HIV1/2
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1. le LP 35 valider l option param tre lavage Choisir un n de test entre 1 et 20 et valider Choisir la proc dure de base 82 puis le mode plaque Rentrer un temps de contact minimum de 04 et un temps de lavage de fond de 05 Une fois les r glages effectu s le laveur revient au mode lavage CALCUL ET INTERPR TATION DES RESULTATS La pr sence ou l absence des anticorps anti VIH1 et ou VIH2 est d termin e en comparant pour chaque chantillon l absorbance enregistr e celle de la valeur seuil calcul e 1 Calculer la moyenne des absorbances pour le s rum de contr le seuil DOR4 DO B1 DO C1 DO D1 DOR4 3 2 Calcul de la valeur sevil La valeur seuil sera d termin e par le rapport DOR4 10 3 Validation de l essai Le s rum de contr le n gatif doit tre inf rieur 70 de la valeur seuil DOR3 0 7 VS VS La moyenne des s rums de contr le seuil doit tre sup rieure 0 80 DORA gt 0 8 Facultatif le rapport DOR5 DORA doit tre sup rieur ou gal 1 3 Cette norme optionnelle est applicable seulement quand la lin arit du lecteur vtilis est sup rieure a 3 000 4 Interpr tation des r sultats les chantillons dont les absorbances sont inf rieures la valeur seuil sont consid r s n gatifs d apr s le test GENSCREEN HIV1 2 version 2 Toutefois les r sultats situ s juste au dessous de la valeur seuil VS 10 lt DO lt VS doivent tre interpr t s avec pr2. s optiques des cupules peut donner des r sultats erron s avec des densit s optiques sup rieures 0 100 en l absence de solution de r v lation Cependant ce ph nom ne n a pas t observ durant les valuations conduites sur 939 chantillons test s R F RENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 BARRE SINOUSSI F CHERMANN J C REY F et al Isolation of a T lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome AIDS Science 1983 220 868 871 2 AUZON M SONIGO P BARRE SINOUSSI F et al Molecular cloning of lymphadenopathy associated virus Nature 1984 312 757 760 3 CLAVEL F GUETARD D BRUN VEZINET F et al Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS Science 1986 233 343 346 4 CLAVEL F GUYADER M GUETARD D et al Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2 Nature 1986 324 691 695 5 BRUN VEZINET F ROUZIOUX C BARRE SINOUSSI F et al Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus LAV by ELISA in patients with acquired immunodeficiency syndrome or lymphadenopathy syndrome Lancet 1984 June 1253 1256 6 MATHIESEN T CHIODI F BROLIDEN P A et al Analysis of a subclass restricted HIV1 gp 41 epitope by omission peptides Immunology 1989 67 1 7 7 NORRBY E BIBERFELD G JOHNSON PR et al The chemistry of site directed serology for HIV Infections AIDS Res Human Retroviruses 1989 5 487 4
3. 6 43 51 DONDERO T J HU D J GEORGE HIV1 variants yet another challenge to public health The Lancet 1994 343 1376 SIMON F LY T D BAILLOU BEAUFILS A et al Sensitivity of screening kits for anti HIV1 subtypes O antibodies AIDS 1994 8 1628 1629 JANSSENS W HEYNDRICKX L FRANSEN et al Genetic and phylogenetic analysis of ENV subtypes G and H in Central Africa AIDS Res Hum Retrovirus 1994 10 877 879 GAOF YUE L ROBERTSON D L et al Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2 evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology J Virol 1994 68 7433 7447 o N foo 23 CE ul CE marking European directive 98 79 CE on in vitro diagnostic medical devices Marquage CE Directive europ enne 98 79 CE relative aux dispositifs m dicaux de diagnostic in vitro Marcodo CE Directiva europea 98 79 CE sobre productos sanitarios para diagn stico in vitro e EG Markierung Europ ische Richtlinie 98 79 EG ber In vitroDiagnostika Marchiatura CE Direttiva europea 98 79 CE relativa ai dispositivi medico diagnostici in vitro Marca o CE Directiva europeia 98 79 CE relativa aos dispositivos m dicos de diagn stico in vitro e CE m rkning Europa direktiv 98 79 EG om medicintekniska produkter l r in vitro diagnostik CEmaerkningen Europa direktiv 98 79 EF om medicinsk udstyr til in vitro diagnostik For in vitro diagnostic use
