e par une technique de PCR quantitative en temps reel qPCR Cette technique est bas e sur la d tection et la quantification d un metteur fluorescent pendant le processus d amplification et l augmentation du signal d mission fluorescente est directement proportionnelle a la quantit
58. ibration initiale de la lecture sur l air 2 Incuber les cuves 37 C durant 5 min dans le spectrophotom tre thermostat 3 Lire la ligne de base pendant 4 minutes 37 C On peut lire 6 cuves en m me temps 4 D clencher la r action par 50 uL de 10 mM acide oxaloac tique dans 100 mM Tris HCI pH 8 1 5 Lecture toutes les 20 secondes durant 4 minutes si laugmentation de l absorbance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu Calcul 1 L activit sp cifique est calcul e apr s soustraction de l activit de base en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le TNB est 13 6 3 Le facteur de correction est donc 1838 2 pour 40 ug de prot ines et 18382 pour 4 ug de prot ines dans l essai Mitochondrion 9 2009 331 339 Contents lists available at ScienceDirect Mitochondrion gt gt CS 4 EVIER journal homepage www elsevier com locate mito ELS Development and implementation of standardized respiratory chain spectrophotometric assays for clinical diagnosis F Medja S Allouche P Frachon C Jardel M Malgat B Mousson de Camaret A Slama J Lunardi J P Mazat A Lomb s a INSERM U975 Paris F 75013 France gt Laboratoire de Biochimie Centre hospitalier et universitaire de Caen F 14033 Caen cedex France Universit Pierre et Marie Curie Paris6 UPMC Paris6
59. im Acta 230 2 177 187 Kramer K A Oglesbee D Hartman S J Huey J Anderson B Magera M J Matern D Rinaldo P Robinson B H Cameron J M Hahn S H 2005 Automated spectrophotometric analysis of mitochondrial respiratory chain complex enzyme activities in cultured skin fibroblasts Clin Chem 51 11 2110 2116 Kubota T Yoshikawa S Matsubara H 1992 Kinetic mechanism of beef heart ubiquinol cytochrome c oxidoreductase J Biochem 111 1 91 98 Letellier T Malgat M Coquet M Moretto B Parrot Roulaud F Mazat J P 1992 Mitochondrial myopathy studies on permeabilized muscle fibers Pediatr Res 32 1 17 22 Lomb s A Nakase H Tritschler H J Kadenbach B Bonilla E DeVivo D C Schon E A DiMauro S 1991 Biochemical and molecular analysis of cytochrome c oxidase deficiency in Leigh s syndrome Neurology 41 491 498 Nohl H Gille L Kozlov A V 1998 Antioxidant derived prooxidant formation from ubiquinol Free Radical Biol Med 25 6 666 675 Romero N B Lomb s A Touati G Rigal O Frachon P Cheval M A Giraud M Possekel S Fardeau M Ogier de Baulny H 1996 Morphological studies of skeletal muscle in lactic acidosis J Inher Metab Dis 19 528 534 Rustin P Chretien D Bourgeron T Gerard B Rotig A Saudubray J M Munnich A 1994 Biochemical and molecular investigations in respiratory chain deficiencies Clin Chim Acta 228 1 3
60. imone and Paris Dr Mich le Brivet Dr Abdel Slama CHU Bic tre Dr Agn s R tig Dr Pierre Rustin CHU Necker Enfants malades Paule Frachon Dr Claude Jardel Dr Anne Lomb s CHU Piti Salp tri re The initial discussion led to the decision to assay the respiratory chain complexes activities at 37 C in order to allow comparison with polarography Agreement was also reached on the parameters that required experimental validation so that optimal conditions for a diagnostic assay could be established i e highest maximal velocity to improve sensitivity in order to better detect partial enzymatic failure as well as linear kinetics with time to avoid common miscalculations of initial velocity and with amount of protein to correctly assess the actual activity 2 2 Material To spare human samples it was decided to initially work on animal tissues Isolated beef heart mitochondria were chosen to provide large stock of homogeneous mitochondrial fractions that were needed for initial evaluations They were prepared using a method adapted from Smith 1967 All operations were con ducted at a temperature of 6 C Ventricular cardiac muscle ob tained from freshly slaughtered animals was homogenized in cold 0 27 M sucrose 10 mM KzHPO with pH adjusted at 7 4 by addition of 1 M Tris base Two centrifugations at 4 C first of the homogenate for 15 min at 1000g then of the resulting superna tant for 30 min at 14 000g gave a fi
61. ion 3 les tableaux de quantification Gr ce ces donn es pourront tre calcul s les rapports entre le nombre de copies des genes mitochondriaux et celui du g ne nucl aire qui sert de r f rence pour les contr les et les patients 1 7 1 Courbes de fusion il est possible de visualiser la courbe de fusion ou melting curve apr s le run en cliquant sur l onglet Melting Curve Figure 7 _ Opticon Monitor Melting Curve 050913 MTDNA 64 VAL tad COX File Edit View Instrument Tools Melting Curve User Help Graphed Samples Options Group COXI Manage Wels C Sets Subtract Blanks M Subtract Baseline ION Well Content Description A C Minimum Over Temperature Range LC i C2 Standard 1000000 C Average Over Temperature Range KK D2 Standard 100000 E Sct Solel MON E Standard 10000 3 Temp Range 55 0 To 55 0 H E2 Standard 10000 Diii i Fi Standard 1000 Fie Intensity C d dT Both F2 Standard 1000 M Show Relative Intensities Gl Sample E Peak Location Boundaries G2 Sample T Left 56 0 H Right 840 H r Smooth Status No Instrument Fluorescence Figure 7 Onglet Melting curve du locigiel Opticon Monitor Bio Rad 12 Des exemples de courbes de fusion obtenues pour les trois g nes d int r t sont reproduits ci dessous Une interpr tation des courbes de fusion est propos e aux participants C OXI Me
62. l cule tres hydrophobe est remplac e dans l essai par la d cylubiquinone beaucoup plus hydrophile L activite est mesur e en suivant la r duction du 2 6 dichloroph nol indoph nol DCPIP par la baisse de l absorbance 600 nm du DCPIP oxyde La ligne de base est mesur e pour pouvoir soustraire une reaction spontanee de transfert d lectrons au DCPIP La sp cificit de la r action peut tre v rifi e par son Inhibition par le malonate 10 mM inhibiteur sp cifique du complexe Il Cette v rification n est pas obligatoire en routine diagnostique du fait de la grande sp cificit de la r action v rifi e au dessus de 90 sur l homog nat de muscle et de foie En pratique 6 determinations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d une m me s rie soit 6 dosages Composition du milieu de r action 25 mM K Phosphate pH 7 5 20 mM succinate 100 uM d cylubiquinone 50 uM DCPIP 1 mM KCN 100 uM ATP 2 mg mL albumine bovine Tissu 40 ug de prot ines surnageant post nucl aire ou suspension cellulaire ou 4 ug de mitochondries isol es Pr paration du milieu de r action 1 Dans un tube de 15 mL pr parer le m lange pour effectuer 7 dosages 2 Dans une cuvette de 1 mL mettre 976 uL du milieu de reaction et ajouter 20 uL d homog nat tissulaire ou de suspension cellulaire pr par une concentration finale de prot ines de 2 mg mL ou de mitochondries de coeur de boeuf di
