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1 - Repositório Aberto da Universidade do Porto

1. 0 0 ceceeeeceeeeeeeees 5 29 5 3 3 Caudal frequ ncia de passo das buretas 5 32 5 3 4 Concentra o de NQS e pH 5 37 5 3 5 An lise de formula es farmac uticas 5 39 AC ONCIUS OS spaces ri cui dra DEL OR Sd Soe 5 40 5 5 Refer ncias bibliogr ficas c nrnna 5 43 CAP TULO 6 ndice Determina o de pirazinamida por quimioluminesc ncia num sistema de fluxo com multi impuls o GA Mtrod o sas nas a ceed SAS LI res eau ewutsdeeeteeele 6 2 Parte Experimental usados avi tet se SE ce O US 6 2 Lu Reapentes apaa aao ees ineo a Sa 6 2 2 Roquipamento nerse doe tidaped neii eedi Cnqoniatalra a 6 2 3 Montagem de fluxo asas us ssa ease as aaa eae tees 6 2 4 M todo de refer ncia cumpessmnisaseanonasaro Sas cs eek 6 3 Resultados e discuss o 05235 ance sagrado aa sc ada soa 6 3 1 Optimiza o dos par metros qu micos 6 3 2 Optimiza o dos par metros do sistema de fluxo 6 3 3 An lise de formula es farmac uticas 6 3 4 Explora o do sistema de fluxo i 6 4 CONCIUS ES pcerisgasisinuso serans Senay Pa APELO pe Seow are 6 5 Refer ncias bibliogr ficas i li cce CAP TULO 7 Conclus es Finais cece cece c ence eeeeeneceenereaesuveuns ANEXO Lista de Publica es Cient ficas Agradecimentos
2. 1 92 Introdu o Geral 1 4 Metodologias anal ticas autom ticas para a an lise de produtos farmac uticos O crescimento cont nuo no desenvolvimento de novos f rmacos dos diversos grupos terap uticos e na investiga o dos efeitos originados quando aplicados em tratamentos motivou a procura de metodologias mais eficientes e sobretudo com uma maior componente de automatiza o Deste modo a an lise de f rmacos quer na forma de formula es farmac uticas quer como mat ria prima para a sua produ o e a sua determina o conjuntamente com a dos seus metabolitos em amostras biol gicas soro plasma urina e outros fluidos constitui grande parte da actividade desenvolvida pelos laborat rios farmac uticos e cl nicos Em termos de an lise farmac utica a FIA sem d vida a metodologia mais divulgada e mais utilizada nos trabalhos cient ficos publicados devido sua antiguidade que lhe confere um conhecimento e aceita o superiores aos das outras metodologias Mas al m da antiguidade existe outro factor que justifica o grau de divulga o cient fica de FIA e que o requisito de conhecimentos e respectivo equipamento inform tico e electr nico de modo a possibilitar a utiliza o das outras metodologias de an lise em fluxo A multicomuta o tem um campo de aplica o por enquanto bastante limitado embora devido ao seu potencial anal tico as perspectivas futuras sejam muito p
3. Determina o espectrofotom trica de isoniazida O sistema anal tico demonstrou um funcionamento est vel e n o se observou desvio da linha de base durante o per odo de determina es anal ticas Esta montagem de fluxo foi capaz de efectuar 30 determina es por hora 6 00 4 00 2 00 Amplitude de sinal cm 0 00 0 4 8 12 16 20 Concentra o de amostra mg L Figura 5 18 Curva de calibra o obtida com solu es padr o de isoniazida com concentra es de 2 0 at 18 0 mg L 5 4 Conclus es l Os resultados obtidos confirmam que o conceito de fluxo pulsado pode ser facilmente implementado atrav s da utiliza o de buretas autom ticas Embora estes dispositivos n o produzam um fluxo pulsado em condi es normais de Determina o espectrofotom trica de isoniazida utiliza o podem efectuar diferentes tarefas incluindo simultaneamente a inser o individual de solu es de amostra e reagentes a comuta o de fluxo e propuls o das diferentes solu es com uma excelente precis o exactid o e versatilidade Adicionalmente estes dispositivos s o robustos e o seu controlo computorizado assegura uma elevada versatilidade na manipula o de solu es possibilitando a implementa o de diferentes estrat gias para a inser o das solu es de amostra como por exemplo a amostragem bin ria conflu ncia de zonas ou inser o de volumes nicos Quando to
4. Introdu o Geral Figura 1 32 Montagem de fluxo para a determina o de c dmio n quel e chumbo V a V v lvulas solen ides de 3 vias C1 a C3 colunas de resinas S amostra E eluente W dreno Adaptado de 73 A espectrometria por absor o at mica com atomiza o electrot rmica foi a eleita por Silva et al em 1998 74 Neste trabalho Figura 1 33 realizava se as etapas de separa o e pr concentra o em linha para a determina o de c dmio chumbo e n quel em guas minerais A multicomuta o proporcionou um manuseamento muito simplificado e vers til da amostra e reagentes o que por sua vez permitiu uma eficiente etapa de pr concentra o e atomiza o da amostra Tamb m envolvendo etapas de separa o e pr concentra o em linha foi desenvolvido um sistema de fluxo multicomutado Figura 1 34 acoplado a um sistema em plasma induzido com detec o por espectrometria de massa ICP MS para a determina o de cobre c dmio chumbo bismuto e sel nio IV em gua do mar por Pozebon et al 75 1 66 Introdu o Geral amp Acondicionamento t Pr concentra o ty Lavagem da coluna o et Elui o Filamento MO ce de tungst nio Figura 1 33 Montagem de fluxo e sequ ncia de funcionamento do sistema para a separa o e pr concentra o de chumbo c dmio e n quel V a V4 v lvulas solen ides de 3 vias S
5. res duos No esquema da Figura 6 4 P a P4 representam quatro micro bombas de volume interno de 8 uL sendo cada uma respons vel pela inser o e impuls o de cada uma das solu es envolvidas na determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas O n mero de reagentes e consequentemente o n mero de solu es que se reflecte num determinado n mero de micro bombas utilizadas cada solu o impulsionada por uma micro bomba diferente um aspecto muito importante a considerar aquando da montagem de um sistema de fluxo Num sistema que envolve muitas solu es e em que a reac o de quimioluminesc ncia de desenvolvimento r pido a amostra deve ser introduzida num fluxo em separado e misturada posteriormente com o reagente de quimioluminesc ncia pr ximo da regi o de entrada para a c lula de fluxo junto ao detector Paralelamente outros reagentes que desencadeiem o in cio da reac o tamb m devem ser misturados Determina o quimioluminom trica de pirazinamida apenas nas proximidades da c lula de fluxo Esta imposi o conferida pela quimioluminesc ncia evidencia claramente a necessidade de se possuir um controlo individualizado e vers til sobre o transporte de cada solu o interveniente num sistema de fluxo o que influencia directamente a extens o da mistura das solu es em fluxo Quando se executa a activa o de uma micro bomba ocorre a aspira o de um deter
6. De acordo com W Misiuk et al 45 muitas das subst ncias propostas para a determina o espectrofotom trica de dibenzoazepinas n o s o satisfat rias para aplica o em sistemas de fluxo cont nuo algumas requerem aquecimento longos tempos para desenvolvimento de cor ou execu o muito demorada Por exemplo usando dicromato de pot ssio em meio acidulado com cido sulf rico requer aquecimento a 50 C por 25 minutos 46 a oxida o por i es de ferro HI em meio cido com cido ac tico necessita de temperaturas elevadas na ordem de 75 C 47 Em face desta situa o o monovanadato de am nio foi seleccionado como o oxidante a usar porque produzia rapidamente produtos de oxida o sendo adicionalmente est veis e a literatura refere que os produtos formados eram mais 3 14 Determina o espectrofotom trica de clomipramina est veis a temperatura ambiente que os compostos formados com i es de ferro III dicromato de pot ssio ou iodato 45 Este reagente n o apresenta propriedades carcinog nicas e um composto qu mico est vel em condi es normais de uso e armazenamento Adicionalmente este reagente de f cil acesso e tal como foi comprovado posteriormente a sua reactividade com a clomipramina ocorre temperatura ambiente e n o requer tempos de reac o longos Deste modo realizaram se ensaios preliminares por procedimentos discretos para avaliar a reac o de oxida
7. c e isca 3 34 CAP TULO 4 Determina o de trimipramina com um sistema autom tico multicomutado com invers o de fluxo A Introd c o t 27 aire salada ISIS SA Sa AT 4 1 4 2 Parte Experimental meeer se Maoh ellen alee ia da 4 7 4 21 Reagentes cin tite ecu ates Minden pen bad REU 2 aids 4 7 4 2 2 Equipamento atest anatase sites tare nuda dai dr ana 4 8 4 2 3 Montagem de fluxo 2 0 0 0 eee iii 4 9 4 2 4 M todo de refer ncia cc cece ecseeeceeeers 4 12 ndice re re rear er 4 3 Resultados e discuss o sp aperors lala paiade ni trae ah wes 4 13 4 3 1 An lise de formula es farmac uticas 4 31 AC OnChISDOS pintado at tec rias S a in 4 34 4 5 Refer ncias bibliogr ficas 0 00 ccc ooon 4 36 CAPITULO 5 Determina o de isoniazida por um sistema em fluxo cont nuo Sato Introdu o wise sra dar sa aa Rd ra 5 1 5 2 Parte Experimental sas ssa gases a na cae e Ud as 5 8 5 21 Reagentes diria eect a Odo aa int asian in du 5 8 5 2 2 Equipamento cs 202i aps apressar E ad 5 9 5 2 3 Montagem de fluxo 22 4 0 0 lt 6 s ess den edevedencvea passas 5 10 5 2 4 M todo de refer ncia cc ccccseceesceccececeaen 5 14 5 3 Resultados e discuss o 0ccceseceessesscosecceecscaeseuees 5 14 5 3 1 Volume de passo da bureta comprimento do reactor volume de amostra e estrat gia de amostragem 5 17 5 3 2 Comprimento do reactor
8. 1 1 ee Rak f Vs coo W f m 4 gore TOT DET Er W Figura 1 29 Montagem de fluxo para a determina o de c lcio com dilui o autom tica das amostras V a Vs v lvulas solen ides de 6 vias B a B4 reactores C transportador S Amostra R reagentes x conflu ncia D detector W dreno Adaptado de 70 1 63 Introdu o Geral Em 2000 Lapa et al 71 implementam um sistema de fluxo multicomutado Figura 1 30 para detec o fluorim trica de isoniazida em formula es farmac uticas e com aplica o em ensaios de dissolu o de comprimidos atrav s de uma t cnica de dilui o por remo o da zona de amostra mais concentrada Figura 1 30 Montagem de fluxo para a determina o de isoniazida V v lvula pneum tica V e V3 v lvulas solen ides de 3 vias D detector B bureta autom tica L e L reactores L canal de limpeza S amostra C transportador Adaptado de 71 Um outro aproveitamento da flexibilidade e versatilidade caracter sticas da multicomuta o concretizou se em 1997 quando se desenvolveu um sistema anal tico que visou a compensa o dos efeitos Schlieren frequentemente associados a determina es espectrofotom tricas A montagem anal tica Figura 1 31 desenvolvida por Lapa et al 72 recorria amostragem bin ria para a prepara o em linha da solu o transportadora o que origin
9. reagentes C transportador L reactor D detector x conflu ncia Adaptado de 111 1 88 Introdu o Geral Tamb m em 2003 Santos et al 112 desenvolveram outro sistema de fluxo explorando o conceito de multi impuls o para a determina o espectrofotom trica de dipirona em prepara es farmac uticas com um ritmo de amostragem de 50 determina es por hora Figura 1 50 Figura 1 50 Montagem de fluxo de multi impuls o para a determina o de dipirona P e P micro bombas S amostra R reagente L reactor D detector x conflu ncia Adaptado de 112 Em 2004 Lima et al 113 publicaram um artigo de revis o dos sistemas de fluxo de multi impuls o Neste trabalho foi salientado o controlo individualizado de cada bomba o que consequentemente possibilita uma inser o de amostra e reagentes caracteristicamente vers til e selectiva Carneiro et al 114 em 2005 desenvolveram um trabalho que envolvia a determina o espectrofotom trica de glucose e frutose em xaropes por interm dio de um sistema de an lise em fluxo baseado no conceito de multi impuls o Figura 1 51 Para efectuar as determina es c psulas contendo xarope eram inseridas directamente num vaso acoplado ao sistema onde eram dissolvidas por um 1 89 Introdu o Geral eee tata e rr es t processo de dissolu o
10. 1 0 metros A Tempo de amostragem 6 s ER Tempo de amostragem 12 s Pela an lise dos resultados na Figura 3 9 verifica se que a diferen a de sinal anal tico obtido com a acidifica o da zona de reac o com cido sulf rico a 5 0 mol L e a 6 0 mol L n o significativa pelo que a solu o de cido sulf rico a Determina o espectrofotom trica de clomipramina utilizar nos ensaios posteriores foi de 5 0 mol L tamb m para esta concentra o que se verifica uma diferen a significativa na resposta entre os dois tempos de amostragem e que n o observada para concentra es de cido sulf rico inferiores O estudo da influ ncia do comprimento do reactor e do caudal foi executado simultaneamente dado que estes par metros determinam o tempo de resid ncia e consequentemente a extens o do desenvolvimento da reac o afectando deste modo a amplitude do sinal anal tico Uma solu o 10 mg L de clomipramina foi inserida a diferentes tempos de amostragem e transportada em direc o ao detector com distintos caudais de 0 5 1 0 e 1 5 ml min Os tempos de amostragem correspondentes a determinados volumes consoante os par metros anal ticos da montagem variaram entre 1 segundo e 40 segundos Ao mesmo tempo o comprimento do percurso anal tico foi alterado atrav s da substitui o do reactor Lj utilizando comprimentos de 0 5 1 0 1 5 e 2 0 metros para cada ensaio de caud
11. 34 S Ulrich T Isensee U Pester J Chromatogr B 685 81 1996 M A Martinez C S de la Torre E Almarza J Anal Toxicol 27 353 2003 K J Lee J J Lee D C Moon J Chromatogr Biomed 616 135 1993 H S Kou C C Chen Y H Huang W K Ko H L Hu S M Wu Anal Chim Acta 525 23 2004 M C Ortiz J Arcos J V Juarros J Lopezpalacios L A Sarabia Anal Chem 65 678 1993 M Khodari Electroanal 5 521 1993 A Ferancova E Korgova R Miko J Labuda J Electroanal Chem 492 74 2000 G M Greenway S J L Dolman Analyst 124 759 1999 H R McKim D G Calverley G B Baker W G Dewhurst Can J Pharm Sci 13 102 1978 K Nikolic L Arsenijevic M Medenica Acta Pharm Jugosl 36 349 1986 B Starczewska H Puzanowska Tarasiewicz Anal Lett 31 809 1998 P Nagaraja M F Silwadi A A Syed Anal Lett 33 2913 2000 P Nagaraja M F Silwadi A A Syed Mikrochim Acta 135 185 2000 European Pharmacopoeia Council of Europe Strasbourg Fourth Ed 2078 2002 J Ruzicka E H Hansen Flow Injection Analysis Second Ed Wiley New York 1988 J Ruzicka G D Marshall Anal Chim Acta 237 329 1990 B F Reis M F Gine E A G Zagatto J L F C Lima R A S Lapa Anal Chim Acta 20 129 1994 D Betteridge P B Oates A P Wade Anal Chem 59 1236 1987 Determina o espectrofotom t
12. Green Chem 3 216 2001 B F Reis A Morales Rubio M de la Guardia Anal Chim Acta 392 265 1999 M D Luque de Castro Pure Appl Chem 74 2293 2002 G D Christian Anal Chem 67 A532 1995 B F Reis Quim Nova 19 51 1996 J Ruzicka E H Hansen Anal Chim Acta 78 145 1975 C E Hammer Drug Development CRC Press Boca Raton 1986 J T Carstensen Drug Stability Marcel Dekker Inc New York USA 1990 C A Johnson J Pharm Biomed Anal 4 689 1986 D Schirmer Modern Methods of Pharmaceutical Analysis CRC Florida USA 1982 A H Beckett J B Stenlake Practical Pharmaceutical Chemistry The Athlone Press London UK 1988 Remington Remington s Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Company Easton Pennsylvania 1990 1 95 Introdu o Geral 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 P MacLaurin K J Parker A Townshend P J Warsfold N W Barnett M Crane Anal Chim Acta 238 171 1990 P MacLaurin P J Warsfold A Townshend N W Barnett M Crane Analyst 116 701 1991 Z L Fang Q Fang X Z Liu H W Chen C L Liu Trends Anal Chem 18 261 1999 B F Rocks Anal Proc 26 321 1989 E H Hansen Talanta 64 1076 2004 J Namiesnik Crit Rev Anal Chem 30 221 2000 J M Calatayud Flow Injection Analysis of Pharmaceutica
13. NH O DOG TA Lumino 3 Aminophthalate 3 APA Figura 6 2 Reac o de oxida o do luminol para produzir luz Adaptado de 42 White et al 43 44 demonstraram que a emiss o de luz a partir da oxida o do luminol devida forma o de um i o negativo do luminol que reage com oxig nio ou um reagente oxidante alternativo para originar um estado excitado do 140 aminoftalato e que respons vel pela emiss o de luz Devido estrutura qu mica da pirazinamida esta forma complexos est veis com o cati o cobre II tendo sido esta propriedade explorada neste trabalho para inibir a actividade catal tica do cati o cobre II na reac o de oxida o do luminol pelo Determina o quimioluminom trica de pirazinamida per xido de hidrog nio Consequentemente a intensidade de luz gerada foi relacionada com a concentra o da pirazinamida nas amostras de formula es farmac uticas 6 2 Parte Experimental 6 2 1 Reagentes Foi preparada diariamente uma solu o com uma concentra o de 500 mg L de pirazinamida atrav s da dissolu o de 50 0 mg da subst ncia s lida em 100 mL de gua bidesionizada A partir desta solu o foram preparadas as solu es padr o utilizadas para a elabora o das curvas de calibra o por dilui o com gua bidesionizada A solu o de cati o cobre II com uma concentra o de 50 mg L foi preparada atrav s da pesagem de 13 4
14. o de sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o explorada uma nova caracter stica hidrodin mica baseada num movimento ca tico das solu es de amostra e reagentes durante o seu transporte para a detec o O fluxo pulsado promove uma mistura r pida entre solu es de amostra e reagentes mesmo em condi es limitadas de dispers o como por exemplo quando na utiliza o nas montagens anal ticas de reactores de pequenas dimens es A metodologia por multi impuls o aplicada para a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas revelou se r pida simples e precisa e exibiu um elevado grau de automa o O controlo de um sistema de fluxo baseado em multi impuls o sendo realizado atrav s da activa o independente de cada micro bomba possibilita um ajuste quase imediato do caudal de solu o debitado por cada dispositivo e portanto em cada ponto de inser o de solu es no sistema de fluxo Deste modo estes sistemas garantem um controlo minucioso do volume de amostra inserido atrav s de um controlo preciso sobre a frequ ncia de pulso de cada micro bomba O controlo preciso sobre todos os par metros de configura o do sistema de fluxo para a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas definiram o elevado grau de versatilidade destes sistemas traduzido pela obten o de diferentes intervalos de calibra o para a determina o do f rmaco por interm dio da simpl
15. o espectrofotom trica de isoniazida executar determina es em formula es farmac uticas por metodologias autom ticas em fluxo Neste trabalho demonstrou se o aumento da produtividade e a redu o do tempo necess rio para realizar uma determina o face ao ritmo de amostragem obtido Outro factor a considerar a diminui o da interven o humana com consequ ncias na redu o dos erros de um procedimento anal tico como em titula es com detec o visual do ponto final que requerem habilidade do operador 5 42 Determina o espectrofotom trica de isoniazida 5 5 Refer ncias bibliogr ficas 10 11 12 13 14 15 16 The Index Merck Thirteenth Edition 5204 2001 G A Brewer Anal Profiles Drug Subst 6 183 1977 The Pharmacological Basis of Therapeutics Goodman s amp Gilman s 10 Ed McGraw Hill 2001 K Johnsson D S King P G Schultz J Am Chem Soc 117 5009 1995 http isi1S isiknowledge com portal cgi J T Stewart I L Honigberg J P Btant W A Murray J L Webb J B Smith J Pharm Sci 65 1536 1976 K C Jindal R S Chaudhary A K Singla S S Gangwal S Khanna J Pharm Biomed Anal 12 493 1994 R N Grupta M Lew J Chromatogr Biomed Appl 69 441 1988 H Kubo T Kinoshita K Matsumoto T Nishikawa Chromatographia 30 69 1990 K Mawatari F Linuma M Watanabe Anal Sci 6 515 1990 A Car