4. acide sulfurique 1N 28 ml 3 x 28 ml Feuilles adh sives pour microplaques 4 12 VALIDIT CONSERVATION La trousse doit tre gard e 2 8 C Chaque l ment de la trousse GENSCREEN HIV1 2 version 2 conserv 2 8 C peut tre utilis apr s une premi re ouverture jusqu la date de p remption indiqu e sur le coffret sauf indication sp cifique R1 Apr s ouverture du sachet sous vide les barrettes conserv es 2 8 C dans leur sachet d origine referm avec soin sont utilisables pendant 4 semaines R2 La solution de lavage dilu e peut tre conserv e 2 30 C pendant 2 semaines La solution de lavage concentr e R2 peut tre conserv e 2 30 C R7a R7b apr s reconstitution les r actifs conserv s 2 8 C sont utilisables pendant 4 semaines R8 R9 Apr s reconstitution les r actifs conserv s l obscurit sont utilisables 6 heures temp rature ambiante 18 30 C MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI Eau distill e Hypochlorite de sodium eau de javel et bicarbonate de sodium Pipettes multipipettes automatiques ou semi automatiques r glables ou fixes pour mesurer et d livrer 25 yl 50 yl 75 yl 80 yl et 100 yl Eprouvettes gradu es 25 ml 100 ml 1000 ml Conteneur de d chets contamin s Bain marie ou incubateur de microplaques thermostat 37 C 1 C Dispositif de lavage manuel semi automatique ou appareil de lavage pour plaque de microtit
5. 75 yl du premier chantillon en F1 75 yl du deuxi me chantillon en G1 etc En fonction du syst me utilis il est possible de modifier la position ou l ordre de distribution des contr les Homog n iser le m lange par 3 aspirations minimum avec la pipette de 75 pl ou en agitant la microplaque apr s l tape de pipetage est galement possible de d poser 100 pl d un chantillon pr alablement dilu au 3 4 ex 150 pl de s rum 50 pl de diluant N B Il est possible de v rifier visuellement la distribution des chantillons ce stade de la manipulation en effet apr s addition des chantillons le diluant qui est initialement violet vire au bleu cf chapitre 12 pour la v rification automatique V RIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DU DEPOT DES ECHANTILLONS ET DU CONJUGUE 5 Lorsque cela est possible couvrir d un film autocollant en appuyant bien sur toute la surface pour assurer l tanch it 6 Incuber la microplaque au bain marie thermostat ou dans un incubateur sec de microplaques pendant 30 5 minutes 37 1 C 7 Retirer le film adh sif Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour d chets contamin s contenant de l hypochlorite de sodium et ajouter imm diatement dans chacune d elles un minimum de 0 370 ml de solution de lavage Respecter un temps de trempage temps d attente minimum de 30 secondes Aspirer de nouveau R p ter le lavage au moins 2 fois soit un minimum de 3 lavages a
6. 93 McKEATING J A WILLEY R L Structure and fonction of the HIV envelope AIDS 1989 3 S35 S41 PASQUALI J L KIENY M P KOLBE H et al Immunogenicity and epitope mapping of a recombinant soluble gp 160 of the human immunodeficiency virus type 1 envelop glycoprotein AIDS Res Human Retroviruses 1990 6 1107 1113 NEURATH A R STRICK N TAYLOR P et al Search for eptiope specific antibody responses to human immunodeficiency virus HIV1 envelope glycoproteins signifying resistance to disease development AIDS Res Human Retroviruses 1990 6 1183 1192 NAIR B C FORD G KALYANARAMAN V S et al Enzyme immunoassay using native envelope glycoprotein gp 160 for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibodies J Clin Microbio 1994 32 1449 1456 ZAAUER H L EXEL OEHLERS P V KRAAUEVELDT T et al Early detection of antibodies to HIV1 by third generation assays The Lancet 1992 340 770 772 CONSTANTINE N T VAN DER GROEN G BELSEY E M et al Sensitivity of HIV antibody assays determined by seroconversion panels AIDS 1994 8 1715 1720 co o 4 ENGELBRECHT S DE JAGER G J VAN RENSBURG E J Evaluation of commercially available assays for antibodies to HIV1 in serum obtained from south african patients infected with HIV1 subtypes B C and D J Med Viroloogy 1994 44 223 228 5 COUROUCE A M et al Trousses de d pistage des anticorps anti VIH1 et VIH2 Spectra Biologie 1994
7. GUE V rification de la distribution des chantillons Apr s la distribution successive du diluant des chantillons R6 puis des chantillons il est possible de v rifier la pr sence des chantillons tester dans les cupules par une lecture spectrophotom trique 620 nm la densit optique d une cupule contenant un chantillon devra tre sup rieure 0 150 une DO inf rieure indique une mauvaise distribution de celui ci V rification de la pr sence de conjugu dans les cupules Apr s l tape de distribution du conjugu R7a R7b il est possible de v rifier sa pr sence dans les cupules par une lecture spectrophotom trique 620 nm la densit optique d une cupule contenant du conjugu devra tre sup rieure 0 100 une DO inf rieure indique une mauvaise distribution du conjugu dans cette cupule V rification du d p t de la solution de r v lation est possible de v rifier la pr sence de la solution de r v lation ros e par lecture automatique 490nm une cupule contenant la solution de r v lation doit avoir une densit optique sup rieure 0 100 une DO plus faible indique une mauvaise distribution de la solution de r v lation y a une diff rence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de r v lation ros e 13 PERFORMANCES les tudes de sensibilit du test GENSCREEN HIV1 2 version 2 ont t r alis es sur des chantillons positifs