63. l require setting up a quality control procedure that is complex III activity are also present in the assay of the combined indispensable for fine technical adjustments Despite its difficul activities Kubota et al 1992 ties standardization of the enzymatic analyses is worth the effort For the patients it allows investigations to take place in different centers without the need to repeat the same assays For the diag nostic centers it allows comparison and discussion of results as well as the possibility for control accreditation We are very aware that the present work is only a first step in the process of establish 5 Conclusion Our work shows that standardization of the spectrophotometric assays of respiratory chain activities is a feasible task Its comple F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 339 Table 3 Results of the standardized protocols in three different diagnostic centers Beef heart mito n 58 Human muscle n 89 39 26 Human liver n 30 217 Human fibroblasts n 50 I 1809 178 42 16 42 8 56 31 27 12 36 12 Il 1813 174 61 22 68 20 79 38 125 59 169 24 27 8 I 888 507 166 72 301 77 252 119 84 35 80 28 55 17 IV 8867 780 184 64 210 42 205 98 69 31 ND 83 15 I 426 176 32 16 ND ND 24 7 I III 1261 324 49 16 48 13 77 46 55 24 37 3 30 7 Cs 2165 215 220 74 278 52 202 102 65 31 80 13 79 18 I CS 0 84 0 10 0 19
64. lting Curve Graph Smoot EEE aa EN Fluorescence x Interpr tation N D 4 Melting Curve Graph RS m Fluorescence Interpr tation B2 M Melting Curve Graph Sei Fluorescence Interpr tation 13 1 7 2 Gammes d talonnage ces donn es peuvent tre visualis es dans onglet Quantitation Graph Figure 8 en TAALA ya Aag Y y Opticon Monitor Quantitation 050913 MTDNA 64 VAL tad Default File Edit View Instrument Tools Quantitation User Help Graphed Samples Options Ms als els e r e sfopafem eden DEE MOS IE man ee M Subtract Baseline a Content Description ca Minimum Over Cycle Range a DOO ICICI D5 Empty 10000 C Average Over Cycle Range l es ee tete Soy Global Minimum TREC IIS IIT CEE sie Pl LA ga GIELIS Et Standard 10000 Suppress Pre Threshold Data z RY COCO SX MIR E2 Standard 10000 alir i F OS ONIN ARI E3 Standard 10000 IE Er M g INIAN NI ee HS Threshold gt sy A K G G KIRI Od LOC JON en en C Manual 0 025 E6 Empty 1000 G Standard Deviation s Dye seat Step ks A Cycle ie Fl Standard 1000 fiver Cide Harige 1 00 Data and Standards I All Dyes I LogScale V AutoScale Smooth nl nn y 3 305x 37 19 2 0 999 Use Replicates Selected Wells Both Status No Instrument ata D Fluorescence
65. lu es a 0 2 mg ml soit au 1 200 M langer Reaction 1 Lecture au spectrophotom tre 37 C longueur d onde 600 nm Calibration initiale de la lecture sur l air 2 Incuber les cuves a 37 C durant 5 min dans le spectrophotometre thermostate 3 Lire la ligne de base pendant 3 minutes a 37 C 4 D clencher la r action par 4 uL de 25 mM d cylubiquinone 5 Lecture toutes les 15 secondes durant 3 minutes si la d croissance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu Calcul 1 L activit sp cifique est calcul e apres soustraction de l activit de base en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le DCPIP est 19 1 3 Le facteur de correction est donc 1308 9 pour 40 ug de prot ines et 13089 pour 4 ug de prot ines dans l essai Dosage du complexe Ill ubiquinol cytochrome c oxydo r ductase Principe Le complexe Ill de la cha ne respiratoire permet l oxydation de l ubiquinol forme r duite de ubiquinone ou coenzyme Qo dont il transf re les lectrons au cytochrome c dont la r duction est suivie par l augmentation d absorbance a 550 nm l existe des activit s parall les non respiratoires d oxydation de lubiquinol L antimycine A est un des inhibiteurs sp cifiques du complexe Ill L activit sp cifique du complexe Ill est donc calcul e par la diff rence entre l activit totale et celle r sistante a lantimycine A qui
66. mo4 Pause A Ag Run Time Thursday September 05 2013 17 51 31 Master File L Skip Plate Se a Quick Load C Plat Data File_Plate_ Data Save 12 MJ Clear Status No Instrument Protocol Setup Quick Load r Plate Reads 50 Melting Curves Estimated Duration 02 29 02 Reaction Volume 20 ul Temperature Control Sample Calculation 2 30 00 1 00 00 1 30 00 Lid Temperature Constant 100C Shutoff lt 30C Figure 5 Onglet Master File du logiciel Opticon Monitor Bio Rad Dans l onglet Plate Setup cliquer sur Edit pour annoter le plan de plaque Figure 6 dans le cadre Dyes choisir SBG1 SYBR Green indiquer le type d chantillon contenu dans le puits en s lectionnant les puits et en cliquant sur la couleur correspondante les puits contenant de leau Blank seront mat rialis s en bleu B ceux contenant les points de gamme Standard en vert Std et ceux qui contiennent les chantillons Sample seront mat rialis s en rouge Sa indiquer le nom des chantillons dans le tableau de droite et cliquer sur Specify Quant Standards pour rentrer les valeurs des diff rents points de gamme 10 J Opticon Monitor Plate Setup 050913 MTDNA 64 VALtad COXI mi File Edit View Instrument Tools Plate User Help m Plate m Wells SENENKNENENKSKNENENENENEN 7 F T i Well Group Defaut gt Manage Show Empties P lt P d di Well Dye Content D