16. 1222272 Res duos pe Detector Reactor T e LE LU Aquecimento Res duos A f Amostra Figura 1 7 Montagem de fluxo representando as diversas interliga es entre as v lvulas accionadas por computador As setas indicam os caminhos normalmente abertos das v lvulas Adaptado de 46 O sistema anal tico desenvolvido apresentou uma precis o sensibilidade e reprodutibilidade semelhante ao de um sistema FIA convencional embora com a vantagem de requerer volumes inferiores de amostra e reagentes para cada an lise Rocks em 1989 20 desenvolveu uma metodologia multian hse tendo por base um sistema de An lise em Fluxo Com Dispers o Controlada 47 aperfei oado pelo recurso a v lvulas solen ides de 3 vias controladas por microprocessador que expandiram as potencialidades do sistema para a an lise de m ltiplos analitos 1 40 Introdu o Geral a sa E SS Este sistema multian lise possibilitava deste modo a execu o de diferentes determina es em amostras cl nicas atrav s da inser o por aspira o de diferentes reagentes Em 1991 Pasquini e Faria 48 desenvolveram um m dulo de injec o de amostras em sistemas FIA constitu do por 3 v lvulas solen ides Figura 1 8 Este dispositivo era controlado automaticamente por um circuito temporizador e permitia a amostragem de volumes de 20 a 300 uL sendo a limita o do volume m ximo definido pelo comprimento do tubo c
17. O aumento da intensidade de sinal anal tico resultante da utiliza o da estrat gia de amostragem bin ria deve se ao maior n mero de interfaces amostra reagente associado a uma menor ocorr ncia de dispers o nessas interfaces o que favoreceu a homogeneiza o da clomipramina com o oxidante vanadato incrementando o desenvolvimento da reac o Este procedimento foi muito importante dado que as solu es analisadas foram preparadas numa solu o de cido sulf rico 5 0 mol L 3 20 Determina o espectrofotom trica de clomipramina cuja pr pria natureza a torna muito viscosa porque em consequ ncia da elevada viscosidade desta solu o uma al quota da amostra introduzida como um volume nico originava unicamente duas zonas de interface o que restringiria o desenvolvimento da reac o devido mistura ineficiente entre amostra e reagente durante o transporte da zona de reac o para o sistema de detec o Em alternativa a usar se longos reactores para promover uma eficiente mistura amostra e reagente o que resultaria num aumento da dispers o da amostra e portanto diminui o da amplitude do sinal anal tico a explora o da metodologia de amostragem bin ria promove a forma o de m ltiplas zonas de interface que se comportam como uma nica e homog nea zona de reac o enquanto o sistema anal tico permanece estruturalmente simples e eficiente A avalia o do desempenho da amostragem bin
18. antidepressivos tric clicos referidos no Cap tulo 3 motivou o desenvolvimento de Ae Determina o espectrofotom trica de trimipramina rr ii ia ai diversos m todos para a determina o do f rmaco em formula es farmac uticas como tamb m em amostras biol gicas Encontra se referido na literatura diversas metodologias cromatogr ficas nomeadamente cromatografia l quida de elevado desempenho HPLC com detec o por espectrofotometria na regi o do ultravioleta 2 6 HPLC com detec o electroqu mica 7 8 HPLC acoplado a um detector de massa 9 cromatografia l quida CL com detector de massa 10 11 CL com detec o electroquimica 12 cromatografia gasosa CG com detector de nitrog neo f sforo 13 CG com detector por ioniza o em chama 14 CG com detector de espectrometria de massa 15 16 cromatografia g s l quido com detector de nitrog neo f sforo 17 18 Em 1993 foi desenvolvido um trabalho para determina o de alguns antidepressivos de entre os quais a trimipramina em plasma humano por Cromatografia Electrocin tica Micelar 19 Para a determina o de trimipramina e tamb m de outros compostos antidepressivos tric clicos em formula es farmac uticas Kou et al desenvolveram em 2004 uma metodologia baseada em _ electroforese capilar com detec o espectrofotom trica na regi o do ultravioleta 20 Na rea dos m todos electroqu micos tamb m foram realizados
19. o de hidr xido de s dio com concentra o 1 75 x 10 mol L para as posteriores determina es anal ticas Determina o quimioluminome trica de pirazinamida 5 00 4 00 3 00 2 00 Amplitude de sinal cm 1 00 0 00 0 01 0 015 0 02 0 025 0 03 0 035 0 04 Concentra o de NaOH M Figura 6 6 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de hidr xido de s dio entre 1 3 x 10 mol L e 3 8 x 10 mol L Ainda no contexto da influ ncia do pH na amplitude de sinal analitico obtido pela oxida o de luminol por per xido de hidrog nio ensaiaram se diferentes concentra es de solu es de cido sulf rico desde 1 x 10 mol L at 6 x 10 mol L Figura 6 7 A solu o de cido sulf rico era utilizada para preparar as solu es de cati o cobre II 6 21 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida w o 2 00 Amplitude de sinal cm 0 1 2 3 4 5 6 7 Concentra o de H SO mM Figura 6 7 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de cido sulf rico entre 1 x 10 mol L e 6x 10 mol L Os resultados obtidos revelam que o m ximo de intensidade de sinal anal tico foi obtido quando se utilizou uma solu o de cido sulf rico com concentra o 4 x 10 mol L visto que para concentra es inferiores e superiores a 4 x 10 mol L o sinal anal tico gerado foi inferior Tais
20. o do motor de passo da bureta Este facto referido porque o motor de passo da bureta pode ser programado para executar m ltiplos passos apenas com uma ordem de actua o enviada pelo computador Neste caso este aspecto mec nico das buretas autom ticas possibilitava alcan ar caudais mais elevados mas por outro lado seriam tamb m mais irregulares A avalia o da influ ncia do caudal foi realizada inserindo volumes crescentes de amostra de 8 16 24 32 e 40 uL em frequ ncias de passo de 1 1 3 2 4e 10 e utilizando uma seringa com capacidade de 2 5 mL a escolha foi justificada em 5 2 3 Adicionalmente para cada uma destas frequ ncias de passos das buretas ou seja para cada caudal testado foi analisado as tr s estrat gias de inser o de amostra mencionadas anteriormente amostragem bin ria conflu ncia de zonas e volumes nicos de amostra Os resultados encontram se representados em gr ficos nas Figuras 5 14 e 5 15 Na Figura 5 14 cada gr fico representa um caudal diferente e poss vel observar os efeitos no sinal anal tico atrav s da altera o da estrat gia de inser o de amostra Na Figura 5 15 os mesmos resultados est o organizados de maneira diferente em que cada gr fico representa uma mesma estrat gia de inser o de amostra para diferentes caudais Verificou se que a amplitude do sinal anal tico mais elevada foi obtida com um caudal de 0 12 mL min tempo de repouso entre passos de 0 5 s e um vo
21. solendide E entrada 1 S sa da M mola Parte Experimental tt e es e are rms 2 3 2 2 Sistema de detec o O detector utilizado no sistema de fluxo por multi impuls o foi um detector de quimioluminesc ncia constru do no laborat rio de Qu mica F sica e adaptado an lise em fluxo Para tal utilizou se um fotomultiplicador da marca Hamamatsu modelo H5784 04 acoplado a uma c lula de fluxo constru da especialmente para se adaptar ao fotosensor Este detector de quimioluminesc ncia foi aplicado determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas e uma descri o mais pormenorizada do sistema de detec o ser apresentada no cap tulo experimental respectivo 2 3 2 3 Sistemas de controlo 2 3 2 3 1 Aparelhagem O controlo dos dispositivos da montagem anal tica foi realizado a partir de um microcomputador com um microprocessador Pentium III a 450 Mhz A semelhan a do controlo dos dispositivos dos sistemas de multicomuta o desenvolvidos as micro bombas e os restantes componentes da montagem anal tica foram controlados atrav s do envio de sinais TTL derivados da utiliza o de uma placa de interfaceamento da marca Advantech modelo PC LabCard PCL 818L e de uma unidade de pot ncia baseada num circuito CoolDrive da marca NResearch Inc Parte Experimental fy 2 3 2 3 2 Programas informaticos Como o funcionamento das micro bombas est dependente da
22. 145 1974 A M Leal M A Alves Ver Port Farm 2 175 1952 C A Georgiou M A Koupparis T P Hadjiioannou Talanta 38 689 1991 J A Garcia Bautista J V Garcia Mateo L Martinez Calatayud Anal Lett 31 1209 1998 S A Halvatzis M M Thimotheou Potamia A C Calokerinos Analyst 115 1229 1990 A Safani M A Karimi M R H Nezhad J Pharm Biomed Anal 30 1499 2003 5 44 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Determina o espectrofotom trica de isoniazida rr e ii eis D D Perrin B Dempsey Buffers for pH and Metal Ion Control London 1979 S Alegret J Alonso J Bartroli A A S C Machado J L F C Lima J M Paul s Qu m Anal 6 278 1987 Farmacopeia Portuguesa VII Ed Oficial Lisboa 1342 2002 R A S Lapa J L F V Lima B F Reis J L M Santos E A G Zagatto Anal Chim Acta 466 125 2002 J Ruzicka E H Hansen Flow Injection Analysis 2nd Ed Wiley New York 1988 J Ruzicka G D Marshall Anal Chim Acta 237 329 1990 B F Reis M F Gin E A G Zagatto J L F C Lima R A S Lapa Anal Chim Acta 293 129 1994 H Pasekova M Polasek J F Cigarro J Dolejsova Anal Chim Acta 438 165 2001 J L F C Lima J A V Prior B F Reis J L M Santos E A G Zagatto Anal Chim Acta 467 75 2002 A C B Dias J L M Santos J L F C Lima E
23. B 8 00 E 6 00 3 4 00 2 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL 8 00 6 00 4 00 bad 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL A Amplitude de sinal cm Amplitude de sinal cm C Amplitude de sinal cm Figura 5 7 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico da capacidade da seringa utilizada em fun o do volume de amostra A amostragem bin ria B conflu ncia de zonas C volumes nicos seringa 10 0 mL e seringa 5 mL A seringa 2 5 mL Determina o espectrofotom trica de isoniazida ee Considerando por exemplo um volume de amostra de 16 uL a utiliza o de um volume de passo de 1 uL origina 32 interfaces amostra reagente para ocorr ncia de reac o recorrendo inser o de solu o de amostra atrav s da estrat gia de amostragem bin ria Comparativamente para o mesmo volume de amostra e utilizando um volume de passo de 4 uL origina se apenas 8 interfaces de reac o Apesar da nfima diferen a de volume entre 1 e 4 uL de volume por passo da bureta autom tica em circunst ncias de dispers o limitada como as ocorridas com a utiliza o de tubos com di metro interno muito pequeno e reduzido volume interno da c lula de fluxo a intercala o de segmentos de solu es com menor volume facilita obviamente a homogeneiza o embora seja importante referir o facto de que este comportamento caracter stico ou distinto n o ocorreria
24. Gastrointestinais v mitos dores abdominais diarreias altera es no gosto icter cia obstrutiva e hepatite com ou sem icter cia vi End crinos perda de peso galactorreia nas mulheres s ndrome de secre o inapropriada da hormona antidiur tica altera es nos n veis sangu neos de a car aumento dos n veis de prolactina e irregularidade na menstrua o Em virtude da probabilidade de elevada sensibilidade das crian as em rela o aos adultos para casos de sobredosagem com antidepressivos tric clicos e dado que um maior n mero de fatalidades em crian as tem sido reportado devem ser feitos esfor os para evitar potenciais sobredosagens especialmente neste grupo de menor idade 3 As sobredosagens podem ter origem em erros de formula o pelo que de grande import ncia o desenvolvimento de novas metodologias de an lise em formula es farmac uticas Os primeiros sinais e sintomas de sobredosagem com antidepressivos tric clicos assumem normalmente a forma de graves reac es anti colin rgicas que se estabelecem passado cerca de 30 minutos a 2 horas ap s a ingest o da droga Os sintomas podem abranger sonol ncia entorpecimento ou insensibilidade ataxia v mitos cianose agita o del rios transpira o severa reflexos hiperactivos rigidez muscular e convuls es Casos de depress o respirat ria podem acontecer assim como hipotens o ou hipertens o inicial No entanto mais observado situa es
25. Montagem de fluxo multicomutado O sistema de fluxo Figura 3 2 desenvolvido incorporava duas v lvulas solen ides de comuta o de 3 vias Vi e V2 A v lvula V era respons vel pela inser o de amostra e reagentes e a v lvula V2 era usada para direccionar o transporte das solu es para um percurso de entre dois percursos anal ticos distintos L e L2 para permitir a execu o de uma etapa de substitui o de solu es e lavagem sem interferir com o canal de amostragem Figura 3 2 Diagrama do sistema de fluxo para a determina o do cloridrato de clomipramina Vi e V2 v lvulas solen ides de 3 vias linhas cont nuas dentro dos simbolos das v lvulas correspondem posi o 1 e linhas tracejadas posi o 2 D Detector B Bureta autom tica A Solu o de amostra C Solu o de reagente transportador vanadato L reactor 1 metros L Canal altemativo para limpeza F Filtro X Ponto de conflu ncia W Res duos Determina o espectrofotom trica de clomipramina OO me A solu o transportadora utilizada igualmente como reagente era inserida atrav s de Vi na posi o 1 e era utilizada para estabelecer a linha de base do registo das determina es Tamb m a solu o de amostra era introduzida no sistema atrav s da v lvula V por interm dio de um tempo predefinido de actua o do solen ide colocando a v lvula na posi o 2 e que dependendo
26. O modo cl ssico de realizar uma monitoriza o ambiental consiste numa amostragem pontual e a sua posterior an lise e medi o num laborat rio Quando h necessidade de efectuar um grande n mero de medi es de um modo rotineiro a automatiza o pode reduzir drasticamente o tempo de an lise e o custo do pessoal Resolvido o problema das an lises de rotina de grandes n meros de amostras a evolu o na 1 13 Introdu o Geral rea da automatiza o levou ao desenvolvimento de equipamentos dotados de funcionamento aut nomo e destinados a obter informa es sobre determinado analito de uma forma cont nua em tempo real ou com algum retardamento Todos os avan os tecnol gicos obtidos at agora que permitiram a simplifica o do procedimento anal tico assim como a automatiza o deste ofereceram monitoriza o as ferramentas necess rias para a obten o de informa o em tempo quase real Em rela o ao controlo de processos industriais qualquer processo implica a exist ncia de procedimentos para a manuten o da qualidade do produto final e consequentemente tamb m para garantir a qualidade da mat ria prima e de certas fases do processo de fabrico Em termos de economia e de efici ncia a convers o qu mica envolvida deve ser monitorizada no reactor ou na corrente de produ o isto em linha com o processo de produ o Isto implica a utiliza o de metodologias anal ticas que
27. Salcedo E A Nuevo J Chromatogr Sci 38 200 2000 J Rodriguez J J Berzas A M Contento M P Cabello J Sep Sci 26 915 2003 J J Berzas C Guiberteau M J Villasenor V Rodriguez Anal Chim Acta 519 219 2004 O Spreuxvaroquaux D Morin C Advenier M Pays J Chromatogr Biomed 416 311 1987 H Chen F Gaul D Guo A Maycock J Pharm Biomed Anal 22 555 2000 Determina o espectrofotom trica de clomipramina or rer 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 H S Kou C C Chen Y H Huang W K Ko H L Hu S M Wu Anal Chim Acta 525 23 2004 F Arioz L Ersoy Pharmazie 49 536 1994 P Nagaraja M F Silwadi A A Syed Anal Lett 33 2913 2000 P Nagaraja M F Silwadi A A Syed Mikrochim Acta 135 185 2000 G M Greenway S J L Dolman Analyst 124 759 1999 G F Read D Riadfahmy Clin Chem 24 36 1978 A E Elgendy M G Elbardicy H M Loutfy M F Eltarras Spectrosc Lett 26 1649 1993 B F Reis M F Gine E A G Zagatto J L F C Lima R A Lapa Anal Chim Acta 293 129 1994 J L F C Lima J A V Prior B F Reis J L M Santos E A G Zagatto Anal Chim Acta 467 75 2002 K L Marques J L M Santos J L F C Lima Anal Chim Acta 518 31 2004 S Alegret J Alonso J Bartrol A A S C Machado J L F C Li
28. amostra DDC reagente W dreno E eluente x y z conflu ncias Adaptado de 74 1 67 Introdu o Geral OOTP HNO Amostra Metanol Ar pore HNGa Amostra Metanol HNOa Amostra Metanol Amostra Metanol Amostra Metanol Figura 1 34 Montagem de fluxo para a determina o de cobre c dmio chumbo bismuto e sel nio V a Vs v lvulas solen ides de 3 vias P e P bombas perist lticas PC coluna de pr concentra o e separa o CC coluna de purifica o W dreno a b c d e conflu ncias Adaptado de 75 68 Introdu o Geral Em 2000 proposto um sistema de fluxo multicomutado com detec o por quimioluminesc ncia Figura 1 35 para a determina o de fendis em guas 76 A determina o consistia na oxida o dos fen is por permanganato em meio cido ap s concentra o em linha numa minicoluna com resina n o i nica XAD 4 Atingiu se um limite de detec o de 5 ng I e um ritmo de 12 amostras por hora Desde ent o outros trabalhos de multicomuta o envolvendo detec o por quimioluminesc ncia t m sido desenvolvidos Eluente Amostra H SO Figura 1 35 Montagem de fluxo para a determina o de fen is V e V2 v lvulas solen ides de 3 vias P bomba perist ltica D detector PC microcomputador C coluna de pr concentra o Adaptado
29. es farmac uticas baseado num sistema autom tico de fluxo multicomutado A estrat gia de inser o de amostra e de reagentes por amostragem bin ria favoreceu o desenvolvimento da reac o e o controlo do volume de amostra inserido baseado na utiliza o de uma amostragem temporizada possibilitou manipular a dispers o da amostra no interior do sistema excluindo a necessidade de efectuar modifica es na configura o f sica da montagem Rentabilizando a elevada versatilidade operacional proporcionada pela multicomuta o foi desenvolvida uma metodologia anal tica para a determina o de trimipramina em formula es farmac uticas que combinou a estrat gia de amostragem bin ria com a utiliza o de uma invers o do sentido do fluxo resultando num desenvolvimento r pido da reac o Foi tamb m concebido um sistema de an lise em fluxo cont nuo baseado na utiliza o de buretas autom ticas que actuam simultaneamente como unidades de inser o e de propuls o de solu es Este sistema aplicado para a determina o de isoniazida em formula es farmac uticas possibilitou a combina o da estrat gia de amostragem bin ria com a inser o de segmentos de solu es com iii Resumo volume de cerca de 1 pL resultando num favorecimento da mistura amostra e reagente mesmo em condi es de dispers o limitada Foi desenvolvida uma metodologia anal tica baseada na implementa o de um sis
30. iii sentido de movimenta o do motor passo a passo A informa o transmitida sob a forma de D Dispense para despejar e de P Pick up para encher iv n mero de passos a percorrer pelo motor num m ximo de 2500 no sentido definido Desta forma atrav s de linhas de programa o em linguagem BASIC as instru es de controlo da bureta autom tica foram integradas nas rotinas de controlo dos restantes dispositivos do sistema multicomutado e eram enviadas pela porta de comunica o s rie Essas linhas de programa o eram do tipo 2 5 Parte Experimental G3 OPEN COM BAUD PARIDADE CARACTER STOPBIT FOR OUTPUT AS N PRINT EN OOD1 C O sistema de tubagens para o transporte das solu es incluindo os reactores eram de constitui o em teflon PTFE da marca Omnifit com um di metro interno de 0 8 mm interligados por ligadores de fabrico pr prio A geometria dos reactores adoptada foi o entrela amento da tubagem sobre uma rede pl stica As conflu ncias utilizadas foram de constru o laboratorial e fabricadas em perspex com diferentes configura es 2 2 3 1 2 Unidades de comuta o v lvulas solen ides Nos sistemas multicomutados os dispositivos de inser o s o os dispositivos fulcrais de todo o conceito Os dispositivos utilizados foram v lvulas solen ides respons veis pela inser o das diferentes solu es As v lvulas solen ides util
