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COMP® ELISA - compelisa.com

1. N mero de tiras Enzyme Amortiguador Conjugate 11X de conjugado 4tiras 350 ul 3 5 ml 6 tiras 500 ul 5 0 ml 12 tiras 1 vial 1 vial ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso en diagn sticos in vitro No apto para uso externo o interno en seres humanos o animales No permitir que el contenido de este kit y sus residuos entren en contacto con animales rumiantes ni cerdos Este kit contiene reactivos que pueden ser infecciosos Este kit contiene reactivos fabricados a partir de componentes de la sangre humana El material de origen se ha comprobado mediante inmunoensayo para ant genos de superficie para hepatitis B y para anticuerpos para el virus VIH y el resultado ha sido negativo No obstante se deber n respetar todas las precauciones recomendadas para el manejo de derivados de la sangre Consulte la publicaci n N 88 8395 CDC del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE UU o bien las correspondientes directrices nacionales locales sobre los procedimientos de seguridad en laboratorios La soluci n tope est compuesta por una soluci n diluida de cido sulf rico Evite la exposici n a bases metales u otros compuestos que puedan reaccionar con cidos El cido sulf rico es venenoso y corrosivo y t xico si se ingiere Para evitar quemaduras provocadas por agentes qu micos evite cualquier contacto con la piel y los ojos PROCEDIMIENTO Par metros del procedimiento Vol menes por espacio Muestra 25 pl
2. Pronta all uso Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenzaln caso di strisce di microtitolazione non utilizzate risigillare il sacchetto e stoccare a 2 8 C per due mesi Liofilizzati Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenza Aggiungere 1 0 ml di acqua distillata per fiala Calibratore ricostituito stoccare a 2 8 C per 4 settimane o a 20 C fino alla data di scadenza Pronto all uso Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenza Concentrato Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenza Preparazione vedere tabella Non congelare Pronto all uso Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenza Sciogliere ciascuna compressa in 500 ml di acqua distillata Conservare la soluzione ad una temperatura di 2 8 e utilizzare entro 4 settimane Pronto all uso Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenza Sensibile alla luce Pronto all uso Stoccare a 2 8 C fino alla data di scadenza Controllo 1 Liofilizzato COMP umana in tampone Aggiungere 0 5 ml di acqua distillata Controllo ricostituito stoccare a 2 8 C per 4 settimane o a 20 C fino alla data di scadenza Controllo 2 Liofilizzato COMP umana in tampone Aggiungere 0 5 ml di acqua distillata Controllo ricostituito stoccare a 2 8 C per 4 settimane o a 20 C fino alla data di scadenza Nota Assicurarsi che tutti i reagenti liofilizzati siano dissolti in modo corretto Le schede di sicurezza del materiale
3. COMP ELISA TT Enzyme Immunoassay Directions for Use 3 12 Gebrauchsanweisung 13 22 Mode d emploi 23 33 Instrucciones de uso 35 44 Istruzioni per l uso 45 54 Aanwijzingen voor gebruik 55 64 Instru es de Utiliza o 65 74 Bruksanvisning 75 84 Brugsanvisning 85 94 INTENDED USE The COMP ELISA is a quantitative enzyme linked immunosorbent assay for the determination of Cartilage Oligomeric Matrix Protein COMP in human serum The presence of elevated levels when considered in conjunction with other laboratory and clinical findings is an aid in identifying aggressive destruction of joint tissue in diseases such as rheumatoid arthritis RA SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST COMP was first described in 1992 by the research group of Professor Dick Heineg rd 1 University of Lund Sweden The molecule is a pentameric protein of five identical disulfide linked subunits 2 with a total molecular mass of 434 kDa 3 COMP was first described in cartilage 1 but has recently also been found in tendons 4 and synovial membranes 5 It has not been possible to detect COMP in culture medium from other connective tissue such as skin or lung tissue 6 Itis well documented 7 8 9 10 that when articular cartilage matrix is degraded by a disease process protein fragments are produced and diffuse out into the joint fluid Some of these proteins such as COMP subsequently appear in the bloodstream and can be used to monito
4. talonnage type Cette courbe ne doit pas tre utilis e pour d terminer les r sultats des dosages effectu s Aso 10 1 COMP U L 29 CALCUL DES R SULTATS Calcul informatique Pour obtenir la concentration des mol cules COMP on peut r aliser une r duction des donn es informatiques d absorbance pour les calibrateurs par rapport la concentration en utilisant la r gression de la spline cubique ou la r gression quatre param tres La concentration des chantillons inconnus doit tre multipli e par le coefficient de dilution par ex x 10 Calcul manuel 1 Placer les valeurs d absorbance obtenues pour les calibrateurs en fonction de la concentration de mol cules COMP sur un papier lin aire logarithmique et tablir une courbe talon 2 Lire la concentration des chantillons inconnus partir de la courbe talon 3 Multiplier les r sultats par le coefficient de dilution x10 VALEURS ATTENDUES Valeurs attendues chez les donneurs de sang Il est de bonne pratique que chaque laboratoire tablisse lui m me ses plages de valeurs attendues Les r sultats suivants peuvent servir de guide jusqu ce que le laboratoire ait r uni suffisamment de donn es Tous les chantillons sont des chantillons de s rum provenant de donneurs de sang su dois a n 336 femme 157 20 73 ans 84 homme 179 19 73 ans 77 x 10 2 70 moyenne 10 0 5 63 957 15 0 5 56 O
5. 17 te schatten Andere data gepubliceerd door Skoumal M et al geven aan dat deze relatie tot de aantasting van kleine gewrichten ook zichtbaar is bij pati nten met een al lang bestaande ziekte 18 62 Interpretatie De volgende richtlijnen kunnen gebruikt worden ter bepaling van de gestadige omzetting van kraakbeen en het risico van de aantasting van gewrichten in de toekomst lt 12 U L Geringer risico van agressieve aantasting van gewrichten 12 15 U L Toenemend risico van agressieve aantasting van gewrichten gt 15 U L Hoog risico van agressieve aantasting van gewrichten Een verhoogd niveau van ESR vergroot verder de kans op agressieve aantasting van gewrichten RESULTAATKARAKTERISTIEKEN Detectielimiet De detectielimiet is lt 0 1 U L Parallellismel Serummonsters werden 10 20 en 40 keer opgelost door gebruik van de monsterverdunner De waargenomen Verkregen Verwachte waarden voor 1 20 en 1 40 lagen binnen een bereik van 93 116 Hook effect Monsters opgelost in 1 10 kunnen een concentratie bereiken tot minstens 200 U I zonder onjuiste lage concentraties Nauwkeurigheid Elk monster werd geanalyseerd in 4 herhalingen tijdens zes verschillende gelegenheden Monster Gem Variatieco ffici nt waarde U L binnen tussen totaal analyse analyse analyse 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Notities Studies uitgevoerd bij AnaMar Medical Uppsala Zweden 63 P
6. 180 ul de tampon d chantillon 25 Pr paration du conjugu enzymatique Pr parer le conjugu enzymatique en diluant 11 fois 1 10 un volume du flacon Enzyme Conjugate 11x dans le tampon conjugu Note Il est conseill de pr parer cette solution en diluant tout le produit en une seule fois En d autres termes il faut verser tout le tampon dans le flacon du conjugu Bien m langer Conserver le conjugu dilu une temp rature de 2 8 C pendant au maximum quatre semaines On peut galement pr parer la quantit n cessaire en se r f rant au tableau ci dessous Bien m langer Nombre de bandes Enzyme Conjugate Tampon 11X conjugu 4 bandes 350 pl 3 5 ml 6 bandes 500 ul 5 0 ml 12 bandes 1 flacon 1 flacon AVERTISSEMENTS ET PR CAUTIONS D EMPLOI e Uniquement pour usage diagnostic in vitro ne pas utiliser en usage interne ou externe chez l homme ou l animal e Les produits contenus dans ce kit et leurs r sidus ne doivent pas tre mis en contact avec un animal ruminant ou un cochon Ce kit contient des r actifs qui peuvent tre infectieux Ce kit contient des r actifs fabriqu s partir de composants sanguins d origine humaine Le donneur a subi un d pistage n gatif par immunoanalyse pour l antigene de surface de l h patite B et pour les anticorps du virus HIV Il faut cependant se conformer aux pr cautions et recommandations concernant le traitement des d riv s sanguins Se r
7. Contr le qualit Labsorbance du calibrateur COMP ELISA le plus bas doit tre sup rieure l absorbance du tampon COMP ELISA Les concentrations des contr les COMP ELISA 1 et 2 doivent tre dans la plage des valeurs indiqu e sur l tiquette Pour chaque lot de contr les les concentrations de mol cules COMP ont t d termin es en utilisant les tests COMP ELISA d AnaMar La valeur moyenne et l cart type sont indiqu s sur tiquette du flacon concern Chaque moyenne statistique est tablie sur six valeurs r it r es au cours de six manipulations cons cutives Comme c est le cas avec toutes les immunoanalyses les r sultats d pendent des proc dures et du mat riel utilis s par les laboratoires lors des tests Il est donc recommand que chaque laboratoire tablisse ses propres valeurs moyennes et ses propres crit res d acceptation par ex 2 ou 3 Pour un ensemble de donn es avec une distribution normale 95 des tests individuels doivent se trouver dans une plage de 2 28 Exemple de grille de travail Puits 1A B 1C D 1E F 1G H 2A B 2C D 2E F 2G H 3A B D signation Tampon d chantillon 0 4 U L de calibrateurs 0 7 U L de calibrateurs 1 2 U L de calibrateurs 1 8 U L de calibrateurs 3 2 U L de calibrateurs Contr le 1 Contr le 2 Echantillon inconnu 1 Concentration indiqu e sur l tiquette du flacon Courbe d talonnage On peut voir ci dessous une courbe d
8. aber nicht mitgeliefertes Material 25 ul Pr zisionspipette mit Einwegspitzen 50 ul 100 ul und 200 ul Multipipetten 1000 ml MeBzylinder Destilliertes Wasser Mikrotiterplatten Photometer mit 450 nm Filter Mikrotiterplatten Sch ttler Mikrotiterplatten Waschger t Referenzmaterial COMP Kalibratoren werden zu einem In house Standard kalibriert der der von Saxne und Heineg rd in Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovials fluid and blood ver ffentlicht in British Journal of Rheumatology Ausgabe 31 S 583 591 1992 beschriebenen COMP Inhibitionsbestimmung entspricht Interferenz Den Reagenzien des Kit wurden Komponenten zur Vermeidung von Interferenzen von den in den Sera des Patienten vorhandenen Maus und RF Antik rpern hinzugef gt Test Verfahren Erstellen Sie f r jeden Assaydurchlauf eine Kalibratorkurve S mtliche Reagenzien und Proben m ssen vor dem Gebrauch auf Zimmertemperatur gebracht werde Kontrollen sollten wie Proben behandelt werden Es wird empfohlen Kalibratoren und Unbekannte in Doppelbestimmung zu testen Geben Sie folgende Reagenzien in die entsprechenden Anti COMP Mikrotiter Kavit ten 1 Kalibratoren 25 ul 2 Verd nnte Kontrollen und verd nnte Proben 25 ul 3 Enzymkonjugat 100 yl 4 2 Std Inkubation auf dem Sch ttelger t bei Raumtemperatur kr ftig sch tteln z B 250 U min Y 16mm 17 5 6 mal mit dem Mikrotiterplatten
9. es refermer herm tiquement le sachet et le conserver une temp rature de 2 8 C pendant deux mois Calibrateurs 5 flacons 1 0 ml Lyophilis s COMP humaine en tampon Conserver une temp rature de 2 Concentration indiqu e sur 8 C jusqu la date limite d utilisation l tiquette du flacon Ajouter 1 0 ml d eau distill e par flacon Calibrateur reconstitu conserver une temp rature de 2 8 C pendant 4 semaines ou 20 C jusqu la date limite d utilisation Tampon d chantillon 2 flacons 7 5 ml Pr t l emploi Conserver une temp rature de 2 8 C jusqu la date limite d utilisation Enzyme Conjugate 11x 1 flacon 1 3ml Concentr Conjugu enzymatique Conserver une temp rature de 2 Anticorps monoclonaux de 8 C jusqu la date limite d utilisation souris 10 pg ml Pour la pr paration voir le tableau Ne pas congeler Tampon conjugu 1 flacon 13 ml Pr t l emploi Coloration en bleu Conserver a une temp rature de 2 a 8 C jusqu la date limite d utilisation i 2 comprim s Dissoudre chaque comprim dans 500 ml d eau distill e Conserver la solution une temp rature de 2 8 C A utiliser dans les 4 semaines Substrat enzymatique TMB 1 flacon 22 ml Pr t l emploi Conserver une temp rature de 2 8 C jusqu la date limite d utilisation Sensible la lumi re 24 Solution d arr t 1 flacon Pr t l emploi 0 5 M H SO Conse
10. f rer la publication de HHS n CDC 88 8395 ou aux directives locales ou nationales sur les proc dures de s curit dans les laboratoires La solution d arr t contient de l acide sulfurique dilu viter tout contact avec des bases des m taux ou d autres compos s pouvant r agir aux acides Lacide sulfurique est un poison et un produit corrosif qui peut tre toxique en cas d ingestion viter tout contact avec la peau ou les yeux afin de pr venir tout risque de br lure chimique 26 PROC DURE Volumes n cessaires par test Volumes par puits Echantillon 25 ul Conjugu 100 ul Substrat enzymatique 200 ul Solution d arr t 50 ul Dur e et temp rature d incubation 1 re incubation 120 min sur un agitateur de plaque temp rature ambiante 20 28 C 2 me incubation 15 min temp rature ambiante Mat riaux requis mais non fournis Micropipette de 25 ul avec pointes jetables Pipettes de r p tition de 50 ul 100 ul et 200 ul prouvette gradu e de 1000 ml Eau distill e Lecteur de plaque EIA avec filtre 450 nm Agitateur de plaque Laveur pour plaques de microtitration Document de r f rence Les calibrateurs de COMP sont talonn s en fonction d une norme interne li e l essai d inhibition COMP d crit par Saxne et Heinegard dans Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood publi dans le British Journal of Rheumatol
11. ndas Obs EDTA plasma och citratplasma kan inte anv ndas Kontakta AnaMar f r r d vid m tning av COMP i andra kroppsv tskor Framst llning av prover och kontroller Prover och kontroller sp des 1 10 i provbuffert 20 ul serum 180 ul provbuffert Beredning av enzymkonjugat Bered enzymkonjugat genom att sp da ut enzymkonjugat 11X 1 10 i enzymkonjugatbuffert Obs M ngden konjugat regleras b st genom att sp da allt p en g ng H ll med andra ord all buffertl sning i konjugatflaskan Blanda f rsiktigt F rvara utsp dd konjugat i 2 8 C i upp till fyra veckor Eller bered den m ngd som beh vs enligt tabellen nedan Blanda f rsiktigt 77 Antal strips Enzym Konjugat konjugat 11X buffert 4 strips 350 ul 3 5 ml 6 strips 500 ul 5 0 ml 12 strips 1 flaska 1 flaska VARNINGAR OCH FORSIKTIGHETSATGARDER e F r in vitro diagnostik Ej f r in eller utv rtes bruk hos m nniskor eller djur e Inneh llet i denna sats samt dess verblivna rester far inte komma i kontakt med idisslande djur eller svin Satsen innehaller reagenser som kan vara smittsamma Satsen innehaller reagenser som tillverkats av blodkomponenter fran manniska K llmaterialet har testats genom en immunologisk bestamningmetod f r hepatit B ytantigen och f r antikroppar f r HIV virus och befunnits vara negativa Oavsett detta b r alla rekommenderade f rsiktighets tg rder vidtagas vid hantering av blodderivat Var v nlig tag del a
12. 49 Da LL 35 28 21 14 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 COMP U L 30 COMP et la PR au stade pr coce et au stade final Une tude portant sur 183 patients atteints de polyarthrite rhumato de a montr qu il existait une corr lation entre la concentration de COMP l inclusion et le risque de destruction tendue des petites articulations au bout de 5 ann es Le rapport de cotes par unit de COMP dans le s rum tait de 1 21 intervalle de confiance IC 1 07 1 36 p lt 0 002 Ces donn es ont servi estimer le risque relatif de d veloppement d une liaison articulaire au dessus du 75 centile Larsen Score gt 59 de 200 apr s 5 ann es 17 D autres donn es publi es par Skoumal M et coll indiquent que cette corr lation la destruction des petites articulations est galement pr sente chez les patients atteints de maladies de longue dur e 18 Interpr tation Les lignes directrices suivantes peuvent servir valuer le renouvellement actuel du cartilage et le risque de destruction de l articulation dans le futur lt 12U L Risque peu lev de liaison articulaire agressive 12 15 U L Augmentation du risque de liaison articulaire agressive gt 15U L Risque lev de liaison articulaire agressive Avec la polyarthrite rhumato de 17 le risque de liaison articulaire agressive augmente encore davantage lorsque la vitesse de s dimentation est lev e VALEURS CARACT RISTIQUES Limite de d c leme