67. munity because of the high number of candidate genes located either in mitochon drial DNA or in the nuclear genome Recognition of homogeneous groups of patients would significantly facilitate the search for the cause of mitochondrial diseases 1567 7249 see front matter 2009 Elsevier B V and Mitochondria Research Society All rights reserved doi 10 1016 j mito 2009 05 001 332 F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 However the nature number and protocol of investigations ap plied to mitochondrial disorders may greatly vary between differ ent diagnostic centers thus preventing direct comparison of patients results obtained in different centers Previous work has been done to standardize protocols for metabolic Touati et al 1997 and morphological Romero et al 1996 analyses of mito chondrial patients It has not been done for the assays of mitochon drial activities for which exist very diverse protocols B nit et al 2006 Birch Machin et al 1989 Chretien et al 2004 Estabrook and Pullman 1967 Janssen et al 2007 Kirby et al 2007 Rustin et al 1994 Trounce et al 1996 Zheng et al 1990 that have been shown to induce large variation of experimental results Gellerich et al 2004 1 2 Standardization of spectrophotometric assays within the frame of the French network of mitochondrial diseases diagnostic centers In 2000 a network regrouping all the French laboratories in volved in the bioch
68. n 9 2009 331 339 337 HI total ubiquinol cyt c oxidoreductase activity 2 3 Ds goe PAG En ac ae aoe 6 aoe D ee mie 6 eee PCI 00 Z D ee _ ee E E 3 ee o ee ee m e ee z EE D D ETE ee En see e o0 AE of ee so A Teese A sert 0 8 0 1 2 3 Time minutes HI antimycin resistant activity 1 2 sat EE seen SO PCA LL 3 ANTON AH E er ee QT e 1 0 un 2 A EE 0 8 0 1 2 3 Time minutes IV activity 2 5 ab PRO enne a Q z ee 1 5 Jenn N 2 Cee E10 Aen en 2000000 0 5 0 1 2 3 4 Time minutes Fig 4 Quasi linear kinetics with time were very difficult to obtain with very active tissue Time course of absorbance values are shown for the assays of Complex III two upper panels and complex IV lower panel Absorbance values are shown with black circles of increasing size with the increasing amount of mitochondrial protein 1 2 4 6 and 10 ug of beef heart mitochondria for the assays of complex III activity and 1 and 2 ug of beef heart mitochondria for the assay of complex IV activity Total ubiquinol cytochrome c oxidoreductase activity was assayed in the presence of 100 uM cytochrome c 75 mM potassium phosphate buffer pH 7 5 200 uM decylubiquinol 1 5 mM KCN 5 uM rotenone 0 25 mM EDTA and 1 mg mL BSA Antimycin resistant ubiquinol cytochrome c oxidoreductase activity was assayed in the same medium with the addition of 5 g mL antimycin Complex IV activity was measure
69. n ou deux genes nucl aires de r f rence ex B2M et ou ATP5B 11 4 Choix des amorces D nomination Position des j ee a Taille de lt S quence nucl otidique 5 3 du gene amorces amplicon For mt 7017 TACGTTGTAGCCCACTTCCACT COXI a 208 pb Rev mt 7224 AGTAACGTCGGGGCATTCCG NDA For mt 11297 ACTCTCACTGCCCAAGAACT 205 pb Rev mt 11501 GTGTGAGGCGTATTATACCA P F 112 CAGCCTATTCTGCCAGCC B2M or exon 3 239 pb Rev exon 3 113 CAATGTTCTCCACATAGTGAGGG 1 2 Forward ou sens Reverse ou antisens position du nucl otide en 5 de l amorce sur l ADNmt 11 5 Mat riel Plasmides recombinants talons pour chaque g ne d int r t COXI ND4 et B2M la concentration de 10 copies ul IQ SYBR Green supermix Bio Rad DNA away Surface Decontaminant Thermo Scientific H 0 DEPC Pipettes de pr cision mLine Biohit 2 10 20 100 et 1000 ul Sartorius Pointes filtres ART Softfit L 10 ul 20ul 100 ul et 1000 ul VWR Microtubes 1 5 ml DNAse free Safelock Eppendorf Bloc froid Appareil de PCR quantitative MyiQ Real Time PCR system Bio Rad Plaque et film optique adapt s l appareil de qPCR Multiplate Low Profile plates white et Microseal C Optical Seal Bio rad 1 6 Protocole op ratoire 1 6 1 Courbes d talonnage Les ADN de plasmides COXI ND4 et B2M 10 copies ul sont dilu s au 1 10 en cascade de mani re a obtenir des concentrations de 10 10 10
70. nate cytochrome c oxidoreductase activity combined II III respectively These results show that complex III activity is not reliably measured in isolated beef heart mitochondria Since their implementation in clinical practice standardized protocols have also been applied to biopsies from patients who were later deemed to be free from specific disease These samples were a posteriori considered as controls Three different diagnostic centers gathered a sufficient number of these control samples to define the range of normal values in muscle liver and cultured fibroblasts Table 3 Interestingly the range of normal values ap peared similar in the three centers despite the absence of proper inter laboratory quality control process Furthermore in each cen ter the standard deviation of control complex III or combined I III and II III activities was similar to that observed with the other respiratory complexes activities The unreliability of the evaluation of complex III activity therefore appeared to be essentially confined to the very active beef heart mitochondria In addition to validate the new protocols we tried them on a dozen cultured skin fibro blasts with previously identified defects in the respiratory chain complexes In each case the previously identified defect was con firmed with the new standardized protocols 4 Discussion 4 1 Standardized procedures are indispensable for the improvement of the screening an
71. ncuber les cuves 37 C durant 5 min dans le spectrophotom tre thermostat 3 D marrer la r action avec 100 ul de 2 mM NADH gard temp rature ambiante 4 Lecture toutes les 15 secondes durant 3 minutes Les 2 cuvettes correspondant au m me chantillon sont lues en m me temps On peut lire 4 cuvettes en m me temps Si la croissance est trop rapide non lin aire refaire le dosage avec moins de tissu Calcul 1 L activit sp cifique est calcul e et rendue en nanomoles min mg de prot ines 2 Le coefficient d extinction utilis pour le cytochrome c est 18 5 3 Le facteur de correction est donc 1351 4 pour 40 ug de prot ines dans l essai homog nat et 13514 pour 4 ug de prot ines dans l essai mitochondries isol es Dosage de l activit Il Ill succinate cytochrome c oxydo r ductase Principe Les complexes Il et Ill de la cha ne respiratoire permettent l oxydation du succinate en fumarate et transferent les lectrons au cytochrome c Cette activit est valu e par l augmentation de l absorbance du cytochrome c r duit a 550 nm L oxydation du cytochrome c r duit par le complexe IV est inhib e par le cyanure de potassium KCN En pratique 6 determinations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d une m me s rie soit 6 dosages Composition du milieu de r action 20 mM K Phosphate pH 7 5 20 mM succinate 100 uM cytochrome c 1 mM KCN 100 uM ATP
