LM DNA Kit Product Insert
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1. Mistura padr o adequada MX e Quadro dos limiares quadro s dos resultados obtidos pela Mistura da sonda adequada BM sonda Solu o de dilui o DS e Tag Polimerase LIFECODES LIFECODES n de Cat logo 628075 B Materiais Necess rios mas N o Fornecidos Foram validados os seguintes materiais para utiliza o com o kit Estojo de fluido Luminex 1xLifecodes N cat 628005 Fita de polietileno transparente Thermowell CostarO n de Agua livre de nuclease Lifecodes N cat 757003 20mL cat logo 6524 LIFECODES n de cat logo 888635 Tubos e tampas para PCR Corning Thermowell Faixas Estreptavidina SA PE conjugada com ficoeritrina PE t rmicas Costar n de cat logo 6542 LIFECODES n de ESTREPTAVIDINA CONJUGADA COM R FICOERITRINA cat logo 888640 ou Corning Thermowell placas PCR de SA PE 1mg ml LIFECODES n de cat logo 628511 96 po os n de cat logo CLS6551 ou placa PCR de 96 e Kits de calibragem Luminex Kit de Calibragem Luminex po os Thermoscientific AB Gene Superplate n de 100 200 Kit de Verifica o de Resultados Luminex 100 200 cat logo AB 2100 n de cat logo LIFECODES 628018 e 628019 Placa Costar CostarQ n de cat logo 6509 LIFECODES respectivamente n de cat logo 888630 C Materiais adicionais a fornecer pelo Utilizador Misturador Vortex Tapete de compress o em silicone Axygen Scientific n CM FLAT ou equivalente Aparelho de ultrasons P2. Por conseguinte o sinal relativo obtido com as sondas SSO no ensaio LIFECODES bem como com outros m todos SSOP pode ser utilizado para atribui o das sondas que tenham reactividade positiva ou negativa com a amostra de ADN amplificada consultar a sec o Resultados O que por sua vez fornece a informa o necess ria para determinar o fen tipo HLA da amostra REAGENTES A Identifica o Consultar a listagem completa dos produtos e n meros do cat logo nos quadros na sec oKits Reagentes por N mero de Cat logo B Avisos e precau es Para utiliza o de diagn stico in vitro Devem ser designadas pipetas separadas para manipula es Pr PCR assim como para manipula es P s PCR Risco biol gico todas as amostras biol gicas e de sangue devem ser tratadas como potencialmente infecciosas Durante o manuseamento seguir as Precau es gerais A solu o de dilui o as misturas de sonda a Taq polimerase e a Estreptavidina conjugada com R Ficoeritrina cont m compostos perigosos Evitar o contacto com a pele e os olhos e deitar fora os materiais ap s utiliza o de acordo com regulamenta o local Consultar a informa o nas folhas de dados relativa seguran a do material 5 Os resultados obtidos por meio da utiliza o destes kits n o devem utilizados como a base exclusiva para a tomada de qualquer decis o cl nica que afecte o paciente C Instru es de armazenamento 1 Seguir as indica es sobre as tempe
3. quotas da mistura de amplifica o nos tubos de PCR que cont m o ADN gen mico O volume total da mistura padr o e ADN gen mico deve ser igual a 50 ul para cada reac o de amostra Vedar bem os tubos para evitar a evapora o durante o processo de PCR Colocar as amostras no ciclador t rmico e executar o programa consultar os quadros 2 e 3 Quadro 1 Componentes de reac o para amplifica o Quantidade por reac o de componente amostra PCR Mistura padr o LIFECODES 15uL ADN gen mico 10 200ng uL Total de 200 ng Taq polimerase LIFECODES 0 5uL 2 50 gua livre de nuclease At ao volume final de 50 l Quadro 2 Condi es do ciclador t rmico para amplifica o Ciclador t rmico Modo velocidade de activa o Modo 9600 Sistema PCR 9700 GenAmp 3 5C sec Ciclador t rmico Veriti com 96 Modo 9700 MAX po os 3 9 C sec Modo seguro activa o MAX Eppendorf Mastercycler Nexus 3 0 C sec Quadro 3 Condi es do ciclador t rmico para amplifica o Fase E o N de Ciclos 1 95 C durante 5 min 1 95 C durante 30 seg 2 60 C durante 45 seg 8 72 C durante 45 seg 95 C durante 30 seg 3 63 C durante 45 seg 32 72 C durante 45 seg 72 C durante 15 min 1 4 C permanente 1 Nota para se certificar da amplifica o da amostra consultar a sec o Electroforese em gel Anexo A Page 5 of 10 LC775TC