8. Pour diagnostic in vitro Para diagn stico in vitro In vitroDiagnostikum Per uso diagnostico in vitro Para uso em diagn stico in vitro n vitro diagnostik n vitro diagnose Manufacturer Fabricant Fabricante Hersteller Produttore Fabricante Tillverkad av Fremstillet af Batch code Code du lot e C digo de lote Chargen Bezeichnung Codice del lotto C digo do lote Batch nr Batchkoden Storage temperature limitation limites de temp ratures de stockage Temperatura limite Lagerungstemperatur Limiti di temperatura di conservazione limites de temperatura de armazenamento Temperaturbegr nsning Temperaturbegraensning BIO RAD Bd Raymond Poincar 92430 MARNES LA COQUETTE T l 33 0 1 47 95 60 00 Fax 33 0 1 47 41 91 33 Catalogue number R f rence catalogue N mero de cat logo Bestellnummer Numero di catalogo N mero de cat logo Katalognummer Katalognummer Authorised Representative Repr sentant agr Representante autorizado Bevollm chtigter Distributore autorizzato Representante Autorizado Auktoriserad representant e Autoriseret repraesentant Expiry date YYYY MM DD Date de p remption AAAA MM JJ Estable hasta AAAA MM DD Verwendbar bis JJJ MM TT Da utilizzare prima del AAAA MM GG Data de expira o AAAA MM DD Utg ngsdatum r M nad Da
9. aboussures efc e les claboussures non acides doivent tre nettoy es compl tement avec une solution 5 minimum d hypochlorite de sodium eau de javel Les claboussures acides doivent tre nettoy es sec La zone d claboussure doit ensuite tre nettoy e avec une solution 5 6 minimum d hypochlorite de sodium Le mat riel utilis pour le nettoyage doit amp tre jet dans le conteneur de d chets contamin s puis limin selon les r gles propres cet effet voir pr cautions 8 7 NE JAMAIS UTILISER LE M ME R CIPIENT POUR DISTRIBUER LE CONJUGU ET LA SOLUTION DE R V LATION CONTROLER LA SOLUTION DE REVELATION ENZYMATIQUE TAMPON SUBSTRAT CHROMOGENE AVANT LA DISTRIBUTION Elle doit amp tre incolore L apparition d une coloration bleue dans les minutes suivant la reconstitution indique que le r actif est inutilisable et doit tre remplac En effet le tampon substrat le chromog ne la solution de r v lation et la solution d arr t peuvent tre contamin s par des ions m talliques Pour cette raison veillez utiliser de pr f rence des r cipients et du mat riel de distribution en plastique ou de la verrerie pr alablement lav e l acide chlorhydrique 1N soigneusement rinc e l eau distill e et s ch e LAVAGE est indispensable de respecter scrupuleusement les proc dures de lavage afin d obtenir les performances maximales du test Proc dures de lavage sur LP 35 Apr s avoir allum
10. alement l inactivation des virus VIH et du virus de l h patite B Eviter tout contact du tampon substrat du chromog ne et de la solution d arr t avec la peau et les muqueuses risques de toxicit d irritation et de br lures D autre part la manipulation et l limination des produits chimiques doivent tre effectu es selon les bonnes pratiques de laboratoire Certains r actifs contiennent de l azoture de sodium comme conservateur l azoture de sodium peut former des azotures de plomb ou de cuivre dans les canalisations du laboratoire Ces azotures sont explosifs Pour viter toute accumulation d azotures rincer grande eau les canalisations si les solutions contenant de l azoture sont limin es par l vier apr s leur inactivation Certains r actifs contiennent du ProClin 300 0 04 0 1 et ou 0 5 Xi Irritant R43 peut entra ner une sensibilisation par contact avec la peau S28 37 Apr s contact avec la peau se laver imm diatement et abondamment avec de l eau et du savon Porter des gants appropri s RECONSTITUTION DES R ACTIFS Note Avant utilisation laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante 18 30 C R actif 1 R1 Microplaque Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionn en sachet ZIP Couper le sachet l aide de ciseaux ou scalpel 0 5 1 cm au dessus du ZIP Ouvrir le sachet et sortir le cadre Replacer dans le sachet les barrettes inutilis es Refermer le sac