31. nas suas diferentes express es e da exactid o anal tica obtida Uma vez que se trata de um aspecto comum a trabalhos a seguir descritos referem se aqui os conceitos e os m todos de an lise estat stica adoptados i Repetibilidade ou precis o within batch within run varia o observada nos resultados da an lise repetida da mesma amostra num curto espa o de tempo e obtidos por refer ncia mesma fun o de calibra o ii A precis o foi sempre avaliada atrav s do c lculo do coeficiente de varia o CV calculado do seguinte modo CV o u x 100 sendo O e p respectivamente o desvio padr o e o valor m dio do conjunto de resultados em an lise itt A exactid o erro sistem tico mede a concord ncia entre o resultado obtido e o valor verdadeiro A avalia o da exactid o das metodologias anal ticas desenvolvidas foi sempre feita atrav s do c lculo do desvio relativo percentual DR o qual consiste em calcular o valor percentual representativo do resultado 2 17 Parte Experimental eee obtido pela metodologia proposta considerando o resultado obtido com a metodologia de refer ncia como 100 iv O limite de detec o LD foi um outro par metro caracterizador das metodologias anal ticas apresentado ao longo desta disserta o O limite de detec o de uma opera o anal tica a menor quantidade de analito numa amostra que pode ser detectada nas n o necessariamente com exa
32. nuo No entanto o recurso paragem de fluxo provoca uma elevada diminui o do ritmo de amostragem e implica a utiliza o de um controlo do sistema que faculte tempos de paragem reprodut veis como por exemplo atrav s de um controlo computorizado A t cnica sandwich 37 baseia se na inser o de uma al quota de amostra entre dois reagentes diferentes de modo que para um volume elevado de amostra e em condi es optimizadas se possa obter duas interfaces de reac o distintas que correspondem a dois sinais anal ticos separados e portanto a uma an lise biparam trica Com base neste conceito deduz se as possibilidades de utiliza o quer para a determina o simult nea de dois analitos quer para a an lise simult nea da amostra em duas zonas de concentra o diferentes Nas t cnicas de gradiente ocorre uma explora o dos gradientes de concentra o originados pelos fen menos de dispers o na zona de amostra Os gradientes de concentra o s o uma caracter stica da an lise em fluxo produzida pelos tempos reprodut veis e dispers o controlada da amostra A reprodutibilidade de pontos individuais de concentra o ao longo do gradiente t o preciso quanto a altura dos sinais anal ticos picos 1 3 1 2 An lise por Injec o Sequencial Com a aplica o crescente da An lise por Injec o em Fluxo em diversas determina es qu micas surgiram novas necessidades aquando da implementa o de an lises q
33. o da amostra e deste modo controlar o intervalo de concentra es de clomipramina que apresenta resposta linear em rela o ao sinal o que constitui uma grande vantagem dos sistemas de multicomuta o a varia o do volume de amostra com base no tempo ilimitado Significa isto que o tempo de amostragem pode ser programado entre O segundos at tempo infinito teoricamente o que se traduz em volumes vari veis de amostra introduzidos no sistema Se o volume de amostra fosse inserido por interm dio do procedimento de inser o de volumes nicos ent o conforme se aumentava o volume de amostra introduzido no sistema menor seria progressivamente o efeito de dispers o na zona central da zona de amostra No entanto recorrendo amostragem bin ria h sempre reagente presente no centro da zona de amostra Por isso conforme se aumenta o volume de amostra introduzido no sistema tamb m se aumenta o volume de reagente mas os efeitos de dispers o axial ocorrem essencialmente nas extremidades da zona de reac o influenciando menos a zona central em propor o ao volume de amostra introduzido Este estudo foi executado atrav s da inser o de uma solu o de clomipramina 10 mg L com tempos de amostragem crescentes utilizando o sistema de amostragem bin ria j definido 1 segundo de amostra 1 segundo de reagente Para um reactor de 1 0 metros e um caudal de 1 0 ml min verificou se que a altura de sinal aumentou pronunciadamente com
34. o era um composto com m ximo de absor o no comprimento de onda de 620 nm O desenvolvimento da reac o foi favorecido atrav s da utiliza o da estrat gia de inser o por amostragem bin ria O controlo do volume de amostra inserido no sistema baseado na utiliza o de uma amostragem temporizada permitiu controlar o n vel de dispers o da amostra sem necessidade de efectuar altera es na configura o f sica da montagem anal tica Determina o espectrofotom trica de clomipramina 3 1 Introdu o O f rmaco cloridrato de clomipramina ou cloridrato de 3 cloro 5 3 dimetilamino propil 10 11 dihidro 5H dibenzo b flazepina Figura 3 1 um f rmaco derivado das dibenzoazepinas que pertence classe farmacol gica dos compostos antidepressivos tric clicos e que s o normalmente utilizados no tratamento dos estados de perturba o obsessivo compulsivos em situa es de fobia e p nico assim como em depress es e outros dist rbios emocionais As obsess es e compuls es provocam um acentuado esgotamento e interferem significativamente com o funcionamento ocupacional e social dos indiv duos Este f rmaco ainda exibe efeitos sedativos ligeiros o que pode ser til no al vio da componente de ansiedade que acompanha frequentemente a depress o N Cl CH2CH2CH N CH3 2 Figura 3 1 Estrutura quimica do Cloridrato de Clomipramina O cloridrato de clomipramina um p cristalino branco o
35. o para o caminho anal tico e o seu desenvolvimento continuava conforme eram inseridos os restantes volumes de amostra intercalados com reagente e n o apenas quando se finalizava a introdu o de um volume nico de amostra Al m disso o aumento da rea total de contacto entre as solu es de amostra e reagente melhorava a efici ncia da mistura e favorecia a homogeneiza o entre ambas as solu es Deste modo n o s toda a zona de amostra participou uniformemente na reac o desde o in cio mas tamb m os efeitos de dispers o que seria normalmente necess rio para estender a reac o desde as fronteiras amostra reagente at s sec es centrais da zona de amostra foram consideravelmente reduzidos Por outro lado e considerando que uma estrat gia expedita para aumentar o sinal anal tico altura dos picos aumentar o volume de amostra introduzido no sistema a sensibilidade beneficia grandemente do procedimento desenvolvido De facto atrav s da inser o de volumes crescentes de amostra seria problem tico garantir um excesso adequado de reagente devido penetra o insuficiente das zonas de reagente 39 que ocorre unicamente nas interfaces de reac o mesmo considerando que esta situa o era em certa escala compensada pela utiliza o de duas zonas de reagente e pela invers o do sentido do fluxo Com o procedimento idealizado era poss vel aumentar o volume de amostra introduzido no sistema e ao mesmo tempo assegura
36. o s o utilizados resultando no seu sub aproveitamento sendo ainda o custo das mesmas muito superior No entanto a longo prazo uma v lvula selectora multiposi o revela se mais duradoura em virtude da sua superior robustez podendo resultar num custo de manuten o inferior ao da utiliza o de v lvulas solen ides de comuta o pois estas s o mais suscept veis a falhas consoante a sua utiliza o Por outro lado as v lvulas solen ides permitem obter frequ ncias muito elevadas de comuta o devido s suas caracter sticas funcionais possibilitando a realiza o da amostragem bin ria que resulta numa mais r pida homogeneiza o amostra reagente com inferior dispers o As v lvulas multiposi o possuem velocidades de rota o entre canais sequentes inferiores s de comuta o das v lvulas solen ides repercutindo tal facto operacional na impossibilidade de realiza o de amostragem bin ria assim como de comuta o c lere da solu o ou percurso pretendido At recentemente 2002 tal impossibilidade de amostragem bin ria pelas v lvulas multiposi o era agravada pela unidirecionalidade de rota o das v lvulas o que implicava uma rota o completa da v lvula para regressar ao mesmo canal de partida Actualmente j se encontram dispon veis v lvulas selectoras multiposi o bidirecionais 1 35 Introdu o Geral _ OC ee Poss veis desvantagens dos sistemas de an lise por
37. porque por cada solu o de reagente envolvida existe uma micro bomba respons vel pela inser o e transporte dos fluidos O controlo autom tico individual e independente de cada micro bomba proporciona uma maior flexibilidade na montagem do sistema anal tico sendo esta caracter stica dos sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o aproveitada quando se pretende montar um sistema anal tico que envolva um grande n mero de solu es na reac o qu mica utilizada e se pretenda ao mesmo tempo um controlo minucioso dos par metros de controlo que influenciam directa ou indirectamente a extens o da mistura e portanto o desenvolvimento da reac o Estes sistemas garantem igualmente um controlo minucioso do volume de amostra inserido atrav s de um controlo sobre o caudal debitado e tamb m sobre o tempo de activa o pulso de cada micro bomba O controlo de um sistema de fluxo por multi impuls o realizado atrav s da activa o independente de cada micro bomba possibilitando um ajuste quase imediato do caudal associado a cada micro bomba e portanto a cada ponto de inser o de solu es no sistema Este sistema de manipula o das solu es permite uma eficiente implementa o de diferentes procedimentos anal ticos sem implicar a modifica o da configura o da montagem anal tica Adicionalmente os sistemas de fluxo por multi impuls o possibilitam a realiza o de diferentes estrat gias de inser o de
38. tamb m aumenta a probabilidade de ocorr ncia de erros nas determina es devido ao aumento do n mero de tubagens envolvidas Tamb m os volumes de solu es envolvidos numa montagem em que os fluidos s o impulsionados atrav s de uma bomba perist ltica s o necessariamente maiores do que os volumes envolvidos quando se aspiram as solu es porque a impuls o com bomba perist ltica implica uma circula o constante dos l quidos No entanto esse consumo pode ser reduzido atrav s da recircula o das solu es o que tamb m contribui para um aumento da complexidade da montagem anal tica Salienta se contudo que o recurso impuls o dos fluidos limita acentuadamente o aparecimento de bolhas de ar porque dentro das tubagens as press es s o positivas 1 34 Introdu o Geral A multicomuta o constitui uma alternativa a outras metodologias de fluxo como por exemplo sistemas baseados em SIA Em multicomuta o quando se utiliza v lvulas solen ides de referir o inferior custo de cada v lvula de comuta o unidade de injec o e a associada optimiza o dos recursos utilizados dado que uma v lvula solen ide pode ser respons vel pela introdu o em fluxo de uma ou duas solu es permitindo deste modo uma adapta o do n mero de v lvulas solen ides consoante o n mero de reagentes do sistema qu mico No caso de sistemas SIA h por vezes canais da v lvula selectora multiposi o que n
39. vel do Sistema Nervoso incluindo sonol ncia tremores tonturas e nervosismo perturba es genito urin rias incluindo altera es na libido falha ejaculat ria impot ncia e dist rbio na mic o e outras perturba es como fadiga suores ganho de peso e altera es a n vel da vis o Embora a lista de efeitos adversos apresentados anteriormente seja relativamente extensa a adversidade do f rmaco pode assumir efeitos mais espec ficos podendo ser categorizados de acordo com o sistema biol gico que afectam no organismo 2 Em seguida apresenta se uma lista resumida de alguns desses efeitos i Neurol gicos efeitos extrapiramidais como a ataxia dor de cabe a del rios desordens no discurso fraqueza muscular hipertonia muscular convuls es e zumbidos nos ouvidos ii Comportamentais sonol ncia fadiga desorienta o ansiedade agita o perturba o do sono ins nias ocorr ncia de pesadelos dist rbios na concentra o alucina es visuais falhas de mem ria Determina o espectrofotom trica de clomipramina e rare ta ta eee ra agressividade epis dios man acos etc iii Cardiovasculares hipotens o palpita es arritmias e perturba es na condu o el ctrica card aca em pacientes com desordens cardiovasculares foi registado a ocorr ncia de fibrila o enfarte do mioc rdio e ataques card acos iv Hematol gicos agranulocitose trombocitopenia e leucopenia v
40. 2 00 c 7 S 1 50 o 3 1 00 Q E lt 0 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL B 2 50 E 2 T 2 00 S 0 S 1 50 v E 1 00 a E lt 0 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL C E 2 50 2 se 2 00 7 S 1 50 QU 3 1 00 a E lt 0 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL Figura 5 13 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico da capacidade da seringa utilizada em fun o do volume de amostra A amostragem bin ria B conflu ncia de zonas C volumes nicos seringa de 10 0 mL O seringa de 5 0 mL A seringa de 2 5 mL Determina o espectrofotom trica de isoniazida A avalia o do efeito do comprimento do reactor por compara o com os resultados obtidos nos ensaios iniciais e representados na Figura 5 6 e Figura 5 7 demonstrou tal como seria de esperar que um reactor de 44 cm produziu um sinal anal tico quase 3 vezes superior ao obtido com um reactor de 22 cm para todas as estrat gias de inser o de amostra Isto pode ser explicado pelo mais reduzido tempo de resid ncia quando se utilizou um reactor de 22 cm e que resultou num desenvolvimento insuficiente da reac o 5 3 3 Caudal frequ ncia de passo das buretas De acordo com o procedimento desenvolvido o caudal era determinado pela frequ ncia de passo n mero de passos executados pela bureta por unidade de tempo multiplicado pelo volume de p
41. 4 uL de reagente 5 ciclos de intercala o para um volume de 20 pL de amostra Sendo assim podia obter se diferentes graus de mistura de solu o de amostra com solu o de reagente dependendo da capacidade das seringas colocadas nas buretas autom ticas O caudal era igualmente um par metro anal tico importante que implicava que fosse mantido constante entre os ensaios porque embora no sistema de fluxo descrito n o influenciasse o volume total de amostra inserido no sistema influenciava certamente o tempo de resid ncia da zona de amostra no sistema e consequentemente o tempo da reac o Assim o caudal foi fixado em 0 24 mL min para todos os ensaios realizados atrav s de uma programa o do tempo de repouso entre cada passo da bureta de 1 0 5 e 0 25 segundos para as seringas de 10 5 e 2 5 mL de capacidade respectivamente Os resultados dos ensaios est o representados na Figura 5 6 organizados pela capacidade das seringas utilizadas Pela observa o dos resultados conclui se que para todas as seringas utilizadas tendo em considera o a estrat gia de amostragem a amostragem bin ria originou os sinais anal ticos mais elevados seguido da estrat gia de conflu ncia de zonas e inser o de volumes nicos de amostra Al m disso o sinal anal tico aumentou acentuadamente com o volume de amostra inserido no sistema at um determinado valor de volume ap s o qual se verificou uma diminui o da resposta anal tica s
42. 6 47 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida e mes te e e re 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 W S Allen S M Aronovic L M Brancone J H Williams Anal Chem 25 895 1953 P A Caccia Am Rev Tuberc Pulm 75 105 1957 H C Goicoechea A C Olivieri J Pharm Biomed Anal 20 681 1999 A Espinosa Mansilla M I Acedo Valenzuela A M de la Pena F Salinas F C Canada Anal Chim Acta 427 129 2001 J Madan A K Dwivedi S Singh Anal Chim Acta 538 345 2005 A M Garcia Camp na W R G Baeyens Chemiluminescence in Analytical Chemistry Marcel Dekker Inc New York 2001 H D Albrecht Z Phys Chem 136 330 1928 http www chm bris ac uk webprojects2002 fleming mechanism htm E H White O C Zafiriou H H Kagi J H M Hill J Am Chem Soc 86 940 1964 E H White M M Bursey J Am Chem Soc 86 941 1964 J L F C Lima J L M Santos A C B Dias M F T Ribeiro E A G Zagatto Talanta 64 1091 2004 S Alegret J Alonso J Bartrol A A S C Machado J L F C Lima J M Paulis Qu m Anal 6 278 1987 Farmacopeia Portuguesa VII Ed Oficial Lisboa 1342 2002 J Du Y Li J Lu Anal Chim Acta 448 79 2001 A Economou P D Tzanavaras M Notou D G Themelis Anal Chim Acta 505 129 2004 A MacDo
43. 9 73 6 2 6 prolongada Anafranil 25 25 6 25 2 0 5 25 5 1 2 injectavel 12 25 7 0 2 25 5 0 8 Desvio relativo para a metodologia desenvolvida em rela o ao procedimento de refer ncia M diatdesvio padr o 3 4 Conclus es Os resultados obtidos mostram que a monitoriza o espectrofotom trica dos produtos de reac o entre a clomipramina e o monovanadato uma alternativa anal tica para a determina o deste f rmaco antidepressivo em prepara es farmac uticas Quando implementado num sistema de fluxo cont nuo multicomutado permitiu o desenvolvimento de uma metodologia simples r pida e facilmente automatizada que pode ser aplicada vantajosamente em an lises de rotina Esta possibilidade refor ada pela n o interfer ncia de subst ncias usadas Determina o espectrofotom trica de clomipramina geralmente como excipientes Al m disso n o requer qualquer pr tratamento da amostra a filtra o realizada em linha ao contr rio do m todo de refer ncia em que obrigatoriamente se dilui e filtra manualmente o que pode melhorar notoriamente o tempo necess rio para a an lise Apesar da sua simplicidade a metodologia de fluxo de canal nico proposta combina a capacidade de mistura homog nea r pida conferida pela amostragem bin ria com um controlo efectivo da dispers o devido vers til inser o de amostra com base no tempo e baixo consumo de reagentes na ordem do
44. AGRADECIMENTOS Ao Professor Doutor Jos Luis Fontes da Costa Lima a quem especialmente agrade o por me ter possibilitado a realiza o deste doutoramento assim como a maneira especial e dedicada com que me acolheu no laborat rio Ao meu amigo Professor Doutor Jo o Lu s um abra o de gratid o sua medida pela marcante presen a durante o desenvolvimento de todo este trabalho o que possibilitou a sua concretiza o O meu profundo reconhecimento pela sua orienta o inteligente e criativa na selec o de Portos e tamb m por todo o trabalho desenvolvido pelo seu primeiro aluno de doutoramento AF unda o para a Ci ncia e Tecnologia no mbito do III Quadro Comunit rio de Apoio qual agrade o a bolsa de doutoramento que me foi atribu da SFRH BD 2833 2000 e todo o apoio financeiro sem os quais n o teria sido poss vel a realiza o deste trabalho Faculdade de Farm cia da Universidade do Porto um agradecimento por me ter acolhido como aluno de doutoramento Aos Professores Doutores Rui Lapa Salette Reis Concei o Montenegro L cia Saraiva Alberto Ara jo Beatriz Quinaz Agostinho Almeida e Eduarda Fernandes e tamb m Marcela Segundo um obrigado por todas as ajudas com que cada um contribuiu sua maneira durante o desenvolvimento do trabalho Dra Isabel Cardoso um beijinho de gratid o pela amizade ternura e palavras de incentivo e pelas bolachinhas 1 da manh nos muitos dias de
45. Chim Acta 313 177 1995 P B Martelli B F Reis M Korn J L F C Fim Anal Chim Acta 387 165 1999 A P S Paim B F Reis Anal Sci 16 487 2000 R S Honorato M C U Ara jo G Veras E A G Zagatto R A S Lapa J L F C Lima Anal Sci 15 665 1999 C M N V Almeida R A S Lapa J L F C Lima E A G Zagatto M C U Ara jo Anal Chim Acta 407 213 2000 C M N V Almeida R A S Lapa J L F C Lima M C U Ara jo B F Reis E A G Zagatto Analyst 125 333 2000 A P S Paim C M N V Almeida B F Reis R A S Lapa E A G Zagatto J L F C Lima J Pharm Biomed Anal 28 1221 2002 X D Wang T J Cardwell R W Cattrall R P Dyson G E Jenkins Anal Chim Acta 368 105 1998 E Kronka B F Reis J A Vieira T Blanco A P Gerv sio Quim Nova 20 372 1997 C A Tumang G C Luca R N Fernandes B F Reis F J Krug Anal Chim Acta 374 53 1998 Introdu o Geral 66 R N Fernandes B F Reis Talanta 58 729 2002 67 R A S Lapa J L F C Lima J L M Santos Anal Chim Acta 407 225 2000 68 M F Gin A P Packer T Blanco B F Reis Anal Chim Acta 323 47 1996 69 L F Gouveia J L F C Lima J A G Morais Anal Chim Acta 366 271 1998 70 F R P Rocha P B Martelli R M Frizzarin B F Reis Anal Chim Acta 366 45 1998 71 R A S Lapa