4. sonda e repetir o ensaio funcionar em boas Utilizador do Luminex IS condi es A conduta de passagem da Remover e submeter a agulha a ultrasons Executar amostra est bloqueada fluxo reverso Contactar a Immucor Transplant Diagnostics Inc caso o problema persista 32 3 385 47 91 Falha do limiar A amostra n o foi ADN baixo Verificar a concentra o e a pureza do ADN CON amplificada ou foi insuficientemente Os sais das concentra es de Aquecer a mistura padr o a 37 C durante 5 minutos amplificada mistura padr o n o est o agitar em v rtice ligeiramente e mexer um pouco o dissolvidos fundo Tag polimerase insuficiente Utilizar Taq Polimerase LIFECODES com valida o N do cat logo 628075 As condi es de amplifica o n o est o dentro dos Executar o perfil t rmico no ciclador t rmico para par metros espec ficos verificar se os par metros est o dentro dos par metros especificados Intensidade M dia de Fluoresc ncia MFI baixa Aquecer a solu o de dilui o a 45 C durante 5 minutos antes da utiliza o e agitar em v rtice Guardar temperatura ambiente Substituir a Estreptavidina PE Falhas m ltiplas de Amplifica o espec fica As condi es de amplifica o Executar o perfil t rmico no ciclador t rmico para SSO ou amostra do alelo n o est o dentro dos verificar se os par metros est o dentro dos n o consegue par metros espec ficos par metros especificados fornecer um A
5. A a O ADN humano pode ser purificado a partir de Sangue total Buffy coats e Esfrega os bucais utilizando um m todo validado que cumpra os crit rios adiante indicados b O ADN extra do de sangue preservado em EDTA e em ACD cido c trico citrato de s dio e dextrose foi testado tendo demonstrado dar os resultados esperados neste ensaio O ADN extra do de sangue preservado em heparina n o pode ser utilizado neste ensaio N o foram testados outros conservantes C O ADN isolado deve estar em 10 mM TRIS pH 8 0 9 0 ou em gua livre de nuclease Caso esteja presente um agente quelatante como EDTA a concentra o final do agente quelatante n o deve exceder 0 5 mM d A presen a de lcool detergentes ou sais poder afectar adversamente a amplifica o do ADN e A concentra o final de ADN dever ser 10 200 ng ul f As medi es de absorv ncia da amostra de ADN a 260 e 280 nm dever o apresentar um r cio de 1 65 para 2 0 g O ADN pode ser utilizado imediatamente ap s o isolamento ou guardado temperatura de 20 C durante um ano A congela o e descongela o repetida devem ser evitadas uma vez que podem resultar na degrada o do ADN PROCEDIMENTO Aten o N o foram validados desvios dos protocolos recomendados e dos materiais necess rios incluindo a Tag polimerase LIFECODES A Materiais fornecidos Para informa es mais detalhadas consultar quadros na sec o Kits Reagentes por N mero de Cat logo
6. EPT 3 08 13 C Hibridiza o Certificar se de que os componentes do tamp o de dilui o para hibridiza o da mistura de sonda LIFECODES est o dissolvidos e que os gr nulos est o completamente em suspens o Ligar o instrumento Luminex e a plataforma XY dando um tempo de aquecimento de 30 minutos Aquecer a mistura da sonda a 55 60 C num bloco t rmico durante pelo menos 5 a 10 minutos para dissolver completamente os componentes na mistura da sonda Submeter a ultra sons durante pouco tempo 15 seg agitando em seguida a mistura em v rtice durante cerca de 15 segundos para suspender completamente os gr nulos Combinar 15 uL da mistura de sonda com 5 uL de produto de PCR de locus espec ficos em cada po o de uma placa de 96 po os do ciclador t rmico CostarQ n 6509 Aquando da distribui o de al quotas em mais de 10 po os agite levemente a mistura de sonda em v rtice depois de cada conjunto de dez Vede a placa com fita de polietileno Costar No 6524 Colocar o tapete de compress o de silicone sobre a placa antes da hibridiza o Hibridizar as amostras nas seguintes condi es de incuba o Quadro 4 Condi es do ciclador 976 durante 5 minutos t rmico para hibridiza o 47 C durante 30 minutos 56 C durante 10 minutos 56 C MANTER Enquanto as amostras hibridizam preparar uma mistura 200 1 de Solu o de Dilui o estreptavidina PE Combinar 170 ul de solu o de dilui o DS e 0 85 ul de 1mg
7. LIFECODES Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford CT 06902 Tel 203 328 9500 ou 888 329 0255 Fax 203 328 9599 WWW IMMUCOR COM IMMUCOR GAMMA Documenta o e Tradu es referentes ao Produto est o dispon veis em www Immucor com FOLHETO INFORMATIVO DO PRODUTO KITS DE TIPAGEM LIFECODES HLA SSO Para utiliza o em diagn stico in vitro NDICE Defini o dos S mbolos Instru es de Utiliza o Kits Reagentes por N mero de Cat logo A Purifica o do ADN gen mico B Amplifica o do ADN PCR C Hibridiza o D An lise com o Instrumento Luminex Utiliza o Prevista Resumo e Explica o Princ pios do Procedimento Reagentes Resultados A Identifica o Controlo de Qualidade B Avisos e precau es Limita es do Procedimento C Instru es de armazenamento Resolu o de problemas D Purifica o ou tratamento para utiliza o Valores Previstos E Indica es de instabilidade Caracter sticas Espec ficas de Funcionamento Requisitos em Mat ria de Instrumentos Refer ncias Colheita e Prepara o da Amostra Licen as Limitadas o O O O O O NO O Ga Aa Procedimento Informa o sobre o Fabricante A Materiais fornecidos Marcas Comerciais Usadas B Materiais necess rios mas n o fornecidos C Materiais adicionais a Eleciroforese em gel fornecer pelo Utilizador Desempenho do gel DEFINI O DOS SIMBOLOS R tulos do produto e documen