72. ntal data underlying the proposed protocols an open access website was created Access to the complete set of data was considered important for a widespread standardization procedure It also might be useful to biologists with specific questions All experimental results in French as well as proposed assay procedures in French and Eng lish were therefore posted at http Ibbma univ angers fr fmdn an open access website of one of the French network centers The experimental data represent 28 Excel documents organized as seven documents one for each activity respiratory complex I II IT and IV combined activities I III and II III and citrate syn thase containing each four documents one for each tissue beef heart mitochondria mouse muscle homogenate human muscle homogenate and human skin fibroblasts suspension Only the most salient results are commented hereafter 3 3 Different homogenization buffers resulted in different mitochondrial activities Three different homogenization buffers were used in the differ ent laboratories of the French network These buffers have been previously described Letellier et al 1992 Lomb s et al 1991 Rustin et al 1994 They share similar pH and osmolarity but have different composition Buffer CCA is 250 mM sucrose 40 mM KCI 2 mM EGTA 1 mg mL fatty acid free BSA and 20 mM Tris HCI pH 7 2 Rustin et al 1994 Buffer MAN is 225 mM mannitol 75 mM sucrose 0 1 mM E
73. od 3 Results 3 1 The diversity of the protocols resulted in striking differences in mitochondrial activities Aliquots of a common preparation of isolated beef heart mito chondria were sent to all the French centers that were performing biochemical evaluation of mitochondrial activities All but one of these centers sent back the mitochondrial activities observed using their usual protocols Table 1 These protocols varied with respect to temperature homogenization buffer and assay medium compo sition Evaluation of the protein content was consistent whatever the method used for its measurement In contrast as previously re ported in similar analyses Gellerich et al 2004 Kirby et al 2007 the differences of respiratory chain assays protocols had striking consequences on the range observed for each individual activity As an example the highest activity measured for citrate synthase was 8 6 times the lowest measurement Table 1 Furthermore the ratios between activities also varied greatly between centers likely due to the heterogeneous impact of the variability in the pro tocols used Table 1 For example the highest ratio of complex III activity to citrate synthase activity was 9 7 times the lowest ratio This initial evaluation convinced the network members of the need to find and apply standardized protocols in order to allow compar ison between centers and to set up a quality control 3 2 To allow sharing the experime
74. oins la PCR est efficace en pratique on consid re qu une pente inf rieure 3 6 c est dire 90 d efficacit n est pas acceptable Les efficacit s de chaque chantillon d une s rie de quantification devront tre comparables pour une interpr tation correcte des donn es entre elles Pour corriger la diff rence d efficacit des chantillons l int rieur d une s rie le nombre de copies de chaque chantillon d int r t sera rapport pour chaque gene quantifi la moyenne des copies de deux ADNs contr les 1 2 4 L optimisation du programme de q PCR des mises au point sont n cessaires pour obtenir une qualit et une efficacit de PCR maximales Etant donn que les conditions optimales de mesure ne sont pas transf rables d un appareil de qPCR l autre les chantillons devront tre analys s sur le m me appareil qui a servi pour les mises au point pr alables L optimisation concerne les param tres suivants Sp cificit de l amplicon elle devra tre v rifi e par PCR classique d p t sur gel de l amplicon valuation de la taille et s quen age s quence appropri e temp rature d hybridation T4 des amorces et concentration de MgCl elles devront tre optimis es pour obtenir 1 une courbe de fusion sp cifique pour chaque produit de PCR 2 des gammes d talonnage avec une efficacit maximale pente la plus proche de 3 33 ll Mat riel et M thodes II 1 E
75. olubility in experimental media du manuel Oroboros Cliquer sur Calibrate S lectionner la deuxi me chambre en cliquant dessus puis recommencer la m me op ration F5 Dans l onglet en bas de l cran choisir flux per volume corrected 4 Preparation des cellules A temp rature ambiante Chauffer la digitonine dilu e dans l eau 95 C pendant 2 minutes 30 agiter et la laisser refroidir a temp rature ambiante Trypsiner les cellules 3 5 millions de cellules par oxygraphie en double soit 2 T75 Stopper la trypsine avec du PBS 5 SVF compter et centrifuger 800 rpm 5 minutes Retirer le PBS SVF et conserver les cellules en culot sec Reprendre le culot sec cellulaire avec 50 ul 1 0 cellules de tampon de respiration BSA Ajouter 15 ug soit 3 ul de digitonine par 10 cellules incuber sous agitation douce agitateur a bascule pendant 2 minutes 30 Ajouter QSP 4 volumes de tampon de respiration BSA Centrifuger a 800 g pendant 2 minutes 30 Reprendre les cellules dans 200 ul de tampon de respiration BSA 5 Oxygraphie Cliquer sur F7 pour d connecter reconnecter l oxygraphe S lectionner le type d analyse d sir 37 C pour cellules ou mitochondries isol es Cliquer sur connect La fen tre Edit Experiment appara t Indiquer le nom du patient dans l onglet titre puis le nombre de cellules le tampon utilise injecter les 200 ul de suspension cell
76. one oxydo r ductase Principe Le complexe de la cha ne respiratoire permet l oxydation du NADH en NAD son activite sera donc evaluee par la disparition du NADH qui absorbe a 340 nm L accepteur naturel des lectrons du complexe est le coenzyme Q ou ubiquinone Cette mol cule tres hydrophobe est remplac e dans l essai par la d cylubiquinone beaucoup plus hydrophile L activit parallele non respiratoire d oxydation du NADH due a l activit cytochrome bs oxydo r ductase est insensible a la rotenone inhibiteur sp cifique du complexe Elle est mesur e par un dosage parallele en presence de rotenone L activit sp cifique du complexe est donc la partie sensible la rotenone de l activit NADH oxydase totale Elle est mesur e par la diff rence entre l activit totale et celle resistante a la rotenone En pratique 6 determinations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d une m me s rie soit 12 dosages Composition du milieu de r action 100 uM NADH 100 uM d cylubiquinone 50 mM K Phosphate pH 7 5 3 5 mg mL d albumine bovine Tissu 40 ug de prot ines Surnageant post nucl aire de foie ou muscle ou 4 ug de mitochondries isol es Inhibition par 12 5 uM rotenone Preparation du milieu de reaction 1 Dans un tube de 50 mL preparer le m lange pour effectuer 7 dosages soit 14 cuves globale 2 Dans une cuvette de 2 mL mettre 2045 uL du milieu de reaction et ajouter 44