13. Asso 1 0 0 5 0 0 0 1 10 COMP U L CALCULATION OF RESULTS Computerized calculation Computerized data reduction of absorbance for the Calibrators versus the concentration using Cubic Spline regression or four parameter regression may be performed to obtain the concentration of COMP Multiply the concentration of the unknown samples with the dilution factor eg X 10 Manual calculation 1 Plot the absorbance values obtained for the calibrators against the COMP concentration on a lin log paper and construct a calibrator curve 2 Read the concentration of the unknown samples from the calibrator curve 3 Multiply the results by the dilution factor x10 EXPECTED VALUES Expected values in blood donors Good practice dictates that each laboratory establishes its own expected range of values The following results may serve as a guide until the laboratory has gathered sufficient data of its own All samples were serum samples collected from blood donors in Sweden n 336 female 157 20 73 years male 179 19 73 years x 10 2 median 10 0 95th 15 0 Frequency 10 12 14 COMP U L 9 COMP in Early and Late RA In a study of 183 rheumatoid arthritis patients the concentration of COMP at inclusion was related to the risk of extensive small joint destruction after 5 years Odds ratio per COMP unit in serum was 1 21 confidence
14. Conjugado 100 pl Substrato enzim tico 200 ul Soluci n tope 50 ul 38 Tiempo y temperatura de incubaci n 1 incubaci n 120 min en un agitador de placas a temperatura ambiente 20 28 C TA 22 incubaci n 15 min a TA Materiales necesarios pero no suministrados Micropipeta de 25 ul con puntas desechables Pipetas de repetici n de 50 ul 100 ul y 200 ul Vaso para an lisis de 1000 ml Agua destilada Lectora de placas ElA con filtro de 450 nm Agitador de placas Dispositivo de lavado para placas de microtitulaci n Material de referencia Los est ndares COMP est n calibrados contra un est ndar in house correlacionado para el ensayo de inhibici n de COMP descrito por Saxne y Heineg rd en Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood publicado por el British Journal of Rheumatology Vol 31 pp 583 591 1992 Interferencia Se han a adido componentes a los reactivos en el kit para evitar la interferencia que producen los anticuerpos de rat n y de FR presentes en los sueros de los pacientes Procedimiento de la prueba Preparar una curva de calibraci n para cada serie de ensayos Todos los reactivos y muestras tienen que tener la temperatura ambiente antes de usarlos Los controles deben tratarse como las muestras Se recomienda realizar las determinaciones de los est ndar y los desconocidos por duplicado A adir a espacios anti COMP
15. Etikett des Fl schchens 1 0 ml destilliertes Wasser per genannte Konzentration Fl schchen zugeben Rekonstituierter Kalibrator Lagerung bei 2 8 C f r 4 Wochen oder bei 20 C bis zum Verfallsdatum Proben Puffer 2 Fl schchen 7 5 ml Gebrauchsfertig Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum Enzymkonjugat 11x 1 Fl schchen 1 3 ml Konzentrat Peroxidase anti COMP Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum monoklonaler Antik rper Maus Bereitung siehe Tabelle 10 pg ml Nicht einfrieren Konjugatpuffer 1 Fl schchen 13 ml Gebrauchsfertig blau gef rbt Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum Waschtabs 2 Tabletten Jede Tablette in 500 ml destilliertem Wasser aufl sen L sung bei 2 8 C aufbewahren und innerhalb von 4 Wochen verbrauchen Enzymsubstrat TMB 1 Fl schchen 22 ml Gebrauchsfertig Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum Achtung Lichtempfindlich Stopp L sung 1 Fl schchen 7 ml Gebrauchsfertig 0 5 M H SO Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum Kontrolle 1 1 Fl schchen 0 5 ml Gefriergetrocknet human COMP in Puffer 0 5 ml destilliertes Wasser zugeben Rekonstituierte Kontrolle Lagerung 4 Wochen bei 2 8 C oder bei 20 C bis Verfallsdatum 14 Kontrolle 2 1 Fl schchen 0 5 ml Gefriergetrocknet human COMP in Puffer 0 5 ml destilliertes Wasser zugeben Rekonstituierte Kontrolle Lagerung 4 Wochen bei 2 8 C oder bei 20 C bis Verfallsdatum Hinweis Achten Sie darauf dass
16. Kalibratorer 25 pl 2 Fortyndede kontroller og fortyndede prover 25 pl 3 Enzymkonjugat 100 ul 4 Inkuber p en pladeryster og ryst kraftigt f eks 250 rpm Y 16mm i 2 timer ved stuetemperatur 5 Vask 6 gange med en automatisk vaskeanordning eller Afsug reaktionsblandingen Tils t 350 ul vaskeoplesning i hver brand Afsug helt Gentag 5 gange Vend pladen om efter sidste vask og bank den kraftigt mod absorberende papir 6 Tils t 200 ul enzymsubstrat TMB 89 7 Inkuberi 15 minutter 8 Tils t 50 ul stopoplosning 9 S t pladen p pladerysteren i cirka 5 sekunder for at sikre at substrat og stopoplesning blandes 10 M l absorbansen ved 450 nm og foretag en evaluering Kvalitetskontrol Absorbansen for laveste COMP ELISA kalibratoren skal veere storre end absorbansen for COMP ELISA provebufferen Koncentrationerne af COMP ELISA kontrol 1 0g 2 skal befinde sig inden for det veerdiomr de der er angivet p meerkaten Koncentrationerne af COMP er fastlagt for hvert lot af kontroller med anvendelse af AnaMars COMP ELISA Gennemsnitsveerdi og standardafvigelse er angivet p meerkaterne p de respektive heetteglas Hver gennemsnitsveerdi er baseret p seks gentagelser i seks p hinanden f lgende k rsler Som det er tilf ldet med alle immunanalyser p virkes resultaterne af de procedurer og det udstyr der anvendes af det enkelte laboratorium Det anbefales derfor at man i laboratoriet fastl g
17. Puffer 4 Streifen 350 ul 3 5 ml 6 Streifen 500 ul 5 0 ml 12 Streifen 1 Fl schchen 1 Fl schchen WARNUNGEN e NUR ZUR IN VITRO DIAGNOSTIK Nicht f r innere oder u ere Anwendung bei Mensch oder Tier e Der Inhalt dieses Kits und die R ckst nde d rfen nicht mit Wiederk uern oder Schweinen in Kontakt kommen Dieser Testkit enth lt Reagenzien die aus Bestandteilen menschlichen Bluts hergestellt sind Die Ausgangsmaterialien wurden mittels Immunoassays auf Hepatitis B Oberfl chen Antigen und Antik rper gegen HIV Virus mit negativem Ergebnis untersucht Trotzdem sind alle empfohlenen VorsichtsmaBnahmen zum Umgang mit humanen Blutderivaten zu beachten Siehe hierzu auch HHS Ver ffentlichung Nr CDC 88 8395 oder entsprechende lokale nationale Sicherheitsvorschriften Die Stopp L sung besteht aus einer verd nnten Schwefels urel sung Der Kontakt mit Basen Metallen oder anderen Stoffen die mit S uren reagieren k nnen ist zu vermeiden Schwefels ure ist giftig und korrosiv und kann bei Verzehr t dlich wirken Bitte Routinevorkehrungen f r den Umgang mit gef hrlichen Chemikalien beachten VERFAHREN Parameter des Verfahrens Volumina pro Bestimmung Probe 25 ul Konjugat 100 ul Enzymsubstrat 200 ul Stop L sung 50 ul 16 Inkubationszeit und temperatur 1 Inkubation 120 Min auf einem Plattensch ttelger t bei Raumtemperatur 20 28 C RT 2 Inkubation 15 Min bei Raumtemperatur stehen lassen Ben tigtes
18. aggressiv ledf rst ring gt 15 U L H g risk f r aggressiv ledf rst ring F rh jd ESR kade ytterligare risken att drabbas av aggressiv ledf rst ring i RA 17 PRESTANDA Detektionsgr ns Detektionsgr nsen r lt 0 1 U L Parallellism Serumproven sp ddes 10 20 och 40 g nger med samma utsp dningsl sning De observerade erh llna f rv ntade v rdena f r 1 20 och 1 40 l g inom intervallet 93 116 Hook Effekt Prov som sp des 1 10 kan ha en koncentration p upp till minst 200 U L utan att ge felaktigt l ga koncentrationer Precision Varje prov analyserades i fyra replikat vid sex olika tillf llen Prov Medelv rde Variationskoefficient U L E inom mellan total assay assay assay 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Noter studier utf rda vid AnaMar Medical Uppsala Sweden 83 METODENS BEGR NSNINGAR En definitiv klinisk diagnos b r inte baseras p en enstaka diagnostisk metod utan b r endast st llas av l karen n r alla kliniska och laboratoriska fynd har utv rderats GARANTI De data som presenterats h r erh lls genom att man anv nde sig av den f reskrivna metoden Alla f r ndringar eller modifieringar av metoden som inte rekommenderas av AnaMar Medical kan p verka resultaten i vilket fall AnaMar Medical avs ger sig alla utf rdade garantier uttryckliga eller underf rst dda inklusive den underf rst dda garantin om s ljbarhet
19. dass AnaMar Medical keine Gew hrleistung indirekt oder gesetzlich vorgeschrieben einschlieBlich der indirekten Garantie der Markt und Gebrauchsf higkeit bernimmt In einem solchen Fall haften weder AnaMar Medical noch seine Vertragsh ndler f r direkte oder Folgesch den ERKL RUNG DER AUF DEN ETIKETTEN VERWENDETEN SYMBOLE n 96 Reagenzien f r 96 Bestimmungen Verfallsdatum do 3 O Aufbewahrung bei 2 8 C Partienummer F r in vitro Diagnostik ES emd Hergestellt von 22 APPLICATION Le test COMP ELISA est un dosage immunoenzymatique quantitatif qui utilise un antig ne adsorb pour d tecter la prot ine de la matrice cartilagineuse COMP ou Cartilage Oligomeric Matrix Protein dans le s rum humain Conjointement aux examens cliniques et aux autres analyses de laboratoire la pr sence de niveaux lev s de cette prot ine est un moyen qui permet de d celer une destruction des tissus articulaires dans des maladies telles que la polyarthrite rhumato de PR R SUM ET EXPLICATION DU TEST La mol cule COMP a t d crite la premi re fois en 1992 par le groupe de recherche du Professeur Dick Heineg rd 1 de Universit de Lund en Su de Cette mol cule est une prot ine pentam rique constitu e de cinq sous unit s identiques liaison bisulfure 2 d une masse mol culaire totale de 434 kDa 3 Dans la description initiale de la mol cule COMP seuls les cartilages 1 taient concern s mais on a
20. interval CI 1 07 1 36 p lt 0 002 These data were used to estimate the relative risk of developing joint destruction above the 75th percentile Larsen Score gt 59 of 200 after 5 years 17 Other data published by Skoumal M et al indicate that this relation to small joint destruction is also seen in patients with long standing disease 18 Interpretation The following guidelines may be used to assess ongoing cartilage turnover and the risk of joint destruction in the future lt 12 U L Lower risk of aggressive joint destruction 12 15 U L Increasing risk of aggressive joint destruction gt 15 U L High risk of aggressive joint destruction An elevated ESR further increased the risk of aggressive joint destruction in RA 17 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Detection limit The detection limit is lt 0 1 U L Parallelism Serum samples were diluted 10 20 and 40 times using the sample diluent The observed Obtained Expected values for 1 20 and 1 40 were in the range 93 116 Hook Effect Samples diluted 1 10 can have a concentration up to at least 200 U L without giving incorrectly low concentrations Precision Each sample was analysed in 4 replicates on six different occasions Sample Mean value Coefficient of variation E un within between total assay assay assay 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Notes Studies performed at AnaMar Medical Uppsala Sweden LIMITATI
21. och ndam lsenlighet I s dana fall ansvarar AnaMar Medical eller dess auktoriserade distribut rer inte f r f ljd eller indirekt skada F RKLARING AV ETIKETTSYMBOLER n 96 Reagenser f r 96 best mningar Utg ngsdatum F rvaras i 2 8 C gt E 8 Tillverkningsnummer lt Endast f r in vitro diagnostik Tillverkad av E 84 TILSIGTET ANVENDELSE COMP ELISA er en kvantitativ enzymimmunanalyse til bestemmelse af Cartilage Oligomeric Matrix Protein COMP i humant serum Forekomsten af forhojede niveauer er n r det ses i kombination med andre laboratoriefund og kliniske fund en hj lp i p visningen af aggressiv destruktion af ledveev i forbindelse med sygdomme som reumatoid arthrit RA RESUM OG BESKRIVELSE AF TESTEN COMP blev beskrevet forste gang i 1992 af en forskningsgruppe under professor Dick Heineg rd 1 Lund Universitet i Sverige Molekylet er et pentamerisk protein med fem identiske disulfid koblede underenheder 2 med en samlet molekylveegt p 434 kd 3 COMP blev f rst beskrevet i cartilago 1 men er for nylig ogs fundet i sener 4 og synovialmembraner 5 Det har ikke veeret muligt at p vise COMP i veekstmedium fra andet bindeveev s som hud eller lungeveev 6 Det er veldokumenteret 7 8 9 10 at n r ledbruskmatrix nedbrydes som f lge af en sygdoms progression produceres proteinfragmenter som diffunderer ud i ledveesken Nogle af disse proteiner s
22. podem ser utilizadas para avaliar a mudan a da cartilagem e o risco de destrui o da r tula no futuro lt 12U L Risco decrescente de destrui o da r tula agressiva 12 15 U L Risco crescente de destrui o agressiva da r tula gt 15 U L Risco elevado de destrui o agressiva da r tula Risco aumentado de destrui o agressiva da r tula Um n vel elevado de ESR aumenta o risco de destrui o agressiva da r tula CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Limite de detec o O limite de detec o de lt 0 1 U L Paralelismo As amostras de soro foram dilu das 10 20 e 40 vezes utilizando o diluente da amostra Os valores obtidos esperados para 1 20 e 1 40 estavam no intervalo de 93 116 Efeito Hook As amostras dilu das em 1 10 podem ter uma concentra o at 200 U L sem darem falsas concentra es baixas Precis o Cada amostra foi analisada em 4 replicados em seis ocasi es diferentes Amostra Valor Coeficiente de varia o m dio U L dentro de entre total ensaio ensaio ensaio 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Notas Estudos realizados em AnaMar Medical Uppsala Su cia 73 LIMITA ES DO PROCEDIMENTO Um diagn stico cl nico definitivo n o dever ser baseado num nico m todo de diagn stico mas s dever ser emitido por um m dico ap s todas as descobertas cl nicas e laboratoriais terem sido avaliadas GARANTIA O desempenho dos dados aqui ap
23. r cemment d couvert sa pr sence dans les tendons 4 et les synoviales 5 Elle n a pu tre d cel e dans des milieux de culture d autres tissus conjonctifs tels que la peau ou les tissus pulmonaires 6 Comme des documents 7 8 9 10 l indiquent clairement une d gradation pathologique de la matrice cartilagineuse articulaire s accompagne d une production de fragments de prot ine qui se r pandent dans le fluide articulaire Certaines de ces prot ines telles que la mol cule COMP apparaissent peu peu dans le sang et peuvent tre utilis es pour surveiller la progression de la destruction cartilagineuse dans des maladies inflammatoires des articulations telles que la polyarthrite rhumato de 8 11 et l arthrose 12 13 14 On a pu d montrer qu il existe une corr lation quantitative entre les concentrations de la mol cule COMP dans le s rum et la d gradation du cartilage 10 en utilisant les modifications radiographiques comme succ dan clinique Ceci a par ailleurs t prouv dans le cas d arthrite induite cliniquement chez animal ou le niveau de s rum COMP tait hautement li la s v rit de l arthrite 15 16 ainsi qu l image clinique de l articulation et aux signes histopathologiques de P rosion du cartilage 16 PRINCIPE DU TEST Le test COMP ELISA est un dosage immunoenzymatique sur deux sites en phase solide Cette technique est bas e sur la m thode sandwich directe Dans cette m thode deux anticor
24. sine egne forventede veerdiomr der Nedenst ende resultater kan veere en rettesnor indtil laboratoriet selv har indsamlet tilstreekkelige data Alle prover var serumprover indsamlet fra bloddonorer i Sverige n 336 kvinde 157 20 73 r mand 179 19 73 r x 10 2 median 10 0 95 15 0 Frekvens 10 12 14 16 COMP U L COMP itidlig og sen RA I en unders gelse af 183 patienter med reumatoid arthrit var koncentrationen af COMP ved unders gelsens start forbundet med risikoen for omfattende destruktion af mindre led efter 5 ar Odds ratio pr COMP enhed i serum var 1 21 konfidensinterval CI 1 07 1 36 p lt 0 002 Disse data blev anvendt til at beregne den relative risiko for at udvikle leddestruktion over den 75 percentil Larsen score gt 59 af 200 efter 5 r 17 Andre data der er offentliggjort af Skoumal M et al indikerer at denne forbindelse til destruktion af mindre led ogs ses hos patienter med leengerevarende sygdom 18 92 Fortolkning Nedenst ende retningslinjer kan anvendes i vurderingen af den igangv rende bruskoms tning og risikoen for fremtidig leddestruktion lt 12U L Lavere risiko for aggressiv leddestruktion 12 15 U L Stigende risiko for aggressiv leddestruktion gt 15 U L Stor risiko for aggressiv leddestruktion Et forh jet niveau af ESR ger yderligere risikoen for aggressiv leddestruktion i RA 17 FUNKTIONSDATA Detekteringsgreensel
25. sono disponibili su richiesta PREPARAZIONE E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI E DELL ENZIMA CONIUGATO Campioni Il sangue deve essere raccolto tramite venipuntura consentendo il coagulo e quindi il siero deve essere separato per centrifugazione campioni possono essere stoccati a temperatura ambiente a solo scopo di trasporto a 2 8 C se testati entro una settimana dalla raccolta o a 20 C per test effettuati pi tardi E anche possibile utilizzare plasma con eparina Nota Il plasma con EDTA e il plasma con citrato non possono essere utilizzati Contattare AnaMar per una consulenza in merito alla misurazione della COMP in altri fluidi corporei Preparazione dei campioni e controlli I campioni e i controlli devono essere diluiti 1 10 nel tampone campioni 20 ul siero 180 ul tampone campioni Preparazione dell enzima coniugato Preparare enzima coniugato per diluizione di enzima coniugato 11X 1 10 in tampone enzima coniugato Nota volumi di coniugato vengono corretti preferibilmente diluendo in un unico passaggio In altre parole versare tutto il tampone nella fiala di coniugato Mescolare con cautela Stoccare il coniugato diluito a 2 8 C per un massimo di quattro settimane Oppure preparare il volume necessario in base alla tabella qui di seguito Mescolare con cautela 47 N mero de strisce Enzima Tampone coniugato 11X coniugato 4 strisce 350 ul 3 5 ml 6 strisce 500 ul 5 0 ml 12 strisce 1 fi