8. U A ou respectivas patentes equivalentes estrangeiras propriedade da Luminex Corporation para efectuar an lise multiplexada de amostras cl nicas para tipagem de HLA INFORMA O SOBRE O FABRICANTE Fabricante Immucor Transplant Diagnostics Inc 550 West Avenue Stamford CT 06902 EUA Tel 203 328 9500 888 329 0255 Fax 203 328 9599 Representante autorizado Emergo Europe Molenstraat 15 2513 BH Haia Pa ses Baixos Tel 31 0 70 345 8570 Fax 31 0 70 346 7299 Assist ncia t cnica na Europa Tel 32 3 385 4791 ltima revis o e publica o deste documento Rev 3 2013 08 29 MARCAS COMERCIAIS UTILIZADAS AB Gene AB Gene House Luminex Luminex Corporation Costar Corning Incorporated VeritiTM Applied Biosystem Microseal M Bio Rad Laboratories Inc Mastercycler Eppendorf IDNAO Agarose Lonza Group Ltd LIFECODES Immucor Inc GelStar Lonza Group Ltd Page 9 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 ANEXO A Electroforese em gel As reac es PCR executadas nos kits de tipagem LIFECODES HLA SSO s o concebidas para produzir produtos bifilamentares e monofilamentares que s o os produtos predominantes que hibridizam com os SSO Para garantia de qualidade ou para diagnosticar a exist ncia de problemas com uma experi ncia poder ser necess rio efectuar a electroforese em gel para examinar a reac o PCR presen a de ADN amplificado Materiais necess rios conforme lista ou equivalente Agarose de g
9. UTILIZAR COM PRECAU O o brometo de et dio um conhecido carcin geno 3 Manter o gel no escuro e deixar solidificar 4 Carregar uma mistura de 2 5 ul de cada produto PCR e 2 5 ul 2 vezes carregando tamp o com corante vis vel por amostra por amplifica o Deixar o gel percorrer no escuro a aproximadamente 160 volts durante 45 minutos ou at que a amostra tenha percorrido um percurso suficiente que permita ver bandas separadas do produto monofilamentar e bifilamentar a banda azul de bromofenol ou outro marcador vis vel migra 2 5 a 5 cm a partir dos po os 5 Fotografar usando transiluminador UV acompanhado de um filtro fotogr fico amarelo GelStarQ Lonza Group Ltd N 50536 ATEN O utilizar equipamento protector quando manusear a mancha de cido nucleico GelStar ou o brometo de et dio e quando fotografar o gel usando o transiluminador UV 6 An lise do gel HLA DPB HLA DQA Bifilamentar es bp 280 240 Monofilamentar es bp 180 160 Desempenho do gel Amplifica o N o amplifica o Po o C C ADN bifilamentar Brilhante ADN monofilamentar menos brilhante Banda de iniciador Page 10 of 10 LC775TCEPT 3 08 13
10. YP existente no suporte da placa Clicar o s mbolo Retract Recolher As amostras est o agora prontas a ser analisadas Dever ser efectuado um primeiro passo antes de dar in cio execu o Depois de as amostras terem sido processadas atrav s do instrumento dever ser efectuada uma ac o de sanitiza o com 70 de Isopropanol ou 20 de lix via de uso dom stico seguida de duas ac es de lavagem Neste momento o instrumento poder ser desligado se n o for utilizado durante o resto do dia Page 6 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 3 Ap s um lote ter sido completado os dados s o exportados como um ficheiro com o valor separado por v rgula csv Estes ficheiros s o denominados OUTPUT CSV e guarados numa pasta cujo Batch Name Nome do lote inclu do no Luminex IS Estes dados ficam ent o dispon veis para se efectuar as classifica es de tipagem conforme se descreve a seguir Consultar o Manual do Utilizador do Luminex para conhecer o funcionamento do instrumento incluindo os procedimentos de in cio de funcionamento calibra o manuten o e encerramento di rios RESULTADOS A tipagem de amostras pode ser efectuada da seguinte forma Os ficheiros CSV gerados podem ser abertos e os dados processados com programas comuns de folha de c lculo como por exemplo o Microsoft Excel Lotus 123 Corel Quattro Pro ou software semelhante A an lise constitu da pelos seguintes passos 1 Certificar se de que o Number o