77. or muscle and either 4 ug beef heart mitochondria 50 ug human muscle homoge nate or 30 ug suspension of sonicated human fibroblasts Activities were expressed as nanomoles cytochrome c oxidized per minute per milligram protein The sensitivity of respiratory complex IV to phosphate concentration was striking with a sharp maximum of activity in both human muscle and skin fibroblasts It was less pronounced with isolated beef heart mitochondria strate concentration gave rise to two exponential decays The rel evant measure which is the initial slope of the first exponential was difficult to accurately evaluate This was particularly obvious with isolated beef heart mitochondria in the case of complex III and IV activities Fig 4 Quasi linear kinetics during at least 2 min could however most often be obtained by reducing the amount of protein in the assay When dealing with the two most active respiratory complexes III and IV in isolated mitochondria this was only possible with minimal amount of protein Fig 4 3 7 Difficulty to find a range of protein content in the assay with linear relationship with activity A linear relationship between the amount of protein and the ob served activity is ideal to define and then compare specific activi ties in a diagnostic assay It was however difficult to obtain with most assays of the respiratory chain complexes This was particu larly the case with the very active beef heart mitochondria fo
78. qui forme du citrate a partir de oxaloacetate et de l ac tylCoA Cette activit est employ e pour valuer la quantit de mitochondries dans les tissus Le CoA r duit CoA SH form lors de la r action r agit avec le 5 5 dithiobis 2 nitrobenzoic acid DTNB pour donner du TNB qui absorbe sp cifiquement 412 nm L activit de la citrate synthase est donc mesur e en suivant augmentation de l absorbance 412 nm La ligne de base est mesur e pour pouvoir soustraire une reaction spontanee de transfert d lectrons En pratique 6 determinations 5 patients et 1 contr le peuvent tre effectu es au cours d une m me s rie soit 6 dosages Composition du milieu de r action 100 uM DTNB 100 mM Tris HCI pH 8 1 300 uM acetyl CoA 500 uM oxaloacetate 0 1 Triton X100 Tissu 40 ug de prot ines surnageant post nucl aire ou suspension cellulaire ou 4 ug de mitochondries purifi es Preparation du milieu de reaction 1 Dans un tube de 15 mL pr parer le m lange pour effectuer 7 dosages R actifs Quantit Quantit chantillon EC RSS 2 Dans une cuvette de 1 mL mettre 930 uL du milieu de reaction et ajouter 20 uL d homog nat tissulaire ou de suspension cellulaire pr par une concentration finale de prot ines de 2 mg mL ou de mitochondries de c ur de b uf dilu es 0 2 mg ml soit 1 200 M langer R action 1 Lecture au spectrophotom tre 37 C longueur d onde 412 nm Cal
79. r which we have never found conditions that conferred a linear rela tionship However in tissues with less active respiratory chain en zymes muscle homogenates or fibroblasts we could define a range of protein content per assay where the relationship between protein content and activity was close to linear That range was al ways narrow because it was the result of a compromise between linearity and the need to observe significant activity Fig 5 3 8 Standardized protocols have been applied in several French centers and have given rise to independent sets of control values During the months following the implementation of the stan dardized protocols in clinical practice in La Salp tri re Hospital in Paris a sample of the large stock beef heart mitochondria was included whenever patient samples were analyzed Reproducibil ity of the protocols could therefore be evaluated using the repeated analyses of the same beef heart mitochondria preparation Table 3 The standard deviation for most assays was close to 10 of the mean activity thus showing their good reproducibility This was not true for the assays of complex III activity either in isola tion or as part of a combined activity The standard deviation ex pressed as of the mean activity was 57 41 and 26 for the antimycin sensitive ubiquinol cytochrome c activity complex III rotenone sensitive NADH cytochrome c oxidoreductase activ ity combined III and succi
80. rate from that observed after its addition 2 wavelength used for the assay the extinction coefficient L mmol cm used were 6 2 for NADH at 340 nm 19 1 for DCPIP at 600 nm 18 5 for cyt c at 550 nm and 13 6 for TNB thionitrobenzoic acid at 412 nm start compound used to start the reaction reading duration of the reaction measurement expressed as minutes duration of reading is 1 min for beef heart mitochondria tissue amount of tissue used for the assay expressed as micrograms of proteins per assay calculation factor factor used to transform the recorded optic density into nanomoles min 1 mg prot the numbers between brackets are the amount of tissue or the calculation factor used for isolated beef heart mitochondria F Medja et al Mitochondrion 9 2009 331 339 335 Beef heart mitochondria 4000 O0 amp 3000 S 2000 gt 1000 0 0 25 50 75 100 Phosphate Human muscle homogenate 80 bn E 60 gt TT 5 5 40 T gt 20 g E 0 0 25 50 75 100 Phosphate Human sonicated fibroblasts 80 IV activity nmol min mg A 0 25 50 75 100 Phosphate Fig 2 Influence on complex IV activity of the phosphate concentration used in the assay medium Complex IV activity was measured as the rate of cytochrome c oxidation at 550nm in the presence of various concentrations of potassium phosphate buffer pH 7 0 Phosphate 80 uM of reduced cytochrome c 100 uM f