46. Esses estudos realizaram se por interm dio da determina o espectrofotom trica de cr mio VI em guas por reac o com 1 5 difenilcarbazida Introdu o Geral Figura 1 47 Montagem de fluxo de multi impuls o P e P micro bombas S amostra R reagente L reactor D detector W dreno x conflu ncia C interface de controlo Adaptado de 93 Ainda no mesmo ano Zagatto et al 110 desenvolveram um sistema de fluxo baseado no conceito de multi impuls o para a determina o espectrofotom trica de cido fitico em extractos de plantas por reac o com salicilato de ferro III e envolvendo extrac es em colunas de troca i nica Figura 1 48 O ritmo de amostragem foi de 150 determina es por hora Lima et al 111 em 2003 exploraram o fluxo pulsado inerente aos sistemas de fluxo multi impuls o e que assegura ptimas condi es de mistura facilitando a homogeneiza o da zona de amostra na determina o da bromexina em formula es farmac uticas Figura 1 49 Introdu o Geral Figura 1 48 Montagem de fluxo de multi impuls o para a determina o de cido fitico P a P micro bombas S amostra R reagente C transportador Rc reactor D detector x conflu ncia Adaptado de 110 Figura 1 49 Montagem de fluxo de multi impuls o para a determina o de bromexina P a P micro bombas S amostra R e R
47. F C Lima Anal Bioanal Chem 382 452 2005 J L M Santos A Clausse J L F C Lima M L M F S Saraiva A O S Rangel Anal Sci 21 1 2005 2 102 CAP TULO 2 PARTE EXPERIMENTAL Neste cap tulo ser o abordados os procedimentos gerais utilizados na prepara o das solu es e tamb m ser o referidos os equipamentos usados sendo dada uma especial nfase s suas caracter sticas e modo de funcionamento Ser o igualmente discutidos os aspectos fundamentais que condicionam a sua utiliza o Parte Experimental 2 1 Introdu o Em virtude de nos trabalhos apresentados ao longo desta disserta o existirem aspectos experimentais comuns eles ser o apresentados conjuntamente neste cap tulo de forma a evitar repeti es desnecess rias nos restantes Nesses real am se apenas os aspectos espec ficos relacionados com os conceitos apresentados Assim aqui ser descrito em primeiro lugar o procedimento geral de prepara o de reagentes e solu es Descreve se em seguida o equipamento usado nas montagens dos sistemas de fluxo desenvolvidos bem como a sua interliga o e os par metros de controlo nomeadamente tempos de amostragem frequ ncias de passo e tempos de pulso Apresenta se por ltimo os procedimentos de avalia o dos resultados obtidos nos diversos trabalhos usados como crit rio de compara o com os resultados obtidos pelas metodol
48. Malcolme Lawes e Pasquini 46 resolveram expandir a aplicabilidade destes dispositivos e propuseram um sistema autom tico igualmente baseado num transporte dependente de g s sobre press o mas de forma a permitir a prepara o em linha de reagentes com tempos de vida curtos e ainda a an lise sequencial de analitos Figura 1 7 Estas inovadoras potencialidades anal ticas deviam se possibilidade do accionamento alternado de grupos de v lvulas solen ides dispostas no sistema de modo a permitir a prepara o dos reagentes antes do contacto com as amostras O accionamento das v lvulas controlado por um microcomputador permitia atingir frequ ncias de 20 Hz o que originava uma eficiente mistura dos reagentes porque tais frequ ncias de comuta o possibilitavam a mistura de pequenas al quotas de solu es de reagentes dependendo o volume das al quotas tamb m do caudal utilizado De acordo com a Figura 1 7 a aspira o atrav s de uma seringa autom tica de um volume nico de amostra ocorria numa zona diferente da montagem anal tica onde ocorria a prepara o dos reagentes permitindo deste 1 39 Introdu o Geral modo primeiro a prepara o do reagente de tempo de vida curto e posteriormente a sua mistura com a solu o de amostra aspirada Entrada gas Reagentes avr DB 5 EA go gt gt B a 7 Q D J p Q T p Q 4 e DA E Sensor LL press o Transportadores Seringa Solen ide
49. O trabalho realizado nesta disserta o envolveu o desenvolvimento de sistemas anal ticos de fluxo baseados no conceito de multicomuta o e de multi impuls o Os sistemas de fluxo desenvolvidos real aram a elevada versatilidade associada aos sistemas baseados nos conceitos de fluxo referidos sobretudo na selec o do percurso em que as solu es de amostra e reagentes podem ser direccionadas e permitiram igualmente recorrer a variad ssimas estrat gias de manipula o da zona de amostra nomeadamente no que respeita adi o dos reagentes e ao controlo do seu transporte para o sistema de detec o Os sistemas autom ticos desenvolvidos podem ser aplicados na an lise de diferentes subst ncias recorrendo a distintas reac es qu micas e envolvendo uma gama alargada de interven es sobre a zona de amostra sem que para isso seja necess rio alterar significativamente a configura o f sica do sistema anal tico como por exemplo atrav s da utiliza o de reactores de diferentes dimens es ou Conclus es Finais de c maras de mistura sendo suficiente apenas modificar os par metros de funcionamento do sistema atrav s do programa de controlo como os tempos e combina es de actua o dos distintos dispositivos de inser o ou comuta o das solu es Os sistemas de fluxo multicomutado possibilitam um controlo preciso e vers til sobre o processo de inser o da amostra devido utiliza o de uma
50. activa o e desactiva o de um solen ide semelhan a dos programas utilizados para o controlo das v lvulas solen ides de comuta o desenvolveram se programas recorrendo a instru es em BASIC implementado em ambiente DOS Tal como para as restantes montagens anal ticas tamb m se considerou como factores decisivos para a programa o o objectivo do trabalho e versatilidade Uma diferen a em rela o aos sistemas de fluxo por multicomuta o que no sistema de fluxo por multi impuls o a frequ ncia de pulso das micro bombas influenciava directamente o caudal sendo importante considerar este aspecto na programa o o que ser explicado com mais detalhe no cap tulo 6 As linhas de programa o para activa o e desactiva o das micro bombas foram iguais s de controlo das v lvulas solen ides de comuta o dado que ambos os dispositivos s o activados por sinais l gicos TTL como j referido 2 4 Optimiza o e avalia o das montagens de fluxo Todas as optimiza es dos sistemas anal ticos desenvolvidos foram efectuadas tendo como objectivo a maximiza o do sinal anal tico obtido em cada determina o Para tal o m todo utilizado foi o de an lise univariada que consiste em variar o valor de um par metro apenas enquanto se mant m os valores dos restantes par metros inalterados Deste modo avaliou se as condi es mais adequadas para cada par metro determinador do desempenho da montagem an
51. administrada 2 g por dia independentemente do peso do indiv duo Tamb m se verificou actividade eficaz do f rmaco quando administrado duas ou tr s vezes por semana mas em doses superiores s mencionada anteriormente No entanto a pirazinamida apresenta efeitos laterais 1 dos quais os danos hep ticos s o os mais graves Quando uma dose de 40 a 50 mg Kg administrada oralmente surgem sinais e sintomas de doen a hepatica em cerca de 15 dos pacientes e em que 2 a 3 apresentam icter cia e em casos raros a morte devido necrose hep tica Mas em primeiro lugar verifica se um aumento das concentra es plasm ticas de aminotransferases causado pelo f rmaco Todos 6 3 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida os pacientes que s o tratados com a pirazinamida devem ser submetidos a estudos da fun o hep tica antes de ser administrada a droga e estes estudos devem ser repetidos com frequ ncia durante o per odo de tratamento com pirazinamida Nos indiv duos em que se verifique insufici ncia hep tica de qualquer grau a terapia com pirazinamida deve ser evitada a n o ser que n o exista alternativa Nas situa es de terapia com pirazinamida e em que surjam evid ncias significativas de danos hep ticos a terapia deve ser interrompida imediatamente A pirazinamida inibe a excre o de urato resultando em hiperuric mia em praticamente todos os pacientes Outros efeitos verificados com a a
52. alde do glutac nico e condensa o deste com o cido p aminobenz ico para formar uma base de Schiff fluorescente com um comprimento de onda de 366 nm e 480 nm Ioannou prop s alternativamente a reac o entre a isoniazida e o 2 hidroxi 1 naftalde do em meio cido 26 O mesmo reagente foi usado por Sarwar et al 27 para a determina o de isoniazida por titula o com detec o visual do ponto final usando o vermelho Bordeaux como indicador A metodologia de refer ncia da Farmacopeia Portuguesa igualmente uma volumetria sendo usado como titulante uma solu o de bromato de pot ssio e como indicador uma solu o de vermelho de metilo Uma ampla variedade de outros m todos volum tricos est dispon vel na literatura incluindo as titula es n o aquosas com cido percl rico com detec o visual 28 ou potenciom trica 29 do ponto de equival ncia M todos electroqu micos tamb m foram aplicados para a determina o da isoniazida e envolvem essencialmente m todos polarogr ficos B0 31 e coulom tricos 32 Tamb m t cnicas que exploram o conceito de gravimetria podem ser encontradas na literatura como por exemplo baseadas na forma o de um composto insol vel entre a isoniazida e o cido p crico 33 No que diz respeito a metodologias de fluxo a detec o espectrofotom trica foi utilizada num sistema envolvendo uma paragem de fluxo para a determina o cin tica de isoniazida por reac o com
53. amostra e reagente mesmo em condi es de dispers o limitada Adicionalmente as buretas autom ticas s o facilmente controladas por computador o que simplifica o funcionamento do sistema at porque as buretas foram os nicos dispositivos activos na montagem Determina o espectrofotom trica de isoniazida i eer aa mr 5 1 Introdu o A isoniazida hidrazida do cido nicot nico ou hidrazida do cido 4 piridinacarbox lico Figura 5 1 uma subst ncia cristalina branca ou incolor sol vel em gua ou em etanol 14 g e 2 g em 100 mL a 25 C respectivamente e pouco sol vel em clorof rmio e ter 1 O CO NH NH2 Figura 5 1 Estrutura quimica da isoniazida Em 1912 Meyer e Mally 2 sintetizaram pela primeira vez esta subst ncia atrav s do aquecimento de uma mistura de cido nicot nico e hidrazida a 300 C A sua ac o antibacteriana sobre estirpes de Mycobacterium foi pela primeira vez confirmada em 1945 por Chorine e Huant Uma solu o 1 de isoniazida origina um valor de pH entre 5 5 e 6 5 A um pH pr ximo de 3 e em condi es anaer bias hidrolisada sendo convertida em cido isonicot nico Por outro lado em condi es aer bias a sua hidr lise alcalina Determina o espectrofotom trica de isoniazida origina principalmente cido isonicot nico isonicotinamida e hidrazida de 1 2 diisonicotinoil A isoniazida considerada
54. caudal em fun o do volume de amostra A amostragem bin ria B conflu ncia de zonas C volumes nicos e tempo de repouso 0 1 s tempo de repouso 0 25 s m tempo de repouso 0 5 s tempo de repouso 0 75 s o tempo de repouso 1 s Determina o espectrofotom trica de isoniazida 5 3 4 Concentra o de NQS e pH A avalia o da influ ncia da concentra o de NQS no sinal anal tico foi realizada para um intervalo de concentra es entre 1 00x10 mol L e 1 00x10 mol L Os resultados obtidos demonstraram claramente um aumento muito acentuado da resposta anal tica de 1 00x10 mol L a 1 50x10 mol L sendo que para concentra es superiores o sinal anal tico diminuiu gradualmente Figura 5 16 A diminui o do sinal registado deve se ao facto de as solu es de NQS com concentra es gradualmente maiores apresentarem uma colora o tamb m gradualmente maior provocando tamb m efeitos de absor o da radia o e implicando em cada ensaio o ajuste do valor de branco no espectrofot metro Sendo assim os valores registados correspondem s diferen as de valor entre a amplitude de sinal do branco e o valor de amplitude de sinal do produto da reac o Considerando os valores apresentados no gr fico da Figura 5 16 foi seleccionada uma solu o com concentra o 1 50x10 mol L de NQS para as experi ncias seguintes Outro par metro qu mico que af
55. cido sulf rico a resposta anal tica aumentava muito acentuadamente enquanto que entre 5 0 e 6 0 mol L tendia ligeiramente para estabiliza o Determina o espectrofotom trica de trimipramina 8 00 Amplitude de sinal cm gt a S S N o o 0 00 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 Concentra o do cido M Figura 4 4 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de cido sulf rico Trimipramina 20 mg L Volume de amostra 100 uL Tempo de amostragem 4 segundos Caudal 1 5 mL min Reactor L 2 0 metros L 1 0 metros Ap s a an lise dos resultados seleccionou se para utiliza o nos ensaios posteriores de uma concentra o de 4 0 mol L de solu o de cido sulf rico para a reac o de determina o de trimipramina pelo sistema de fluxo montado porque o aumento de resposta anal tica verificada entre concentra es de 4 0 e 5 0 mol L de cido sulf rico n o era suficientemente significativa para compensar o efeito causado pelo aumento da viscosidade das solu es de cido sulf rico consequ ncia do aumento das concentra es o que constitu a uma dificuldade adicional na mistura dos segmentos de amostra reagente no interior do sistema de aii Determina o espectrofotom trica de trimipramina a SS dae a fluxo Adicionalmente como os restantes par metros da montagem anal tica seriam ainda optimizados essa diferen a de s
56. com o fluxo de luminol per xido de hidrog nio o desenvolvimento da reac o de quimioluminesc ncia ocorria mais r pido Sendo assim para se conseguir que a zona de reac o na altura de tempo correspondente ao m ximo de intensidade de emiss o de luz estivesse a percorrer a c lula de fluxo e portanto a passar em frente ao detector seria necess rio remover o reactor L ou alternativamente realizar os ensaios de determina o com caudais muito elevados ou seja programando o funcionamento das micro bombas com valores de tempo de pulso muito pequenos ocorrendo o risco de Determina o quimioluminome trica de pirazinamida neste ltimo caso ocorrer uma diminui o da reprodutibilidade dos tempos de inser o de reagentes Consequentemente para realizar a an lise de prepara es farmac uticas utilizou se a montagem anal tica optimizada com a presen a do reactor L 15 cm e atrav s da estrat gia de inser o de volumes nicos no ponto de conflu ncia X visto que com esta configura o obteve se o sinal anal tico mais elevado 6 3 3 An lise de formula es farmac uticas Para avaliar a metodologia desenvolvida na determina o da pirazinamida em formula es farmac uticas foi realizado um estudo da influ ncia de alguns compostos utilizados normalmente como excipientes Um composto foi considerado como n o interferente quando a varia o de sinal anal tico era 3 quand
57. de 76 O recurso multicomuta o permitiu o desenvolvimento de um processo para a determina o directa de alum nio cobre e zinco em amostras s lidas de ligas met licas atrav s da electro dissolu o em linha das ligas e detec o por espectrometria de absor o at mica em chama Figura 1 36 77 1 69 Introdu o Geral Figura 1 36 Montagem de fluxo para a determina o directa de alum nio cobre e zinco PP bomba perist ltica V a V4 v lvulas solen ides x y z t conflu ncias H c mara de homogeneiza o W dreno FAAS detector Adaptado de 77 Outra t cnica de detec o acoplada a sistemas de fluxo multicomutado foi a espectrofluorimetria Lapa et al al m do trabalho publicado em 2000 j referido anteriormente 71 desenvolveu outro sistema multicomutado Figura 1 37 para a determina o fluorim trica de cido f lico ap s fotodegrada o 78 O sistema estava programado para optar pelo tempo de amostragem mais adequado concentra o da amostra e tal controlo por computador tamb m possibilitou que as determina es anal ticas fossem efectuadas num intervalo alargado de concentra es atrav s da selec o de diferentes volumes de amostra relacionados directamente com os tempos de amostragem t 70 Introdu o Geral Figura 1 37 Montagem de fluxo para a determina o de cido f lico V a V v l
58. de conflu ncia D Detector W Res duos Determina o espectrofotom trica de isoniazida sl 5 2 4 M todo de refer ncia Para avaliar a exactid o da metodologia desenvolvida foi analisada a isoniazida em formula es farmac uticas de acordo com a Farmacopeia Portuguesa 40 atrav s de uma titula o com bromato de pot ssio e utilizando como indicador o vermelho de metilo O doseamento foi realizado numa amostra de 20 comprimidos pulverizados atrav s da pesagem rigorosa de uma quantidade de p correspondente a cerca de 0 4 g de isoniazida e seguido de dissolu o em gua bidesionizada A solu o resultante foi filtrada e lavada com gua bidesionizada at completar 250 mL Em seguida a uma al quota de 50 mL da ltima solu o foi adicionado 50 mL de gua bidesionizada 20 mL de cido clor drico 0 2 g de brometo de pot ssio e 0 05 mL de solu o de vermelho de metilo Esta solu o foi titulada com uma solu o 0 1 mol L de bromato de pot ssio at se verificar o desaparecimento da colora o vermelha sendo que mL de solu o de bromato de pot ssio 0 1 mol L corresponde a 3 429 mg de isoniazida 5 3 Resultados e discuss o A utiliza o de buretas autom ticas como dispositivos activos de propuls o em sistemas anal ticos de fluxo sofreu recentemente um aumento not vel Este facto relaciona se directamente com as caracter sticas operacionais das buretas au
59. de hipotens o progressiva que podem levar eventualmente a ataques Perturba es cardiovasculares s o frequentemente presentes incluindo taquicardia arritmias card acas e falhas na condu o el ctrica card aca Determina o espectrofotom trica de clomipramina A relev ncia terap utica e farmacol gica da clomipramina estimulou o desenvolvimento de diversos m todos para a sua determina o tanto em fluidos biol gicos corporais como em formula es farmac uticas No que se refere utiliza o de m todos cromatogr ficos para determina o da clomipramina estes encontram se amplamente divulgados em rela o a outros m todos de quantifica o essencialmente no que diz respeito an lise de amostras biol gicas e por for a da import ncia que a monitoriza o dos n veis de clomipramina tem em bioqu mica cl nica Diversos m todos cromatogr ficos foram utilizados para determina o da clomipramina dos quais se destacam cromatografia l quida de elevado desempenho HPLC com detec o por espectrofotometria na regi o do ultravioleta em amostras biol gicas 4 17 HPLC com detec o por quimioluminesc ncia 18 cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa 19 21 cromatografia gasosa com detector de nitrog neo f sforo 22 24 cromatografia gasosa com detec o por ioniza o em chama 25 27 cromatografia l quida com detec o electroqu mica 28 e cromatografia l
60. diversos como por exemplo i Mecanismo uma combina o de pe as em que pelo menos uma dessas pe as m vel capazes de produzir um efeito ii Mecaniza o o uso de mecanismos para substituir refinar estender ou complementar o esfor o humano 111 M quina um sistema constitu do por um conjunto de mecanismos capaz de realizar uma ou mais ac es O conceito de instrumenta o est relacionado com a produ o e ou transmiss o de informa o de acordo com a IUPAC Sendo assim um instrumento uma m quina usada para observar medir ou comunicar uma propriedade par metro a qual substitui refina estende ou complementa o esfor o humano podendo ser constitu do por um ou mais mecanismos A utiliza o de sistemas instrumentos aos quais adicionado um componente de decis o sem interven o humana denomina se automa o Mais concretamente definida como o uso de uma combina o de mecanismos e ou instrumentos para substituir refinar estender ou complementar um esfor o humano na realiza o de uma determinada tarefa em que pelo menos uma das opera es envolvidas controlada sem interven o humana atrav s de um sistema de retroalimenta o Um sistema de retroalimenta o definido como um mecanismo instrumental combinando elementos sensores e actuadores os quais podem alterar o modelo de realiza o de determinada tarefa 1 15 Introdu o Geral A