11. a deve ser ensaiada novamente e Se um padr o de resultados obtidos pela sonda n o produz um tipo HLA a amostra deve voltar a ser amplificada e ensaiada Pode tamb m ser necess rio voltar a isolar o ADN da amostra e voltar a amplificar e a testar Conforme mencionado na sec o Limita es do procedimento muito importante seguir o protocolo com precis o Quaisquer desvios podem resultar em erro da tipagem da amostra Page 8 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE FUNCIONAMENTO Quando os kits de tipagem LIFECODES HLA SSO s o utilizados de acordo com o procedimento descrito no folheto informativo pode ser determinado o tipo HLA de classe e Classe Il das amostras de ADN O kit HLA DPB e os kits HLA DQA apresentam uma concord ncia de 100 95 intervalo de confian a 91 9 100 para 30 amostras de aptid o CAP e corresponderam aos Resultados de Aptid o CAP REFER NCIAS 1 Olerup O et al 1992 Tissue Antigens 39 225 3 Maeda M et al 1989 Tissue Antigens 34 290 2 Saiki RK et al 1986 Nature 324 163 4 Bugawan TL et al 1990 Immunogenetics 32 231 LICEN AS LIMITADAS A Tag polimerase fabricada para a Immucor Transplant Diagnostics pela Promega Corp Est licenciada Promega ao abrigo das patentes dos EUA n s 5 338 671 e 5 587 287 e das suas patentes internacionais correspondentes A aquisi o deste produto inclui uma licen a limitada n o transfer vel sob a patente 5 981 180 nos E
12. a pelo tipo de material biol gico m todo de purifica o quantidade e integridade do ADN gen mico Por essa raz o o sinal obtido para a s sonda s de consenso pode servir como um indicador do sucesso dos procedimentos de amplifica o e hibridiza o De igual forma o sinal obtido com a sonda de consenso pode ser usado para normalizar o sinal das sondas espec ficas do alelo e corrigir as varia es da quantidade de produto amplificado na reac o de hibridiza o A an lise dos resultados gerados a partir da tipagem SSO pode ser utilizada para determina o da presen a ou aus ncia de sequ ncias espec ficas de ADN em ADN amplificado e para identificar os alelos poss veis na amostra Para o procedimento de Tipagem LIFECODES HLA SSO as Microesferas Luminex concebidas para utiliza o com o Instrumento Luminex t m sondas anexadas Podem ser misturadas e analisadas Microesferas Luminex at ao n mero m ximo de 100 popula es diferentes atrav s do Instrumento Luminex uma vez que cada popula o de microesferas pode ser distinguida pela sua assinatura ou cor de fluoresc ncia nica Uma sonda SSO diferente pode estar ligada a cada microesfera de cor Por esse motivo uma mistura de v rias sondas pode ser distinta uma da outra em virtude da sua associa o com microesferas de cores espec ficas O Instrumento Luminex consegue tamb m quantificar as quantidades relativas de produto de PCR marcado que hibridiza com cada Microesfera Luminex
13. ar o mais poss vel a exposi o luz ATEN O n o utilizar os componentes ap s a sua data de validade ter expirado ATEN O N o foram validados desvios dos protocolos recomendados e dos materiais necess rios incluindo a Tag polimerase LIFECODES Page 2 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 UTILIZA O PREVISTA Tipagem HLA do ADN dos alelos de Classe I e Classe II RESUMO E EXPLICA O A tipagem do ADN com base no HLA utilizando ADN amplificado por PCR um procedimento laboratorial comum A amplifica o do ADN por PCR utilizada como um meio de melhorar uma regi o ADN seleccionada Para a tipagem HLA utilizado um teste posterior para determina o das propriedades do ADN amplificado T m sido utilizados na tipagem HLA diversos tipos de testes como o SSP 1 SSOP directo 2 RFLP 3 e SSOP e t cnicas dot blot reversos 4 Tal como os m todos SSOP e dot blot reverso os kits de Tipagem LIFECODES HLA SSO utilizam oligonucle tidos espec ficos para sequ ncia SSOs para identificar que alelos HLA est o presentes numa amostra amplificada por PCR E o conjunto de SSOs empregues n o as metodologias que determina a capacidade de distinguir entre os v rios alelos presentes na amplifica o por PCR Enquanto os m todos dot blot e SSOP reversos empregam marcadores enzim ticos e substratos colorim tricos que requerem desenvolvimento posterior o teste LIFECODES um sistema homog neo multiplex Isto todos os SSOs s o a