26. tv ttsteg tar bort obundna enzym m rkta antikroppar Det bundna konjugatet detekteras genom en reaktion med 3 3 5 5 tetrametylbenzidin TMB Reaktionen avbryts genom att syra tills tts Det ger en kolorimetrisk slutpunkt som avl ses spektrofotometriskt 75 REAGENSER Varje COMP ELISA kit inneh ller reagenser f r 96 best mningar vilket r cker till en kalibreringskurva en blank tv kontroller och 40 prover i duplikat F r st rre analysserier anv nd sammanslagna reagenser fr n f rpackningar med samma tillverkningsnummer Utg ngsdatum f r hela kitet anges p den yttre etiketten Rekommenderad f rvaringstemperatur r 2 8 C Anti COMP coatad platta Monoklonala antikroppar fr n mus Kalibratorer humant COMP i buffertl sning Koncentration angiven p flaskans etikett Provbuffert Enzymkonjugat 11x Peroxidas anti COMP Monoklonala antikroppar fr n mus 10 pg ml Konjugatbuffert F rgkod bl Tv ttabletter Enzymsubstrat TMB Stoppl sning 0 5 M H SO 1 platta 96 brunnar 8 strips 5 flaskor 2 flaskor 7 5 ml 1 flaska 1 3 ml 1 flaska 13 ml 2 tabletter 1 flaska 22 ml 1 flaska 7 ml 76 F rdig att anv ndas F rvaras i 2 8 C fram till utg ngsdatum F r oanv nda mikrotiterstrips terf rslut p sen och f rvara i 2 8 C i tv m nader Frystorkade F rvara i 2 8 C fram till utg ngsdatum Tills tt 1 0 ml destillerat vatten per flaska Rekonstituerad kali
27. 1 Calibradores 25 ul 2 Muestras diluidas y controles diluidos 25 ul 3 Conjugado enzim tico 100 pl 4 Incubar en agitador y agitar con intensidad 250 rpm 16mm durante 2 horas a temperatura ambiente 39 5 Lavar 6 veces con lavador autom tico o bien Aspirar el volumen de reacci n A adir 350 ul de soluci n de lavado a cada espacio Aspirar completamente Repetir 5 veces Despu s del ltimo lavado invertir y dar golpecitos a la placa firmemente contra papel secante A adir 200 ul de substrato enzim tico TMB Incubar durante 15 minutos A adir 50 ul de soluci n tope Poner la placa en el agitador durante unos 5 segundos para asegurar la mezcla del substrato y la soluci n tope 10 Medir la capacidad de absorci n a 450 nm y evaluar Control de calidad La absorci n del m s bajo calibrador de COMP ELISA debe ser mayor que la absorci n de la muestra de COMP ELISA Las concentraciones del Control 1 y 2 de COMP ELISA deben estar dentro del rango de los valores especificados en su etiqueta ojo E Por cada lote de controles se han determinado las concentraciones de COMP usando COMP ELISA de AnaMar El valor medio y la desviaci n t pica se indican en la etiqueta del vial respectivo Cada valor medio se basa en seises replicados en seises series consecutivas Como con todos los inmunoensayos los resultados son afectados por los procedimientos de prueba y los equipos usados por disti
28. 2 15 U L Erh htes Risiko der aggressiven Gelenkzerst rung gt 15 U L Hohes Risiko der aggressiven Gelenkzerst rung Eine erh hte BSG steigerte das Risiko der aggressiven Gelenkzerst rung in RA 17 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze betr gt lt 0 1 U L Parallelismus Serumproben wurden 1 10 1 20 und 1 40 mit dem Proben Puffer verd nnt Der Quotient der Erhalten Erwartet Werte f r 1 20 und 1 40 lag im Bereich 93 116 Hook Effekt 1 10 verd nnte Proben k nnen eine Konzentration von bis zu mindestens 200 U I erreichen ohne fehlerhaft niedrige Konzentrationen zu ergeben Pr zision Jede Probe wurde in 4 facher Wiederholung zu sechs verschiedenen Zeitpunkten analysiert Probe Mittelwert Variationskoeffizient UNE Intra Assay Inter Assay Analyzen Varianz Varianz Varianz 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 FuBnote 1 Bei AnaMar Medical Uppsala Schweden durchgef hrte Studien 21 VERFAHRENSGRENZEN Eine definitive klinische Diagnose sollte nicht auf einem einzelnen beliebigen Diagnoseverfahren basieren sondern nur vom Arzt unter Ber cksichtigung aller klinischen Befunde und Laborbefunde vorgenommen werden HAFTUNG Die hier angegebenen Leistungsdaten wurden im Rahmen des angegebenen empfohlenen Verfahrens ermittelt Jegliche nderung des Verfahrens die nicht von AnaMar Medical empfohlen wurde kann die Ergebnisse beeintr chtigen so
29. Detekteringsgreensen er lt 0 1 U L Parallelisme Serumproverne blev fortyndet 10 20 og 40 gange med anvendelse af provefortynderen De observerede opnaede forventede veerdier for 1 20 og 1 40 var inden for omradet 93 116 Hook effekt Prover der er fortyndet 1 10 kan have en koncentration p mindst 200 U L uden at give ukorrekt lave koncentrationer Nojagtighed Hver prove blev analyseret i fire kopier og ved seks forskellige lejligheder Prove Gennemsnits Variationskoefficient veerdi U L inden for mellem analyse analyse analyse i alt 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Noter Unders gelser udf rt hos AnaMar Medical Uppsala Sverige 93 PROCEDURENS BEGR ENSNINGER En definitiv klinisk diagnose ber ikke baseres p en enkelt diagnostisk metode men kun foretages af leegen efter at de kliniske og laboratoriets resultater er blevet evalueret GARANTI De funktionsdata der er beskrevet her blev indhentet med anvendelse af den angivne anbefalede procedure Enhver ndring i proceduren som ikke er anbefalet af AnaMar Medical kan p virke resultaterne og i det tilf lde frasiger AnaMar Medical sig alle garantier b de udtrykkelige indirekte og lovbestemte og herunder ogs indirekte garantier for salgbarhed og egnethed til et bestemt form l I s danne tilf lde vil AnaMar Medical og AnaMar Medicals autoriserede forhandlere ikke v re erstatningspligtige i forbindelse med h nd
30. Distilled water EIA plate reader with 450 nm filter Plate shaker Wash device for microtitration plates Reference Material COMP Calibrators are calibrated against an in house standard correlated to the COMP inhibition assay described by Saxne and Heineg rd in Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood published in British Journal of Rheumatology vol 31 pp 583 591 1992 6 Interference Components have been added to reagents in the kit to prevent interference from mouse and RF antibodies present in the patient sera Test Procedure Prepare a calibrator curve for each assay run All reagents and samples must be brought to room temperature before use Controls should be treated as samples We recommend that each determination for calibrators and unknowns is performed in duplicate Add to anti COMP wells 1 Calibrators 25 ul 2 Diluted controls and diluted samples 25 ul 3 Enzyme conjugate 100 ul 4 Incubate on a shaker and shake intensely eg 250 rpm 16mm for 2 hours at room temperature at setting 5 Wash 6 times with automatic washer or Aspirate the reaction volume Add 350 ul Washing solution to each well Aspirate completely Repeat 5 times After the final wash invert and tap the plate firmly against absorbent paper Add 200 ul enzyme substrate TMB Incubate for 15 minutes Add 50 ul stop solution Put the plate on the shak
31. MP kartlades f rst i brosk 1 men har nyligen ven terfunnits i senor 4 samt i synovialmembran 5 Det har inte varit m jligt att sp ra COMP i odlingssubstrat fr n annan bindv v s som hud eller lungv vnad 6 Det r v l dokumenterat 7 8 9 10 att n r ledbroskmatrix bryts ned i en sjukdomsprocess produceras proteinfragment som diffunderar ut i ledv tskan Vissa av dessa proteiner s som COMP visar sig sedan i blodet och kan anv ndas f r att kartl gga broskf rst ringen vid inflammatoriska ledsjukdomar som reumatoid artrit 8 11 och osteoartrit 12 13 14 Genom att anv nda r ntgenf r ndringar som klinisk surrogatslutpunkt har man p visat en kvantitativ relation mellan COMP koncentrationen i serum och broskf rst ring 10 Denna har ytterligare styrkts genom experimentellt framkallad artrit i djurmodeller d r COMP serumniv n korrelerade starkt med artritens sv righetsgrad 15 16 och ven med klinisk scoring av leder och histopatologiska tecken p brosknedbrytning 16 SAMMANFATTNING AV METODEN COMP ELISA r en immunologisk best mningsmetod som utnyttjar tv antikroppar varav den ena r kopplad till fast fas Den baseras p den direkta sandwich teknik d r tv monoklonala antikroppar riktas mot separata antigen determinanter p COMP molekylen Under inkubationen reagerar COMP i provet med peroxidaskonjugerade anti COMP antikroppar och anti COMP antikroppar bundna till mikrotiterbrunnen Ett enkelt
32. ONS OF THE PROCEDURE A definitive clinical diagnosis should not be based on any single diagnostic method but should only be made by the physician after all clinical and laboratory findings have been evaluated WARRANTY The performance data presented here were obtained using the recommended procedure indicated Any change or modification in the procedure not recommended by AnaMar Medical may affect the results in which event AnaMar Medical disclaims all warranties expressed implied or statutory including the implied warranty of merchantability and fitness for use In such an event AnaMar Medical and its authorized distributors shall not be liable for damages indirect or consequential 11 EXPLANATION OF SYMBOLS USED ON LABELS n 96 Reagents for 96 determinations Expiry date Store at 2 8 C FI O Lot no O For In Vitro Diagnostic Use Manufactured by E VERWENDUNGSZWECK COMP ELISA ist ein Festphase Enzym Immunoassay zur Bestimmung des Cartilage Oligomeric Matrix Proteins COMP in Humanserum Die Anwesenheit erh hter Werte unter Ber cksichtigung aller klinischen Befunde und Laborbefunde ist eine Hilfe bei der Identifizierung voranschreitender Zerst rung von Gelenkgewebe bei Krankheiten wie Rheumatoider Arthritis RA ZUSAMMENFASSUNG DES TESTS COMP wurde erstmalig 1992 von der Forschergruppe von Professor Dick Heineg rd 1 der Universit t Lund Schweden beschrieben Bei dem Molek l handelt e
33. ROCEDUREBEPERKINGEN Een definitieve klinische diagnose dient niet op slechts n enkele diagnosemethode te zijn gebaseerd maar moet door de arts worden gedaan nadat alle klinische en laboratoriumondervindingen zijn ge valueerd GARANTIE De hier getoonde resultaatgegevens zijn verkregen met behulp van de aangegeven en aanbevolen procedure Enige wijziging of modificatie in de procedure welke niet door AnaMar Medical zijn aanbevolen kunnen het resultaat be nvloeden zodat AnaMar Medical afstand doet van alle uitgedrukte garanties impliciet of statutair hierbij inbegrepen de impliciete garantie van verkoopbaarheid en gebruiksdeugdelijkheid In het gegeven geval kunnen AnaMar en haar erkende distributeurs niet aansprakelijk worden gesteld voor directe of gevolgschade VERKLARING VAN DE OP ETIKETTEN GEBRUIKTE SYMBOLEN n 96 Reagentia voor 96 bepalingen Vervaldatum 8 C Bewaren bij 2 8 C Partij nr Voor diagnostisch in vitro gebruik ES md Vervaardigd door 64 APLICA O O COMP ELISA um ensaio de imunoabsor o enzim tica para a determina o da Prote na Oligom rica da Matriz Cartilaginosa COMP no soro humano A presen a de n veis elevados quando considerada em conjunto com outras descobertas laboratoriais e cl nicas uma ajuda na identifica o da destrui o agressiva dos tecidos das r tulas em doen as com a artrite reumat ide AR RESUMO E EXPLICA O DO TESTE A COMP foi descrita pela p
34. Voor elke partij controles zijn de concentraties COMP gedetermineerd door gebruik van AnaMar COMP ELISA De gemiddelde waarde en de standaardafwijking worden vermeld op de respectievelijke ampuletiketten Elke gemiddelde waarde is gebaseerd op zes herhalingen in zes opeenvolgende reeksen Zoals bij alle immunoanalyses zullen de resultaten worden be nvloed door testprocedures en uitrusting zoals door verschillende laboratoria wordt gebruikt Zodoende wordt aanbevolen dat elk laboratorium haar eigen gemiddelde waarden en acceptatiecriteria vaststelt bijv 2 S D of 3 S D Een reeks van 2 S D zou 95 van de enkelvoudige determinaties in een gegevensset met normale verdeling moeten omvatten Voorbeeld van een werkblad Wells Identiteit 1A B Monsterbuffer 1C D Kalibrator 0 4 U L 1E F Kalibrator 0 7 U L 1G H Kalibrator 1 2 U L 2A B Kalibrator 1 8 U L 2C D Kalibrator 3 2 U L 2E F Controle 1 2G H Controle 2 3A B Onbekende 1 Concentratie aangegeven op ampuletiket 60 IL Kalibratiecurve Hieronder wordt een kenmerkende kalibratiecurve getoond Gebruik deze curve niet om feitelijke analyseresultaten te bepalen 2 5 Aso COMP U L BEREKENING VAN RESULTATEN Computerberekening Er kan een computergestuurde datareductie van absorptie voor de kalibratoren versus de concentratie worden uitgevoerd door gebruik te maken van kubische spline regressie of vierparameter regressie teneinde de concentratie van COMP te
35. Waschger t waschen oder Reaktionsgemisch manuell absaugen 350 ul Waschl sung zu jeder Kavit t zugeben Vollst ndig absaugen Waschdurchgang 5 mal wiederholen Waschpufferreste gr ndlich entfernen indem die Kavit ten mit der Offnung nach unten mehrmals kr ftig auf eine saugf hige Unterlage aufgeschlagen werden 200ul Enzymsubstrat TMB zugeben 15 Min inkubieren bei Raumtemperatur 50 ul Stopp L sung zugeben Die Mikrotiterplatte zur gr ndlichen Durchmischung von Substrat und Stoppl sung 5 Sekunden lang auf dem Sch ttelger t sch tteln 10 Die Absorption bei 450 nm messen und auswerten ojoj NSP Qualit tskontrolle Die Absorption des niedrigsten COMP ELISA Kalibrators sollte ber der Absorption des COMP ELISA Proben Puffers liegen Die COMP ELISA Kontrolle 1 und 2 Konzentrationen sollte innerhalb des auf den Etiketten angegeben Wertebereichs liegen F r jede Kontrolle wurden die COMP Konzentrationen mittels AnaMar COMP ELISA ermittelt Der Mittelwert und die Standardabweichung sind auf dem jeweiligen Fl schchenetikett angegeben Jeder Mittelwert basiert auf vier Wiederholungen in sechs aufeinander folgenden Testans tzen Wie bei allen Immunoassays werden die Ergebnisse von den Testverfahren und ger ten der verschiedenen Labors beeinfluBt Daher wird empfohlen daf3 jedes Labor seine eigenen Mittelwerte und Akzeptanzkriterien ermittelt z B 2 S D oder 3 S D Ein Bereich von 2 S D
36. ala 1 fiala AVVERTENZE E PRECAUZIONI e Per l impiego diagnostico in vitro Non per uso interno o esterno in esseri umani o animali e contenuti di questo kit e i loro residui non devono venire in contatto con animali ruminanti o suini Questo kit contiene reagenti che possono essere infettivi Questo kit contiene reagenti prodotti da componenti del sangue umano Il materiale originale stato controllata con test immunologico per l antigene di superficie dell epatite B e per anticorpi contro il virus HIV e trovato negativo Ciononostante dovrebbero essere osservate tutte le precauzioni raccomandate per la manipolazione di sangue Fare riferimento alla pubblicazione HHS N CDC 88 8395 o alle disposizioni locali nazionali corrispondenti sulle procedure di sicurezza nei laboratori La Stop Solution consiste in una soluzione di acido solforico diluito Evitare di esporla a basi metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi L acido solforico un veleno ed corrosivo che pu essere tossico per ingestione Per prevenire ustioni chimiche evitare il contatto con pelle e occhi PROCEDUR Parametri della procedura Volume per pozzetto Campione 25 pl Coniugato 100 ul Substrato enzimatico 200 ul Stop solution 50 pl Tempo di incubazione e temperatura 1a incubazione 120 min su un agitatore per piastre a temperatura ambiente 20 28 C TA 2a incubazione 15 min a TA 48 Materiali necessari ma non forniti Mi
37. alle gefriergetrockneten Reagenzien vorschriftsmaBig aufgel st sind Sicherheitsdatenblatter sind auf Anfrage erh ltlich VORBEREITUNG VON UND UMGANG MIT PROBEN UND ENZYMKONJUGAT Proben Blut wird durch Venenpunktion entnommen und das Serum wird nach Koagulation durch Zentrifugieren getrennt Das Probenmaterial kann bei Raumtemperatur versandt oder falls innerhalb einer Woche nach Entnahme analysiert bei 2 8 C oder bei sp terer Analyse bei 20 C gelagert werden Es kann auch Heparin Plasma verwendet werden Hinweis EDTA Plasma und Zitrat Plasma sind f r die Testung nicht geeignet F r Anleitungen zur COMP Bestimmung aus anderen K rperfl ssigkeiten setzen Sie sich bitte mit AnaMar Medical in Verbindung Vorbereitung der Proben Serumprobe und Kontrollen werden 1 10 mit dem Proben Puffer verd nnt 20 ul Serum oder Kontrolle 180 ul Verd nner Vorbereitung des Enzymkonjugats Bereiten Sie das Enzymkonjugat durch Verd nnung des Enzymkonjugats 11x 1 10 im Konjugatpuffer vor Hinweis Gr Bere Konjugatmengen werden vorzugsweise durch eine sofortige Verd nnung der gesamten Menge hergestellt Mit anderen Worten gieBen Sie den gesamten Puffer in das Konjugat Puffer Fl schchen Vorsichtig mischen Verd nntes Konjugat bei 2 8 C bis zu vier Wochen aufbewahren Oder bereiten Sie die ben tigte Menge gem B der nachstehenden Tabelle zu Vorsichtig mischen 15 Streifenanzahl Enzym Konjugat Konjugat 11X