61. do caudal estabelecia o volume de amostra e possibilitava um controlo efectivo sobre a dispers o da amostra como se refere seguidamente Pelo recurso amostragem bin ria 41 a amostra n o era inserida no sistema como um nico volume mas sim dividida em v rios segmentos de reduzido volume altemados com reduzidos volumes de reagente Como os volumes de solu o introduzidos no sistema eram definidos pelo tempo de amostragem porque durante o tempo de amostragem ocorria a entrada no sistema de um determinado volume de solu o que dependia do caudal definido ent o o n mero e tempos de cada ciclo de intercala es definiam o tempo de amostragem final e portanto o volume de amostra Inicialmente V e V2 eram colocadas na posi o 1 e assim a solu o transportadora fluia pelo detector Em seguida a v lvula V era accionada alternativamente entre as posi es 1 e 2 de acordo com os tempos de intercala o predefinidos permitindo a intercala o de al quotas de reduzido volume de amostra e reagente o que favorecia a homogeneiza o dos volumes de amostra com os de reagente e consequentemente o desenvolvimento da reac o Ulteriormente a v lvula Viera comutada para a posi o 1 e a zona de amostra transportada atrav s do reactor L em direc o ao detector Figura 3 2 D Ap s a detec o da amostra as v lvulas Vi e V2 eram accionadas para a posi o 2 para possibilitar a troca das solu es e prepara o do siste
62. dos reagentes e amostra promovida essencialmente pelo fluxo pulsado imediatamente antes da detec o influenciando deste modo directamente a reac o de quimioluminesc ncia isto a oxida o do luminol pelo per xido de hidrog nio na presen a do cati o cobre II Contudo poderia pensar se que a presen a do reactor Li colocado imediatamente antes da detec o n o se justificava devido eficiente mistura providenciada pelo movimento pulsado do fluxo e porque a reac o de quimioluminesc ncia utilizada neste trabalho muito r pida mas outros factores influenciavam a sua presen a como por exemplo o caudal e a dispers o que por sua vez dependem da estrat gia de amostragem utilizada para a mistura das zonas de amostra cobre com o fluxo de luminol per xido de hidrog nio linha de base Sendo assim realizou se um estudo da influ ncia que as dimens es do reactor L exerciam na intensidade de luz detectada pelo fotomultiplicador Figura 6 10 Dos dados obtidos verificou se que um reactor L de comprimento 15 cm 6 25 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida rrr rr rare e possibilitava a obten o do mais elevado sinal anal tico Para outras dimens es do reactor Li inferiores e superiores verificou se que o sinal anal tico era menor que o obtido com 15 cm Deste modo fixou se o valor de comprimento do reactor L1 em 15 cm e foi este comprimento de reactor o utili
63. eee 2 13 2 3 2 3 1 Aparelhagem 22 006 ccnevaa pines seteanas 2 13 2 3 2 3 2 Programas inform ticos 2 14 2 4 Optimiza o e avalia o das montagens de fluxo 2 14 2 5 Prepara o de padr es e amostras ciic eee eee e eee 2 15 2 6 M todos de refer ncia cupins ustzerndo Pubs do canada ate 2 16 2 7 Procedimentos de avalia o das metodologias anal ticas desenvolvidas fond dea ot aa dss at DD doa eta Ra feudo 2 17 2 8 Refer ncias bibliogr ficas 00 0 cece eee eee eee eee eee e tees 2 19 ndice CAP TULO 3 Determina o espectrofotom trica de clomipramina num sistema de fluxo multicomutado Do AM OGUCAOK a sed sree Da aa E EA 3 1 D2 Parte Experimental cacsidocenamadosi qpessse pes ni aeien 3 6 Dead Reagentes 2250 eis Reed SUR Aa 3 6 3 2 2 Equipamento 5 245 ccs vases sek rd pass Baena da dida 3 7 3 2 3 Montagem de fluxo multicomutado 3 8 3 2 4 Metodo de refer ncia ss scedadaess o Met emana saia dome 3 12 3 3 Resultados e dISCUSS O sxqus deuseuanto wack masa nda ia dada 3 13 3 3 1 Ensaios preliminares por procedimentos discretos 3 13 3 3 2 Desenvolvimento e optimiza o do sistema de fluxo 3 20 3 3 3 An lise de formula es farmac uticas 3 29 SA GONCIUS ES cuuiad as fubnnds as pap RE SSL Ra RDI OE aoa 3 31 3 5 Refer ncias bibliogr ficas
64. em 1995 usaram a metodologia de multicomuta o associada a amostragem bin ria para estenderem as potencialidades da nova metodologia a multi determina es anal ticas isto a determina o de dois analitos e o uso de mais que um reagente Nesse trabalho desenvolveu se dois sistemas de multicomuta o um para a determina o de n quel com uma topologia em linha Figura 1 12 das v lvulas solen ides e outro que com uma disposi o em estrela Figura 1 13 permitiu a determina o de ferro III e cr mio VI 1 45 Shee get Se o oa Introdu o Geral Figura 1 12 Montagem de fluxo para a determina o de n quel numa configura o em linha V a V v lvulas solen ides de 3 vias B a B reactores DET detector S amostra R a R reagentes P liga o bomba perist ltica Adaptado de 5 Figura 1 13 Montagem de fluxo para a determina o de ferro e cr mio numa configura o em estrela V a Vs v lvulas solen ides de 3 vias Rc reactor DET detector S amostra Cs transportador R e R reagentes P liga o bomba perist ltica Adaptado de 51 Evidenciou se o potencial da mistura bin ria de reagentes e amostras traduzido numa mais r pida homogeneiza o boa precis o e exactid o baixo consumo de 46 Introdu o Geral reagentes e ritmos de amostragem de 60 e 110 determina es por hor
65. fluxo cont nuo baseada na recolha manual de amostra do meio de dissolu o durante alguns ou apenas um per odos de tempo predeterminados A informa o anal tica assim obtida pode revelar se insuficiente para descrever o processo cin tico de dissolu o impossibilitando uma contribui o nos estudos de concep o e avalia o de novas formas de dosagem Al m disso os procedimentos manuais de an lise discreta apresentam baixos ritmos de determina o s o pouco pr ticos e particularmente dif ceis ou at mesmo imposs veis de executar quando v rios testes est o a decorrer em paralelo nos vasos de multi dissolu o geralmente seis A monitoriza o cont nua dos princ pios activos nos meios de dissolu o exige por isso a sua automatiza o Fang et al 19 em 1999 identificou as caracter sticas de um teste de dissolu o autom tico ideal i elevada efici ncia no pr tratamento e determina o em linha da amostra permitindo a monitoriza o em tempo real 11 elevada frequ ncia de amostragem para obter uma elevada resolu o do perfil de dissolu o iii baixo consumo de amostra para que a introdu o de dist rbio no volume do meio de dissolu o seja m nimo particularmente quando est o envolvidas elevadas frequ ncias de amostragem iv testes em paralelo nos vasos de multi dissolu o com um nico detector v determina o simult nea de multi componentes numa forma de dosagem vi elevada est
66. gia de inser o por amostragem bin ria originou resultados equivalentes aos obtidos com a estrat gia de inser o por conflu ncia de zonas Verificou se que para tempos de pulso superiores a 300 ms isto para caudais inferiores a 2 13 mL min ocorria uma diminui o do sinal anal tico para todos os volumes de amostra inseridos no ponto de conflu ncia X Isto significa que a estrat gia por amostragem bin ria tamb m originou um desenvolvimento r pido da reac o de quimioluminesc ncia Adicionalmente devido estrat gia de inser o utilizada tamb m ocorriam fen menos de dilui o dos reagentes introduzidos no sistema resultando num abaixamento do sinal registado pelo detector Quando se analisa este estudo comparativo das diferentes estrat gias de inser o de amostra cobre no fluxo de luminol per xido de hidrog nio conclui se que para a montagem anal tica descrita em 6 2 3 e utilizada para a realiza o destes ensaios a utiliza o da estrat gia de inser o por volumes nicos no ponto de conflu ncia X originou o sinal anal tico mais elevado e que 4 pulsos de amostra introduzidos no sistema com um tempo de pulso de 300 ms isto um caudal de 2 13 mL min possibilitou uma melhor sensibilidade de detec o Os resultados apresentados na Figura 6 13 demonstram que com a utiliza o das estrat gias de inser o por conflu ncia de zonas e por amostragem bin ria para a mistura do fluxo de amostra cobre
67. impuls o se alterarem ap s tempo de exposi o fric o dos rolamentos Em multiseringa o uso de uma seringa do bloco multiseringa como reservat rio de amostra para introdu o directa da amostra no sistema de fluxo aumentaria o ciclo anal tico de um modo substancial em tempo porque implicaria a realiza o de v rios passos de lavagem entre amostras consecutivas de modo a evitar a contamina o entre amostras consecutivas por res duos das anteriores efeito de sobreposi o de zonas carry over em ingl s Desta maneira e porque essencial que se transfira com precis o um determinado volume de amostra para o sistema de forma reprodut vel foram adoptadas estrat gias alternativas 1 77 Introdu o Geral recorrendo ao volume interno de uma al a de injec o ou rela o tempo vs caudal durante a fase de amostragem 1 3 1 5 Lab on valve A metodologia designada por Ruzicka de Lab on valve LOV proposta em 2000 86 surgiu como uma evolu o microminiaturizada de SIA Considerando que o objectivo principal da microminiaturiza o de ensaios baseados em reac es qu micas a diminui o da utiliza o da massa consumida e res duos originados ent o apenas o volume do canal de processamento da amostra nas montagens anal ticas de fluxo necessita de ser diminu do Os sistemas LOV e os sistemas SIA s o operados com base no mesmo princ pio O centro principal do sistema u
68. influ ncia no sinal anal tico da estrat gia de inser o de volumes nicos uma al quota de solu o de amostra cobre foi inserida no ponto de conflu ncia X ap s a interrup o do fluxo de luminol per xido de hidrog nio de modo a que se formassem duas interfaces de reac o entre amostra cobre e luminol per xido de hidrog nio Este ensaio foi efectuado para diferentes volumes inseridos de solu o amostra cobre atrav s do aumento do n mero de pulsos executados pelas micro bombas P e P4 em simult neo Os volumes de amostra cobre inseridos no fluxo de luminol per xido de hidrog nio pela estrat gia de inser o de volumes nicos corresponderam a uma varia o de 1 a 6 pulsos executados pelas micro bombas P e P4 A an lise da Figura 6 13 A revela que o sinal anal tico mais elevado foi obtido para a situa o de inser o de 4 pulsos de solu o de amostra cobre para um tempo de pulso de 300 ms um sinal anal tico equivalente foi verificado para volumes de amostra cobre correspondentes a 5 pulsos introduzidos no sistema mas para tempos de pulso de 500 ms e 700 ms Esta situa o verifica se porque para caudais menores o tempo em que a zona de reac o demora a atingir o detector menor e portanto o m ximo de intensidade de luz emitida ocorre fora da c lula de fluxo Neste caso o sinal anal tico compensado por um aumento da quantidade de reagentes introduzidos no sistema atrav s do aumento do n mero de pul
69. isoniazida Os tubos de fluxo e os reactores eram em PTFE e com diferentes di metros internos 0 38 mm 0 5 mm e 0 8 mm Tamb m foram utilizados adaptadores constru dos no laborat rio conectores e conflu ncias 39 5 2 3 Montagem de fluxo A integra o das diferentes opera es em apenas um nico componente resultou num sistema de fluxo que explorou o conceito de multi impuls o com uma configura o muito simples Figura 5 3 Figura 5 3 Diagrama da montagem de fluxo para a determina o de isoniazida B e B Buretas autom ticas equipadas com seringas de 2 5 mL para a introdu o de amostra e reagente respectivamente A Solu o de amostra C Solu o de reagente transportador X ponto de conflu ncia L Reactor 44 cm D Detector W Res duos Determina o espectrofotom trica de isoniazida a emma marra ms A montagem de fluxo proposta foi apenas constitu da por dois distintos componentes funcionais duas buretas autom ticas B e Bz e um espectrofot metro No entanto as buretas autom ticas foram os nicos dispositivos activos do sistema de fluxo O computador embora n o se encontre esquematizado na Figura 5 3 foi um componente necess rio visto que o controlo do sistema dependia das instru es programadas No sistema anal tico a bureta autom tica B foi respons vel pela inser o e propuls o do transportador tamb m utilizado como reagente enq
70. lise foi proporcionada pela multicomuta o devido sua intr nseca versatilidade e elevado controlo na direccionalidade do fluxo Tais caracter sticas possibilitaram outra op o de amostragem de zonas na sequ ncia de uma nica inser o de amostra e sem afectar negativamente o ritmo de amostragem uma determinada zona de amostra era seleccionada para detec o a qual por sua vez era seccionada transversalmente em duas por es a anterior encaminhada directamente para a 1 47 Introdu o Geral detec o e a posterior sujeita a uma paragem de fluxo para incremento do tempo de reac o Figura 1 14 Montagem de fluxo para a determina o de creatinina P e P bombas perist lticas V a V3 v lvulas solen ides de 3 vias L a L reactores S amostra DET detector W dreno rect ngulo preto banho de gua setas direc o do fluxo Adaptado de 52 Em 1996 realizado por Oliveira et al 53 outro trabalho da s rie de artigos relativos multicomuta o na an lise em fluxo Este trabalho consistiu num sistema de divis o de fluxo para a determina o simult nea de cobre e zinco em plantas por espectrofotometria na zona do vis vel em que as duas sec es resultantes da divis o da zona de amostra foram sujeitas a dois tempos de resid ncia diferentes o que permitiu a determina o das concentra es de cobre e zinco em fun o das suas distintas
71. nervosas Deste modo o seu mecanismo de actua o por interm dio de um prolongamento dos efeitos de aumento de humor provocado pela exist ncia dos neurotransmissores nas sinapses nervosas 1 Devido ao seu perfil farmacol gico a trimipramina tem tamb m utilidade no tratamento de casos psic ticos Nas situa es de administra o desta droga a doentes com qualquer ind cio de doen a cardiovascular s o necess rios cuidados especiais devido possibilidade de interfer ncias a n vel da condu o card aca ocorr ncia de arritmias enfarte do mioc rdio e taquicardia Do mesmo modo que se deve ter aten o com a sua administra o em pacientes com elevada press o intra ocular hist ria de reten o urin ria ou glaucoma por causa das propriedades anti colin rgicas do f rmaco nos doentes com hipertiroidismo ou em tratamento cujo alvo a tir ide devido toxicidade cardiovascular da trimipramina em doentes medicados com guanetidina ou f rmacos semelhantes porque a trimipramina pode interferir com os efeitos farmacol gicos desta droga 1 Em qualquer paciente em estado avan ado de depress o a possibilidade de cometer suic dio elevada pelo que quando estes doentes n o se encontram hospitalizados a dosagem de trimipramina prescrita deve ser a mais baixa poss vel Consequentemente a relev ncia terap utica e farmacol gica da trimipramina conjuntamente com a sua inerente toxicidade efeitos adversos dos
72. novas necessidades industriais e socio econ micas Na actualidade vive se uma era tecnol gica em constante evolu o que exerce uma influ ncia acentuada na rea de an lise qu mica de compostos e subst ncias como por exemplo a n vel da ind stria farmac utica Os desenvolvimentos modernos nos campos da automa o quimiometria t cnicas de separa o e de medi o amostragem e pr tratamento de amostras t m vindo a ser gradualmente incorporados como procedimentos normais ou at de rotina em Qu mica Anal tica 1 A exactid o precis o selectividade e sensibilidade s o os principais requisitos de um m todo anal tico que s o consideradas quando o qu mico anal tico avalia diversas metodologias com vista obten o de informa o qu mica de um sistema e deste modo essas exig ncias anal ticas devem ser permanentemente consideradas como refer ncias para a an lise de amostras e compara o entre estrat gias anal ticas e m todos de an lise 2 No entanto quando na pr tica se executa uma determina o anal tica n o s o apenas estes princ pios b sicos a ter em considera o mas tamb m alguns aspectos pr ticos como por exemplo o tempo necess rio para a execu o da an lise da amostra o custo da an lise o conforto e seguran a na execu o assim como efeitos laterais relacionados com o Introdu o Geral consumo de reagentes e produ o de res duos sendo este lt
73. num espelho O accionamento do n cleo do solen ide impulsionava as membranas de teflon Figura 2 1 MT1 e MT2 num sentido estabelecendo um dos percursos ap s o desligar da v lvula uma mola helicoidal recolocava as membranas de teflon na sua posi o inicial estabelecendo o percurso alternativo No caso das v lvulas de duas vias uma mola exercia press o sobre uma membrana de teflon nica nestes dispositivos obstruindo o percurso nas v lvulas normalmente fechadas e quando a v lvula era accionada o n cleo do solen ide pressionava a membrana no sentido contr rio provocando a abertura da v lvula A inser o das solu es de amostras foi efectuada por comuta o das v lvulas solen ides para a posi o correspondente abertura do canal de entrada da solu o de amostra permanecendo a v lvula nesta posi o por um tempo predefinido tempo de amostragem Nos sistemas de fluxo desenvolvidos baseados no conceito de multicomuta o os volumes de solu o introduzidos no sistema eram definidos pelo tempo de amostragem e pelo caudal utilizado isto durante o tempo de amostragem ocorria a entrada no sistema de um determinado volume de solu o que dependia do caudal definido 2 3 1 3 Sistema de detec o O sistema de detec o utilizado para as determina es anal ticas nos sistemas de multicomuta o foi um detector espectrofotom trico Em todas as montagens anal ticas e para a determina o de clomipram
74. o da quantidade lip dica extra vel com metanol dos microorganismos Quando usada isoladamente no tratamento da tuberculose verifica se o r pido aparecimento de estirpes resistentes fen meno que limitado ou mesmo evitado atrav s de uma terapia combinada com outros agentes antibacterianos O mecanismo mais comum da resist ncia isoniazida a ocorr ncia de muta es na enzima catalase peroxidase diminuindo a sua actividade enzim tica e impedindo a convers o da pr droga isoniazida no seu 5 2 Determina o espectrofotom trica de isoniazida metabolito activo Outro mecanismo de resist ncia est relacionado com uma muta o no gene respons vel pela biossintese de cidos mic licos 3 4 A isoniazida prontamente absorvida podendo ser administrada por via oral ou parent rica atingindo um valor m ximo de concentra o no sangue entre uma a duas horas ap s a sua administra o A sua liga o s prote nas plasm ticas pequena menor que 10 e difunde se facilmente atrav s dos fluidos biol gicos incluindo o l quido cerebrospinal tecidos e rg os Cerca de 75 a 95 da dose de isoniazida administrada excretada na urina dentro de 24 horas principalmente como metabolitos Os principais produtos de excre o nos seres humanos resultam de acetila o enzim tica acetilisoniazida e hidr lise enzim tica cido isonicot nico Outras vias metab licas como conjuga o com a glic
75. o e ainda m todos anal ticos adequados monitoriza o destes factores As fontes prov veis de problemas de seguran a e os procedimentos do controlo da qualidade e especifica es do produto ficam assim definidos tendo sempre como objectivo obedecer aos requisitos impostos por ag ncias regulamentares nacionais ou estrangeiras 14 O esfor o anal tico envolvido no desenvolvimento e comercializa o de uma formula o pode ser subdividido numa s rie de tarefas como 1 determina o da identidade e da pureza das mat rias primas e intermedi rios usados na produ o do f rmaco ii determina o da identidade e da pureza do f rmaco iii isolamento e identifica o de impurezas vestigi rias no f rmaco iv determina o de produtos de degrada o do f rmaco vi determina o da identidade e pureza dos excipientes usados na manufactura dos produtos formulados vii determina o da identidade do f rmaco no produto formulado viii determina o produtos de degrada o do produto formulado ix estabelecimento de um padr o de refer ncia anal tica para o f rmaco Introdu o Geral Os requisitos da selectividade precis o exactid o e o grau de complexidade que aceit vel do procedimento anal tico variam consideravelmente de tarefa para tarefa referidas acima pelo que surge a necessidade de recorrer a uma variedade de t cnicas anal ticas para o seu desempenho 14 Uma vez definido e va