14. ardado at ao m ximo de 3 dias entre os 2 e os 8 C antes de ser utilizado Se pretender um armazenamento mais prolongado armazenar a 20 C durante uma semana no m ximo at ser poss vel realizar o ensaio O produto amplificado pode ser congelado e descongelado apenas uma vez A congela o e descongela o repetidas resultar o na degrada o das amostras amplificadas e dar o resultados incorrectos se as mesmas forem utilizadas para ensaio Page 4 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 A Purifica o do ADN gen mico utilizando o m todo escolhido a concentra o final deve ser 10 200 ng ul Ajustar se necess rio com gua livre de nuclease Manter todas as amostras com concentra es semelhantes B Amplifica o de ADN PCR 1 2 3 Deixar que a mistura padr o MX aque a temperatura ambiente 18 30 C Agitar levemente os reagentes em v rtice durante aproximadamente 10 segundos Isto far com que os sais fiquem dissolvidos Mexer um pouco 5 10 segundos na microcentrifugadora para que o conte do assente no fundo do tubo Utilizando o quadro 1 abaixo preparar os componentes para a amplifica o para n 1 reac es usando a quantidade indicada para cada componente por reac o excepto para ADN Adicionando gua livre de nuclease fazer com que o volume final atinja 50 ul por reac o Agitar levemente Pipetar a quantidade adequada de ADN Gen mico 100 300 ng nos tubos de PCR Distribuir as al
15. bridiza o ficam dissolvidos 2 Incuba es a 47 C e a 56 C exigem um elevado grau de precis o 0 5 C Deve ser utilizado um ciclador t rmico A temperatura dentro dos po os da placa de 96 po os do ciclador t rmico deve ser verificada utilizando um termopar por exemplo Modelo VPT 0300 da Bio Rad ou equivalente A temperatura dentro dos po os e entre os po os n o deve variar mais do que 0 5 C 3 O per odo temperatura de 56 C muito importante e n o deve exceder um total de 15 minutos Isto inclui a incuba o de 10 minutos e n o mais de 5 minutos para diluir todas as amostras com a mistura da solu o de dilui o estreptavidina PE 4 Uma vez dilu das as amostras mant m se est veis temperatura ambiente durante duas horas no m ximo conservar ao abrigo da luz Uma vez que uma placa completa de 96 po os pode levar at 1 5 horas para ser processada atrav s do instrumento Luminex a an lise deve ter in cio num per odo n o superior a 30 minutos ap s a dilui o para assegurar que a ltima amostra analisada dentro do limite de 2 horas 5 N o misturar componentes de outros kits e conjuntos Devido natureza complexa da tipagem HLA a interpreta o dos dados e as classifica es de tipagem devem ser verificadas por pessoal qualificado RESOLU O DE PROBLEMAS Baixa contagem de M suspens o da mistura da sonda Pr aquecer submeter a ultra sons e agitar em v rtice gr nulos a mistura da
16. f Events N mero de eventos de cada SSO em cada amostra pelo menos 60 Esta informa o encontrada na sec o DataType Count Tipo de dados contagem no ficheiro CSV 2 Determinar que os valores das sondas de consenso para cada amostra est o acima da respectiva Intensidade M dia de Fluoresc ncia ou MFI m nima Os limiares m nimos s o espec ficos do conjunto e podem ser encontrados no Quadro dos Limiares Aten o e Para se obter resultados fi veis necess rio dispor de dados suficientes recolhidos pelo instrumento Luminex e Recolha pelo menos 60 ocorr ncias para cada SSO 3 Subtrair o valor do Background Control Controlo de fundo de cada sonda dos valores da amostra que produzem o conjunto de dados de fundo corrigido Os valores de controlo de fundo encontram se no Quadro dos limiares e s o espec ficos do conjunto Os valores de fundo s o valores MFI Intensidade M dia de Fluoresc ncia m dios pada cara gr nulo para compensa o de ru do de fundo devido varia o de gr nulos 4 Para cada amostra dividir os dados de fundo corrigidos de cada sonda pelo valor de fundo corrigido da sonda de consenso correspondente produzindo o conjunto de dados normalizado MFI Sonda MFI Controlo em branco para sonda MFI Consenso MFI Controlo em branco para Consenso 5 Para cada sonda registar o valor normalizado na folha de c lculo do Quadro dos limiares 6 Uma vez que tenham sido classificados todo