38. ar el estado actual del cart lago y el riesgo de destrucci n articular futura lt 12U L Disminuci n del riesgo de destrucci n articular agresiva 12 15 U L Aumento del riesgo de destrucci n articular agresiva gt 15U L Alto riesgo de destrucci n articular agresiva Un nivel elevado de VSG aumenta a n m s el riesgo de destrucci n articular agresiva en AR 17 CARACTER STICAS DE FUNCIONAMIENTO L mite de detecci n El l mite de detecci n es lt 0 1 U L Paralelismo Las muestras de suero fueron diluidas 10 20 y 40 veces usando el diluente de muestras Los valores observados Obtenidos Esperados para 1 20 y 1 40 estuvieron en el intervalo 93 116 Efecto gancho Las muestras diluidas a 1 10 pueden tener una concentraci n de por lo menos 200 U I sin dar unas concentraciones bajas de forma incorrecta Precision Cada muestra fue analizada en 4 replicados en seis ocasiones distintas Muestra Valor Coeficiente de variaci n medio U L dentro del entre ensayo ensayo ensayos total 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Notas Estudios realizados en AnaMar Medical Uppsala Suecia 43 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Un diagn stico cl nico definitivo no debe basarse en un nico m todo diagn stico sino que debe ser hecho por el m dico s lo despu s de haber sido evaluados todos los resultados cl nicos y de laboratorio GARANT A Los datos del funcionamiento aqu pr
39. as muestras desconocidas en la curva de calibraci n 3 Multiplicar los resultados por el factor de diluci n x10 4 VALORES ESPERADOS Valores esperados en donantes de sangre La pr ctica generalmente aceptada prescribe que cada laboratorio establezca su propia gama esperada de valores Los resultados siguientes pueden servir como gu a hasta que el laboratorio haya recopilado suficientes datos propios Todas las muestras eran muestras de suero recogidas en donantes de sangre en Suecia n 336 hembras 157 20 73 afios varones 179 19 73 afios x 10 2 media 10 0 95 15 0 Frecuencia 10 12 14 COMP U L COMP en AR temprana y tard a En un estudio realizado en 183 pacientes con artritis reumatoide la concentraci n de COMP en las inclusiones estaba relacionada con el riesgo de destrucci n extensiva de articulaci n pequefia tras 5 afios La proporci n por unidad COMP en suero era de 1 21 intervalo de confianza CI 1 07 1 36 p lt 0 002 Estos datos se utilizaron para estimar el riesgo relativo de desarrollar destrucci n de articulaci n por encima del percentil 75 Escala Larsen gt 59 de 200 despu s de 5 a os 17 Otros datos publicados por Skoumal M et al indican que esta relaci n con la destrucci n de articulaci n pequefia tambi n se observa en pacientes con enfermedad antigua prolongada 18 42 Interpretaci n Utilizar las directrices siguientes para evalu
40. at spectrofotometrisch kan worden afgelezen 55 REAGENTIA Elke COMP ELISA kit bevat reagentia voor 96 wells hetgeen voldoende is voor n kalibratiecurve een blanco proef twee controles en 40 monsters in tweevoudige uitvoering Voor meer omvangrijke analyseseries dienen de gezamenlijke reagentia te worden gebruikt uit verpakkingen met identieke partijnummers De vervaldatum voor de complete kit wordt op het label aan de buitenzijde vermeld De aanbevolen opslagtemperatuur is 2 8 C Anti COMP gecoate plaat 1 plaat 96 wells Klaar voor gebruik monoclonale antistoffen 8 well strips Bewaren bij 2 8 C tot de vervaldatum oorsprong muis Voor niet gebruikte microtitratiestrips de zak weer hersluiten en bewaren bij 2 8 C gedurende hoogstens 2 maanden Kalibratoren 5 ampullen 1 0 ml Vriesgedroogd menselijk COMP in buffer Bewaren bij 2 8 C tot de vervaldatum Concentratie aangegeven op 1 0 ml gedistilleerd water per ampul ampuletiket toevoegen Opgelost standaard bewaren bij 2 8 C gedurende 4 weken of bij 20 C tot de vervaldatum Monsterbuffer 2 ampullen 7 5 ml Klaar voor gebruik Bewaren bij 2 8 C tot de vervaldatum Enzymconjugaat 11x 1 ampul 1 3 ml Concentraat Peroxidase anti COMP Bewaren bij 2 8 C tot de vervaldatum monoclonale antistoffen Bereiden zie de tabel oorsprong muis 10 pg ml Niet bevriezen Conjugatiebuffer 1 ampul 13 ml Klaar voor gebruik Kleurcode blauw Bewaren bij 2 8 C tot de ver
41. ata de validade Controlo 1 Liofilizado COMP humana em tamp o Junte 0 5 mL de gua destilada Controlo reconstitu do armazene entre 2 e 8 C durante 4 semanas ou a 20 C at data de validade Nota Certifique se de que os reagentes liofilizados s o dilu dos correctamente Folha de Dados de Seguran a do Material dispon vel a pedido PREPARA O E MANUSEAMENTO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO DA ENZIMA Amostras O sangue deve ser colhido por pun o venosa deixar coagular e o soro deve ser separado por centrifuga o As amostras podem ser armazenadas temperatura ambiente apenas para efeitos de transporte a uma temperatura entre 2 e 8 C se ensaiadas num per odo de uma semana ap s a colheita ou a uma temperatura de 20 C para ensaios posteriores Contacte a AnaMar para obter conselhos relativamente medi o da COMP em outros fluidos corporais O plasma em heparina tamb m pode ser utilizado Nota O plasma EDTA e o plasma com citrato n o podem ser utilizados Prepara o de amostras e controlos As amostras e os controlos devem ser dilu dos em 1 10 de tamp o da amostra 20 uL de soro 180 uL de tamp o da amostra Prepara o do conjugado da enzima Prepare o Conjugado da Enzima atrav s da dilui o do Conjugado da Enzima 11X 1 10 em tamp o do Conjugado da Enzima Nota Os volumes do conjugado s o preferivelmente ajustados atrav s da dilui o em conjunto e em simult neo Por ou
42. brator f rvaras i 2 8 C i 4 veckor eller i 20 C fram till utg ngsdatum F rdig att anv ndas F rvaras i 2 8 C fram till utg ngsdatum Koncentrat F rvaras i 2 8 C fram till utg ngsdatum F r beredning se tabell Frys ej F rdig att anv ndas F rvaras i 2 8 C fram till utg ngsdatum L s upp varje tablett i 500 ml destillerat vatten F rvara l sningen i 2 8 C Anv ndes inom 4 veckor F rdig att anv ndas F rvaras i 2 8 C fram till utg ngsdatum Ljusk nsligt F rdig att anv ndas F rvaras i 2 8 C fram till utg ngsdatum Kontroll 1 1 flaska Frystorkad humant COMP i buffertl sning Tills tt 0 5 ml destillerat vatten Rekonstituerad l sning f rvaras i 2 8 C i 4 veckor eller i 20 C fram till utg ngsdatum Kontroll 2 1 flaska Frystorkad humant COMP i buffertl sning Tills tt 0 5 ml destillerat vatten Rekonstituerad l sning f rvaras i 2 8 C i 4 veckor eller i 20 C fram till utg ngsdatum Obs Det r viktigt att alla frystorkade reagens r ordenligt uppl sta Varuinformationsblad finns tillg ngligt p beg ran FRAMST LLNING OCH HANTERING AV PROVER OCH ENZYMKONJUGAT Prover Blod b r samlas in genom venpunktion och till tas koagulera Serum separeras genom centrifugering Serum kan f rvaras i rumstemperatur endast vid frakt i 2 8 C om best mning sker inom en vecka fr n uppsamlingen eller i 20 C vid senare analys ven heparinplasma kan anv
43. cas evite o contacto com os olhos e com a pele PROCEDIMENTO Par metros do Procedimento Volumes por po o Amostra 25 uL Conjugado 100 pL Substrato da enzima 200 uL Solu o de paragem 50 uL 68 Tempo e Temperatura da Incubac o 1 2 Incuba o 120 min num agitador de placas temperatura ambiente 20 28 C RT 2 2 Incuba o 15 min a RT Materiais requeridos mas n o fornecidos Micropipetas de 25 uL com pontas descart veis Pipetas de repeti o de 50 uL 100 pL e 200 uL Copo de 1000 mL gua destilada Leitor de placas EIA com filtro de 450 nm Agitador de placas Dispositivo de lavagem para placas de microtitula o Material de Refer ncia Os Calibradores COMP s o calibrados de acordo com uma norma interna correlacionada com o ensiao de inibi o da COMP descrito por Saxne e Heineg rd em Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood Publicado no Jornal Brit nico de Reumatologia vol 31 p ginas 583 591 1992 Interfer ncia Foram adicionados componentes aos reagentes no kit para evitar a interfer ncia de anticorpos dos ratos e RF no soro humano a testar Procedimento do Teste Prepare uma curva do calibrador para cada teste Todos os reagentes e amostras dever o estar temperatura ambiente antes da sua utiliza o Os controlos dever o ser tratados como amostras Recomendamos que cada determina o para os calibradores e valore
44. contrada tambi n en tendones 4 y en membranas sinoviales 5 No ha sido posible detectar COMP en medio de cultivo de otros tejidos conjuntivos tales como la piel o tejido pulmonar 6 Se ha documentado 7 8 9 10 que cuando la matriz cartilaginosa articular se degrada debido a un proceso pat geno se producen fragmentos de prote na que se difunden en el fluido de la articulaci n Algunas de estas prote nas tales como COMP aparecen despu s en la circulaci n sangu nea y pueden utilizarse para controlar el progreso de la degradaci n del cart lago en enfermedades articulares inflamatorias tales como la artritis reumatoide 8 11 y la osteoartritis 12 13 14 Se ha demostrado la existencia de una relaci n cuantitativa entre las concentraciones de COMP en suero y la degradaci n del cart lago 10 usando cambios radiogr ficos como punto final cl nico sustituto Esto se ha demostrado con m s detalle en artritis inducida experimentalmente en modelos animales donde el nivel de suero COMP mostr una alta correlaci n con la gravedad de la artritis 15 16 al igual que con el test cl nico articular y con signos histopatol gicos de erosi n cartilaginosa 16 PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO COMP ELISA es un inmunoensayo enzim tico de dos sitios de fase s lida Se basa en la t cnica directa tipo s ndwich en la que dos anticuerpos monoclonales son dirigidos contra determinantes antig nicos separados en la mol cula COMP Durante la
45. cropipetta da 25 ul con puntali monouso pipette a ripetizione da 50 ul 100 ul e 200 ul becher da 1000 ml Acqua distillata Lettore da piastre per test immunoenzimatici con filtro da 450 nm Agitatore per piastre Dispositivo di lavaggio per piastre da microtitolazione Materiale di riferimento calibratori COMP sono calibrati rispetto ad uno standard interno correlato al saggio di inibizione della COMP descritto da Saxne e Heineg rd in Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood pubblicato sul British Journal of Rheumatology vol 31 pp 583 591 1992 Interferenza Sono stati inseriti reagenti nel kit per prevenire eventuali interferenze causate dalla presenza di anticorpi di topo e fattori reumatoidi presenti nel siero del paziente Procedura di test Preparare una curva di calibrazione per ogni ciclo di saggio Prima di essere utilizzati tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente controlli devono essere trattati come campioni Si raccomanda di eseguire ogni determinazione in doppio per calibratori e incogniti Aggiunta ai pozzetti anti COMP 1 Calibratori 25 pl 2 Controlli e campioni diluiti 25 pl 3 Enzima coniugato 100 ul 4 Incubare in un agitatore e agitare con forza per es 250 rpm 16mm per 2 ore alla temperatura ambiente impostata 5 Lavare 6 volte con una macchina automatica per il lavaggio o Aspirare i
46. da r tula cl nica e os sinais histopatol gicos da eros o da cartilagem 16 REGRAS DO PROCEDIMENTO O COMP ELISA um imunoensaio de enzimas em dois locais de fase s lida Baseia se directamente na t cnica de sandu che na qual dois anticorpos monoclonais s o direccionados contra determinantes antig nicos na mol cula da COMP Durante a incuba o a COMP presente na amostra reage com os anticorpos da peroxidase conjugada anti COMP e os anticorpos anti COMP ligam se ao po o da microtitula o Um procedimento de lavagem da amostra remove os anticorpos rotulados com enzima n o ligados O conjugado ligado detectado por uma reac o com tetrametilbenzidina 3 3 5 5 TMB Esta reac o interrompida pela adi o de cido para proporcionar um ponto final colorim trico que lido espectrofotometricamente 65 REAGENTES Cada kit COMP ELISA cont m reagentes para 96 pocos o que suficiente para uma curva de calibra o um ensaio a branco dois controlos e 40 amostras em duplicado Para s ries de ensaios maiores utilize reagentes agrupados de embalagens que apresentem n meros de lote id nticos A data de validade do kit completo indicada na etiqueta exterior A temperatura de armazenamento recomendada entre 2 e 8 C Placa revestida com anti COMP 1 placa 96 po os Pronto a utilizar Anticorpos monoclonais de 8 tiras de po os Armazenar entre 2 e 8 C at data ratinho de validade Para tiras d
47. de ok nda proven fr n kalibreringskurvan 3 Multiplicera resultaten med sp dningsfaktorn X10 81 F RV NTADE V RDEN F rv ntade v rden hos bloddonatorer God sed f reskriver att varje laboratorium fastst ller sitt eget f rv ntade v rdeintervall F ljande resultat kan fungera som v gledning fram till dess att laboratoriet samlat ihop tillr ckliga egna data Alla prover var serumprov som insamlades fr n bloddonatorer i Sverige n 336 kvinnor 157 20 73 r m n 179 19 73 r x 10 2 median 10 0 95 e percentilen 15 0 Frekvens 10 12 COMP U L COMP i tidig och framskriden RA I en studie d r 183 patienter med reumatisk artrit deltog relaterades COMP koncentrationen vid inklusion till risken f r betydande f rst ring av sm leder efter 5 r Oddskvoten per COMP enhet i serum var 1 21 konfidensintervall KI 1 07 1 36 p lt 0 002 Dessa data anv ndes f r att v rdera den relativa risken att utveckla ledf rst ring ovan den 75 e percentilen Larsen Score gt 59 av 200 efter 5 r 17 Andra data publicerade av Skoumal M et al indikerar att denna relation till f rst ring av sm leder ven kan ses hos patienter med l ngvarig sjukdom 18 82 Tolkning F ljande riktlinjer kan anv ndas f r att utv rdera p g ende broskoms ttning och risk f r ledf rst ring i framtiden lt 12U L L gre risk f r aggressiv ledf rst ring 12 15 U L kad risk f r
48. e microtitula o n o utilizadas feche novamente a embalagem e armazene entre 2 e 8 C durante dois meses Calibradores 5 frascos 1 0 ml Liofilizado COMP humana em tamp o Armazenar entre 2 e 8 C at data Cocentra o indicada no r tulo de validade do frasco Junte 1 0 ml de gua destilada por frasco Calibrador reconstitu do armazene entre 2 e 8 C durante 4 semanas ou a 20 C at data de validade Tamp o da amostra 2 frascos 7 5 ml Pronto a utilizar Armazenar entre 2 e 8 C at data de validade Conjugado da enzima 11x 1 frasco 1 3 ml Pronto a utilizar Peroxidase anti COMP Armazenar entre 2 e 8 C at data Anticorpos monoclonais de de validade ratinho 10 ug mL Preparac o ver tabela N o congele Tamp o do conjugado 1 frasco 13 ml Pronto a utilizar Codificag o de cor azul Armazenar entre 2 e 8 C at data de validade Pastilhas de lavagem 2 pastilhas Dissolva cada pastilha em 500 ml de gua destilada Guarde a solu o a 2 8 C Utilizar no prazo de 4 semanas Substrato da enzima TMB 1 frasco 22 ml Pronto a utilizar Armazenar entre 2 e 8 C at data de validade Sens vel luz 66 Solu o de paragem 1 frasco Pronto a utilizar 0 5M H SO Armazenar entre 2 e 8 C at data de validade Controlo 1 Liofilizado COMP humana em tamp o Junte 0 5 mL de gua destilada Controlo reconstitu do armazene entre 2 e 8 C durante 4 semanas ou a 20 C at d
49. ecola della COMP Durante l incubazione la COMP nel campione reagisce con gli anticorpi anti COMP perossidasi coniugati legati al pozzetto da microtitolazione Una semplice fase di lavaggio rimuove anticorpo marcato con enzima non legato Il coniugato legato viene rilevato tramite una reazione con 3 3 5 5 tetrametilbenzidina TMB Questa reazione viene arrestata aggiungendo acido per attribuire un endpoint colorimetrico che viene letto spettrofotometricamente 45 REAGENTI Ogni kit COMP ELISA contiene reagenti per 96 pozzetti sufficiente per una curva di taratura una prova in bianco due controllie 42 campioni in doppio Per una pi ampia serie di saggi utilizzare una combinazione di reagenti da confezioni con il medesimo numero di lotto La data di scadenza del kit completo amp indicata sull etichetta esterna La temperatura di stoccaggio raccomandata amp di 2 8 C Piastra rivestita di anti COMP anticorpi monoclonali di topo Calibratori COMP umana in tampone Concentrazione indicata sull etichetta della fiala Tampone campioni Perossidasi anti COMP Enzima coniugato 11x anticorpi monoclonali di topo 10 pg ml Tampone coniugato Codice colore blu Pastiglie di detersivo Substrato enzimatico TMB Soluzione di arresto 0 5M H SO 1 piastra 96 pozzetti strisce da 8 pozzetti 5 fiale 1 0 ml 2 fiale 7 5 ml 1 fiala 1 3 ml 1 fiala 13 ml 2 compresse 1 fiala 22 ml 1 fiala 7 ml 46