76. o m ximo de intensidade de luz gerada pela reac o foi obtido para uma concentra o de luminol de aproximadamente 4 x 10 mol L este valor foi seleccionado para as posteriores determina es A concentra o da solu o de hidr xido de s dio utilizada na reac o de oxida o do luminol era importante para o desenvolvimento da reac o de quimioluminesc ncia ao influenciar o pH final em que se processava a reac o dentro da c lula de fluxo ap s a mistura dos reagentes Por isso realizaram se ensaios visando o estudo da influ ncia no sinal anal tico da concentra o da solu o de hidr xido de s dio utilizada para preparar a solu o de luminol Figura 6 6 Desses estudos verificou se que entre concentra es de hidr xido de s dio de 1 3 x 107 mol L a 1 75 x 102 mol L a intensidade de resposta aumentava e que para valores de concentra o superiores a 1 75 x 10 mol L o sinal anal tico diminuia Al m da influ ncia directa da concentra o de ides hidr xido na reac o de oxida o do luminol Figura 6 2 o perfil do registo anal tico obtido pode ser tamb m devido influ ncia do pH na concentra o de i es de cobre II em solu o dado a constante de solubilidade do hidr xido de cobre ser na ordem de 10 Talvez por isso se verifique a diminui o de sinal anal tico para concentra es de hidr xido de s dio superiores a aproximadamente 1 75 x 107 mol L Assim utilizou se uma solu
77. para a automatiza o anal tica 93 Em multi impuls o ao contr rio das metodologias de fluxo previamente propostas e mais concretamente a an lise por injec o em fluxo 25 a an lise por injec o sequencial 38 ou a multicomuta o 43 as etapas sucessivas de 1 8 Introdu o Geral um procedimento t pico em fluxo como a inser o de amostra adi o de reagentes e propuls o das solu es s o efectuadas pelo mesmo componente da montagem e n o por dispositivos activos distintos e individuais Os sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o Figura 1 46 s o baseados na utiliza o de dispositivos solen ides respons veis pela impuls o de volumes impostos pelos dispositivos como por exemplo 3 8 25 e 50 uL por cada activa o pulsos Estes dispositivos micro bombas possibilitam a montagem de sistemas anal ticos automatizados e facilmente controlados por computador visto que todas as opera es fundamentais envolvidas numa an lise qu mica em fluxo incluindo a inser o de amostra a adi o de reagentes a mistura das solu es e o transporte da zona de reac o podem ser efectuadas por esses mesmos componentes Figura 1 46 Montagem de fluxo de multi impuls o convencional V e Vz micro bombas A amostra R reagente L reactor D detector W dreno 1 82 Introdu o Geral As micro bombas funcionam simult
78. proceder Determina o espectrofotom trica de isoniazida ii a iii iii E lavagem e prepara o da bureta B com a nova solu o ou seja era imprescind vel a defini o de uma etapa de lavagem no programa de controlo do sistema Esta etapa embora n o implicasse um grande consumo de tempo podia afectar o ritmo de amostragem sendo este facto importante considerando que o objectivo final do trabalho seria a aplica o do sistema de fluxo para determina es anal ticas de rotina em formula es farmac uticas Deste modo para minimizar esta limita o a etapa de lavagem foi realizada operando a bureta autom tica B com uma frequ ncia de passo muito elevada de aproximadamente 10 passos por segundo o que permitia um caudal de cerca de 0 6 mL min para uma seringa de 2 5 mL de capacidade que era o volume mais adequado para a implementa o de algumas fases interm dias do procedimento desenvolvido Um procedimento alternativo ou sin rgico ao anterior e relativo etapa de lavagem na substitui o da solu o de amostra consistia na inclus o de uma v lvula solen ide de comuta o de tr s vias V colocada entre a bureta autom tica B e o ponto de conflu ncia X em simult neo com uma al a de armazenamento L para prevenir que as solu es de amostra atingissem a seringa da bureta B Figura 5 4 Ou seja a solu o de amostra era primeiro aspirada em excesso para a al a de armazename
79. quida com detec o por espectrofotometria na regi o do ultravioleta 29 Foi tamb m realizado um trabalho de quantifica o recorrendo a electroforese capilar com detec o espectrofotom trica na regi o do ultravioleta 30 V rias metodologias com detec o colorim trica na regi o do vis vel recorrendo a diversas reac es de desenvolvimento de cor foram tamb m usadas para a determina o de clomipramina Em 1994 Arioz e Ersoy realizaram a determina o de clomipramina por reac o com 2 3 dicloro 5 6 diciano p benzoquinona 31 e em 2000 surgem dois trabalhos um por reac o da clomipramina e tamb m outros compostos tric clicos com dihidrocloreto de p fenilenediamina diazotada em cido sulf rico 32 e o outro por reac o com ferro III e subsequente reac o com cianeto de ferro em cido ac tico 33 Determina o espectrofotom trica de clomipramina E cpa ee O Atrav s de quimioluminesc ncia electrogerada realizou se um trabalho de determina o de diversos antidepressivos tric clicos entre os quais a clomipramina em 1999 por reac o dos grupos amina terci rios com tris 2 2 bipiridil rut nio II 34 Em 1978 tamb m se realizou um trabalho de determina o de clomipramina em plasma biol gico atrav s de um procedimento especifico por radioimunoensaios 35 Em 1993 surgiu a primeira metodologia em fluxo desenvolvida por Elgendy et al 36 para a determina
80. referidas anteriormente se relacionam com o facto de com a automatiza o dos m todos anal ticos ocorrer igualmente a automatiza o da etapa anal tica de manipula o da amostra podendo englobar as etapas de amostragem e o seu pr tratamento 6 Nos m todos de an lise discretos existe uma grande influ ncia negativa na qualidade e efici ncia da an lise causada pela manipula o da amostra 7 em que se destaca a diminui o da precis o a necessidade de trabalhar com volumes elevados de amostra uma tend ncia para um decr scimo na utiliza o dos procedimentos de qualidade e um aumento significativo do tempo dedicado pelo operador execu o da an lise Em meados do s culo anterior aproximadamente os principais esfor os foram essencialmente centralizados no desenvolvimento de novos e mais sofisticados m todos de medi es baseados em princ pios f sico qu micos e deste modo hoje em dia existe um grande n mero de t cnicas e metodologias apropriadas para serem convenientemente adaptadas para a resolu o de qualquer problema espec fico atrav s da automa o 8 Introdu o Geral No entanto necess rio prestar aten o s v rias etapas das an lises qu micas amostragem pr tratamento da amostra esquema anal tico selec o da metodologia mais apropriada hifeniza o entre t cnicas anal ticas medi o do sinal anal tico aquisi o tratamento dos dados e desconta
81. s o assim definidos para as buretas autom ticas utilizadas no ensaio com motores de capacidade de execu o de 2500 passos no percurso m ximo por seringa Os volumes de amostra inseridos no sistema e traduzidos proporcionalmente pelo n mero de passos executados pela bureta respons vel pela inser o da solu o de amostra foram programados de modo a serem coincidentes para as tr s estrat gias de amostragem ensaiadas para que deste modo os resultados obtidos entre os ensaios fossem pass veis de compara o independentemente da capacidade da seringa utilizada Isto significa que por exemplo era obtido um volume de amostra de 20 uL com 5 passos de uma bureta equipada com uma seringa de 10 mL 10 passos com uma seringa de 5 mL e 20 passos com a utiliza o de uma seringa de 2 5 mL A nica diferen a e que era importante ocorria na estrat gia de amostragem bin ria o volume de cada passo dependente da capacidade da seringa acoplada bureta autom tica influenciava a intercala o dos segmentos de amostra e reagente De facto e embora considerando que o volume final da zona de amostra era id ntico uma seringa de 5 18 Determina o espectrofotom trica de isoniazida 2 5 ml possibilitava a intercala o de 1 uL de amostra e 1 uL de reagente 20 ciclos de intercala o para um volume de 20 uL de amostra enquanto uma seringa de 10 mL apenas permitia a intercala o de al quotas de 4 uL de amostra e
82. se que por cada pulso actua o da micro bomba ocorria a dispensa de um volume de 2 11 Parte Experimental solu o de 8 uL com uma precis o de 2 de acordo com informa es do fabricante A frequ ncia de pulso pode ser ajustada at um m ximo de 250 pulsos tamb m por informa o do fabricante por minuto para as micro bombas de 8 pL permitindo atingir caudais de 2 0 mL min Para as micro bombas de 25 e 50 HL a frequ ncia de pulso pode ir at 150 actua es por minuto o que corresponde respectivamente a caudais m ximos de 3 75 e 7 50 mL min As micro bombas Figura 2 2 de forma cil ndrica e com reduzidas dimens es com cerca de 5 cm de altura e 1 8 cm de di metro s o dispositivos com diafragmas cuja posi o depende da activa o de um solen ide Os diafragmas est o normalmente fechados atrav s de uma mola interna O solen ide activado atrav s da aplica o de uma voltagem o que provoca a abertura do diafragma e a entrada do l quido para uma c mara interna Quando se cessa a aplica o da voltagem o solen ide desactivado e a mola interna rep e os diafragmas em posi o de fecho A ac o da mola sobre os diafragmas provoca simultaneamente a impuls o do l quido contido na c mara interna para o exterior SVO OOF 6a aa Pas Sy S605 POON BOOK 0 va Seas O a SM KS Sah Figura 2 2 Diagrama representativo do corte de uma micro bomba Sol
83. sua forma protonada 6 2 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida reabsorvido pela bact ria facilmente atrav s da membrana O influxo do cido pirazin ico aparentemente mais forte que o deficiente efluxo provocando uma acumula o do cido nas bact rias A forma protonada do cido dentro das c lulas origina um aumento de prot es que eventualmente provocam a acidifica o citoplasm tica com a consequente inibi o de enzimas vitais 12 Uma das enzimas afectadas parece ser a enzima respons vel pela s ntese dos cidos gordos da membrana das bact rias e portanto envolvida na biosintese de cidos mic licos 1 A pirazinamida prontamente absorvida no tracto gastrointestinal e distribu da globalmente pelo corpo incluindo o sistema nervoso central pulm es e f gado A administra o oral de 500 mg origina concentra es plasm ticas de aproximadamente 9 a 12 ug mL ao fim de duas horas e 7 ug mL ao fim de oito horas O tempo de semi vida plasm tico de 9 a 10 horas em pacientes com fun o renal normal O f rmaco excretado principalmente por filtra o renal e o maior produto de excre o o cido 5 hidroxipirazin ico atrav s de uma reac o de hidroxila o 1 A pirazinamida est dispon vel para administra o oral na forma de comprimidos A dose oral di ria para adultos 15 a 30 mg Kg administrados numa nica dose A dose m xima que pode ser
84. trabalho nocturno durante o desenrolar do trabalho laboratorial Aos j doutorados Ivone Pinto companheira do lcool et lico 96 Rita Catarino vizinha Adriana Pimenta e Nestor Zarate muitos beijinhos e abra os por todos os momentos de excelente disposi o que proporcionaram Agradecimentos Aos meus amigos do laborat rio Christophe Siquet grande abra o de agradecimento pelas tradu es Marlene L cio Karine Marques Marta Ribeiro Helena Ferreira Lu s Magalh es David Costa Paula Pinto Em lia Santos C lia Amorim e todos os outros deixo beijinhos e abra os por todo o apoio e amizade com que vivemos todos juntos no laborat rio Ao Rodrigo Santos um abra o pelos momentos de amizade companheirismo e apoio A D Belmira Pereira um amigo agradecimento por todos os aux lios nas resolu es dos problemas no dia a dia de trabalho no laborat rio amiga Paula Jer nimo Tssshh um beijinho pela amizade desenvolvida Ao amigo Pedro Maia pelos prolongados luscos fuscos ao som Drum n Bass um especial abra o por todas as filosofias e reflex es incidentes na realiza o humana de todos os seres enquanto egoc ntricos e simplesmente humanos minha amiga Cristina Lopes Pires beijinhos de sincera gratid o por toda a amizade partilha companheirismo jantares e caf s Ao meu amigo de longa data Gabriel Pereira um abra o de amizade sincer
85. um espectrofot metro um espectrofluorimetro um detector electroqu mico etc v Sistema de aquisi o e registo dos dados um registador ou um microcomputador que recebe os sinais anal ticos fornecidos pelo detector A metodologia FIA originou n o s a possibilidade de executar os procedimentos anal ticos convencionais de um modo mais simples r pido e inovador mas mais importante em virtude da sua versatilidade permitiu realizar procedimentos anal ticos que no tempo eram dif ceis ou imposs veis de executar de um modo robusto Neste contexto inclui se m todos baseados na explora o dos gradientes de concentra o criados pela injec o da amostra e tamb m m todos em que s o 1 25 Introdu o Geral gerados constituintes transit rios e metast veis ou onde o pr prio sinal anal tico transit rio dada a sua natureza como por exemplo em procedimentos baseados em medidas quimio ou bioluminom tricas 21 Este tipo de ensaios era de muito dif cil execu o porque a cin tica envolvida nas reac es qu micas com o resultado de emiss o de energia na forma de luz geralmente r pida mas com o surgimento da metodologia FIA tornou se mais pratic vel o relacionamento da luz emitida com a concentra o e deste modo a explora o destes procedimentos para ensaios quantitativos 25 Deste modo al m de uma elevada capacidade adaptativa a objectivos espec ficos d
86. utiliza o das v lvulas solen ides com o aparecimento de uma nova estrat gia de manuseamento de amostra e introdu o de reagentes em que Reis et al 43 designaram de multicomuta o Este trabalho envolveu a utiliza o das v lvulas solen ides como dispositivos activos para a selec o do caminho anal tico de entre v rios e tamb m como intervenientes no manuseamento de solu es devido a cada v lvula constituir um comutador independente possibilitando a cria o de uma rede de fluxo Figura 1 11 Figura 1 11 Montagem de fluxo para a determina o espectrofotom trica de ferro V a V v lvulas solen ides de 3 vias DET detector Rc reactor Cs transportador R reagente S amostra x canal obstru do y ponto de conflu ncia P liga o bomba perist ltica Adaptado de 43 Tendo como base a caracter stica de comutadores independentes foi ent o desenvolvido o conceito de amostragem bin ria Este conceito pode ser concretizado recorrendo a uma v lvula solen ide sendo que a cada entrada da v lvula corresponde uma solu o ou ent o a duas v lvulas solen ides Figura 1 11 em que cada uma possui um canal obstru do Esta ltima situa o descrita que envolve a utiliza o de v lvulas solen ides com canais obstru dos foi 1 44 Introdu o Geral utilizada inicialmente pelos autores do conceito de multicomuta o por motivos
87. zonas assegurava uma mais adequada homogeneiza o da zona de amostra mesmo para volumes elevados de amostra conforme se pode verificar pelos resultados Em seguida na Figura 5 7 s o apresentados os mesmos resultados obtidos do ensaio anterior mas organizados de acordo com a estrat gia de amostragem utilizada Quando se compara a amplitude de sinal anal tico em rela o ao volume por passo das buretas verifica se que o sinal anal tico mais elevado foi semelhante para os tr s volumes por passo avaliados 1 2 e 4 uL No entanto o valor mais elevado foi obtido para baixos volumes de amostra quando se utilizava uL e 2 uL de volume de passo das buretas De facto os resultados obtidos por exemplo com a estrat gia de amostragem bin ria Figura 5 7 demonstraram que o m ximo de sinal foi obtido com um volume de amostra de aproximadamente 16 uL para 1 pL e 2 uL de volume por passo e com 24 uL de volume de amostra para um volume de 4 HL por passo Este desempenho diferente foi devido provavelmente melhor homogeneiza o da zona de amostra e que s poss vel com a intercala o de volumes de amostra e reagente t o pequenos como 1 uL o que originou m ltiplas interfaces de reac o e contribuiu portanto para um desenvolvimento da reac o muito mais optimizado 5 2 Determina o espectrofotom trica de isoniazida em 8 00 6 00 4 00 2 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL
88. 0 1 00 s Amplitude de sinal cm 0 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL B 5 00 4 00 3 00 2 00 1 00 Amplitude de sinal cm 0 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL C 5 00 4 00 3 00 2 00 1 00 Amplitude de sinal cm e 0 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL Figura 5 11 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico da estrat gia de inser o de amostra utilizada em fun o do volume de passo A amostragem bin ria B conflu ncia de zonas C volumes nicos m seringa de 10 0 mL O seringa de 5 0 mL A seringa de 2 5 mL Determina o espectrofotom trica de isoniazida Contudo como a utiliza o de 1 uL de volume de passo implicava a coloca o de seringas de 2 5 mL de capacidade nas buretas e o volume destas se esgotava mais rapidamente que com a utiliza o de seringas de 5 ou 10 mL para o mesmo n mero de determina es havia obrigatoriedade de um maior n mero de etapas de enchimento das seringas sendo esta dificuldade superada atrav s da estrat gia de adi o ao sistema de uma v lvula solen ide de comuta o como referido na descri o da montagem anal tica 5 3 2 Comprimento do reactor Um par metro tamb m importante e que foi avaliado foi o comprimento do reactor Lz utilizado no sistema anal tico porque influenciava directamente a dispers o e o tempo de resid ncia d
89. 002 86 J Ruzicka Analyst 125 1053 2000 87 CD ROM Sequential Injection for Biomelecuar Assays FlAlab Instruments Bellevue USA 88 A D Carrol L Scampavia J Ruzicka Analyst 127 1228 2002 89 C M Schulz L Scampavia J Ruzicka Analyst 127 1583 2002 C M Schulz J Ruzicka Analyst 127 1293 2002 90 C H Wu L Scampavia J Ruzicka B Zamost Analyst 126 291 2001 91 C H Wu L Scampavia J Ruzicka Analyst 126 1947 2002 92 C H Wu L Scampavia J Ruzicka Analyst 127 898 2002 93 R A S Lapa J L F C Lima B F Reis J L M Santos E A G Zagatto Anal Chim Acta 466 125 2002 94 G D Owens R W Taylor T Y Ridley D W Margerum Anal Chem 52 130 1980 95 S A Jacobs M T Nemeth G W Kramer T Y Ridley D W Margerum Anal Chem 56 1058 1984 96 M T Nemeth K D Fogelman T Y Ridley D W Margerum Anal Chem 59 283 1987 1 100 Introdu o Geral 97 C P Bowers K D Fogelman J C Nagy T Y Ridley Y L Wang S W Evetts D W Margerum Anal Chem 69 431 1997 98 T Korenaga X Zhou T Moriwake H Muraki T Naito S Sanuki Anal Chem 66 73 1994 99 D A Weeks and K S Johnson Anal Chem 68 2717 1996 100 E B van Akker M Bos W E van der Linden Anal Chim Acta 378 111 1999 101 P S Francis S W Lewis K F Lim K Carlsson Bo Karlberg Talanta 58 1029 200
90. 1 mg de cloreto de cobre dihidratado e dissolu o em 100 mL duma solu o 4 x 10 mol L de cido sulf rico Atrav s desta solu o preparou se outra solu o de cati o cobre II com concentra o de 4 mg L em cati o cobre II utilizada nas determina es anal ticas por dilui o com a solu o 4 x 10 mol L de cido sulf rico Uma solu o de concentra o x 10 mol L em luminol foi preparada atrav s da pesagem de 182 64 mg de luminol 97 w w e dissolu o em 100 mL de solu o de hidr xido de s dio com concentra o de 1 75 x 10 mol L Esta solu o serviu para preparar outra solu o de luminol utilizada para as determina es com uma concentra o de 4 x 10 mol L por dilui o com solu o de hidr xido de s dio com concentra o 1 75 x 10 mol L 6 8 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Uma solu o 2 5 x 10 mol L de per xido de hidrog nio foi preparada diariamente atrav s da dilui o de 256 uL de peridrol em 1000 mL de gua bidesionizada 6 2 2 Equipamento Todas as medi es foram efectuadas com um detector de quimioluminesc ncia constru do no laborat rio cuja constru o pr pria foi realizada do modo a adaptar o detector para an lises em fluxo Para este prop sito utilizou se um fotomultiplicador da marca Hamamatsu modelo Fotosensor H5784 04 e tamb m uma c lula de fluxo com volume interno de 40 uL constru da para ser