81. re considered unreliable in these cell preparations data obtained on only three samples ing consistent and reproducible testing of mitochondrial function in patients with a suspected mitochondrial disorder Acknowledgements This work has been supported by grants from INSERM the AFM Association Francaise contre les Myopathies and the GIS Mala dies rares We thank Dr Nigel Clarke for his most useful comments on the manuscript Appendix A Supplementary data Supplementary data associated with this article can be found in the online version at doi 10 1016 j mito 2009 05 001 References Aur K Mamchaoui K Frachon P Butler Browne G S Lomb s A Mouly V 2007 Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene Neuromusc Disord 17 368 375 B nit P Goncalves S Dassa E P Bri re J J Martin G Rustin P 2006 Three spectrophotometric assays for the measurement of the five respiratory chain complexes in minute biological samples Clin Chim Acta 374 81 86 Birch Machin M A Shepherd I M Watmough N J Sheratt H S A Bartlett K Darley Usmar V M Milligan D W A Welch R J Aynsley Green A Turnbull D M 1989 Fatal lactic acidosis in infancy with a defect of complex III of the respiratory chain Pediatr Res 25 553 559 Chretien D Bourgeron T R tig A Munnich A Rustin P 1990 The measurement of the rotenone sensitive NADH cytochrome c redu
82. rne il existe une relation lin aire entre les valeurs de Ct Cp obtenues exp rimentalement a partir des diff rentes dilutions d un chantillon de calibrateur plasmide et le log de la concentration de chacune des dilutions exprim e en nombre de copies par volume total en ul de m lange r actionnel L quation de la droite d talonnage est Ct ou Cp 1 logE x logT logK logE Ct y valeur du cycle seuil crossing point obtenue exp rimentalement To x quantit initiale d ADN en nombre de copies 20 ul de r action 1 logE pente de la droite E Efficacit de la qPCR L efficacit maximale de 100 est obtenue pour E 2 et la pente de la droite est alors gale 3 33 Exp rimentalement on tol re une efficacit entre 1 85 et 2 Figure 4 pente 3 305 pour une efficacit de 2 01 y 3 306x 37 19 r 2 0 999 UseReplicates Selected Wells 3 4 5 If Toggle Axis Log Quantity 4 Figure 4 Droite d talonnage obtenue partir de 5 dilutions de plasmide calibrateur 10 10 10 10 10 copies ul Plus le coefficient de r gression est proche de 1 plus la gamme est lin aire sur l ensemble des points Cette droite d talonnage renseigne surtout sur l efficacit de la qPCR E En effet durant la phase lin aire la quantit d ADN doit th oriquement doubler a chaque cycle avec une efficacit maximale de 100 E 2 Plus la pente n gative est faible m
83. rst mitochondrial pellet which was homogenized in 0 27 M sucrose 2 mM Tris HCI pH 7 4 and submitted to the same two low speed high speed centrifugations The final mitochondrial pellet was homogenized at a concentration of 40 mg mL and the mitochondrial suspension was frozen in li quid nitrogen as small beads of 50 uL volume and stored at 80 C Yield usually was 4 6 g of mitochondrial proteins for one heart Mouse quadriceps was elected as an easily accessible mate rial allowing the analysis of homogenates preparation It was ob tained from normal animals anesthetized with 2 isoflurane inhalation and kept at 80 C before use Muscle was homogenized with a glass glass Potter in 9 vol of homogenization buffer typi cally 50 mg of muscle in 450 uL of buffer and spun down at 650 g during 20 min at 4 C The supernatant was kept and the pel let was suspended in 10 vol of homogenization buffer and submit ted to the same procedure Both supernatants were pooled and used for the assays Control human muscle and fibroblasts were obtained through the AFM tissue repository bank in accordance to the local ethics committee Both muscle fragments and skin biopsy were obtained during surgery of patients without neuromuscular disease Muscle homogenates were prepared in a manner similar to the mouse muscle homogenates Fibroblasts were cultured in a high glucose medium supplemented with 1 mM pyruvate 50 ug mL uridine and 10 FCS They were h
84. se Succinate d shydrog nase Cerveau de souris Cytochrome c oxydase 75 minutes Cytochrome c oxydase Succinate d shydrog nase Cerveau de souris Cytochrome c oxydase 75 minutes Cytochrome c oxydase Succinate d shydrog nase Cerveau de souris Cytochrome c oxydase 45 minutes 75 minutes Cerveau de souris Succinate d shydrog nase 45 minutes 75 minutes Conclusion Pr paration tissulaire Coupes au cryostat pas de fixation Qualit des coupes paisseur H t rog n it intra tissulaire des activit s Pr ciser les cibles d int r t Activit SDH gt gt COX voire gt gt gt COX Adapter les dur es d incubation Co marquage COX SDH d abord COX puis SDH KCN DAB est un carcinog ne Protocole d utilisation DAB source www unil ch webdav site unisep shared Risques pour l homme et pour l environnement Dispersion giclures irritant pour la peau les voies respiratoires et les yeux Nocif par ingestion Canc roge ne Suspect CMR Toxique pour les milieux aquatiques Mesures de protection et regles de comportement Porter blouse lunettes gants appropri s masque avec filtre sp cifique chaussures ferm es Travailler sous une chapelle type Sorbonne Bien lire les tiquettes recommandations R et S CMR oA A Wi OBLIGATOIRE C onduite tenir en cas de danger Renversement de petites quantit s neutraliser
85. t respiratory complexes and part of the substrates products are lo cated in a membrane environment reliable protocols could be developed They are progressively implemented in the French diag nostic centers Three centers have now used them for over a year and have gathered enough results from control samples to allow analyzing reproducibility and reliability In this paper we summa rize our results from testing the previous protocols to defining optimal conditions for measurement of each respiratory chain complex Finally we discuss the compromises that were required to develop protocols suitable for use in clinical diagnostic laboratories 2 Material and methods 2 1 Preliminary discussion All diagnostic centers within the French network contributed to preliminary discussions about the diverse protocols of sample preparation and assays in use The persons involved at the time in the discussion were from the diagnostic centers that are located in Angers Dr Olivier Douay Dr Gilles Simard CHU d Angers Bor deaux Dr Thierry Letellier Monique Malgat Pr Jean Pierre Mazat Universit Bordeaux 2 Caen Dr St phane Allouche CHU de la C te de Nacre Grenoble Pr Jo l Lunardi CHU de Grenoble Lille Pr Bernard Sablonni re H pital Roger Salengro Lyon Dr B n dicte Mousson de Camaret Hospices Civils de Lyon and Dr Cather ine Godinot Claude Bernard University Lyon Marseille Dr Marie France Montfort CHU La T