50. elige skader eller folgeskader SYMBOLER P M ERKATERNE n 96 Reagenser til 96 bestemmelser T Udl bsdato Ke Opbevares ved 2 8 C LOT Lot nr Til diagnostisk anvendelse in vitro Produceret af E 94 REFERENCES REFERENZEN R F RENCES REFERENCIAS RIFERIMENTI REFERENTIES BIBLIOGRAFIA REFERENSER REFERENCER 1 Hedbom E Antonsson P Hjerpe A Aeschlimann Paulsson M Rosa Pimentel E et al Cartilage matrix proteins An acidic oligomeric protein COMP detected only in cartilage J Biol Chem 1992 267 6132 6 2 Oldberg A Antonsson P Lindblom K Heinegard D COMP cartilage oligomeric matrix protein is structurally related to the thrombospondins J Biol Chem 1992 267 22346 50 3 Zaia J Boynton RE Mcintosh A Marshak DR Olsson H Heinegard D et al Post translational modifications in cartilage oligomeric matrix protein Characterization of the N linked oligosaccharides by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry J Biol Chem 1997 272 14120 4 DiCesare P Hauser N Lehman D Pasumarti S Paulsson M Cartilage oligomeric matrix protein COMP is an abundant component of tendon FEBS Lett 1994 354 237 40 5 DiCesare PE Carlson CS Stollerman ES Chen FS Leslie M Perris R Expression of cartilage oligomeric matrix protein by human synovium FEBS Lett 1997 412 249 52 6 Recklies AD Baillargeon L White C Regulation of cartilage oligomeric matrix protein synthesis i
51. en hiervoor naar de HHS Publicatie nr CDC 88 8395 of gelijkwaardige plaatselijke nationale richtlijnen ten aanzien van veiligheidsprocedures voor laboratoria De stopoplossing bestaat uit een verdunde zwavelzuuroplossing Vermijd blootstelling aan basen metalen of andere samenstellingen die met zuren kunnen reageren Zwavelzuur is giftig en corrosief en kan bij opname door de mond toxisch zijn Om chemische verbranding te voorkomen contact met huid en ogen vermijden PROCEDURE Parameters van de procedure Volumes per well Monster 25 ul Conjugaat 100 ul Enzymsubstraat 200 ul Stopoplossing 50 ul Incubatietijd en temperatuur 1 incubatie 120 min op schudapparatuur op kamer temperatuur 20 28 C RT 2 incubatie 15 min op RT 58 Vereist materiaal maar niet geleverd 25 ul micropipette met wegwerppunten 50 ul 100 ul en 200 ul herhaalpipetten 1000 ml bekerglas Gedistilleerd water EIA plaatlezer met 450 nm filter Schudapparatuur Wasinstallatie voor microtitratieplaten Referentiemateriaal COMP Kalibratoren zijn gekalibreerd ten opzichte van een interne standaard gecorreleerd aan de COMP inhibitie analyse beschreven door Saxne en Heineg rd in Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood Gepubliceerd in het British Journal of Rheumatology vol 31 pp 583 591 1992 Interferentie Er zijn componenten aan reagentia in de kit toegevoegd teneinde inter
52. er for approximately 5 seconds to ensure mixing of substrate and stop solution 10 Measure absorbance at 450 nm and evaluate o o Quality Control The absorbance of the lowest COMP ELISA Calibrator should be greater than the absorbance of the COMP ELISA sample buffer The COMP ELISA Control 1 and 2 concentrations should be within the range of the values stated on its label For each lot of controls the concentrations of COMP have been determined using COMP ELISA from AnaMar The mean value and standard deviation are stated on the respective vial label Each mean value is based on six replicates in six consecutive runs As with all immunoassays the results are affected by the testing procedures and equipment used by different laboratories It is therefore recommended that each laboratory establish its own mean values and criteria of acceptance e g 2 S D or 3 S D A range of 2 S D should encompass 95 of the single determinations in a data set with normal distribution Example of Worksheet Wells Identity 1A B Sample buffer blank 1C D Calibrators 0 4 U L 1E F Calibrators 0 7 U L 1G H Calibrators 1 2 U L 2A B Calibrators 1 8 U L 2C D Calibrators 3 2 U L 2E F Control 1 2G H Control 2 3A B Unknown1 Concentration indicated on vial label Calibrator curve A typical calibrator curve is shown below Do not use this curve to determine actual assay reults 2 5 2 0 1 5
53. er proprio conto Tutti i campioni erano campioni di siero prelevati da donatori di sangue in Svezia n 336 femmina 157 20 73 anni maschio 179 19 73 anni x 10 2 mediana 10 0 95 15 0 Frequenza 10 12 14 COMP U L COMP in AR in fase iniziale e avanzata In uno studio su 183 pazienti affetti da artrite reumatoide la concentrazione di COMP all inclusione era correlata al rischio di distruzione estesa delle piccole articolazioni dopo 5 anni Il rapporto di probabilit per unit di COMP nel siero stata di 1 21 intervallo di confidenza IC 1 07 1 36 p lt 0 002 Questi dati sono stati utilizzati per stimare il rischio relativo di sviluppare distruzione articolare al di sopra del 75mo percentile Score di Larsen gt 59 su 200 dopo 5 anni 17 Altri dati pubblicati da Skoumal M et al Indicano che questa correlazione con la distruzione delle piccole articolazioni osservata anche in pazienti con patologie perduranti da lungo tempo 18 52 Interpretazione Le seguenti direttive possono essere utilizzate per valutare il ricambio di cartilagine in corso e il rischio di distruzione articolare in futuro lt 12U L Basso rischio di distruzione articolare aggressiva 12 15 U L Rischio crescente di distruzione articolare aggressiva gt 15 U L Rischio elevato di distruzione articolare aggressiva Un livello elevato di ESR aumenta ulteriormente il rischio di distruzione articolare aggr
54. era Tesimetod F rbered en kalibratorkurva f r varje best mningsomg ng Alla reagenser och prover skall ha rumstemperatur innan de anv nds Kontroller b r behandlas som prover Vi rekommenderar att varje best mning f r kalibratorer och ok nda utf rs i duplikat Tills tt i anti COMP brunnar 1 Kalibratorer 25 ul 2 Utspadda kontroller och utsp dda prover 25 ul 3 Enzymkonjugat 100 pl 4 Inkubera i rumstemperatur p en skak f r plattor Skaka kraftigt t ex 250 rpm 9 16mm under tv timmar 5 Tv tta 6 ggr i automattv tt eller Aspirera reaktionsvolymen Tills tt 350 ul tv ttl sning i varje brunn Aspirera torrt Upprepa 5 ggr Efter sista tv tten v nd plattan och knacka den mot absorberande papper 6 Tills tt 200 ul Enzymsubstrat TMB Inkubera 15 minuter 79 8 Tills tt 50 ul stoppl sning 9 Placera plattan p en skak f r plattor i omkring 5 sekunder f r att vara s ker p att substrat och stoppl sning blandas 10 M t absorbans vid 450 nm och utv rdera Kvalitetskontroll Absorbansen av den l gsta COMP ELISA kalibratorn b r vara st rre n absorbansen av COMP ELISA provbuffert Koncentrationen f r COMP ELISA Kontroll 1 och 2 b r ligga inom det intervall som anges p etiketten For varje tillverkning av kontroller har COMP koncentrationerna best mts genom att anv nda COMP ELISA fr n AnaMar Medelv rdet och standardavvikelsen anges p respektive flask
55. esentados fueron obtenidos usando el procedimiento recomendado indicado Todo cambio o modificaci n del procedimiento no recomendado por AnaMar Medical puede afectar a los resultados en cuyo caso AnaMar Medical rechaza todas las garant as expl citas impl citas o legales incluida la garant a impl cita de comerciabilidad e idoneidad para el uso En tal caso AnaMar Medical y sus distribuidores autorizados no ser n responsables de los da os directos o consecuenciales EXPLICACI N DE LOS S MBOLOS UTILIZADOS EN LAS ETIQUETAS n 96 Reactivos para 96 determinaciones Fecha de caducidad 8 C Conservar a 2 8 C Lote N Para diagn stico in vitro Fabricado por Es md 44 UTILIZZO PREVISTO COMP ELISA un saggio immunoenzimatico quantitativo per la determinazione della proteina oligomerica della matrice cartilaginea COMP nel siero umano La presenza di livelli elevati se considerata in congiunzione con altre evidenze cliniche e di laboratorio amp di aiuto nell identificare la distruzione aggressiva di tessuto delle articolazioni in malattie come l artrite reumatoide AR RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST La COMP stata descritta per la prima volta nel 1992 dal gruppo di ricerca del professor Dick Heineg rd 1 Universit di Lund Svezia La molecola amp una proteina pentamerica composta da cinque subunit identiche unite da ponti disolfuro 2 con una massa molecolare totale di 434 kDa 3 La COMP sta
56. essiva in AR 17 CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE Limite di rilevabilita Il limite di rilevabilita lt 0 1 U L Parallelismo campioni di siero sono stati diluiti 10 20 e 40 volte utilizzando il diluente campione I valori ottenuti attesi riscontrati per 1 20 e 1 40 erano nell intervallo 93 116 Effetto gancio I campioni diluiti a 1 10 possono presentare una concentrazione massima di almeno 200 U L senza fornire concentrazioni incorrettamente basse Precisione Ogni campione stato analizzato in 4 repliche in sei diverse occasioni Campione Valore Coefficiente di variazone medio U L entro tra totale saggio saggio saggio 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 27 3 3 3 18 0 1 7 4 2 4 5 Note Studi effettuati alla AnaMar Medical Uppsala Svezia 53 LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Una diagnosi clinica definitiva non deve basarsi su di un qualsiasi singolo metodo diagnostico bens deve essere effettuata solamente dal medico dopo che tutti i riscontri clinici e di laboratorio sono stati valutati GARANZIA I dati sulla prestazione qui presentati si sono ottenuti utilizzando la procedura raccomandata indicata Qualsiasi cambiamento o modifica della procedura non raccomandati da AnaMar Medical pu influenzare i risultati nel qual caso AnaMar Medical nega tutte le garanzie espresse implicite od obbligatorie compresa quella implicita di commerciabilita e adeguatezza all impiego In tale evento AnaMar Med
57. etikett Varje medelv rde baseras p sex replikat i sex p varandra f ljande omg ngar Som vid alla immunologiska best mningsmetoder p verkas resultaten av de provmetoder och den utrustning olika laboratorier anv nder Det rekommenderas d rf r att varje laboratorium fastst ller sina egna medelv rden och acceptanskriteria t ex 2 eller 3 standardavvikelser Ett standardavvikelseintervall p 2 b r omfatta 95 av de enskilda best mningarna i en dataupps ttning med normal distribution Exempel p arbetsblad Brunnar Identitet 1A B Provbuffert 1C D Kalibrator 0 4 U L 1E F Kalibrator 0 7 U L 1G H Kalibrator 1 2 U L 2A B Kalibrator 1 8 U L 2C D Kalibrator 3 2 U L 2E F Kontroll 1 2G H Kontroll 2 3A B Ok nd 1 Koncentration angiven p flaskans etikett 80 IL Kalibreringskurva En typisk kalibreringskurva visas nedan Anv nd inte denna kurva f r att fastst lla sj lva testresultaten 2 5 Aso COMP U L UTR KNING AV RESULTAT Datoriserad ber kning En datoriserad datareduktion av kalibratorernas absorbans som funktion av koncentrationen anv nds genom att till mpa kubisk spline eller fyrparametrisk regression Multiplicera koncentrationen f r de ok nda proven med sp dningsfaktorn X10 Manuell ber kning 1 Plotta de absorbansv rden som erh lls f r kalibratorerna mot COMP koncentrationen p ett lin log papper och konstruera en kalibreringskurva 2 Avl s koncentrationen f r
58. ferentie van muis en RF antistoffen die aanwezig zijn in de pati ntsera te voorkomen Testprocedure Bereid een kalibratiecurve voor elke analysereeks Alle reagentia en monsters dienen voor gebruik op kamertemperatuur te worden gebracht Controles moeten worden behandeld als monsters Wij raden u aan elke determinatie voor kalibratoren en onbekenden in tweevoud uit te voeren Toevoegen aan anti COMP wells 1 Kalibratoren 25 pl 2 Verdunde controles en verdunde monsters 25 pl 3 Enzymconjugaat 100 ul 4 Incuberen op schudinstallatie en gedurende 2 uur flink schudden bijv 250 rpm 16mm op kamertemperatuur op setting 5 6 keer spoelen met automatische wasser of het reactievolume opzuigen Voeg 350 ul wasoplossing toe aan elke well Helemaal opzuigen 5 keer herhalen Na de laatste spoeling de plaat omkeren en stevig tegen absorberend papier slaan 6 Voeg 200 ul enzymsubstraat TMB toe 59 7 Incuberen gedurende 15 minuten 8 Voeg 50 ul stopoplossing toe 9 Zet de plaat gedurende 5 seconden op de schudinstallatie om de menging van substraat en stopoplossing te waarborgen 10 Meet de absorptie bij 450 nm en evalueer het resultaat Kwaliteitscontrole De absorptie van de laagste COMP ELISA kalibrator moet groter zijn dan de absorptie van de COMP ELISA monsterbuffer De COMP ELISA Controle 1 en 2 concentraties moeten binnen het bereik van de op het etiket aangegeven waarden liggen
59. ffer Bem rk Konjugatm ngderne skal helst justeres ved fortynding p n gang Med andre ord skal al bufferen h ldes i h tteglasset med konjugat Bland forsigtigt Opbevar det fortyndede konjugat ved 2 8 C i op til 4 uger Alternativt kan den n dvendige m ngde pr pareres i henhold til nedenst ende tabel Bland forsigtigt 87 Antal strimler Enzym Konjugat konjugat 11X buffert 4 strimler 350 ul 3 5 ml 6 strimler 500 pl 5 0 ml 12 strimler 1 heetteglas 1 heetteglas ARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER e Til diagnostisk anvendelse in vitro Ikke beregnet til indvendig eller udvendig anvendelse p mennesker eller dyr e Indholdet af dette s t samt eventuelle residuer m ikke komme i kontakt med drovtyggere eller svin Dette seet indeholder reagenser som kan veere smitsomme Dette seet indeholder reagenser der er fremstillet af humane blodkomponenter Kildematerialet er blevet testet med immunanalyse for hepatitis B overfladeantigen og for antistoffer mod HIV og er konstateret negativ Alligevel skal alle anbefalede forsigtighedsregler for h ndtering af blodderivater overholdes Der henvises til HHS Publication no CDC 88 8395 eller de tilsvarende lokale nationale retningslinjer for sikkerhedsprocedurer for laboratorier Stopoplesningen best r af fortyndet svovisyreoplasning Undg kontakt med baser metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer Svovlsyre er et giftigt og korroderende stof som
60. g 40 prover i to eksemplarer Til st rre reekker analyser anvendes sammenlagte reagenser fra pakninger med identiske lot numre Udlebsdatoen for hele seettet er angivet p den udvendige meerkat Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2 8 C Anti COMP belagt plade monoklonale antistoffer fra mus Kalibratorer human COMP i buffer Koncentration oplyst p heetteglassets etiket Provebuffer Enzymkonjugat 11x Peroxidase anti COMP monoklonale antistoffer fra mus 10 pg ml Konjugatbuffer Bla farvekode Tvattabletter Enzymsubstrat TMB Stopoplesning 0 5M H SO 1 plade 96 br nde 8 br ndstrimler 5 h tteglas 2 h tteglas 1 flaske 1 h tteglas 2 tabletter 1 h tteglas 22 ml 1 h tteglas 7 ml 86 Klar til brug Opbevares ved 2 8 C indtil udl bsdatoen Hvis der er ubrugte mikrotitrerings strimler tilbage lukkes posen igen og opbevares ved 2 8 C i to m neder Lyofiliserede Opbevares ved 2 8 C indtil udl bsdatoen Tils t 1 0 ml destilleret vand pr heetteglas Rekonstitueret kalibrator opbevares ved 2 8 C 4 uger eller ved 20 C indtil udlobsdatoen Klar til brug Opbevares ved 2 8 C indtil udlobsdatoen Koncentrat Opbevares ved 2 8 C indtil udlobsdatoen Preeparation se tabel M ikke nedfryses Klar til brug Opbevares ved 2 8 C indtil udlobsdatoen L s upp varje tablett i 500 ml destillerat vatten F rvara l sningen i 2 8 C Anv ndes inom 4
61. ger sine egne gennemsnitsv rdier og acceptkriterier f eks 2 S D eller 3 S D Et omr de p 2 S D b r omfatte 95 af de enkelte bestemmelser i et datas t med normal fordeling Eksempel p arbejdsark Br nde Betegnelse 1A B Pr vebuffer 1C D Kalibratorer 0 4 U L 1E F Kalibratorer 0 7 U L 1G H Kalibratorer 1 2 U L 2A B Kalibratorer 1 8 U L 2C D Kalibratorer 3 2 U L 2E F Kontrol 1 2G H Kontrol 2 3A B Ukendt1 Koncentration oplyst p heetteglassets etiket 90 IL Kalibratorkurve En typisk kalibreringskurve vises i nedenst ende Brug ikke denne kurve til fastl ggelse af de faktiske analyseresultater 2 5 Aso COMP U L BEREGNING AF RESULTATER Beregning p computer Datareduktion af absorbansen for kalibratorerne kontra koncentrationen kan udf res p computer med anvendelse af cubic spline eller fire parameterregression med henblik p at beregne koncentrationen af COMP Koncentrationen af de ukendte prover multipliceres med fortyndingsfaktoren f eks X 10 Manuel beregning 1 Plot veerdierne for absorbans der er indhentet for kalibratorerne i forhold til COMP koncentrationen ind p et lin log papir og konstruer en kalibratorkurve 2 Aflees koncentrationen af de ukendte prover p kalibratorkurven 3 Multiplicer resultaterne med fortyndingsfaktoren x10 91 FORVENTEDE V ERDIER Forventede veerdier for bloddonorer Som god praksis b r det enkelte laboratorium fastl gge