91. 2 102 K Carlsson H S Jacobsen A L Jensen T Stenstr m Bo Karlberg Anal Chim Acta 354 35 1997 103 K Carlsson L Moberg Bo Karlberg Water Res 33 375 1999 104 K Carlsson Bo Karlberg Anal Chim Acta 423 137 2000 105 K Carlsson Bo Karlberg Anal Chim Acta 415 1 2000 106 K Carlsson Bo Karlberg Anal Chim Acta 434 149 2001 107 X D Wang T J Cardwell R W Cattrall G E Jenkins Anal Commun 35 97 1998 108 S W Lewis P S Francis K F Lim G E Jenkins X D Wang Analyst 125 1869 2000 109 S W Lewis P S Francis K F Lim G E Jenkins Anal Chim Acta 461 131 2002 110 J M T Cameiro E A G Zagatto J L M Santos J L F C Lima Anal Chim Acta 474 161 2002 111 A C B Dias J L M Santos J L F C Lima E A G Zagatto Anal Chim Acta 499 107 2003 112 J L F C Lima S M O Sa J L M Santos E A G Zagatto J Pharm Biomed Anal 32 1011 2003 A DS Sp pesei ig 1 101 Introdu o Geral 113 114 115 116 117 J L F C Lima J L M Santos A C B Dias M F T Ribeiro E A G Zagatto Talanta 64 1091 2004 J M T Carneiro A C B Dias E A G Zagatto J L M Santos J L F C Lima Anal Chim Acta 531 279 2005 A F Lavorante A Morales Rubio M de la Guardia B F Reis Anal Bioanal Chem 381 1305 2005 K L Marques J L M Santos J L
92. 2030 equipada com uma seringa de vidro de volume 5 0 mL foi utilizada para aspirar e impulsionar fluxo bi direccionado as solu es atrav s do sistema Como dispositivo de pot ncia para alimenta o e controlo das v lvulas solen ides de comuta o usou se um circuito baseado num integrado ULN 2003 36 O controlo do sistema anal tico atrav s do computador efectuou se por interm dio de uma placa de interface PC LabCard modelo PCL 818L da marca Advantech Todo o controlo do sistema anal tico dependia de um nico microcomputador Pentium a 200 MHz e de um programa inform tico O controlo envolvia o funcionamento sincronizado da bureta autom tica e a activa o dos solen ides das v lvulas anteriormente referidas O programa foi desenvolvido em linguagem BASIC e possibilitava o controlo individualizado das m ltiplas v lvulas solen ides e o funcionamento da bureta autom tica atrav s de simples comandos Determina o espectrofotom trica de trimipramina ai ie ee 4 2 3 Montagem de fluxo O sistema de fluxo desenvolvido Figura 4 2 envolvia quatro v lvulas solen ides duas de duas vias V e V2 normalmente fechadas e duas de tr s vias V3 e V4 Em virtude da metodologia explorada neste trabalho envolvendo a invers o do sentido do fluxo relevante referir que a bureta autom tica tamb m tinha uma v lvula VB mas esta era de constitui o diferente das v lvulas solen ides A v lvula VB possu a duas vi
93. 4 Determina o espectrofotom trica de trimipramina amostra e reagente a zona de reac o originada apresentava a zona da cauda pr ximo do ponto de inser o no sistema Com a invers o do fluxo essas zonas sofrem altera es na disposi o invertendo assim as suas posi es Teoricamente ocorre ap s a invers o de fluxo a penetra o das zonas dianteiras da zona de reac o nas zonas de cauda Figura 4 3 Diagrama do sistema de fluxo inicial para a determina o de maleato de trimipramina Vi e V2 v lvulas solen ides de 2 vias V3 e V4 v lvulas solen ides de 3 vias linhas cont nuas dentro dos s mbolos das v lvulas correspondem posi o e linhas tracejadas posi o 2 C Solu o de transportador cido sulf rico A Amostra R Reagente monovanadato de am nio B Bureta autom tica VB v lvula da bureta autom tica L reactor 2 0 metros L Reactor 1 0 metros X Ponto de conflu ncia D Detector CL canal de limpeza W Res duos 4 15 Determina o espectrofotom trica de trimipramina As solu es ensaiadas de cido sulf rico tinham concentra es compreendidas entre 1 0 e 6 0 mol L As solu es de cido sulf rico foram utilizadas n o apenas como transportador mas tamb m para preparar as solu es padr o de trimipramina e a solu o com o reagente que era uma solu o 6 0 x 10 mol L de monovana
94. 5 26 27 28 29 30 31 32 33 34 N Sadeg N Pertat H Duterte M Dumontet J Chromatr Biomed 675 113 1996 A Mehmedagic P Verite S Menager C Tharasse D Andre O Lafont J Chromatr B 695 365 1997 Y P Patel N Shah I C Bhoir M Sundaresan J Chromatr A 828 287 1998 P J Smith J van Dyk A Fredericks Int J Tuberc Lung D 3 S325 1999 J E Conte E Lin E Zurlinden J Chromatr Sci 38 33 2000 M C Gennaro R Calvino C Abrigo J Chromatr B 754 477 2001 B Mohan N Sharda S Singh J Pharm Biomed Anal 31 607 2003 J W Wu H H Shih S C Wang T H Tsai Anal Chim Acta 522 231 2004 J Woo C L Wong R Teoh K Chan J Chromatr Biomed 420 73 1987 A Walubo P Smith P I Folb J Chromatr Biomed 658 391 1994 M Y Khuhawar F M A Rind J Chromatr B 766 357 2002 E Calleri E Lorenzi S Furlanetto G Massolini G Caccialanza J Pharm Biomed Anal 29 1089 2002 A Espinosa Mansilla M I Acedo Valenzuela A M de la Pena F C Canada F S Lopez Talanta 58 273 2002 J Roboz Z Israeli P G Dayton T F Yu Fed Proc 33 358 1974 M I Acedo Valenzuela A Espinosa Mansilla A M de la Pena F C Canada Anal Bioanal Chem 374 432 2002 G R Svoboda J Am Pharm Assoc 45 405 1956 M A A Lomillo O D Renedo M J A Martinez Anal Chim Acta 449 167 2001
95. 94 11 F Coudore F Hourcade C MolinierManoukian A Eschalier E Lavarenne J Anal Toxicol 20 101 1996 12 H Weigmann S Hartter C Hiemke J Chromatogr B 710 227 1998 13 R Theurillat W Thormann J Pharm Biomed Anal 18 751 1998 14 L Palego D Marazziti L Biondi G Giannaccini N Sarno A Armani A Lucacchini G B Cassano L Dell Osso Ther Drug Monit 22 190 2000 Determina o espectrofotom trica de clomipramina 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 R Pirola E Mundo L Bellodi S R Bareggi J Chromatogr B 772 205 2002 J J Berzas C Guiberteau A M Contento V Rodriguez Chromatographia 56 545 2002 C Frahnert M L Rao K Grasmader J Chromatogr B 942 35 2003 H Yoshida K Hidaka J Ishida K Yoshikuni H Nohta M Yamaguchi Anal Chim Acta 413 137 2000 D Alkalay J Volk S Carlsen Biomed Mass Spectrom 6 200 1979 S J Gaskell PostGrad Med J 56 90 1980 A Sioufi F Pommier J P Dubois J Chromatogr Biomed 428 78 1988 R de la Torre J Ortuno J A Pascual S Gonzalez J Ballesta Ther Drug Monit 20 340 1998 Z Chlobowska E Chudzikiewicz P Koscienlniak W Piekoszewski A Stolarz Chem Anal 48 255 2003 M A Martinez C S de la Torre E Almarza J Anal Toxicol 27 353 2003 J J B Nevado M J V Llerena A M C
96. A G Zagatto Anal Chim Acta 499 107 2003 M Valcarcel M D Luque de Castro Flow Injection Analysis Principles and Applications Ellis Horwood Chichester 1987 5 45 CAP TULO 6 DETERMINA O DA PIRAZINAMIDA POR QUIMIOLUMINESC NCIA NUM SISTEMA DE FLUXO COM MULTI IMPULS O A pirazinamida um f rmaco utilizado no tratamento da tuberculose Neste cap tulo descrito o desenvolvimento de uma metodologia anal tica baseada na implementa o de um sistema de fluxo com multi impuls o acoplado a um sistema de detec o por quimioluminesc ncia para a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas Na metodologia desenvolvida obtiveram se dois intervalos de resposta linear para concentra es de pirazinamida unicamente atrav s de altera es nas instru es introduzidas no programa de controlo do sistema e portanto sem necessidade de efectuar altera es na configura o f sica da montagem de fluxo Determina o quimioluminom trica de pirazinamida 6 1 Introdu o A Pirazinamida Figura 6 1 ou pirazina 2 carboxamida uma droga de primeira escolha para o tratamento da tuberculose uma doen a extremamente infecciosa provocada pela bact ria Mycobacterium tuberculosis e uma das doen as com maior grau de cont gio e morte a n vel mundial 1 o N Cc NH N Figura 6 1 Estrutura quimica da pirazinamida O f rmaco pirazina
97. A e SIA reside no facto de que no caso de SIA o sistema de injec o constitu do por uma v lvula selectora multiposi o com controlo autom tico A v lvula selectora multiposi o constitu da por diversas portas laterais e uma porta central O seu funcionamento consiste no acesso alternativo de cada porta lateral porta central e portanto o n mero de posi es poss vel depende do n mero de portas laterais A coloca o do sistema de propuls o geralmente uma bomba perist ltica no percurso do canal central da v lvula selectora permite o acesso amostra dreno solu o de lavagem reagentes canal de reac o e detector apoiados em cada uma das v rias portas laterais da v lvula rotativa multiposi o 1 28 Introdu o Geral Figura 1 2 Montagem SIA convencional A amostra C solu o transportadora R reagente B bomba perist ltica V v lvula multiposi o L reactor D detector W dreno Num sistema de fluxo SIA um determinado volume de amostra aspirado para uma al a suficientemente longa para evitar o contacto das solu es com o sistema de propuls o As restantes solu es s o aspiradas do mesmo modo sob controlo temporizado Para efectuar o transporte da zona de amostra em direc o ao detector ocorre a invers o da direc o do fluxo caracter stica dominante da metodologia SIA e que incrementa os fen menos de mistura entre a am
98. B Figura 4 2 Diagrama do sistema de fluxo para a determina o de maleato de trimipramina A Fase de amostragem B Fase de transporte para detec o Vi e V2 v lvulas solen ides de 2 vias V e V v lvulas solen ides de 3 vias linhas tracejadas dentro dos s mbolos das v lvulas correspondem posi o 1 e linhas cont nuas posi o 2 C Solu o de transportador cido sulf rico A Amostra R Reagente monovanadato de am nio B Bureta autom tica VB v lvula da bureta autom tica L reactor 2 0 metros X Ponto de conflu ncia D Detector CL canal de limpeza W Res duos Determina o espectrofotom trica de trimipramina A inser o de amostra e reagente no sistema anal tico era definida pelos dados inseridos no programa inform tico de controlo da montagem Para al m dos dados relativos a outros par metros de funcionamento do sistema por exemplo caudal era necess rio introduzir os tempos de accionamento das v lvulas solen ides de comuta o Eram esses tempos de actua o das v lvulas V e Va que determinavam o volume introduzido de amostra e reagente consoante o caudal predefinido A sequ ncia de actua o dessas v lvulas determinava a metodologia utilizada para inser o da amostra no sistema de fluxo Portanto um ciclo de inser o envolve simultaneamente os tempos e sequ ncia de actua o das v lvulas solen id
99. J L F C Lima J L M Santos Anal Chim Acta 419 17 2000 72 R A S Lapa J L F C Lima B F Reis J L M Santos E A G Zagatto Anal Chim Acta 366 209 1998 73 C E S Miranda B F Reis N Baccan A P Packer M F Gin Anal Chim Acta 453 301 2002 74 M M Silva M A Z Arruda F J Krug P V Oliveira Z F Queiroz M Gallego M Valc rcel Anal Chim Acta 368 255 1998 75 D Pozebon V L Dressler A J Curtius J Anal At Spectrom 13 363 1998 76 J Michalowski P Halaburda A Kojlo Anal Lett 33 1373 2000 77 C A Giacomozzi R R U Queir z I G Souza J A G Neto J Autom Methods Manage Chem 21 17 1999 78 R A S Lapa J L F C Lima B F Reis J L M Santos E A G Zagatto Anal Chim Acta 351 223 1997 79 R A S Lapa J L F C Lima B F Reis J L M Santos Anal Chim Acta 377 103 1998 Introdu o Geral 80 F R P Rocha B F Reis J J R Rohwedder Fresenius J Anal Chem 370 22 2001 81 F R P Rocha P B Martelli B F Reis Talanta 55 861 2001 82 F R P Rocha B F Reis Anal Chim Acta 409 227 2000 83 F R P Rocha P B Martelli B F Reis Anal Chim Acta 438 11 2001 84 V Cerda J M Estela R Forteza A Cladera E Becerra P Altimira P Sitjar Talanta 50 695 1999 85 M Mir V Cerda J M Estela TrAC Trends Anal Chem 21 199 2
100. Jo o Alexandre Velho Prior SISTEMAS AUTOM TICOS EM FLUXO CONTINUO PARA O CONTROLO DE FORMULACOES FARMACEUTICAS FACULDADE DE FARMACIA UNIVERSIDADE DO PORTO PORTO 2005 SISTEMAS AUTOM TICOS EM FLUXO CONT NUO PARA O CONTROLO DE FORMULA ES FARMAC UTICAS Disserta o apresentada UNIVERSIDADE DO PORTO com vista obten o do grau de doutor por Jo o Alexandre Velho Prior Novembro 2005 Servi o de Quimica Fisica Faculdade de Farmacia Universidade do Porto Porto Portugal ndice NDICE Agradecimentos cost uate deters ent dose Dee ha ns DUAS evaatiated i ROO a gs aes fa a NE pa a a ill A DSUACE sis OA a EED ae BE Bhar utd on aah id Mattel ae A v RESUME a e a eae a a a a ERS Sao vii CAP TULO 1 Introdu o Geral l Introducir E e E E aR 1 1 1 1 Controlo de qualidade de formula es farmac uticas 1 5 1 2 Automa o e automatiza o 6c ccc ce ec ececec eee eeenes 1 13 1 3 M todos de fluxo este neciencay ss calada a sia ocaso 1 19 1 3 1 M todos de fluxo cont nuo ce ccc ee cence es 1 21 1 3 1 1 An lise por Injec o em Fluxo 1 22 1 3 1 2 An lise por Injec o Sequencial 1 27 1 3 1 3 Multicomuta o 0 reis 1 31 1 3 1 3 1 Conceitos gerais c cece eee 1 31 1 3 1 3 2 Evolu o da multicomuta o 1 37 1 3 1 4 Multiseringa onic c
101. L no fluxo de luminol per xido de hidrog nio por interm dio da estrat gia de inser o de volumes nicos de acordo com a configura o descrita no esquema representativo dos par metros de configura o do programa de controlo do sistema e representado na Tabela 6 2 Tabela 6 2 Esquema representativo dos par metros de configura o do programa de controlo do sistema para obten o de uma curva anal tica com linearidade entre 1 e 15 mg L N mero de Tempo de Etapa Estado de Impuls o pulsos pulso ms Pl P2 P3 P4 I ON ON OFF OFF 10 300 2 OFF OFF ON ON 1 300 3 OFF OFF OFF ON 3 300 4 OFF OFF ON ON 1 300 5 OFF OFF OFF ON 3 300 6 ON ON OFF OFF 30 300 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Com este ensaio demonstrou se que foi poss vel alterar a zona de resposta linear entre o sinal anal tico e a concentra o de solu o de pirazinamida atrav s da execu o de diferentes ordens de activa o das micro bombas controlando os volumes intercalados no sistema Deste modo revelou se a versatilidade do sistema de fluxo que deste modo poderia ser facilmente aplicado para a determina o anal tica de outros compostos cuja adapta o requeria unicamente altera es ao n vel de programa o do controlo do sistema No entanto a diminui o da resposta linear obtida por reconfigura o do controlo do sistema n o foi suficiente para poder efectuar determin
102. a Este conceito de inser o de solu es em multicomuta o proporciona mais uma vantagem face aos sistemas FIA a reac o qu mica para produ o do composto a detectar pode ter in cio durante a fase de amostragem Em FIA o reagente 1 33 Introdu o Geral adicionado amostra ap s inser o desta no percurso anal tico n o sendo por isso o intervalo de amostragem aproveitado para desenvolvimento da reac o 43 A multicomuta o permite uma simplifica o das montagens e redu o do consumo dos reagentes quando as solu es s o aspiradas atrav s da coloca o do dispositivo propulsor ap s o detector visto que deste modo as solu es s o aspiradas para um canal nico em direc o ao detector Este procedimento original e ainda hoje predomina nas montagens referidas na literatura No entanto a estrat gia de aspira o das solu es aumenta a probabilidade de ocorr ncia de bolhas de ar devido s press es inferiores que surgem no interior do sistema anal tico O transporte das solu es por impuls o atrav s da coloca o da unidade propulsora antes das v lvulas solen ides implica que para cada solu o exista um canal de impuls o como sucede quando se utiliza uma bomba perist ltica por exemplo Desta forma ocorre inevitavelmente um aumento da complexidade da montagem anal tica dado que existe um maior n mero de canais de transporte para gerir e por isso
103. a es directas em urina porque apenas cerca de 4 a 14 de pirazinamida n o metabolizada excretada pela urina no espa o de 24 horas 51 Se for considerado a elimina o de 4 de uma dose administrada de pirazinamida de 20 a 25 mg Kg significa a elimina o de aproximadamente 1 2 mg L a 2 mg L de pirazinamida n o metabolizada na urina no espa o de 24 horas 6 4 Conclus es A metodologia desenvolvida constitui uma estrat gia para a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas e pode ser uma alternativa til relativamente a outros procedimentos de an lise dispon veis porque exibe um elevado grau de automa o uma metodologia r pida precisa simples origina um baixo volume de res duos e requer pouca interven o do operador na sua manuten o Deste modo as caracter sticas e potencialidades dos sistemas de fluxo por multi impuls o fazem estes sistemas muito atractivos para a implementa o de procedimentos anal ticos autom ticos e exibem evidentes vantagens relacionadas Determina o quimioluminom trica de pirazinamida principalmente com as m ltiplas tarefas conferidas s micro bombas nomeadamente a inser o de solu es o transporte e mistura das solu es e a comuta o individualizada entre a introdu o de solu es A multi impuls o uma metodologia em fluxo que possibilita a manipula o minuciosa e individual de cada solu o envolvida
104. a Realizando a mesma determina o mas na montagem anal tica sem o reactor Lz e utilizando monovanadato de am nio com concentra o de 8 9 Determina o espectrofotom trica de trimipramina x 10 mol L o mesmo tempo de inser o de amostra originou um sinal anal tico correspondente a 9 cm e com um ritmo de amostragem de 48 amostras hora Em seguida avaliou se a influ ncia no sinal anal tico de v rios tempos de segmento de amostra mantendo o tempo de segmento de reagente em 0 25 segundos atrav s da amostragem bin ria Deste modo procedeu se optimiza o do volume de segmento de amostra introduzido no sistema A concentra o da solu o de trimipramina ensaiada foi 20 mg L e o n mero de ciclos de amostragem bin ria foi 9 A altera o dos tempos de inser o de segmento de amostra efectuou se com diferen as de tempo de 0 25 segundos Os resultados est o representados graficamente na Figura 4 10 18 00 16 00 14 00 12 00 Amplitude de sinal cm 10 00 8 00 0 0 5 1 1 5 2 Tempo de amostragem s Figura 4 10 Influ ncia na resposta anal tica de v rios tempos de inser o de amostra em combina o com a inser o de 0 25 s de reagente em amostragem bin ria Determina o espectrofotom trica de trimipramina Verificou se um aumento acentuado da amplitude de sinal na resposta anal tica desde 0 25 segundos at 0 75 segundos de inser o de segmento
105. a mas de n o agradecimento devido a todas as vezes a que fui for ado a desviar me do meu trabalho s rio e rduo para enveredar em quantum leaps Ao meu grande amigo Artur Figueirinha tamb m um abra o de amizade sincera por todas as desesperadamente hilariantes multi discuss es e multi representa es teatrais Presunto e petiscos s no final Ao Ricardo Oliveira meu amigo um abra o de gratid o por aguardar pacientemente pelos jantares constantemente adiados e pela s desforra s no snooker minha namorada Ros rio um beijinho especial por toda a compreens o paci ncia carinho amizade e for a Aos meus queridos pais e irm o a quem tudo devo n o h palavras que descrevam o significado da sua presen a na minha vida ii Resumo RESUMO O objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento de sistemas anal ticos autom ticos para o controlo qu mico de formula es farmac uticas Os sistemas de fluxo implementados possibilitaram variad ssimas formas de interven o sobre a zona de amostra nomeadamente a explora o de diferentes estrat gias de amostragem incluindo a amostragem bin ria a inser o de volumes nicos e a inser o por conflu ncia de zonas e tamb m permitiram um controlo efectivo do transporte da zona de reac o para o sistema de detec o Implementou se um procedimento anal tico para a determina o de clomipramina em formula