86. tissue were shown Experimental data and proposed protocols have been posted on a free access website Their subsequent use in several diagnostic centers has improved consistency for all assays 2009 Elsevier B V and Mitochondria Research Society All rights reserved Keywords Diagnostic test assessment Mitochondrial disorders Respiratory chain complexes 1 Introduction 1 1 The need for standardized enzymatic investigations of patients with mitochondrial diseases Abbreviations AFM Association Fran aise contre les Myopathies III respiratory complex III i e antimycin sensitive ubiquinol cytochrome c oxidoreductase EC 1 10 2 2 Total III ubiquinol cytochrome c reductase in the absence of antimycin Mitochondrial diseases defined as the diseases that are due to BSA bovine serum albumin IV respiratory complex IV i e cytochrome c oxidase EC 1 9 3 1 I respiratory complex I i e rotenone sensitive NADH ubiquinone oxidoreductase EC 1 6 5 3 SDH succinate dehydrogenase proximal part of respiratory complex II Il respiratory complex II i e succinate ubiquinone oxidoreductase activity EC 1 3 5 1 I III rotenone sensitive NADH cytochrome c oxidoreductase I II succinate cytochrome c oxidoreductase CS citrate synthase dUb decylubiquinone succ succinate DCPIP 2 6 dichlorophenolindo phenol dUb H gt decylubiquinol cyt c cytochrome c red cyt c reduced cytochrome c ACOA acetylCoenzyme A OA
87. to favor the specific antimycin sensitive activity The mechanisms underlying the biphasic effect of substrate concentration were probably diverse and their amplitude and position in substrate concentration depended on the tissue They were particularly striking with murine muscle homogenate Fig 3 but less pro nounced for other tissues In the case of respiratory complex IV the reaction rate initially followed a hyperbolic relationship to increasing concentrations of reduced cytochrome c followed by substrate inhibition Fig 3 There again the extent of that behavior depended on the tissue most probably in connection to the level of enzyme activity It was much less pronounced in human sonicated fibroblasts than in human muscle Fig 3 3 6 Difficulty to obtain linear kinetics as a function of time In most cases the high specific activity of the respiratory com plex and possibly its high concentration as compared to the sub IV III II III CS 7 0 75 7 5 8 0 50 25 for fibros 50 20 100 1 mM KCN 12 5 M 1mM KCN rot 100 uM red cytc 200 uM NADH 20 mM succ 100 uM DTNB 50 for 100 uM cyt c 100 uM cyt c 300 uM ACoA fibroblasts 500 uM OA 1 mg mL BSA 100 uM ATP 2 mg mL 0 1 Triton BSA X100 550 550 550 412 rot Baseline Tissue NADH cyt c OA 3 3 3 4 40 1 40 4 40 4 40 4 1351 4 54 054 1351 4 13 514 1351 4 13 514 1838 2 18 382 Table 2 Conditions used in the
88. trophotometric assays of the mitochondrial respiratory chain of the diversity of protocols used in the different French centers Table 1 Centers 1 2 3 4 5 Activities I 637 763 2378 860 652 SDH 552 988 1890 938 531 II Ill 2244 544 1003 872 790 III 589 2774 2122 1632 IV 2917 3337 3930 1636 4530 CS 4517 2036 3697 3248 1997 Ratios I CS 0 14 0 37 0 64 0 26 0 33 SDH CS 0 12 0 49 0 51 0 29 0 27 HI CS 0 29 0 75 0 65 0 82 IV CS 0 65 1 64 1 06 0 50 207 I I III 0 28 1 40 257 0 99 0 83 I IV 0 22 0 23 0 61 0 53 0 14 I IV 0 18 0 71 1 30 0 36 6 7 8 9 Range 697 960 637 2378 780 1190 358 531 1890 476 1200 550 792 476 2244 2200 3745 1101 589 3745 2010 3070 2200 1003 1003 4530 1560 1330 527 1793 527 4517 0 45 0 72 0 14 0 72 0 50 0 89 0 68 0 12 0 89 1 41 2 82 2 09 0 29 2 82 1 29 231 4 17 0 56 0 50 4 17 1 46 0 80 0 28 2 37 0 35 0 31 0 14 0 61 1 09 1 22 0 50 0 18 1 30 Activities are expressed as nanomoles per minute and milligram protein I rotenone sensitive NADH ubiquinone oxidoreductase activity SDH succinate dehydrogenase activity proximal part of respiratory complex II II III succinate cytochrome c oxidoreductase activity III antimycin sensitive ubiquinol oxidoreductase activity IV cytochrome c oxidase activity CS citrate synthase activity Range range of values between the different centers numbered from 1 to 9 data not available 334 Beef heart mitochondria
89. ubes eppendorf avant ouverture pour faire tomber les gouttes au fond aucune ouverture brusque des tubes en particulier a proximit d autres tubes ouverts changement de gants apres chaque manipulation de plasmides 11 3 Choix des g nes quantifi s Lors de cet atelier l amplification a port sur deux g nes mitochondriaux MT CO1 COXI g ne codant pour la cytochrome oxydase sous unit du complexe IV de la cha ne respiratoire et MT ND4 ND4 gene codant pour la mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4 sous unit 4 du complexe un gene nucl aire B2M gene codant pour la Beta 2 microglobuline Pour le diagnostic des anomalies qualitatives et quantitatives de ADNmt le protocole de qPCR des chantillons de patients d pendra du type d anomalie recherch e 1 d l tions h t roplasmiques de l ADNmt coexistence au sein d un tissu d ADNmt d l t et d ADNmt non d l t d termination du nombre de copies de deux g nes extra d l tion exemple 16S et ND2 pour la quantification de ADNmt total et de deux g nes intra d l tion ex COXI et ND4 pour la quantification de l ADNmt delete a condition que la deletion englobe ces deux genes sinon on choisit deux autres g nes intra d l tion par exemple ND4 et ND5 pour la 1 d l tion comnune 2 depletion de l ADNmt d termination du nombre de copies de trois g nes mitochondriaux ex 165 ND2 et COXI rapport es a u