62. ibra o 2 Leia a concentra o das amostras desconhecidas a partir da curva de calibra o 3 Multiplique os resultados pelo factor de dilui o x10 71 VALORES ESPERADOS Valores esperados em dadores de sangue Uma boa pr tica dita que cada laborat rio deve estabelecer o seu pr prio intervalo de valores esperados Os resultados que se seguem poder o servir de guia at que o laborat rio tenha recolhido dados suficientes as amostras eram amostras de soro recolhidas de dadores de sangue na Su cia n 336 mulher 157 20 73 anos homem 179 19 73 anos x 10 2 m dia 10 0 95 15 0 Frequ ncia 10 12 14 16 COMP U L COMP em RA precoce e tardio Num estudo de 183 doentes de artrite reumat ide a concentra o de COMP na inclus o foi relacionada com o risco de uma destrui o da r tula pequena extensiva ao fim de 5 anos A rela o por unidade de COMP no soro foi de 1 21 intervalo de confian a CI 1 07 1 36 p lt 0 002 Estes dados foram utilizados para realizar uma estimativa do valor previs vel positivo PPV e o risco relativo de desenvolvimento de uma destrui o da r tula acima dos 75 pontua o Larsen gt 59 de 200 ao fim de 5 anos 17 Outros dados publicado por Skoumal M et al indicam que esta rela o com a destrui o da r tula tamb m identificada em doentes com doen as prolongadas 18 72 Interpreta o As directrizes que se seguem
63. ical ed i suoi distributori autorizzati non saranno responsabili di danni diretti o conseguenti SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI UTILIZZATI SULLE ETICHETTE n 96 Reagenti per 96 determinazioni Data di scadenza Stoccaggio a 2 8 C do 3 O Lotto n Per l impiego diagnostico in vitro Prodotto da ES md 54 BEOOGD GEBRUIK COMP ELISA is een kwantitatieve enzyme linked immunosorbente analyse voor het bepalen van Cartilage Oligomeric Matrix Protein COMP in menselijk serum De aanwezigheid van verhoogde niveaus bij afweging in samenhang met andere klinische en laboratoriumondervindingen is een hulpmiddel bij het vaststellen van agressieve aantasting van gewrichtsweefsel bij ziektes als reumato de artritis RA SAMENVATTING EN TOELICHTING OP DE TEST COMP werd voor de eerste keer in 1992 beschreven door de researchgroep van professor Dick Heineg rd 1 aan de Universiteit van Lund Zweden De molecule is een pentamerische prote ne van vijf identieke disulfide geketende subunits 2 met een totale moleculaire massa van 434 kDa 3 COMP werd eerst beschreven in kraakbeen 1 maar is onlangs ook gevonden in spierpezen 4 en synoviaal vlies 5 Het is niet mogelijk geweest om COMP te ontdekken in kweken van andere bindweefsels zoals huid of longweefsel 6 Hetis voldoende gedocumenteerd 7 8 9 10 dat er wanneer gewrichtskraakbeenmatrix degenereert door een ziekteproces prote nefragmenten worden geproduceerd die via diffu
64. il expiry date Control 2 1 vial LyophilizedAdd 0 5 ml distilled water human COMP in buffer 0 5 ml Reconstituted control store at 2 8 C for 4 weeks or at 20 C until expiry date Note Make sure that all lyophilized reagents are properly dissolved Material Safety Data Sheet is available upon request 4 PREPARATION AND HANDLING OF SAMPLES AND ENZYME CONJUGATE Samples Blood should be collected by venipuncture allowed to clot and the serum separated by centrifugation Specimens can be stored at room temperature for shipping purpose only at 2 8 C if assayed within one week after collection or at 20 C if assayed later Heparin plasma can also be used Note EDTA plasma and citrate plasma cannot be used Contact AnaMar for advice regarding measurement of COMP in other body fluids Preparation of samples and controls Samples and controls should be diluted 1 10 in sample buffer 20 ul serum 180 ul sample buffer Preparation of Enzyme Conjugate Prepare the enzyme conjugate by dilution of enzyme conjugate 11X 1 10 in conjugate buffer Note Conjugate volumes are preferably adjusted by diluting all at once In other words pour all of the buffer into the conjugate vial Mix gently Store diluted conjugate at 2 8 C for up to four weeks Or prepare the needed volume according to the table below Mix gently Number of strips Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 4 strips 350 ul 3 5 ml 6 strip
65. incubaci n COMP en la muestra reacciona con anticuerpos anti COMP conjugados con peroxidasa y anticuerpos anti COMP ligados al espacio de microtitulaci n Un sencillo paso de lavado elimina el anticuerpo no ligado de marcaci n enzim tica El conjugado ligado se detecta por una reacci n con 3 3 5 5 tetrametilbencidina TMB Esta reacci n se detiene a adiendo cido para dar un punto final colorim trico que se lee de forma espectrofotom trica 35 REACTIVOS Cada kit de COMP ELISA contiene reactivos para 96 espacios lo que es suficiente para una curva de calibraci n uno vacio dos controles y 40 muestras en duplicado Para series de ensayos mayores se deben usar reactivos agrupados de envases que lleven n meros de lote id nticos La fecha de caducidad de todo el kit se indica en la etiqueta externa La temperatura de conservaci n recomendada es de 2 8 C Placa revestida Anti COMP anticuerpos monoclonalest de rat n Calibradores COMP humana en amortiguador Concent Concentraci n indicada en la etiqueta del vial Amortiguador de muestra Conjugado enzim tico 11x Anti COMP conjugado con peroxidasa anticuerpos monoclonales de rat n 10 g ml Amortiguador conjugado Color codificado azul Pastillas de lavado Substrato enzim tico TMB Soluci n tope 0 5M H SO 1 placa 96 espacios Listo para usar tiras de 8 espacios Conservar a 2 8 C hasta la fecha de caducidad Las tiras de
66. kan veere toksisk ved indtagelse For at forebygge kemiske forbreendinger skal kontakt med hud og gjne undg s PROCEDURE Procedurens parametre Meengder pr br nd Prove 25 ul Konjugat 100 yl Enzymsubstrat 200 pl Stopoplesning 50 ul Inkubationstid og temperatur 1 inkubation 120 min p en pladeryster ved stuetemperatur 20 28 C 2 inkubation 15 min ved stuetemperatur 88 Nodvendige materialer der ikke er vedlagt 25 ul mikropipette med engangsspidser 50 ul 100 ul og 200 ul gentagende pipetter 1000 ml beegerglas Destilleret vand EIA pladel ser med 450 nm filter Pladeryster Vaskeanordning til mikrotitreringsplader Referencemateriale COMP kalibratorerne er kalibreret i forhold til en intern standard som er sammenlignet med en COMP inhibitionsassay der er beskrevet af Saxne og Heineg rd i Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood udgivet i British Journal of Rheumatology vol 31 pp 583 591 1992 Interferens Reagenserne i s ttet er tilsat komponenter for at forebygge interferens fra muse og RF antistoffer i patientens sera Testprocedure Udarbejd en kalibratorkurve for hver analysekorsel Alle reagenser og prover skal have opn et stuetemperatur inden brug Kontrollerne skal behandles som prover Det anbefales at hver bestemmelse udfores i to eksemplarer for kalibratorer og ukendte prover Tilseet i anti COMP brondene 1
67. l volume di reazione Aggiungere 350 ul di soluzione di lavaggio a ogni pozzetto Aspirare completamente Ripetere 5 volte Dopo il lavaggio finale capovolgere e picchiettare con forza contro carta assorbente 49 Aggiungere 200 ul di substrato enzimatico TMB Incubare per 15 minuti Aggiungere 50 ul di Stop solution Porre la piastra sull agitatore per circa 5 secondi per assicurare la miscelazione di substrato e Stop solution 10 Misurare l assorbanza a 450 nm e valutare o 3 o Controllo di qualit Lassorbanza del calibratore COMP ELISA minimo deve essere superiore a quella del campione COMP ELISA La concentrazione dei controlli 1 e 2 COMP ELISA deve essere compresa nell intervallo di valori riportato sull etichetta ControlsLe concentrazioni di COMP di ogni lotto di controlli sono state determinate utilizzando COMP ELISA di AnaMar Il valore medio e la deviazione standard sono riportati sulle rispettive etichette delle fiale Tutti i valori medi sono basati su sei repliche in sei cicli consecutivi Come per tutti i test immunologici i risultati sono influenzati dalle procedure e dalle apparecchiature di prova utilizzate dai diversi laboratori Pertanto si raccomanda che ogni laboratorio definisca i propri valori medi e criteri di accettazione ad es 2 D S o 3 D S Un intervallo di 2 D S deve comprendere il 95 delle singole determinazioni in un set di dati con distribuzione normale E
68. licite concernant le caract re propre la commercialisation et l ad quation a un usage particulier AnaMar Medical et ses distributeurs agr s ne pourront dans un tel cas tre tenus pour responsables des dommages qui pourraient en r sulter directement ou indirectement 32 SIGNIFICATION DES SYMBOLES SUR LES TIQUETTES n 96 R actifs pour 96 tests Date limite d utilisation conserver une temp rature de 2 8 C gt EJ Lot n re sl E Uniquement pour usage diagnostic in vitro Fabriqu par E 33 USO DESEADO El COMP ELISA es un ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas que se utiliza para la detecci n de la prote na oligom rica de la matriz del cart lago COMP Cartilage Oligomeric Matrix Protein en suero humano La presencia de niveles elevados junto con otras conclusiones cl nicas y de laboratorio sirven de ayuda para poder identificar la destrucci n agresiva de los tejidos de las articulaciones en enfermedades tales como artritis reumatoide AR SUMARIO Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA COMP fue descrita por primera vez en 1992 por el grupo de investigaci n del profesor Dick Heineg rd 1 de la Universidad de Lund Suecia La mol cula es una prote na pentam rica compuesta por cinco subunidades id nticas enlazadas por puentes de disulfuro 2 con una masa molecular total de 434 kDa 3 COMP fue descrita por primera vez en cart lago 1 pero ltimamente ha sido en
69. lot numbers The expiry date for the complete kit is stated on the outer label The recommended storage temperature is 2 8 C Anti COMP Coated Plate 1 plate 96 wells Ready for use Mouse monoclonal 8 well strips Store at 2 8 C until expiry date antibodies For unused microtitration strips reseal the bag and store at 2 8 C for two months Calibrators 5 vials 1 0 ml Lyophilized human COMP in buffer Store at 2 8 C until expiry date Concentration indicated on Add 1 0 ml distilled water per vial vial label Reconstituted calibrator store at 2 8 C for 4 weeks or at 20 C until expiry date Sample Buffer 2vials 7 5ml Ready for use Store at 2 8 C until expiry date Enzyme Conjugate 11x 1 vial 1 3 ml Concentrate Peroxidase anti COMP Store at 2 8 C until expiry date Mouse monoclonal antibodies Preparation see table 10 pg ml Do not freeze Conjugate Buffer 1 vial 13 ml Ready for use Color coded blue Store at 2 8 C until expiry date Wash tablets 2 tablets Dissolve each tablet in 500 ml distilled water Store wash solution at 2 8 C Use within 4 weeks Enzyme Substrate TMB 1 vial 22 ml Ready for use Store at 2 8 C until expiry date Light sensitive Stop Solution 1 vial 7 ml Ready for use 0 5 M H SO Store at 2 8 C until expiry date Control 1 1 vial 0 5 ml LyophilizedAdd 0 5 ml distilled water human COMP in buffer Reconstituted control store at 2 8 C for 4 weeks or at 20 C unt
70. microtitulaci n que no se utilicen pueden volver a guardarse en la bolsa cerrada durante dos meses a una temperatura de 2 8 C 5 viales 1 0 ml Liofilizado Conservar a 2 8 C hasta la fecha de caducidad A adir 1 0 ml de agua destilada por vial Est ndar reconstituido conservar a 2 8 C durante 4 semanas o bien a 20 C hasta la fecha de caducidad 2 viales 7 5 ml Listo para usar Conservar a 2 8 C hasta la fecha de caducidad 1 vial 1 3 ml Concentrado Conservar a 2 8 C hasta la fecha de caducidad Preparaci n consulte la tabla NO CONGELAR 1 vial 13 ml Listo para usar Conservar a 2 8 C hasta la fecha de aducidad 2 pastillas Disolver cada pastilla en 500 ml de agua destilada Conservar la soluci n a 2 8 Utilizar dentro de un plazo de 4 semanas 1 vial 22 ml Listo para usar Conservar a 2 8 C hasta la fecha de caducidad SENSIBLE A LA LUZ 1 vial 7 ml Listo para usar Conservar a 2 8 C hasta la fecha de caducidad 36 Control 1 Liofilizado COMP humana en A adir 0 5 ml de agua destilada amortiguador Control reconstituido conservar a 2 8 C durante una semana o a 20 C hasta la fecha de caducidad Control 2 Liofilizado COMP humana en A adir 0 5 ml de agua destilada amortiguador Control reconstituido conservar a 2 8 C durante una semana o a 20 C hasta la fecha de caducidad Nota Debe asegurarse de que todos los reactivos liofilizados est n disueltos del mod
71. n human synovial cells and articular chondrocytes Arthritis Rheum 1998 41 997 1006 7 Neidhart M Hauser N Paulsson M DiCesare PE Michel BA Hauselmann HJ Small fragments of cartilage oligomeric matrix protein in synovial fluid and serum as markers for cartilage degradation Br J Rheumatol 1997 36 1151 60 8 M nsson B Carey D Alini M lonescu M Rosenberg LC Poole AR Heinegard D Saxne T Cartilage and bone metabolism in rheumatoid arthritis Differences between rapid and slow progression of disease identified by serum markers of cartilage metabolism J Clin Invest 1995 95 1071 7 9 M nsson B Geborek P Saxne T Cartilage and bone macromolecules in knee joint synovial fluid in rheumatoid arthritis relation to development of knee or hip joint destruction Ann Rheum Dis 1997 56 91 6 95 Marti C Neidhart M Gerber T Hauser N Michel BA H uselmann HJ Cartilage Oligomerix Matrix Protein COMP Die Rolle eines nichtkollagenen Knorpel Matrix Proteins als Marker der Krankenheitsaktivit t und Gelenkzerst rung bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und Arthrose Z Rheumatol 1999 58 79 87 Forslind K Eberhardt K Jonsson A Saxne T Increased serum concentrations of cartilage oligomeric matrix protein A prognostic marker in early rheumatoid arthritis Br J Rheumatol 1992 31 593 8 Petersson IF Boegard T Svensson B Heinegard D Saxne T Changes in cartilage and bone metabolism identified by serum marker
72. nt La limite de d c lement est lt 0 1 U L Parallelisme Des chantillons de s rum ont t dilu s 10 20 et 40 fois avec le diluant d chantillon Les rapports Valeurs obtenues Valeurs attendues pour les dilutions 1 20 et 1 40 se situaient entre 93 116 Effet Hook La concentration des chantillons dilu s dix fois peut atteindre au minimum 200 U L sans que les concentrations obtenues soient incorrectement basses 31 Precision Pour chaque chantillon on a analyse quatre r pliques six occasions diff rentes Echantillon Valeur Coefficient de variation noi intra essais inter essais total essais 1 6 9 3 0 1 8 3 5 2 13 1 1 9 2 7 3 3 3 18 0 T7 4 2 4 5 Notes Etudes r alis es par AnaMar Medical Uppsala Su de LIMITES DU TEST Un diagnostic clinique d finitif ne doit pas se baser sur une seule m thode de diagnostic et ceci quelle que soit cette m thode Le m decin ne doit effectuer ce diagnostic qu apr s avoir valu tous les r sultats cliniques et ceux des analyses de laboratoire GARANTIE Les valeurs caract ristiques de performance mentionn es ici ont t obtenues en utilisant la proc dure recommand e et indiqu e Toute modification ou tout changement du protocole qui ne seraient pas recommand s par AnaMar Medical pourraient affecter les r sultats et dans ce cas AnaMar Medical rejetterait toute garantie explicite implicite ou l gale y compris la garantie imp
73. ntos laboratorios Por este motivo se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores medios y criterios de aceptaci n por ej 2 3 desviaciones t picas Un intervalo de 2 desviaciones t picas debe abarcar un 95 de las determinaciones singulares en un conjunto de datos con una distribuci n normal Ejemplo de ficha de trabajo Espacios Identidad 1A B Amortig de muestra 1C D Calibrador 0 4 U L 1E F Calibrador 0 7 U L 1G H Calibrador 1 2 U L 2A B Calibrador 1 8 U L 2C D Calibrador 3 2 U L 2E F Control 1 2G H Control 2 3A B Desconocido 1 Concentraci n indicada en la etiqueta del vial 40 IL Curva de calibraci n Debajo se muestra una curva t pica de calibraci n No use esta curva para determinar los resultados del ensayo actual 2 5 Aso COMP U L C LCULO DE RESULTADOS C lculo computerizado Es posible realizar una reducci n de datos computerizados de absorbencia para los est ndar versus concentraci n mediante una regresi n de cuatro par metros o c bica para obtener la concentraci n de COMP Hay que multiplicar la concentraci n de las muestras desconocidas por el factor de diluci n es decir X 10 C lculo manual 1 Trazar los valores de la capacidad de absorci n obtenidos para los calibrador contra la concentraci n COMP en un papel cuadriculado logar tmico o en un papel lineal logar tmico y construir una curva de calibraci n 2 Leer la concentraci n de l
74. o correcto Si lo desea puede solicitar la Hoja de datos sobre seguridad del material PREPARACI N Y MANEJO DE MUESTRAS Y CONJUGADO ENZIMATICO Muestras Extraer una muestra de sangre mediante venipuntura permitir su coagulaci n y separar el suero mediante centrifugaci n Las muestras pueden conservarse a temperatura ambiente s lo para transporte a 2 8 C si se va a realizar el ensayo a la semana como m ximo de haber recogido la muestra o bien a 20 C si se va a posponer el ensayo Tambi n puede utilizarse plasma con heparina Nota No se puede utilizar plasma EDTA ni plasma con citrato Si desea obtener informaci n sobre la medici n de COMP en otros fluidos corporales p ngase en contacto con AnaMar Preparaci n de muestras y controles Las muestras y controles deben diluirse a 1 10 en amortiguadores de muestra 20 ul de suero 180 ul de amortiguador de muestra Preparaci n del conjugado enzim tico Para preparara el conjugado enzim tico debe diluir el frasco de Enzyme Conjugate 11X 1 10 en amortiguador de conjugado enzim tico Nota Los vol menes de conjugado se ajustan preferentemente diluyendo todo de una vez En otras palabras se debe verter todo el amortiguador en el vial de conjugado 37 Mezclar suavemente Conservar el conjugado diluido a 2 8 C durante cuatro semanas como m ximo O bien prepare el volumen necesario del modo descrito en la tabla siguiente Mezclar suavemente