11. cozzo GENSCREEN HIV1 2 version 2 1 plaque 96 tests 72278 5 plaques 480 tests 72279 POUR LA D TECTION DES ANTICORPS ANTI VIH1 ET ANTI VIH2 DANS LE SERUM PLASMA PAR TECHNIQUE IMMUNO ENZYMATIQUE Contr le de qualit du fabriquant Tous les produits fabriqu s et commercialis s par la soci t BIO RAD sont plac s sous un syst me d assurance qualit de la r ception des mati res premi res jusqu la commercialisation des produits finis Chaque lot du produit fini fait l objet d un contr le de qualit et n est commercialis que s il est conforme aux crit res d acceptation La documentation relative la production et au contr le de chaque lot est conserv e par notre soci t TABLE DES MATIERES INT R T CLINIQUE PRINCIPE DE LA TROUSSE GENSCREEN HIV1 2 version 2 COMPOSITION DE LA TROUSSE GENSCREEN HIV1 2 version 2 VALIDITE CONSERVATION MAT RIEL N CESSAIRE MAIS NON FOURNI CHANTILLONS PR CAUTIONS RECONSTITUTION DES R ACTIFS MODE OP RATOIRE REMARQUES CALCUL ET INTERPR TATION DES R SULTATS V RIFICATION SPECTROPHOTOMETRIQUE DU DEPOT DES CHANTILLONS ET DU CONJUGU PERFORMANCES LIMITES DU TEST R F RENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1 INT R T CLINIQUE Le syndrome d immunod ficience acquise SIDA est une maladie infectieuse d origine virale se traduisant par un d ficit profond de l immunit cellulaire Deux types de virus apparent s au groupe des lentivirus ont t i
12. de patients atteints de SIDA ou pr SIDA ARC ainsi que sur des panels de sensibilit compos s d chantillons document s provenant de patients r cemment infect s par le virus VIH la sensibilit VIH1 valu e sur 413 chantillons de patients atteints de SIDA ou pr SIDA ARC positifs VIH1 groupe M et confirm s en Western Blot ainsi que 31 chantillons VIH1 groupe O et confirm s en western blot VIH1 a t estim e 10076 e la sensibilit groupe O test e galement sur 4 chantillons VIH1 groupe O ind termin s en Western Blot a t jug e satisfaisante avec 3 chantillons trouv s positifs la sensibilit VIH2 valu e sur 119 s rums dilu s ou non dilu s et issus de patients confirm s positifs par Western Blot a t estim 100 la sensibilit VIH 1 groupe M a t valu e sur 29 panels de s roconversion commerciaux BBI NABI Bioclinicals partners ainsi que sur le panel de sensibilit de l INTS Les r sultats sont conformes l tat de l art 21 14 15 22 LIMITES DU TEST Sur le panel de I INTS les 45 chantillons de s roconversion ainsi que les 13 de per seroconversion sont positifs La sp cificit du test chez les donneurs de sang a t estim e 99 98 sur 5025 chantillons test s 3 r actions positives ont t observ es lors de l analyse de 212 patients pr sentant des pathologies ou des tats sans relation avec le virus du SIDA femmes enceintes facteur
13. echnique immuno enzymatique bas e sur le principe du sandwich en deux tapes pour la d tection des diff rents anticorps associ s aux virus VIHT et ou VIH2 dans le s rum ou plasma humain GENSCREEN HIV1 2 version 2 repose sur l utilisation d une phase solide pr par e avec des antig nes purifi s prot ines recombinantes gp160 et p25 du virus VIH1 et peptide mimant l pitope immunodominant de la glycoprot ine d enveloppe du virus VIH2 et d un conjugu pr par avec des antig nes marqu s la peroxydase prot ine recombinante nucl ocapsidique et peptides mimant les pitopes immunodominants des glycoprot ines d enveloppe des virus VIH1 et VIH2 La mise en oeuvre du test comprend les tapes r actionnelles suivantes 1 Les s rums tudier ainsi que les s rums de contr le sont distribu s dans les cupules Si des anticorps anti VIHT et ou VIH2 sont pr sents ils se lient aux antig nes fix s sur la phase solide Le d p t d chantillon est valid par un changement de couleur du violet au bleu SDP Sample Deposition Proof 2 Les antig nes VIH1 et VIH2 purifi s marqu s la peroxydase sont ajout s apr s lavage Ils se lient leur tour aux IgG et ou IgM et ou IgA retenus par la phase solide 3 La pr sence de l enzyme immobilis e sur les complexes est r v l e par incubation en pr sence du substrat apr s limination de la fraction de conjugu rest e libre 4 Apr s arr t de la r action la lecture s ef