90. ulaire dans la cuve adapter le capuchon doucement et v rifier l absence de bulles dans la chambre Ajouter 10 pi de pyruvate 2 5 mM puis 20 ul de Malate 5 mM substrats du complexe Attendre 2 3 minutes au moins la stabilisation du flux ligne rouge introduire 20 pl de NAD 0 50 mM puis 20 ul d ADP 1 50 mM Attendre d obtenir un plateau pour le flux activation de la phosphorylation Ajouter 25 ul de cytochrome c 4 uM Attendre d obtenir un plateau pour le flux int grit membranaire Ajouter 20 pi de glutamate 5 mM Attendre la stabilisation du flux ligne rouge complex I Introduire 40 pl de succinate 10 mM Attendre d obtenir un plateau pour le flux complexe Il Introduire 4 pi de rotenone 5 uM Attendre d obtenir un plateau pour le flux inhibition du complexe l Ajouter 2 pl d oligomycine 8 ug ml Attendre d obtenir un plateau pour le flux inhibition ATP synthase Ajouter 2 ul de FCCP 1 uM Attendre d obtenir un plateau pour le flux d couplant Introduire 4 pl d Antimycine 2 ug ml Attendre d obtenir un plateau pour le flux inhibition du complexe III Introduire 20 pl d Ascorbate 4 mM d s que le flux est stable ajouter 20 ul de TMPD 0 3 mM complexe IV D s que le flux est stable Introduire 20 ul de KCN 2 mM et 20 ul d Azide 1 mM Attendre d obtenir un plateau pour le flux inhibition du complexe IV A la fin de la s quence pr lever 4x400 pl dans chaque cham
91. undertake automation of the assays within the French network for the two following rea sons We considered that automation would not bring significant time saving to justify the required supplemental technical verifica tions as the manual preparation of samples and reagents repre sents at least half the time spent for the measurement in our present protocol where we simultaneously assay five diagnostic samples and a control In addition the inter assay variability ob tained with our standardized protocols is close to that reported with automation procedures Our choice of first assaying beef heart mitochondria and mouse muscle aimed at sparing control human muscle and cultured fibro blasts It however illustrated the variability of respiratory chain activities and their ratios in different tissues Table 3 In the end beef heart mitochondria proved a suboptimal control sample for establishing clinical diagnostic tests because this tissue exhib ited behaviors due to high enzyme activity levels that were not encountered with human tissue preparations This was also true for mouse muscle whose kinetic behavior was often significantly different from that of human muscle for example in the inhibition of complex III activity by high concentration of cytochrome c see Fig 3 Most of the difficulties encountered probably stemmed from the high specific activities of beef heart isolated mitochondria and mouse muscle Their analysis could therefore b
92. ycine Diluer la poudre d antimycine A d un Poudre au cong lateur A Poudre Sigma A _ flacon dans l thanol 95 a raison de 20 C 8674 0 4 mL mg 2 5 mM rotenone Peser la poudre de rotenone et la diluer Poudre au cong lateur Poudre Aldrich R200 dans le m lange thanol 95 DMSO 20 C 1 FW 394 4 50 50 a raison de 1 014mL mg Aliquotes de 200 uL REACTIFS GARDES AU REFRIGERATEUR Rangement 5 mM DCPIP Peser 72 5 mg de la poudre de Poudre dans le 2 6 dichloroph nol DCPIP diluer avec 50 mL d eau dessiccateur indoph nol de sodium distill e Marquer la date car le temp rature ambiante Poudre Sigma D 1878 FW m lange ne se garde que 1 mois 290 1 corrig 326 1 50 mM K phosphate pH 7 0 Peser 3 4 g de poudre K et diluer Poudre temp rature potassium dihydrog no dans 500 mL d eau distill e peser ambiante phosphate K1 Prolabo 4 35 g de poudre K et diluer dans 33611 265 FW 136 09 Di 500 mL d eau distill e M langer les potassium hydrog no solutions sous contr le du pH en phosphate k2 Prolabo ajoutant la solution acide K1 dans 33612 268 FW 174 18 la solution alcaline K2 jusqu obtention du pH 7 0 Aliquotes de 50 mL 500 mM K phosphate pH 7 5 Peser 34 g de poudre K et diluer Poudre temp rature potassium dihydrog no dans 500 mL d eau distill e peser ambiante phosphate K1 Prolabo 43 5 g de poudre K et diluer dans 33611 265 FW 136 09 Di 500 mL d eau distill
93. ycles de PCR effectu s Fl Phase lexponentiellel Phase plateau I I I I I Bruit de Threshdia cycle Ct fond _ EE Figure 2 Courbe de d tection de la fluorescence en fonction du nombre de cycles de PCR 1 2 Caract ristiques de la qPCR 1 2 1 Le cycle seuil ou crossing point le concept de cycle seuil est la base d une quantification pr cise et reproductible A chaque cycle l intensit de la fluorescence est proportionnelle la concentration d amplicons produits Le cycle seuil Ct threshold cycle repr sente le nombre de cycles requis o le signal d mission de fluorescence est significativement plus lev que la ligne de base Figure 2 Le cycle seuil est galement appel crossing point Cp et correspond au nombre virtuel de cycles o chaque chantillon contient le m me nombre de produits de PCR Plus il y a de copies d ADN amplifier moins lev sera le nombre de cycles requis pour atteindre le Ct ou le signal d mission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus lev que le bruit de fond Puis au cours de la phase exponentielle la quantite d ADN pr sent double a chaque cycle 1 2 2 La courbe de fusion la fin de la qPCR une courbe de fusion est r alis e Cette tape consiste en une augmentation progressive de la temperature du bloc du thermocycleur avec une lecture de la fluorescence a chaque degr Au cours de cette tape l ADN double
94. zyme du cycle de Krebs toutes ces anomalies conduisant a une diminution de la production des quivalents r duits utilis s par la mitochondrie 2 Preparation des r actifs 2 A Liste et r f rence des r actifs ADP SIGMA A7699 Antimycine A SIGMA A8674 Ascorbate SIGMA A7631 Azide SIGMA S2002 BSA SIGMA A6003 Cytochrome c SIGMA C7752 Digitonine SIGMA D141 FCCP SIGMA C2920 Glutamate SIGMA G1251 KCI SIGMA P3911 KCN SIGMA 20781 0 KH2PO4 SIGMA P9791 Malate SIGMA M1000 Mannitol SIGMA M9647 MgCl2 SIGMA M1028 NAD ROCHE 10127965001 Oligomycine SIGMA 04876 Pyruvate SIGMA P5280 Rot none SIGMA R8875 Succinate SIGMA S3674 TMPD SIGMA T7394 2 B Periodicite La solution m re de respiration est stable trois mois a 4 C le tampon de respiration contenant de la BSA est stable 1 mois Les substrats et inhibiteurs se pr parent tous les trois mois except s le KCN le FCCP l antimycine A et l oligomycine pr parer tous les mois Tous les inhibiteurs dilu s dans l thanol sont conserver en tubes bouchon vis avec joint pour viter toute fuite ou vaporation 2 C Tampon de respiration Tampon de respiration sans BSA qsp 500 ml KH PO4 10 mM 681 mg Mannitol 300 mM 2 33 mg KCI 10 mM 373 mg MgCl 5 mM 2 50 ml Ajuster le pH a 7 4 avec du KOH conservation 3 mois a 4 C Tampon de respiration BSA BSA 1 mg ml 50 mg Q

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