75. oensaios os resultados s o afectados pelos procedimentos de teste e pelo equipamento utilizado por diferentes laborat rios Assim recomenda se que cada laborat rio estabelega os seus pr prios valores m dios e crit rios de aceita o p ex 2 S D ou 3 S D Um intervalo de 2 S D deve incluir 95 das determina es individuais em conjuntos de dados com distribui o normal Exemplo de folha de trabalho Po os Identidade 1A B Tamp o da amostra 1C D Calibradores 0 4 U L 1E F Calibradores 0 7 U L 1G H Calibradores 1 2 U L 2A B Calibradores 1 8 U L 2C D Calibradores 3 2 U L 2E F Controlo 1 2G H Controlo 2 3A B Desconhecido1 Cocentra o indicada no r tulo do frasco 70 IL Curva de calibra o Uma curva de calibra o t tpica mostrada em baixo N o utilize esta curva para determinar os resultados actuais do ensaio 2 5 Aso COMP U L C LCULO DOS RESULTADOS C lculo computorizado A redu o de valores de absorv ncia computadorizados para os calibradores versus a concentra o utilizando a regress o de veio c bico ou quatro par metros de regress o podem ser efectuadas para obter uma concentra o de COMP Multiplique a concentra o de amostras desconhecidas com o factor de dilui o por exemplo x10 C lculo manual 1 Registe os valores de absorv ncia obtidos para os calibradores contra a concentra o de COMP numa folha de registo e construa uma curva de cal
76. ogy vol 31 pp 583 591 1992 Interf rence Pour viter les interf rences provoqu es par les anticorps murins et par les anticorps facteurs rhumatoides dans le s rum du patient des composants ont t ajout s au tampon conjugu 27 R alisation du test Pr parer une courbe talon pour chaque manipulation Tous les r actifs et les chantillons doivent tre amen s la temp rature ambiante avant leur utilisation Nous recommandons que chaque test soit effectu en double pour les calibrateurs et les chantillons inconnus Ajouter dans les puits anti COMP 1 Calibrateurs 25 ul 2 Contr les dilu s et chantillons dilu s 25 pl 3 Conjugu enzymatique 100 ul 4 Incuber sur un agitateur et secouer intens ment par ex 250 tr min 16mm pendant 2 heures la temp rature ambiante la prise 5 Laver chaque puits 6 fois avec le laveur automatique ou bien Aspirer le volume de r action Ajouter 350 ul de solution de lavage dans chaque puits Aspirer compl tement R p ter 5 fois cette op ration Apr s le dernier lavage retourner et taper fermement la plaque sur du papier absorbant Ajouter 200 ul de substrat enzymatique TMB Incuber pendant 15 minutes Ajouter 50 ul de solution d arr t Placer la plaque sur l agitateur pendant environ 5 secondes pour bien m langer le substrat et la solution d arr t 10 Mesurer l absorbance 450 nm et faire l estimation Oo
77. ps monoclonaux sont dirig s contre des pitopes diff rents de la mol cule COMP Lors de l incubation la mol cule COMP pr sente dans l chantillon r agit avec les anticorps anti COMP conjugu s la peroxydase et avec les anticorps anti COMP qui sont fix s au fond du puits de microtitration Une simple phase de lavage permet d enlever les anticorps marqu s par enzyme non fix s Le conjugu fix est quant lui mis en vidence par une r action avec du 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB Pour stopper la r action on ajoute de l acide afin d obtenir une r v lation colorim trique qui est mesur e par spectrophotom trie 23 REACTIFS Les kits COMP ELISA contiennent chacun des r actifs pour 96 puits qui permettent de r aliser en double une courbe talon un chantillon blanc deux contr les et 40 chantillons Pour les s ries d analyses plus importantes il faut utiliser des r actifs regroup s dans des emballages portant des num ros de lot identiques La date limite d utilisation de ensemble de la trousse d immunodosage est indiqu e l ext rieur sur l tiquette Il est recommand de conserver les kits une temp rature de 2 8 C Plaque couverte d anti COMP 1 plaque 96 puits Pr te l emploi Platte par bande de 8 Conserver une temp rature de 2 Anticorps monoclonaux de 8 C jusqu la date limite d utilisation souris S il y a des bandes de puits de microtitration non utilis
78. r the progress of cartilage degradation in inflammatory joint diseases such as rheumatoid arthritis 8 11 and osteoarthritis 12 13 14 A quantitative relation has been shown between the concentrations of COMP in serum and cartilage degradation 10 using radiographic changes as a surrogate clinical endpoint This has been further proved in experimentally induced arthritis in animal models where the COMP serum level was highly correlated to the severity of arthritis 15 16 and also to the clinical joint score and histopathological signs of cartilage erosion 16 PRINCIPLE OF THE PROCEDURE COMP ELISA is a solid phase two site enzyme immunoassay It is based on the direct sandwich technique in which two monoclonal antibodies are directed against separate antigenic determinants on the COMP molecule During incubation COMP in the sample reacts with peroxidase conjugated anti COMP antibodies and anti COMP antibodies bound to the microtitration well A simple washing step removes unbound enzyme labeled antibody The bound conjugate is detected by a reaction with 3 3 5 5 tetramethylbenzidine TMB This reaction is stopped by adding acid to give a colorimetric endpoint that is read spectrophotometrically REAGENTS Each COMP ELISA kit contains reagents for 96 wells which is sufficient for one calibrator curve a blank two controls and 40 samples in duplicate For larger series of assays use pooled reagents from packages bearing identical
79. resentados foi obtido utilizando o procedimento indicado recomendado Qualquer altera o ou modifica o no procedimento n o recomendada pela AnaMar Medical poder afectar os resultados caso em que a AnaMar Medical recusa qualquer responsabilidade relativamente a garantias expressas impl citas ou obrigat rias incluindo a garantia impl cita comercial e de adequa o a um determinado fim Nessa eventualidade a AnaMar Medical e seus distribuidores autorizados n o ser o respons veis por quaisquer danos indirectos ou directos EXPLICA O DOS S MBOLOS UTILIZADOS NAS ETIQUETAS n 96 Reagentes par 96 determina es Data de validade Armazenar entre 2 e 8 C gt EJ F 8 Numero do lote lt Para uso de diagn stico in vitro E Fabricado por 74 ANV NDNINGSOMR DE COMP ELISA r en kvantitativ enzym l nkad immunsorbent metod f r best mning av Cartilage Oligomeric Matrix Protein COMP i humant serum F rekomst av f rh jda niv er tillsammans med andra laboratorie och kliniska fynd r till hj lp vid identifiering av aggressiv leddestruktion vid sjukdomar som reumatoid artrit RA SAMMANFATTNING OCH F RKLARING AV TESTEN COMP beskrevs f rsta g ngen 1992 av en forskargrupp ledd av professor Dick Heineg rd 1 vid Lunds universitet Molekylen r ett pentameriskt protein med fem identiska subenheter f renade med disulfidbrygga 2 och har en total molekylvikt p 434 kDa 3 CO
80. rimeira vez em 1992 pelo grupo de investiga o do Dick Heineg rd 1 da Universidade de Lund na Su cia A mol cula uma prote na pentam rica constitu da por cinco sub unidades dissulf dicas id nticas 2 com um total de massa molecular de 434 kDa 3 A COMP foi descrita pela primeira vez na cartilagem 1 mas recentemente tamb m foi encontrada nos tend es 4 e nas membranas sinoviais 5 N o foi poss vel detectar a COMP atrav s de meios de culturas a partir de outros tecidos de liga es tais como tecidos cut neos ou pulmonares 6 Est bastante documentado 7 8 9 10 que quando a matriz cartilaginosa articular degradada por um processo de doen a s o produzidos fragmentos de prote nas que se difundem no l quido da r tula Algumas destas prote nas tais como a COMP aparecem subsequentemente no fluxo sangu neo e podem ser utilizadas para monitorizar o avan o da degrada o da cartilagem em doen as inflamat rias da r tula tais como a artrite reumat ide 8 11 e a osteoartrite 12 13 14 Foi apresentada uma rela o quantitativa entre as concentra es de COMP na degrada o do soro e da cartilagem 10 utilizando altera es radiogr ficas como um ponto final cl nico suplementar Esta rela o foi ainda comprovada em experi ncias de indu o de artrite em modelos animais em que o n vel de soro da COMP estava altamente correlacionado com a gravidade da artrite 15 16 e tamb m com os resultados
81. rminanten des COMP Molek les gerichtet sind W hrend der Inkubation reagiert COMP aus der Serumprobe mit Peroxidase konjugierten Anti COMP Antik rpern einerseits und mit Anti COMP Antik rpern die an die Oberfl che der Mikrotiterplattenkavit t gebunden sind andererseits Mittels einer einfachen Waschstufe werden ungebundene Enzym markierte Antik rper entfernt Das gebundene Konjugat wird durch eine Reaktion mit 3 3 5 5 Tetramethylbenzidin TMB nachgewiesen Durch Zugabe einer s ureh ltigen L sung wird die Reaktion gestoppt das gef rbte Endgemisch der Reaktion wird spektrophotometrisch gemessen und ausgewertet 13 REAGENZIEN Jeder COMP ELISA Kit enth lt Reagenzien f r 96 Bestimmungen ausreichend f r eine Kalibratorkurve eine Blindprobe zwei Kontrollproben in Doppelbestimmung F r umfangreichere Analyseserien sollten Reagenzien mit identischen Chargennummern verwendet werden Das Verfallsdatum des kompletten Kits steht auf dem AuBenetikett Der Testkit sollte bis zum Gebrauch bei 2 8 C gelagert werden Anti COMP beschichtete Platte 1 Platte 96 Kavit ten Gebrauchsfertig Monoklonaler Antik rper Maus 8 Kavit ten Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum je Streifen Unbenutzte Mikrotiterstreifen sind mit dem Trockenmittel in verschlossenem Folienbeutel noch 2 Monate bei 2 8 C haltbar Kalibratoren 5 Fl schchen 1 0 ml Gefriergetrocknet Humanes COMP in Puffer Lagerung bei 2 8 C bis Verfallsdatum Auf dem
82. rver une temp rature de 2 8 C jusqu la date limite d utilisation Contr le 1 1 flacon 0 5 ml Lyophilis COMP humaine en tampon Ajouter 0 5 ml d eau distill e Contr le reconstitu Conserver une temp rature de 2 8 C pendant Contr le 2 1 flacon 0 5 ml Lyophilis COMP humaine en tampon Ajouter 0 5 ml d eau distill e Contr le reconstitu Conserver une temp rature de 2 8 C pendant N B S assurer que tous les r actifs lyophilis s sont correctement dissous Les fiches techniques sant s curit sont disponibles sur demande PR PARATION ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS ET DU CONJUGUE ENZYMATIQUE chantillons Le sang doit tre recueilli par ponction veineuse Une fois le sang coagul le s rum est s par par centrifugation Les chantillons peuvent tre conserv s la temp rature ambiante s ils doivent tre exp di s une temp rature de 2 8 C si le test est r alis dans la semaine qui suit la ponction veineuse ou 20 C si le test est r alis ult rieurement On peut galement utilis du plasma H parine N B Ne pas utiliser de plasma EDTA d date de sodium ou du plasma citrat Pour le dosage de la mol cule COMP dans d autres liquides corporels contacter AnaMar Pr paration des chantillons et des contr les Les chantillons et les contr les doivent tre dilu s au 1 10 dans le tampon d chantillon 20 ul de s rum
83. s 500 ul 5 0 ml 12 strips 1 vial 1 vial WARNINGS AND PRECAUTIONS e For in vitro diagnostic use Not for internal or external use in humans or animals e The contents of this kit and their residues must not be allowed to come into contact with ruminating animals or swine This kit contains reagents that may be infectious 5 This kit contains reagents manufactured from human blood components The source material has been tested by immunoassay for hepatitis B surface antigen and for antibodies for HIV virus and found to be negative Nevertheless all recommended precautions for handling blood derivatives should be observed Please refer to HHS Publication no CDC 88 8395 or corresponding local national guidelines on laboratory safety procedures The Stop Solution consists of dilute sulfuric acid solution Avoid exposure to bases metals or other compounds that may react with acids Sulfuric acid is a poison and corrosive which may be toxic if ingested To prevent chemical burns avoid contact with skin and eyes PROCEDURE Parameters of the Procedure Volumes per well Sample 25 ul Conjugate 100 ul Enzyme Substrate 200 ul Stop Solution 50 ul Incubation Time and Temperature 1st incubation 120 min on a plate shaker at room temperature 20 28 C RT 2nd incubation 15 min at RT Materials Required but not Provided 25 ul micropipette with disposable tips 50 ul 100 ul and 200 ul repeating pipettes 1000 ml beaker
84. s desconhecidos seja efectuada em duplicado Adi o a po os de anti COMP 1 Calibradores 25 uL 2 Controlos dilu dos e amostras dilu das 25 UL 3 Conjugado da enzima 100 uL 4 Incube num misturador e agite intensamente por ex 250 rpm Y 16 mm durante 2 horas temperatura ambiente 5 Lave 6 vezes com o lavador autom tico ou 69 Aspire o volume da reac o Junte 350 uL de solu o de lavagem a cada po o Aspire completamente Repita 5 vezes Depois da ltima lavagem inverta e pressione a placa firmemente contra papel absorvente Junte 200 uL de substrato da enzima TMB Incube durante 15 minutos Junte 50 uL de solu o de paragem o 3 o Coloque a placa no misturador durante aproximadamente 5 segundos para se certificar de que mistura o substrato e a solu o de paragem 10 Meca a absorv ncia a 450 nm e avalie Controlo de Qualidade A absorv ncia do inferior Calibrador COMP ELISA deve ser superior absorv ncia do tamp o da amostra COMP ELISA A concentra o dos Controlos e Il COMP ELISA deve encontrar se dentro do intervalo de valores indicado nas respectivas etiquetas Para cada lote as concentra es de COMP foram determinadas utilizando o COMP ELISA da AnaMar O valor m dio e o desvio m dio est o indicados na etiqueta dos respectivos frascos Cada valor m dio baseia se em seis replicados em seis execug es consecutivas Tal como todos os imun
85. s in early osteoarthritis of the knee joint Br J Rheumatol 1998 37 46 50 Clark AG Jordan JM Vilim V Dragomir AD Luta G Kraus VB Serum cartilage oligomeric matrix protein reflects osteoarthritis presence and severity Arthr Reum 1999 42 2356 64 Petersson IF Boegard T Dahlstrom J Svensson B Heinegard D Saxne T Bone scan and serum markers of bone cartilage in patients with knee pain and osteoarthritis Osteoarthritis and Cartilage 1998 6 33 39 Vingsbo Lundberg C Saxne T Olsson H Holmdahl R Increased serum levels of cartilage oligomeric matrix protein in chronic erosive arthritis in rats Arthritis Rheum 1998 41 544 50 Larsson E Mussener A Heinegard D Klareskog L Saxne T Increased serum levels of cartilage oligomeric matrix protein and bone sialoprotein in rats with collagen arthritis Br J Rheumatol 1997 36 1258 61 Lindqvist EK Eberhardt K Saxne T Heineg rd D Serum COMP for risk assessment of joint destruction in early rheumatoid arthritis Presented at EULAR 2002 Skoumal M Kolarz G Klingler A Serum levels of cartilage oligomeric matrix protein A predicting factor and a valuable parameter for disease management in rheumatoid arthritis Scand J Rheumatol 2003 32 156 161 96 IL AnaMar Medical AB Kungsportsavenyn 22 SE 411 36 G teborg Sweden Tel 46 31 732 41 40 Fax 46 31 732 41 49 e mail info anamar com web www anamar com 2040 08 Revised Jul 2007
86. s sich um ein pentameres Protein bestehend aus f nf identischen Untereinheiten mit Disulfidbindung 2 und einem Molekulargewicht von 434 kDa 3 COMP wurde anfangs in Knorpel 1 beschrieben wurde allerdings j ngst auch in Sehnen 4 und Synovialmembranen 5 festgestellt Bislang war der Nachweis von COMP in Gewebekultur anderer Bindegewebsarten wie z B Haut oder Lunge nicht m glich 6 Eindeutig dokumentiert ist 7 8 9 10 dass beim krankhaften Abbau von Gelenkknorpel Fragmente des Matrixproteins entstehen und in die Gelenkfl ssigkeit abgegeben werden Einige dieser Proteine wie z B auch COMP tauchen allm hlich im Blutkreislauf auf und k nnen zur berwachung des Knorpelabbaues bei entz ndlichen Gelenkserkrankungen wie Rheumatoider Arthritis 8 11 und Arthrose 12 13 14 eingesetzt werden Eine quantitative Korrelation zwischen COMP Konzentrationen in Serum und Knorpelabbau 10 wurde anhand von R ntgenaufnahmen nachgewiesen Weitere Nachweise hierf r wurden auch bei experimentell induzierter Rheumatoider Arthritis im Tiermodell gefunden wo der COMP Serumspiegel eine signifikante Korrelation zur Schwere der Arthritis aufwies 15 16 aber auch mit dem klinischen Bild des Gelenkes und den histopathologischen Befunden der Knorpelerosion 16 bereinstimmte TESTPRINZIP COMP ELISA ist ein Festphase Enzym Immunoassay basierend auf der Direkt Sandwich Technik bei der zwei monoklonale Antik rper gegen verschiedene Antigen Dete