14. erve d utiliser un seul et m me lot de ceuxci au cours d un m me essai Ces r actifs peuvent tre utilis s avec d autres produits de notre soci t De plus la solution de lavage R2 identifi 20X en vert sur l tiquette peut tre m lang e avec l une des deux autres solutions de lavage inclues dans les diff rents kits r actifs Bio Rad R2 identifi 1OX en bleu ou 10X en orange sur l tiquette correctement reconstitu es condition qu un seul m lange soit utilis pour une m me manipulation donn e Contacter nos services techniques pour obtenir des informations d taill es e La solution de r v lation tampon substrat chromog ne doit tre color e en rose l apparition d une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le r actif est inutilisable et doit amp tre remplac Pour cette pr paration utiliser de pr f rence des r cipients et du mat riel de distribution en plastique usage unique ou de la verrerie pr alablement lav e l acide chlorhydrique 1N rinc e l eau distill e et s ch e Conserver cette solution l abri de la lumi re Avant utilisation attendre 10 minutes pour que les r actifs s quilibrent la temp rature du laboratoire Reconstituer soigneusement les r actifs V rifier l exactitude et la pr cision des pipettes et le bon fonctionnement des appareils utilis s Ne pas modifier le mode op ratoire lavage il est indispensable de respecte
15. fectue au spectrophotom tre 450 620 700 nm l absorbance observ e pour un chantillon permet de conclure quant la pr sence ou l absence d anticorps anti VIH1 et ou VIH2 3 COMPOSITION DE LA TROUSSE GENSCREEN HIV1 2 version 2 Tous les r actifs sont destin s l usage exclusif du diagnostic in vitro ETIQUETAGE NATURE DES R ACTIFS PRESENTATION 72278 72279 RI Microplaque 12 barrettes de 8 cupules sensibilis es plaque 5 plaques avec les antig nes VIH et VIH2 purifi s R2 Solution de lavage concentr e 20x flacon flacon Tampon Tris NaCl pH 7 4 70 ml 235 ml Conservateur ProClin 300 0 04 R3 S rum de contr le n gatif humain flacon flacon 1 ml 1 ml R4 S rum de contr le seuil humain flacon flacon 2 5ml 2 5 ml R5 S rum de contr le positif humain flacon flacon 1 ml 1 ml R6 Diluant des chantillons flacon 2 flacons 14 ml 2 x 10 ml R7a Conjugu flacon 2 flacons Antig nes VIH1 et VIH2 purifi s marqu s qsp 12 5 ml qsp 2 x 30 ml la peroxydase lyophilis s R7b Diluant du conjugu flacon 2 flacons 2 5 ml 2 x 30 ml R8 Tampon pour substrat de la peroxydase flacon 2 flacons Solution de Citrate de Sodium et 60 ml 2 x 60 ml d Acetate de Sodium pH 4 0 contenant 0 015 d H202 et 4 de DMSO R9 Chromog ne Solution contenant 1 flacon 2 flacons de la tetramethyl benzidine TMB 5 ml 2x5 ml RIO Solution d arr t 1 flacon 3 flacons
16. g Anvendes far AAAA MM DD Consult Instruction for use Consulter le mode d emploi Consulte la instrucci n para el uso Siehe Gebruchsanweisung e Consultare le istruzioni per uso Consulte o folheto Informativo Se instruktionsanvisning vid anv ndning Se instruktion fer brug 09 2006 code 883513
17. her et laisser reposer pendant 10 minutes en remuant et en retournant de temps en temps pour faciliter la dissolution R actif 7b R7b Diluant du conjugu Solution de lait cr m color e tampon TRIS additionn de 0 1 de chloroforme et de Proclin R actif 8 R8 Tampon substrat Solution pr te l emploi d acide citrique et d ac tate de sodium pH 4 0 contenant 0 015 d eau oxyg n e et 4 de dim thylsulfoxyde DMSO R actif 9 R9 Solution de chromog ne concentr e Solution contenant du t tram thylbenzidine TMB Diluer 11 fois la solution dans le tampon substrat ex 1 ml de r actif R9 10 ml de r actif R8 Stabilit 6 heures R actif 10 R10 Solution d acide sulfurique 1N pr te l emploi MODE OP RATOIRE Suivre strictement le protocole propos Utiliser les s rums de contr le n gatif positif et le s rum seuil chaque mise en oeuvre du test pour valider la qualit du test Appliquer les bonnes pratiques de laboratoire 1 Etablir soigneusement le plan de distribution et d identification des chantillons 2 Pr parer la solution de lavage dilu e 3 Sortir le cadre support et les barrettes R1 de l emballage protecteur 4 D poser directement sans pr lavage de la plaque successivement 4 1 25 yl de diluant dans chaque cupule 4 2 75 yl de s rum de contr le n gatif R3 en Al 75 yl de s rum de contr le seuil R4 en B1 C1 et D1 75 yl de s rum de contr le positif R5 en E1