17. imiares Os valores obtidos com os SSOs de consenso a partir de brancos com gua devem ser inferiores ao valor limite para o SSO conforme especificado na Folha de Trabalho do Quadro dos Limiares A s Mistura s de sonda LIFECODES cont m cont m uma ou mais sondas SSO identificadas nas folhas de trabalho dos kits de tipagem Estas sondas de consenso hibridizam com todos os alelos e actuam como controlos internos para verificar a amplifica o e para confirmar a ocorr ncia de hibridiza es Se o valor m nimo n o for obtido para estes SSO a amostra poder n o produzir a tipagem correcta e o teste da amostra deve ser repetido O ensaio deve ser executado conforme recomendado na folha de dados devendo igualmente ser executado com quaisquer outros procedimentos de controlo de qualidade que estejam em conformidade com os requisitos locais estaduais federais e ou das ag ncias de acredita o LIMITA ES DO PROCEDIMENTO As condi es da PCR e as condi es do ensaio descritas exigem condi es controladas com precis o Os desvios destes par metros podem conduzir falha do produto Page 7 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 Todos os instrumentos devem ser calibrados em conformidade com as recomenda es do fabricante e dever o funcionar dentro dos par metros recomendados pelo fabricante 1 Os gr nulos devem ser pr aquecidos e postos em boa suspens o antes da utiliza o Este procedimento assegura que os componentes do tamp o de hi
18. ml estreptavidina PE SA PE por amostra Recomenda se efectuar a mistura da solu o de dilui o em quantidade suficiente para n 1 amostras tendo em conta as perdas que ocorrem ao fazer a pipetagem Consultar o quadro 5 Manter a mistura da solu o de dilui o estreptavidina PE no escuro temperatura ambiente a estreptavidina PE sens vel luz A solu o de dilui o pode ser aquecida a 45 C durante 5 minutos e agitada em v rtice ap s a sua chegada para assegurar que todos os componentes ficam dissolvidos A solu o de dilui o deve estar temperatura ambiente 18 30 C antes de se efectuar a mistura Preparar antes da utiliza o e eliminar qualquer por o que reste Quadro 5 Volumes de prepara o da N de Solu o de Estreptavidina PE SA solu o de dilui o mostras Aucke 08 DS OB Nota 9 o NOUL O 085 a S 850uL 4 25uL 1700uL 3400uL 8500uL 42 5uL N O CANCELAR O PROGRAMA DE HIBRIDIZA O ANTES DE RETIRAR O TABULEIRO DO CICLADOR T RMICO Ao atingir os 56 C manter Hold enquanto o tabuleiro est no ciclador t rmico diluir cada amostra com 170 ul da mistura da solu o de dilui o preparada com estreptavidina PE E fundamental que todas as amostras sejam dilu das no per odo de 5 minutos ap s o passo HOLD a 56 C de 10 minutos Retirar o tabuleiro das amostras do ciclador t rmico e coloc lo no instrumento Luminex D An lise da amostra utilizando o ins
19. mostra de ADN contaminada resultado de ADN parcialmente degradado Voltar a isolar o ADN da amostra de sangue tipagem HLA Evapora o durante a fase de hibridiza o Caso n o se esteja a utilizar a totalidade da placa deixar uma fila vazia de cada lado das amostras que v o ser ensaiadas de forma a permitir que a placa fique bem vedada A amplifica o por PCR pode ser verificada atrav s de electroforese em gel consultar o Anexo A VALORES PREVISTOS Normalmente os valores podem ser processador como positivos e negativos Em alguns casos raros os valores podem ser indeterminados Um valor indeterminado representa um intervalo em que n o foram observados valores nem positivos nem negativos Se uma amostra contiver valores indeterminados para uma sonda SSO espec fica a amostra deve ser tipada com a sonda em primeiro lugar como negativa e em seguida como positiva Podem surgir tr s casos 1 Uma das escolhas isto Positiva ou Negativa apresenta uma correspond ncia 2 Ambas as escolhas t m correspond ncia e A amostra pode voltar a ser ensaiada ou os alelos obtidos de ambas as tipagens podem ser registados 3 Nenhuma das escolhas tem uma correspond ncia Nesta situa o poss vel que existam outras sondas que tenham sido incorrectamente classificadas Esta amostra precisa de voltar a ser ensaiada e possivelmente de voltar a ser amplificada Caso existam mais de duas sondas indeterminadas a amostr
20. nalisados simultaneamente e o teste realizado na totalidade num nico reactor atrav s da incorpora o de um nico reagente PRINC PIOS DO PROCEDIMENTO O procedimento de Tipagem LIFECODES HLA SSO baseado na hibridiza o do produto monofilamentar PCR para sondas SSO A amplifica o de ADN por PCR utiliza normalmente quantidades equimolares de primer forward e reverse para gerar um produto de ADN bifilamentar Contudo se a quantidade de um primer for excessiva em rela o ao outro a reac o ir gerar algum produto de ADN monofilamentar para al m do produto bifilamentar Durante os ciclos iniciais da fase de amplifica o LIFECODES gerado ADN bifilamentar Ap s o primer limitante se ter dissipado o primer restante utiliza o produto bifilamentar como uma matriz para gerar ADN monofilamentar Este m todo gera produtos bifilamentares e monofilamentares que ap s desnatura o ir o ambos participar na reac o de hibridiza o Cada uma das diferentes sondas pode ser hom loga a uma sequ ncia dentro do ADN amplificado que nica para um alelo ou grupo de alelos Por outras palavras estas sondas s o concebidas de forma a que cada sonda hibridize preferencialmente com uma regi o complementar que pode ou n o estar presente no ADN amplificado Al m disso o ADN amplificado tamb m hibridizado com uma ou mais sondas de consenso hom logas a sequ ncias presentes em todos os alelos de um locus A tipagem SSO pode ser afectad