87. sempio di foglio di lavoro pozzetti Identit 1A B Tampone campioni 1C D Calibratori 0 4 U L 1E F Calibratori 0 7 U L 1G H Calibratori 1 2 U L 2A B Calibratori 1 8 U L 2C D Calibratori 3 2 U L 2E F Controllo 1 2G H Controllo 2 3A B Ignoto1 Concentrazione indicata sull etichetta della fiala 50 IL Curva di taratura In basso mostrata una tipica curva di calibrazione Non utilizzare questa curva per determinare i risultati dell analisi 2 5 Aso COMP U L CALCOLO DEI RISULTATI Calcolo computerizzato Per ottenere la concentrazione di COMP eseguire la riduzione computerizzata di assorbenza per i calibratori rispetto alla concentrazione utilizzando la regressione spline cubica oppure a quattro parametri Moltiplicare la concentrazione dei campioni ignoti per il fattore di diluizione per es per 10 Calcolo manuale 1 Tracciare i valori di assorbenza ottenuti per gli calibratore rispetto alla concentrazione di COMP su di un foglio di carta millimetrata semilogaritmica e costruire una curva di tatatura 2 Leggere la concentrazione di campioni ignoti dalla curva di tatatura 3 Moltiplicare i risultati per il fattore di diluizione x10 51 VALORI ATTESI Valori attesi in donatori di sangue La buona pratica suggerisce che ogni laboratorio stabilisca il proprio intervallo di valori attesi risultati seguenti possono servire da guida finch il laboratorio ha raccolto dati sufficienti p
88. sie in de gewrichtsvloeistof komen Een aantal van deze prote nes zoals COMP komt zodoende ook in de bloedsomloop en kan worden gebruikt om de ontwikkeling van kraakbeendegradatie te controleren in inflammatoire gewrichtsaandoeningen zoals reumato de artritis 8 11 en osteoartritis 12 13 14 Er is een kwantitatieve relatie aangetoond tussen de concentraties van COMP in serum en de kraakbeendegradatie 10 bij gebruik van radiografische veranderingen als een surrogaat klinisch eindpunt Dit is nader bewezen in experimenteel opgewekte artritis in animale modellen waarbij de COMP serumspiegel in hoge mate in verband kon worden gebracht met de mate van artritis 15 16 en ook met klinische gewrichtswaarde en histopathologische tekenen van kraakbeenerosie 16 PRINCIPE VAN DE PROCEDURE COMP ELISA is een vastefase tweezijdige enzymen immunoanalyse gebaseerd op de direct sandwich methode waarbij twee monoclonale antistoffen naar aparte antigene determinanten op de COMP molecule worden gericht Tijdens de incubatie reageert COMP in de proef met peroxidase geconjugeerde anti COMP antistoffen en met anti COMP antistoffen die zijn gebonden aan de microtitratie well Een simpele wasprocedure verwijdert ongebonden als enzym gemarkeerde antistoffen De gebonden conjugatie wordt ontdekt door een reactie met 3 3 5 5 tetramethylbenzidine TMB Deze reactie wordt gestopt door zuur toe te voegen en om zodoende een colorimetrisch eindpunt teweeg te brengen d
89. sollte 95 der Einzelbestimmungen in einem Datenset mit normaler Verteilung umfassen Beispiel f r eine Arbeitsblatt Kavit ten Bezeichnung 1A B Proben Puffer Blindprobe 1C D Kalibratoren 0 4 U L 1E F Kalibratoren 0 7 U L 1G H Kalibratoren 1 2 U L 2A B Kalibratoren 1 8 U L 2C D Kalibratoren 3 2 U L 2E F Kontrolle 1 2G H Kontrolle 2 3A B Unbekannte Probe Auf dem Etikett des Fl schchens genannte Konzentration Kalibrationskurve Weiter unten ist eine typische Kalibrationskurve dargestellt Diese Kurve nicht zur Feststellung aktueller Probenergebnisse verwenden 2 5 Asso 1 COMP U L BERECHNUNG DER ERGEBNISSE Computergest tzte Berechnung Zum Erhalt der Konzentration des COMP kann eine Computergest tzte Datenreduktion des Absorptionsverm gens der Kalibratoren im Vergleich zu der Konzentration unter Verwendung der Kubische Spline Regression oder der Vier Parameter Regression durchgef hrt werden Die Konzentration der unbekannten Probe mit dem Verd nnungsfaktor multiplizieren z B X 10 Manuelle Berechnung 1 Die f r die Kalibratoren erzielten Absorptionswerte gegen ber der COMP Konzentration auf einem Lin log Papier eintragen und eine Kalibrationskurve bilden 19 2 Die Konzentration der unbekannten Proben an der Kalibrationskurve ablesen 3 Die Ergebnisse mit dem Faktor x 10 multiplizieren ERWARTETE WERTE Erwartete Werte von Blutspendern Es wird empfohlen in jedem Labor d
90. som COMP dukker efterfolgende op i blodbanen og kan anvendes til monitorering af udviklingen af brusknedbrydning i forbindelse med inflammatoriske ledsygdomme som reumatoid arthrit 8 11 og osteoarthrit 12 13 14 Et kvantitativt forhold mellem koncentrationerne af COMP i serum og brusknedbrydning 10 er p vist med anvendelse af radiografiske forandringer som et klinisk surrogat slutpunkt Dette er blevet yderligere bevist i eksperimentelt induceret arthrit i dyremodeller hvor niveauet af COMP i serum var steerkt forbundet med sveerhedsgraden af arthrit 15 16 og desuden til den kliniske led score og histopatologiske tegn p erosion i cartilago 16 PROCEDURENS PRINCIPPER COMP ELISA er en fast fase enzymimmunanalyse Den er baseret p den direkte sandwich teknik hvor to monoklonale antistoffer rettes mod separate antigene determinanter p COMP molekylet Under inkubationen reagerer COMP i proven med peroxidase konjugerede anti COMP antistoffer samt anti COMP antistoffer der er bundet til mikrotitreringsbronden Med et enkelt udskylningstrin fjernes ubundet enzym meerket antistof Det bundne konjugat p vises med en reaktion med 3 3 5 5 tetramethylbenzidin TMB Denne reaktion standses ved at tils tte syre for at f et kolorimetrisk slutpunkt som aflaeses spektrofotometrisk 85 REAGENSER Hvert COMP ELISA seet indeholder reagenser til 96 br nde hvilket er tilstr kkeligt til 1 kalibratorkurve et blindforsog to kontroller o
91. ta descritta per la prima volta nella cartilagine 1 ma recentemente stata trovata nei tendini 4 e nelle membrane sinoviali 5 Non stato possibile rilevare la COMP nel terreno di coltura di altri tessuti connettivi come la pelle o il tessuto polmonare 6 stato documentato 7 8 9 10 che quando la matrice della cartilagine articolare degradata da un processo patologico frammenti proteici vengono prodotti e diffusi nel fluido articolare Alcune di queste proteine quali la COMP appaiono successivamente nel circolo ematico e possono essere utilizzate per monitorare l avanzamento della degradazione cartilaginea nelle patologie infiammatorie articolari quali l artrite reumatoide 8 11 e Posteoartrite 12 13 14 stata evidenziata una relazione quantitativa tra le concentrazione della COMP nel siero e la degradazione cartilaginea 10 utilizzando modificazioni radiografiche come un endpoint clinico surrogato Questo rapporto stato ulteriormente dimostrato nell artrite indotta sperimentalmente in modelli animali nei quali il livello serico della COMP era altamente correlato alla gravit dell artrite 15 16 e allo score clinico articolare e ai segni istopatologici di erosione cartilaginea 16 PRINCIPIO DELLA PROCEDURA COMP ELISA un test immunoenzimatico a fase solida a due siti Si basa sulla tecnica a sandwich diretta nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla mol
92. tras palavras verta todo o tamp o no frasco do conjugado 67 Misture suavemente Armazene o conjugado dilu do a uma temperatura entre 2 e 8 C at quatro semanas Ou prepare o volume necess rio de acordo com o quadro seguinte Misture suavemente N mero de tiras Enzima Conjugado Conjugado 11X tamp o 4tiras 350 ul 3 5 ml 6 tiras 500 ul 5 0 ml 12 tiras 1 frasco 1 frasco AVISOS E PRECAU ES e Para uso de diagn stico In Vitro N o se destina a utiliza o interna ou externa em humanos ou animais Os conte dos deste kit e os respectivos res duos n o devem entrar em contacto com animais ruminantes ou su deos Este kit cont m reagentes que podem ser infecciosos Este kit cont m reagentes fabricados a partir de componentes sangu neos humanos O material de origem foi testado por imunoensaio contra o antig nio de superf cie da Hepatite B e anticorpos do v rus HIV e foi considerado negativo Contudo devem ser observadas todas as precau es para o manuseamento de derivados sangu neos Consulte a Publica o da HHS n CDC 88 8395 ou as directrizes correspondentes locais nacionais acerca dos procedimentos laboratoriais de seguran a A Solu o de Paragem composta por uma solu o de cido s lfurico Evite a exposi o a bases metais ou outros compostos que possam reagir com os cidos O cido sulf rico venenoso e corrosivo e pode ser t xico se ingerido Para evitar queimaduras qu mi
93. urch wiederholte Analysen Mittelwerte und Akzeptanzbereiche f r Kontrollen zu etablieren Die nachfolgende Darstellung der Normalwerte ist als Richtlinie gedacht bis das Labor gen gend eigene Daten hat S mtliche Proben waren Serumproben von Blutspendern in Schweden n 336 weiblich 157 20 73 Jahre mannlich 179 19 73 Jahre x 10 2 Medianwert 10 0 95 Perzentile 15 0 Frequenz 10 12 14 COMP U L Klinische Relevanz des COMP Wertes bei RA im Fr h und Sp tstadium In einer Studie an 183 Patienten mit rheumatoider Arthritis wurde die COMP Konzentration bei Beginn der Untersuchung in Bezug gesetzt zum Risiko einer Zerst rung der kleinen Gelenke nach 5 Jahren Die ODDS Ratio je Serum COMP Einheit betrug 1 21 Vertrauensbereich von 1 07 1 36 p lt 0 002 Diese Daten dienten zur Einsch tzung des relativen Risikos nach 5 Jahren eine Gelenkdestruktion zu entwickeln oberhalb der 75 Perzentile Larsson Score gt 59 von 200 17 Vom Skoumal M et al ver ffentlichte Daten weisen darauf hin PPV dass dieser positive Vorhersagewert auch in Bezug zur Zerst rung der kleinen Gelenke bei Patienten mit seit langem bestehender Krankheit festzustellen ist 18 20 Interpretation Die folgenden Richtlinien k nnen zur Bewertung des gegenw rtigen Knorpelumsatzes und des zuk nftigen Risikos der Gelenkzerst rung verwendet werden lt 12U L Geringes Risiko der aggressiven Gelenkzerst rung 1
94. v HHS Publikation nr CDC 88 8395 eller motsvarande lokala nationella s kerhetsf reskrifter f r laboratorier Stoppl sningen best r av utsp dd svavelsyrel sning Undvik kontakt med baser metaller eller andra f reningar som kan reagera med syror Svavelsyra r ett gift det r fr tande och kan vara giftigt vid f rt ring F r att f rebygga kemiska br nnskador undvik kontakt med hud och gon METOD Parametrar M ngd per brunn Prov 25 ul Konjugat 100 ul Enzymsubstrat 200 ul Stoppl sning 50 ul Inkubationstid och temperatur 1 a inkubationen 120 min p en skak avsedd f r plattor i rumstemperatur 20 28 C 2 a inkubationen 15 min i rumstemperatur 78 Rekommenderad utrustning som inte ing r 25 ul mikropipetter med eng ngsspetsar 50 ul 100 ul och 200 ul dospipetter 1000 ml b gare Destillerat vatten ElA plattl sare med 450 nm filter Skak avsedd f r mikrotiterplattor Tv ttapparat f r mikrotiterplattor Referensmaterial COMP kalibratorer kalibreras gentemot f retagets egen standard som korrelerats med en inhibitionsassay f r COMP best mning som beskrivits av Saxne och Heineg rd i artikeln Cartilage oligomeric matrix protein A novel marker of cartilage turnover detectable in synovial fluid and blood British Journal of Rheumatology vol 31 sid 583 591 1992 Interferens Komponenter har tillsatts reagenserna kitet f r att f rhindra interferens fr n antikroppar mot mus och RF i patientens s
95. valdatum Reinigingstabletten 2 tabletten Elke tablet oplossen in 500 ml gedistilleerd water Oplossing bewaren bij 2 8 C Moet binnen 4 weken worden gebruikt Enzymsubstraat TMB 1 ampul aar voor gebruik ewaren bij 2 8 C tot de vervaldatum Lichtgevoelig Stopoplossing 1 ampul Klaar voor gebruik 0 5M H SO Bewaren bij 2 8 C tot de vervaldatum 56 Controle 1 Vriesgedroogd menselijk COMP in buffer 0 5 ml gedistilleerd water toevoegen Opgeloste controle bewaren bij 2 8 C gedurende 4 weken of bij 20 C tot de vervaldatum Controle 2 Vriesgedroogd menselijk COMP in buffer 0 5 ml gedistilleerd water toevoegen Opgeloste controle bewaren bij 2 8 C gedurende 4 weken of bij 20 C tot de vervaldatum Opmerking Zie erop toe dat alle vriesgedroogde reagentia goed worden opgelost Veiligheidsinformatiebladen zijn op aanvraag verkrijgbaar VERZAMELING EN HANTERING VAN MONSTERS EN ENZYMCONJUGAAT Monsters Bloed dient te worden afgenomen door middel van venapunctie stolling en het serum moet gesepareerd worden door middel van centrifugering Monsters kunnen worden bewaard op kamertemperatuur alleen voor verzendingsdoeleinden bij 2 8 C indien geanalyseerd binnen een week na afname of bij 20 C in geval van latere analyse Er mag tevens heparineplasma worden gebruikt Opmerking EDTA plasma en citraatplasma mogen niet worden gebruikt Raadpleeg AnaMar voor adviezen betreffende de analyse
96. van COMP in andere lichaamsvloeistoffen Monstervoorbereiding en controles Monsters en controles moeten worden verdund met een 1 10 verdunner 20 ul serum 180 ul verdunner Voorbereiding van enzymconjugaat Bereid het enzymconjugaat voor door verdunning van enzymconjugaat 11X 1 10 in enzymconjugatiebuffer Opmerking Conjugatievolumes worden bij voorkeur afgesteld door alles in n keer te verdunnen Met andere woorden giet de gehele buffer in de conjugatieampul Rustig mengen Verdund conjugaat gedurende maximaal vier weken bewaren op 2 8 C Of bereid het benodigde volume conform onderstaande tabel Rustig mengen 57 Aantal strips Enzym Conjugatie Conjugaat 11X buffer 4 strips 350 pl 3 5 ml 6 strips 500 pl 5 0 ml 12 strips 1 ampul 1 ampul WAARSCHUWINGEN EN VOORZORGSMAATREGELEN e Voor diagnostisch in vitro gebruik Niet voor inwendig of uitwendig gebruik voor mensen en dieren De inhoud van deze kit en de restanten ervan mogen onder geen voorwaarde in contact komen met herkauwend vee of varkens Deze kit bevat reagentia die infectueus kunnen zijn Deze kit bevat reagentia die van bestandsdelen van menselijk bloed afkomstig zijn Het bronmateriaal is getest door middel van immunoanalyse voor hepatitis B surface antigen en voor antistoffen voor HIV virus en negatief bevonden Niettemin dienen alle aanbevolen voorzorgsmaatregelen voor de hantering van bloedderivaten in acht te worden genomen Wij verwijz
97. veckor Klar til brug Opbevares ved 2 8 C indtil udlobsdatoen Lysfolsomt Klar til brug Opbevares ved 2 8 C indtil udlobsdatoen Kontrol 1 1 heetteglas 0 5 ml Lyofiliseret human COMP i buffer Tils t 0 5 ml destilleret vand Rekonstitueret kontrol opbevares ved 2 8 C i 4 uger eller ved 20 C indtil udl bsdatoen Kontrol 2 1 h tteglas 0 5 ml Lyofiliseret human COMP i buffer Tils t 0 5 ml destilleret vand Rekonstitueret kontrol opbevares ved 2 8 C i 4 uger eller ved 20 C indtil udl bsdatoen Bem rk Alle lyofiliserede reagenser skal v re ordentligt opl st Datablad om materialesikkerhed f s ved henvendelse PR PARATION OG H NDTERING AF PR VER OG ENZYMKONJUGAT Pr ver Blod skal indsamles med venepunktur og efterlades til st rkning og serummet separeres med centrifugering Pr paraterne kan opbevares ved stuetemperatur kun i forbindelse med transport ved 2 8 C hvis de analyseres inden for 1 uge efter indsamling eller ved 20 C hvis de analyseres senere Heparinplasma kan ogs anvendes Bem rk EDTA plasma og citratplasma kan ikke anvendes Vejledning om m ling af COMP i andre kropsv sker f s ved henvendelse til AnaMar Pr paration af pr ver og kontroller Pr ver og kontroller skal fortyndes 1 10 i pr vebuffer 20 ul serum 180 ul pr vebuffer Pr paration af enzymkonjugat Pr parer enzymkonjugatet ved at fortynde enzymkonjugat 11X 1 10 i enzymkonjugatbu
98. verkrijgen Vermenigvuldig de concentratie van de onbekende monsters met de verdunningsfactor bijv x 10 Handmatige berekening 1 Breng de verkregen absorptiewaarden voor de kalibratoren ten opzichte van de COMP concentratie in kaart op log log of lin log papier en construeer een kalibratiecurve 2 Lees de concentratie van de onbekende monsters van de kalibratiecurve af 3 Vermenigvuldig de resultaten met de oplossingsfactor x10 61 VERWACHTE WAARDEN Verwachte waarden in bloeddonors Het behoort tot de normale gang van zaken dat elk laboratorium haar eigen te verwachten resultatenreeks vaststelt Onderstaande resultaten kunnen dienst doen als richtsnoer totdat het laboratorium zelf voldoende gegevens heeft verzameld Alle monsters waren serummonsters verkregen van bloeddonors in Zweden n 336 vrouw 157 20 73 jaar man 179 19 73 jaar x 10 2 mediaan 10 0 95 15 0 Frequetie 10 12 COMP U L COMP in vroege en late RA In een studie van 183 pati nten lijdend aan reumato de artritis was de concentratie COMP bij inclusie gerelateerd aan het risico van omvangrijke aantasting van kleine gewrichten na 5 jaar De waarschijnlijkheidsratio per COMP unit in serum was 1 21 betrouwbaarheidsinterval CI 1 07 1 36 p lt 0 002 Deze data werden gebruikt om het relatieve risico van het ontwikkelen van de aantasting van gewrichten boven het 75 percentiel Larsen Score gt 59 van 200 na 5 jaar

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