18. het soigneusement et le replacer 2 8 C R actif 2 R2 Solution de lavage concentr e 20 fois Diluer 20 fois la solution dans l eau distill e On obtient ainsi la solution de lavage pr te l emploi Pr voir 800 ml pour une plaque de 12 barrettes R actif 3 R3 S rum de contr le n gatif S rum humain n gatif en anticorps anti VIH1 et anti VIH2 en antig ne HBs et en anticorps anti HCV contenant 0 1 d azoture de sodium R actif 4 R4 S rum sevil S rum humain contenant une faible quantit d anticorps anti VIH n gatif en antig ne HBs et anticorps anti VHC inactiv par la chaleur contenant 0 1 d azoture de sodium R actif 5 R5 S rum de contr le positif S rum humain positif en anticorps anti VIH n gatif en antig ne HBs et anticorps anti VHC inactiv par la chaleur contenant 0 1 d azoture de sodium R actif 6 R6 Diluant pour chantillons pr t l emploi Solution de s rum de veau tampon TRIS additionn de 0 1 de chloroforme de Proclin et d un indicateur color t moin de d p t des chantillons R actif 7a R7a Conjugu lyophilis Antig nes VIH1 et VIH2 purifi s marqu s la peroxydase Contient de la BSA et du Proclin 0 1 Taper doucement le flacon sur la paillasse pour d tacher toute substance pouvant adh rer au bouchon de caoutchouc Enlever le bouchon avec soin et verser le contenu d un flacon de diluant conjugu dans le flacon de conjugu lyophilis Rebouc
19. le test GENSCREEN HIV1 2 version 2 Un tel r sultat n gatif n exclut pas la possibilit d une infection VIH1 VIH2 La variabilit des virus VIH1 groupe M groupe O et VIH2 ne permet pas d exclure la possibilit de r actions faussement n gatives Aucune m thode connue ne peut offrir l assurance que le virus VIH est absent Toute technique ELISA hautement sensible peut produire des r actions faussement positives Afin de v rifier la sp cificit de la r action tout chantillon trouv positif reproductible selon les crit res d interpr tation du test GENSCREEN HIV1 2 version 2 doit tre soumis un test de confirmation Western Blot Le chauffage des chantillons peut affecter la qualit des r sultats La m thode colorim trique de v rification du d p t des chantillons et ou des conjugu s et ou de la solution de r v lation ne permet pas de v rifier l exactitude des volumes distribu s mais seulement de montrer la pr sence d chantillons et ou des conjugu s et ou de la solution de r v lation Le taux de r ponses erron es obtenues avec cette m thode est li e la pr cision du syst me utilis des CV cumul s de pipetage et de lecture sup rieurs 10 peuvent d grader significativement la qualit de cette v rification Dans le cas d un lavage inefficace apr s l tape d incubation du conjugu la v rification automatique de la distribution de la solution de r v lation par lecture 490 nm des densit
20. ogiques NE PAS UTILISER DE S RUMS OU PLASMAS CONTAMIN S HYPERLIP MIQUES OU HYPERH MOLYSES REMARQUE Aucune interf rence n a t mise en vidence sur des chantillons contenant jusqu 90 g l d albumine et 200 mg l de bilirubine ainsi que sur des chantillons lip miques contenant jusqu 36 g l de triglyc rides et sur des chantillons h molys s contenant jusqu 20 g l d h moglobine PR CAUTIONS La qualit des r sultats est d pendante du respect des bonnes pratiques de laboratoires suivantes Le nom du test ainsi qu un num ro d identification sp cifique du test sont mentionn s sur le cadre de chaque microplaque Ce num ro d identification sp cifique figure galement sur chaque barrette Genscreen HIV 1 2 Version 2 Num ro sp cifique d identification 05 Cette identification doit tre v rifi e avant chaque utilisation Toute barrette dont le num ro de test est absent ou diff rent de celui correspondant au test r alis ne doit pas tre utilis e Ne pas utiliser de r actifs apr s la date d expiration Ne pas m langer des r actifs de lots diff rents au cours d un m me essai Remarque Il est possible d utiliser d autres lots de solution de lavage R2 identifi 20X en vert sur l tiquette de tampon substrat R8 identifi TMB buf en bleu de chromog ne R9 identifi TMB 11x en violet et de solution d arr t R10 identifi 1N en rouge que ceux fournis dans la trousse sous r s