21. onteiras do filtro de camadas microcentr fugas Pipetadores pipetadores multicanais e ponteiras 1 20 ul 20 200 ul 1000 ul Software de folha de c lculo Bloco t rmico 70 de isopropanol ou 20 de lix via Tabuleiro de reten o Applied Biosystems n 403081 para utiliza o apenas com o ciclador t rmico INSTRU ES PARA UTILIZA O NOTAS As misturas da sonda e a estreptavidina PE s o sens veis luz conservar ao abrigo da luz e n o congelar Aquecer os gr nulos a uma temperatura entre os 55 e os 60 C durante pelo menos 5 a 10 minutos para dissolver completamente os componentes na mistura da sonda Submeter a ultra sons durante pouco tempo 15 seg agitando em seguida a mistura em v rtice durante cerca de 15 segundos para suspender completamente os gr nulos Usar do m ximo cuidado no processo de forma o de al quotas utilizando pipetas calibradas Caso contr rio poder resultar em perda de reagente e no insucesso da amostra Todas as temperaturas devem ser rigorosamente respeitadas Flutua es t o pequenas como 0 5 C podem afectar os resultados Na fase de hibridiza o as amostras n o devem permanecer no estado dilu do a 56 C durante mais de 5 minutos consultar a sec o Resultados Recomenda se o ensaio das amostras amplificadas com a maior brevidade poss vel Caso as amostras n o possam ser processadas no instrumento Luminex no mesmo dia o produto amplificado pode ser gu
22. raturas adequadas para o armazenamento que constam no r tulo da embalagem do componente do kit 2 As misturas a sonda e estreptavidina PE s o sens veis luz CONSERVAR AO ABRIGO DA LUZ N O CONGELAR 3 N o utilizar os componentes ap s a data de validade ter expirado D Purifica o ou tratamento necess rio para utiliza o Consultar Colheita e prepara o da amostra E Indica es de instabilidade 1 Caso tenha ocorrido precipita o dos sais durante o transporte ou armazenamento dissolver novamente na totalidade antes de utilizar agitando em v rtice temperatura ambiente 18 a 30 C 2 N o utilizar Estreptavidina conjugada com R Ficoeritrina que tenha sido congelada durante o transporte ou armazenamento REQUISITOS EM MAT RIA DE INSTRUMENTOS 1 Plataforma de Instrumentos e XY Luminex N mero do produto 888300 888310 2 Foram validados os seguintes Cicladores T rmicos Sistema PCR 9700 96 Well GeneAmpQ PCR regulado para 9600 Base n de cat logo N8050200 Bloco Dourado n de cat logo 4314878 Ciclador T rmico VeritiTM 96 Well regulado a 9700 m x N do cat logo 4375786 Eppendorf Mastercycler Nexus regulado para modo seguro SAFE N de cat logo 6333000 014 Consultar Tabela 2 para velocidades m ximas de activa o Aten o N o foram validados outros cicladores t rmicos nem velocidades de activa o pa q E o Page 3 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 COLHEITA E PREPARA O DA AMOSTR
23. rau para Ebectroforese Lonza Group Ltd IDNA Agarose n 50170 Fonte de alimenta o aparelho de electroforese e Tamp o do gel 1x 40xTAE Promega N V4281 Mancha de gel com cido nucleico GelStar Lonza Group Ltd n 50535 Transiluminador UV ChromatoVUE UVP Inc modelo TM36 Sistema de imagiologia fotogr fica A migra o relativa do produto monofilamentar depende da concentra o do gel e do sistema tamp o utilizados As migra es aproximadas para cada amplifica o s o referidas em baixo para amostras processadas em gel de Agarose a 2 em tamp o 1X TAE tamp o tris acetato de electroforese Condi es para electroforese 1 Remover a mancha de cido nucleico GelStar Lonza Group Ltd N 50535 do congelador para descongelar Manter no escuro 2 O gel usado para este procedimento deve estar a 2 isto para uma base de 200 ml de gel utilizar 4 gramas de agarose com 200 ml 1X TAE Diluir de 40X TAE Adicionar 10 ul da mancha de cido nucleico GelStar agarose fundida Ao deitar o gel certificar que deixa espa o suficiente para o ADN percorrer uma dist ncia significativa 2 5 a 5 cm UTILIZAR COM PRECAU O o GelStarf um carcin geno potencial NOTA poss vel processar geles com 20 ul de 10 mg ml de brometo de et dio em vez da mancha de cido nuc lico GelStar A intensidade da banda do produto ser menor em geles que contenham brometo de et dio do que em geles que contenham GelStarQ