21. r scrupuleusement les proc dures de lavage afin d obtenir les performances maximales du test Consignes d hygi ne et de s curit Les contr les positif et seuil ont t inactiv s par la chaleur 17 18 Le mat riel d origine humaine utilis dans la pr paration du contr le n gatif a t test et trouv n gatif en anticorps anti VIH1 et VIH2 en antig ne HBs et en anticorps anti VHC Le mat riel d origine humaine utilis dans la pr paration du contr le positif et du s rum seuil a t test et trouv n gatif en antig ne HBs et en anticorps anti VHC Du fait qu aucune m thode ne peut garantir de facon absolue l absence de virus VIH H patites B ou C ou d autres agents infectieux Consid rer ces r actifs ainsi que les chantillons de patients comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les pr cautions d usage Consid rer le mat riel directement en contact avec les chantillons et les r actifs ainsi que les solutions de lavage comme des produits contamin s l autoclavage 121 C pendant une heure minimum est le meilleur proc d d inactivation des virus VIH et du virus de l h patite B NE PAS INTRODUIRE DANS L AUTOCLAVE DE SOLUTIONS CONTENANT DE L HYPOCHLORITE DE SODIUM La fiche de donn es de s curit est disponible sur demande le traitement des solutions et du mat riel contamin s avec de l eau de javel la concentration finale de 5 d hypochlorite de sodium pendant 30 minutes permet g
22. ration Appareil de lecture pour microplaques quip de filtres 450nm et 620 700nm Papier absorbant Nous consulter pour une information pr cise concernant les appareils valid s par nos services techniques CHANTILLON Pr lever un chantillon de sang selon les pratiques en usage Les tests sont effectu s sur des chantillons non dilu s de s rum ou de plasma collect s avec des anticoagulants comme l EDTA l h parine le citrate ACD Extraire le s rum ou le plasma du caillot ou des globules rouges d s que possible pour viter toute h molyse Une h molyse tr s prononc e peut affecter les performances du test Les chantillons pr sentant des agr gats doivent tre clarifi s par centrifugation avant le test Les particules ou agr gats de fibrine en suspension peuvent donner des r sultats faussement positifs ne pas chavffer les chantillons Les chantillons seront conserv s 2 8 C si le d pistage est effectu dans les 7 jours ou peuvent tre conserv s congel s 20 C Les plasmas devront subir une d congelation rapide par chauffage pendant quelques minutes 40 C pour limiter la pr cipitation de la fibrine Eviter les cong lations d cong lations r p t es Les chantillons ayant t congel s et d congel s plus de 3 fois ne doivent pas tre utilis s Si les chantillons doivent voyager les emballer selon la r glementation en usage pour le transport des agents tiol
23. rhumato de lg anti nucl aire ou autres infections virales La pr cision du test GENSCREEN HIV1 2 version 2 a t d termin e par l analyse de 4 chantillons 1 s rum n gatif ch 1 2 s rums faiblement positifs en anticorps anti VIH 1 ch 2 et 3 et 1 s rum fortement positif en anticorps anti VIH1 ch 4 La r p tabilit intra essai de la technique a t valu e par l analyse de ces 4 chantillons qui ont t test s 30 fois au cours de la m me manipulation alors que la reproductibilit inter essai a t valu e par l analyse de ces 4 m mes chantillons qui ont t test s en triplet sur 5 jours diff rents raison de 2 essais ind pendants par jour Les r sultats sont regroup s dans les 2 tableaux suivants Tableau 1 R p tabilit intra essai n 30 ch 1 ch 2 ch 3 ch 4 moyenne des ratios 0 12 3 34 9 05 19 6 d viation standard 0 04 0 45 0 30 0 73 CV ratios 31 5 13 6 3 3 3 7 ratios OD C O Tableau 2 Reproductibilit inter essai n 30 ch 1 h2 ch3 ch4 moyenne des ratios 0 12 3 43 9 27 19 35 d viation standard 0 02 0 41 0 89 1 93 CV ratios 19 3 12 1 9 65 10 0 ratios OD C O De tr s faibles taux d anticorps peuvent ne pas tre d tect s lors d infection r cente en cons quence un r sultat n gatif signifie que l chantillon contr l ne contient pas d anticorps d tectables par
24. sol s des lymphocytes de patients atteints de SIDA ou de ses prodromes Le premier nomm VIH1 a t isol en France puis aux Etats Unis Le second nomm VIH2 a t isol chez deux malades d origine africaine et s est r v l tre responsable d un nouveau foyer de SIDA en Afrique de l Ouest Les connaissances sur la variabilit g n tique des souches des virus VIH ont t acquises par le s quencage des g nes GAG POL et ENV des souches repr sentatives de chacun des soustypes Les virus VIH1 sont divis s en 2 groupes le groupe M comprenant 9 sous types A et le groupe Le virus VIH2 comprend 5 sous types La r partition g ographique des diff rents sous types est maintenant assez bien d finie Certains variants VIH1 n ont que 70 d homologie pour les g nes GAG et POL avec les principaux isolats et seulement 50 pour le g ne ENV ces diff rences peuvent expliquer l chec du diagnostic de l infection chez certains patients Les diff rentes souches du virus VIH2 pr sentent des communaut s antig niques avec le virus simien SIV au niveau de toutes les prot ines prot ines d enveloppe et prot ines internes h t rologie 30 mais pr sentent moins de 40 d homologie avec les prot ines d enveloppe du virus VIH1 Le test GENSCREEN HIV1 2 version 2 permet la d tection simultan e des anticorps anti VIH1 et anti VIH2 PRINCIPE DE LA TROUSSE GENSCREEN HIV1 2 version 2 GENSCREEN HIV1 2 version 2 est une t
25. u total Le volume r siduel doit tre inf rieur 10 yl si n cessaire s cher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant Si l on dispose d un laveur automatique respecter le m me cycle op ratoire voir chapitre 10 Remarques 8 Distribuer rapidement 100 pl de la solution de conjugu dans toutes les cupules Le conjugu doit tre agit avant emploi NB La distribution du conjugu qui est color en vert peut tre v rifi e visuellement ce stade de la manipulation cf chapitre 12 pour la v rification automatique V RIFICATION SPECTROPHOTOMETRIQUE DU D P T DES CHANTILLONS ET DU CONJUGU 9 Si cela est possible recouvrir la microplaque d un film neuf Incuber 30 5 minutes la temp rature ambiante 18 30 C 10 Retirer le film adh sif vider toutes les cupules par aspiration et laver au moins 5 fois comme pr c demment Le volume r siduel doit tre inf rieur 10 pl si n cessaire s cher les barrettes par retournement sur une feuille de papier absorbant 19 Distribuer rapidement dans toutes les cupules 80 pl de la solution de r v lation de l activit enzymatique R8 R9 pr alablement pr par e Laisser la r action se d velopper l obscurit pendant 30 5 minutes temp rature ambiante 18 30 C Lors de cette incubation ne pas utiliser de film adh sif N B La distribution de la solution de r v lation qui est color e en rose peut tre contr l e
26. udence et il est conseill de tester de nouveau les chantillons correspondants en double lorsque les syst mes utilis s et les proc dures du laboratoire le permettent Les chantillons dont les absorbances sont gales ou sup rieures la valeur seuil sont consid r s initialement positifs d apr s le test GENSCREEN HIV1 2 version 2 Ils doivent tre contr l s de nouveau en double avant l interpr tation finale Si apr s r p tition de l essai pour un chantillon l absorbance des 2 doublets est inf rieure la valeur seuil le r sultat initial est non reproductible et l chantillon est d clar n gatif selon le test GENSCREEN HIV1 2 version 2 L origine des r actions non reproductibles est souvent en relation avec les causes suivantes lavage insuffisant des microplaques contamination des chantillons n gatifs par un s rum contenant un titre lev d anticorps contamination ponctuelle de la solution de r v lation par des agents chimiques oxydants eau de javel ions m talliques etc contamination ponctuelle de la solution d arr t Si apr s r p tition de l essai l absorbance mesur e sur l un des deux doublets est gale ou sup rieur la valeur seuil le r sultat initial est reproductible et l chantillon est d clar positif selon le test GENSCREEN HIV1 2 version 2 et trait comme indiqu dans le 813 12 V RIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DE LA DISTRIBUTION DES CHANTILLONS ET DU CONJU
27. visuellement ce stade de manipulation Il y a une diff rence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de r v lation ros e se reporter au paragraphe 12 pour la v rification automatique VERIFICATION SPECTROPHOTOM TRIQUE DU DEPOT DES ECHANTILLONS ET DES REACTIFS 12 Ajouter 100 pl de la solution d arr t R10 en adoptant la m me s quence et le m me rythme de distribution que pour la solution de r v lation Homog n iser le m lange r actionnel N B La distribution de la solution d arr t qui est incolore peut tre contr l e visuellement ce stade de la manipulation La coloration du substrat ros e pour les chantillons n gatifs ou bleu pour les chantillons positifs disparait des cupules qui deviennent incolores pour les chantillons n gatifs ou jaunes pour les chantillons positifs apr s addition de la solution d arr t 13 Essuyer soigneusement le dessous des plaques Au moins 4 minutes apr s la distribution de la solution d arr t et dans les 30 minutes qui suivent l arr t de la r action lire la densit optique 450 620 700 nm l aide d un lecteur de plaques 14 S assurer avant la transcription des r sultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d identification des plaques et des chantillons 10 REMARQUES 11 20 ATTENTION VITER LES CONTAMINATIONS EN COURS DE MANIPULATION EN CAS DE CONTAMINATIONS cl
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