24. s os valores o padr o de resultados obtidos pela sonda isto todos os positivos e negativos atribu dos a uma dada amostra pode ser comparado com o s quadro s de resultados obtidos pelas sondas Aten o e Existe um Quadro dos limiares separado para cada locus e para cada sonda de mistura e Estes quadros dos limiares s o espec ficos do conjunto certifique se de que o n mero do conjunto nos quadros dos limiares e o n mero do conjunto de um kit de tipagem s o coincidentes e Seum valor normalizado de uma sonda espec fico for superior ao limiar m ximo de uma classifica o negativa e inferior ao valor m nimo de uma classifica o positiva a amostra deve ser considerada como indeterminada para esta sonda A amostra deve ser tipada assumindo inicialmente que o valor negativo e em seguida assumindo que positivo e Consultar a sec o VALORES PREVISTOS para mais informa o sobre os valores limiares CONTROLO DE QUALIDADE Recomenda se a execu o de um controlo positivo e de um controlo negativo com cada teste por exemplo um branco com gua e uma amostra previamente tipada respectivamente As sondas de oligonucle tido da sequ ncia espec fica SSO de consenso indicadas no Quadro dos limiares hibridizam com os respectivos alelos espec ficos do locus Os valores obtidos com os SSOs de consenso dos controlos positivos devem exceder o valor limite para os SSO conforme especificado na Folha de Trabalho do Quadro dos L
25. tos suplementares N mero do ILOT N mero do Limita es de Limite m ximo lote cat logo temperatura de temperatura Conservar Data de l Suficiente para validade Z Pa abrigo Q tasias N y N o congelar a luz Consultar m origies Representante REPCE a ES dE p i Fabricante na Europa REP CE Utiliza o MiZAQAO Page 1 of 10 LC775TCEPT 3 08 13 KITS REAGENTES POR N MERO DE CAT LOGO LCT DQA Kit de Tipagem LIFECODES HLA DQA1 SSO N do Cat logo 628931 LM DQA Kit de Tipagem LIFECODES HLA DQA para utiliza o com Luminex Product 628061 Reagente N mero do j Volume de Armazenamento 20 enchimento m p Suficiente para 20 XN padr o LIFECODES HLA cmo 420 on 2 o eme ias t i 2 E BM DQA ada ERES OPS 628063 360 ul Conservar ao abrigo da luz Solu o de dilui o 628155 o 18300 o 18300 TAQ Taq polimerase LIFECODES 628075 25 ul 10 C a 30 C LCT DPB Kit de Tipagem LIFECODES HLA DPB1 SSO N do Cat logo 628935 LM DPB Kit de Tipagem LIFECODES HLA DPB para utiliza o com Luminex Product 628910 R N d y E enchimento o ro X z Suficiente para 20 MX DPB e padr o LIFECODES HLA emos 420 BETE amostras 2 me Bm DPe Mi tura de sonda LIFECODES HLA 628902 360 yl Conservar ao abrigo da luz PO Solu o de dilui o 628155 o 8300 o 8300 TAQ Tag polimerase LIFECODES 628075 25 ul 10 C a 30 C FAs Misturas de sonda s o sens veis luz evit
26. trumento Luminex Para obter os melhores resultados submeter de imediato as amostras a ensaio usando o instrumento Luminex A leitura das amostras pode ser efectuada at 30 minutos ap s terem sido dilu das Caso a leitura n o seja feita de imediato proteger as amostras da luz Ligar o instrumento Luminex entre 30 minutos e 4 horas antes de proceder ao ensaio das amostras Antes de analisar as amostras no instrumento Luminex criar um Batch Run Execu o de lote com o qual as amostras ser o analisadas 1 2 a Seleccionar Create a new batch Criar um novo lote a partir do menu File Ficheiro e Por exemplo no caso de se pretender analisar HLA DPB adicionar o Batch para HLA DPB e Surge o Batch Template Modelo de lote a que atribu do o nome neste caso de HLA DPB e Ter em aten o que as vers es de modelos t m n meros de lote espec ficos e correspondem aos n meros dos conjuntos de kits e Seguir as instru es que surgem passo a passo no ecr para a cria o de lotes e Ao atribuir um nome ao lote n o incluir v rgulas no mesmo uma vez que a informa o que se segue a uma v rgula perder se ap s exporta o dos dados e Para obter mais instru es sobre a forma de criar lotes simples e m ltiplos consultar o Manual do Utilizador do Luminex Clicar sobre o s mbolo Eject Ejectar para ejectar o suporte da placa Colocar a placa do ciclador t rmico de 96 po os contendo as amostras no bloco t rmico X
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