106. a para cada um dos sistemas respectivamente Ainda em 1995 Ara jo et al 52 prosseguem a s rie de trabalhos em multicomuta o com o desenvolvimento do um trabalho Figura 1 14 em que foi explorado uma nova estrat gia de amostragem de zonas para a execu o de elevadas dilui es em linha A amostragem de zonas efectuada num nico canal anal tico e associada com a t cnica de paragem de fluxo foi aplicada determina o espectrofotom trica da creatinina em amostras de urina com base num m todo cin tico Uma vez mais a multicomuta o permitiu que as potencialidades da amostragem de zonas e paragem de fluxo fossem expandidas com o acr scimo de uma simplifica o da montagem anal tica O m todo cin tico derivado da reac o de Jaff s quando aplicado an lise de urina implica elevadas dilui es das amostras e sendo assim a montagem anal tica desenvolvida era constitu da por tr s v lvulas solen ides em configura o linear e dois canais transportadores de solu o um canal para efectuar a dilui o da amostra de urina por amostragem temporizada da por o mais terminal e mais dispersa da zona de amostra sendo rejeitada a por o remanescente o segundo dedicado para realizar a paragem da zona de amostra num banho aquecido com o objectivo de incrementar o tempo de reac o e por conseguinte a sensibilidade da determina o de salientar que a independ ncia de execu o destas duas fases de an
107. a reac o de oxida o do luminol n o ocorria um desenvolvimento da reac o com significativa extens o e portanto a sensibilidade de detec o era baixa A activa o das micro bombas P e P4 originava a inser o no sistema das solu es de amostra e de cati o cobre II atrav s de uma estrat gia de amostragem predefinida O reactor L possibilitava a uniformiza o da mistura promovida pelo movimento ca tico das solu es causado pelo fluxo pulsado das solu es de amostra e de cati o cobre II e deste modo permitiu optimizar a mistura das quatro solu es utilizadas na reac o de determina o da pirazinamida A reac o de emiss o de luz tinha o seu in cio no ponto de conflu ncia X da Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Figura 6 4 e foi optimizada pelo reactor L durante o transporte da zona de reac o O procedimento utilizado neste trabalho possibilitou um registo anal tico sob a forma de picos cuja altura foi relacionada directamente com a concentra o de pirazinamida Cada pico correspondia ao sinal anal tico gerado pela reac o de quimioluminesc ncia e influenciado pelo efeito inibidor da pirazinamida cuja altura dependia das suas concentra es A introdu o no sistema de solu es de pirazinamida com concentra es gradualmente maiores originou respostas anal ticas gradualmente menores O perfil do registo assim obtido deve se ao procedimento utili
108. a a forma o do fluxo com a solu o de luminol e per xido de hidrog nio em que as micro bombas P e P2 foram activadas em simult neo No estudo efectuado foi tamb m avaliada a influ ncia no sinal anal tico de diferentes caudais para cada estrat gia de inser o O caudal foi variado atrav s da configura o de diferentes valores para o tempo de pulso das micro bombas Os tempos de pulso avaliados foram de 300 500 e 700 ms correspondendo a 6 31 Determina o quimioluminome trica de pirazinamida aproximadamente 2 13 mL min 1 48 mL min e 1 13 mL min respectivamente Para o c lculo dos caudais necess rio considerar que dada a estrat gia de inser o utilizada s o sempre activadas duas micro bombas em simult neo com excep o para a estrat gia de conflu ncia de zonas em s o activadas 4 micro bombas originando um segmento de 16 uL de volume de solu o Outros factores tamb m importantes para o c lculo dos caudais s o o tempo de activa o e o tempo de pulso frequ ncia de pulso das micro bombas Como j referido anteriormente em 6 2 3 os par metros de controlo das micro bombas envolviam um tempo de activa o de 150 ms em que o solen ide estava activo e originava a entrada para a micro bomba de uma al quota de solu o e um tempo de pulso 300 ms 500 ms e 700 ms para o ensaio descrito em que o solen ide estava desactivado e ocorria a impuls o da al quota de solu o no s
109. a em fluxo denominada an lise por injec o em fluxo baseada em multiseringa como resultado de uma tentativa de reunir todas as vantagens das t cnicas de fluxo descritas anteriormente Cerda et al em 1999 84 descrevem um sistema de an lise em fluxo baseado no uso de uma multiseringa Figura 1 43 1 75 Introdu o Geral Reactor Reactor Reactor wey Figura 1 43 Sistema de fluxo por multiseringa S amostra C transportador R e R reagentes W dreno Adaptado de 84 O centro vital em que assenta esta metodologia o elemento propulsor que uma multiseringa autom tica produzida pela empresa Crison O pist o de uma multiseringa possibilita o movimento simult neo dos mbolos de quatro seringas que podem ter diferentes capacidades As seringas est o ligadas a um veio comum que se movimenta por estar interligada a um motor multi passo O motor multi passo controlado por computador e pode totalizar nalguns modelos de multiseringas um total de 40000 passos o que significa que na utiliza o de uma seringa de 1 ml cada passo do motor corresponde a um d bito de 0 025 uL sa da de cada seringa est incorporada uma v lvula solen ide de tr s vias e na extremidade oposta encontra se um mbolo que proporciona o enchimento ou esvaziamento das seringas Sintetizando este equipamento propulsor permite atingir os ritmos de amostragem de FIA manter uma robustez de SIA e a versat
110. a reac o ao longo do tempo atrav s do registo em papel do sinal anal tico obtido com o espectrofot metro Figura 3 6 A Os resultados est o representados graficamente na Figura 3 6 B e correspondem aos m ximos de absor o em unidades de absorv ncia obtidos para cada ensaio A qv BIIUQAIOS 3 16 Determina o espectrofotom trica de clomipramina B 0 800 0 600 8 o c 2 0 400 3 Yu Q lt 0 200 0 000 0 1 2 3 4 5 6 7 Concentra o dos cidos M Figura 3 6 A Registo obtido para a influ ncia na absorv ncia de diferentes concentra es de cido sulf rico Velocidade de registo 20 mm min B Avalia o da influ ncia da natureza e concentra o de cidos na reac o de oxida o da clomipramina por vanadato de am nio Vanadato de am nio 1 25x10 M Clomipramina 1I0mgL H SO HCI E HNO3 Os valores apresentados na Figura 3 6 permitem concluir que para o cido clor drico e cido sulf rico o sinal anal tico aumentou ligeiramente com a concentra o dos cidos de 2 0 a 3 0 mol i e verificou se um aumento acentuado entre 3 0 e 5 0 mol L De 5 0 a 6 0 mol L o sinal anal tico apresentava ind cios de estabiliza o Para o cido n trico o sinal anal tico exibia um aumento cont nuo mas discreto ao longo do intervalo de concentra es mi Si q O Sia 3 17 Determina o espectrofotom trica de clomiprami
111. a selec o criteriosa do bin mio tempo caudal utilizando apenas uma unidade propulsora tornam estes sistemas simples robustos est veis a longo prazo e com poucas exig ncias de manuten o A simplicidade de configura o uma das suas caracter sticas n o requerendo grandes reconfigura es f sicas sempre que se altere a determina o anal tica ou as condi es em que esta realizada Assim qualquer altera o das condi es experimentais como por exemplo volume de injec o tipo de reac o dilui o de amostra rela o reagente amostra conseguida atrav s de uma altera o das instru es introduzidas no computador Deste modo ao contr rio das complexas montagens FIA n o h necessidade de reconfigura o f sica do percurso das solu es No entanto uma v lvula multiposi o substancialmente mais dispendiosa que a v lvula convencional de FIA conferindo um custo muito elevado aos sistemas SIA que tamb m n o podem ser controlados por meios manuais necessitando por isso de dispositivos controladores e computacionais A activa o de uma v lvula SIA efectuada atrav s de um dispositivo com um circuito integrado para controlo e que por sua vez pode ser controlado por computador por interm dio de uma aplica o inform tica desenvolvida para tal efeito A grande desvantagem apontada em rela o metodologia FIA a redu o dos ritmos de determina o em cerca de 30 a 50 pois o
112. a solu o 4 0 mol L de cido sulf rico e completando o volume para 100 mL com a mesma solu o de cido As solu es de amostras foram preparadas a partir de formula es farmac uticas dispon veis comercialmente comprimidos de Surmontil 25 mg e Surmontil 100 mg atrav s da dissolu o de quantidades apropriadas de comprimidos pulverizados numa solu o 4 0 mol L de cido sulf rico As solu es de amostra analisadas pela metodologia descrita no presente cap tulo n o foram sujeitadas a qualquer pr tratamento incluindo a filtra o porque se verificou que as solu es de amostra n o eram turvas e que n o ocorria diferen a de sinal obtido entre a utiliza o de solu es de amostra filtradas e n o filtradas Determina o espectrofotom trica de trimipramina 4 2 2 Equipamento Foi utilizado um espectrofot metro da marca Jenway Jenway UK modelo 6100 equipado com uma c lula de fluxo Hellma com volume interno de 18 pL para efectuar as leituras de absorv ncia no comprimento de onda 620 nm A montagem de fluxo inclu a quatro v lvulas solen ides NResearch USA duas de tr s vias duas entradas e uma sa da e duas de duas vias uma entrada e uma sa da Tubos de fluxo e reactores eram em PTFE com 0 8 mm de di metro interno da marca Omnifit Tamb m se utilizou conflu ncias conectores e adaptadores constru dos no laborat rio 35 Uma bureta autom tica da marca Crison modelo BU
113. a zona de reac o no sistema antes da detec o isto o tempo de reac o para um determinado caudal Considerando que um dos objectivos foi avaliar o desempenho do sistema proposto em condi es de dispers o limitadas o comprimento do reactor foi fixado em 44 cme o di metro interno do tubo utilizado foi de 0 38 mm Um reactor mais longo ou com um di metro interno maior resultaria num aumento da dispers o de amostra que iria certamente atenuar ou mascarar a influ ncia do volume de passo na resposta anal tica Os resultados est o representados nas Figuras 5 12 e 5 13 5 29 Determina o espectrofotom trica de isoniazida A 2 50 A E 2 w 2 00 Z 7 S 1 50 E 1 00 o E lt 0 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL B x E 2 50 2 2 00 i D 1 50 VU 3 1 00 a E lt 0 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL C Amplitude de sinal cm e gt N N q o q ai o o o 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL Figura 5 12 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico da estrat gia de inser o de amostra utilizada em fun o do volume de amostra A seringa de 10 0 mL B seringa de 5 0 mL C seringa de 2 5 mL 4 amostragem bin ria O volumes nicos A conflu ncia de zonas Determina o espectrofotom trica de isoniazida 2 50 A z 2
114. abilidade do pr tratamento da amostra e do sistema detector em condi es de opera o cont nua por per odos 1 12 Introdu o Geral prolongados vii monitoriza o cont nua da linha de base e da recalibra o em linha do sistema de detec o viii reduzido consumo de reagentes 1 2 Automa o e automatiza o A crescente automatiza o dos m todos de an lise qu mica teve origem na necessidade de aumentar o n mero de an lises de rotina efectuadas nos laborat rios de maneira a responder rapidamente e eficazmente com menor depend ncia do analista e o mais importante menor custo De facto a automatiza o das metodologias anal ticas envolve um duplo objectivo obter o m ximo de informa o poss vel de uma amostra com o menor custo poss vel 2 Inicialmente os primeiros sistemas anal ticos autom ticos comercializados foram direccionados para os laborat rios cl nicos 20 No entanto a aplica o deste tipo de sistemas expandiu se para outras reas como por exemplo o controlo de processos industriais farmac uticos e alimentares e a monitoriza o por exemplo ambiental 21 A monitoriza o entendida como o conjunto de metodologias anal ticas que permitem extrair informa es de sistemas em evolu o est a experimentar um crescimento significativo ao rentabilizar a enorme evolu o a n vel tecnol gico na rea da instrumenta o anal tica e automatiza o 22
115. ado e a implementa o de estrat gias anal ticas complementares como por exemplo amostragem de zonas ou recircula o de amostra o que assegura um controlo efectivo da dispers o de amostra e possibilita a execu o de dilui es numa vasta gama que pode ser ajustada de acordo com a concentra o da amostra mas tamb m proporciona um intervalo alargado para as determina es 1 36 Introdu o Geral 1 3 1 3 2 Evolu o da Multicomuta o Em 1985 Rothwell e Woolf 44 realizaram um trabalho com a aplica o de uma v lvula solen ide miniaturizada Figura 1 5 com controlo por um circuito temporizador Deste modo foi poss vel a realiza o de injec es reprodut veis de volumes vari veis de amostra com base num controlo de tempo Os autores efectuaram ensaios comparativos entre a utiliza o da v lvula solen ide e a utiliza o de uma v lvula rotativa convencional Naquela poca com as v lvulas rotativas convencionais a introdu o de um determinado volume de amostra no sistema era fun o das dimens es do reactor de amostragem utilizado e para alterar o volume de amostra introduzido exigia uma altera o f sica das dimens es do reactor de amostragem Com a v lvula solen ide de 3 vias e controlada por um circuito temporizador o volume de amostra era definido em fun o do tempo de abertura da v lvula e do caudal sendo este ltimo controlado por uma bomba perist ltica que impulsion
116. ado do processo de produ o A obten o desta informa o qu mica em tempo real extremamente til para melhorar a consist ncia qualidade e quantidade dos processos produtivos O controlo em processo pode ser utilizado para efectuar correc es aos processos produtivos se for caso disso sendo de vital import ncia para o uso eficiente da energia do tempo e das mat rias primas Um dos testes de controlo de qualidade de formula es farmac uticas a determina o do teor de princ pio activo A import ncia do controlo anal tico deste par metro decorre de uma poss vel altera o qu mica da subst ncia activa durante o seu armazenamento da exist ncia de um erro de fabrico por incorpora o de quantidades diferentes daquelas previstas para o produto final etc Os m todos anal ticos quantitativos utilizados para a determina o do teor de princ pio activo devem ser selectivos precisos e exactos Al m disso exige se que estas an lises em grande escala sejam econ micas e com elevados ritmos de determina o A automatiza o associada s metodologias de fluxo satisfaz todos estes requisitos Para a an lise quantitativa de f rmacos veiculados em formula es farmac uticas as mais diversas farmacopeias referem frequentemente v rias etapas preliminares de prepara o das amostras que incluem muitas vezes v rios processos extractivos repetidos 14 Este procedimento visa obter a separa o do f rmaco a determi
117. afectados pelo caudal tendo se verificado contudo a ocorr ncia de duplos picos at em caudais t o baixos como 0 06 mL min 5 34 A C E Determina o espectrofotom trica de isoniazida B 5 6 50 E 6 50 q 5 50 o 5 50 B D 2 o E 3 E E lt i 6 12 18 24 30 36 42 8 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL Volume de amostra uL D 5 6 50 5 6 50 A E q q E N o 5 50 4 5 50 3 Tv 4 50 4 50 5 3 50 3 50 0 6 12 18 24 30 36 42 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL Volume de amostra pL 5 50 4 50 Amplitude de sinal cm Y o 3 50 0 8 16 24 32 40 48 Volume de amostra pL Figura 5 14 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico do caudal em fun o do volume de amostragem A tempo de repouso 0 1 s B tempo de repouso 0 25 s C tempo de repouso 0 5 s D tempo de repouso 0 75 s E tempo de repouso 1 s e amostragem bin ria o conflu ncia de zonas A volumes nicos 5 35 Determina o espectrofotom trica de isoniazida A 5 6 50 q E na o 2 90 TU o 3 4 50 Q E lt 3 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL B 5 6 50 T E N o 550 o 3 4 50 E lt 3 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL C e 5 6 50 q E N o 200 o 5 4 50 3 50 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL Figura 5 15 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico do
118. al tica No entanto a optimiza o do sistema dependia de diversos factores Parte Experimental como por exemplo o bio de amostragem e a sensibilidade implicando a necessidade de atingir um compromisso entre estes factores de modo a maximizar a efici ncia do sistema anal tico As determina es anal ticas das amostras farmac uticas foram efectuadas atrav s de curvas de calibra o para a esp cie a determinar recorrendo inser o de conjuntos de solu es padr o com concentra es definidas Com o intuito de realizar com a maior brevidade poss vel a an lise dos resultados e portanto chegar ao resultado anal tico desenvolveram se folhas de c lculo Microsoft Excel 2000 de modo a relacionar o sinal anal tico com a concentra o da solu o em an lise e realizar o tratamento estat stico dos valores obtidos por regress o linear obtendo se equa es que traduziam as rela es verificadas e o respectivo coeficiente de correla o As concentra es das esp cies a determinar foram obtidas por relacionamento com a intensidade dos sinais anal ticos ou seja atrav s da medi o da altura em cent metros dos sinais providenciados pelos detectores O sinal relativo concentra o de um analito foi calculado atrav s da m dia de um conjunto de leituras correspondentes a inser es consecutivas da mesma amostra A concentra o final de cada uma das esp cies analisadas foi calculada por interp
119. al efectuado Apresenta se em seguida uma compila o gr fica dos resultados obtidos representados em tr s gr ficos correspondendo cada a um determinado caudal ensaiado Figura 3 10 Observou se que para um caudal de 0 5 ml min Figura 3 10 A o sinal anal tico mais elevado foi obtido com montagens em que se utilizava um reactor com 1 0 metros de comprimento O aumento do comprimento do reactor resultou na diminui o do sinal anal tico o que pode ser explicado pelo aumento da dispers o da amostra que se predomina ao facto de o tempo de reac o ser maior Um reactor de 0 5 metros originou um sinal anal tico semelhante ao obtido usando 1 0 metros de reactor mas apenas para valores de volume de amostra inferiores a 40 uL Com o aumento do volume de amostra para valores superiores a 40 pL a altura de sinal obtida com a utiliza o de um reactor de 0 5 metros diminuiu e aproximou se do valor obtido com 2 0 metros de reactor Determina o espectrofotom trica de clomipramina nn te Ds Volume de amostragem uL 0 00 83 33 166 67 250 00 333 33 A j Amplitude de sinal cm o 10 20 30 40 Tempo de amostragem s Volume de amostragem uL 0 00 166 67 333 33 500 00 666 67 B Amplitude de sinal cm 0 10 20 30 40 Tempo de amostragem s Volume de amostragem uL 0 00 250 00 500 00 750 00 1000 00 C Amplitude de sinal cm o 10 20 30 40 Tempo de amostragem s Figu
120. almente uma fun o essencial na homogeneiza o das al quotas de volumes de amostra com as al quotas de reagente introduzidas no sistema O segundo reactor L2 colocado exactamente antes do sistema de detec o entre a v lvula solen ide V3 e o sistema de detec o D tinha como objectivo potenciar o efeito de mistura amostra reagente assim como optimizar o desenvolvimento da reac o por interm dio do aumento do tempo de reac o O comprimento deste ltimo reactor era de 1 0 metros Com os componentes do sistema de fluxo assim definidos realizaram se ensaios de avalia o da influ ncia que a concentra o de cido sulf rico exercia no sinal anal tico em rela o amplitude do sinal originado por uma solu o 20 mg L de trimipramina por oxida o com monovanadato de am nio Para tal o caudal foi programado para 1 5 mL min e o tempo total de inser o de amostra foi fixado em 4 segundos o que correspondia a aproximadamente 100 uL de solu o de maleato de trimipramina introduzido no sistema Nas primeiras experi ncias a amostra foi introduzida como um volume nico entre dois segmentos de igual volume 100 uL de solu o de reagente tempo de inser o de 4 segundos cada para um caudal de 1 5 mL min originando deste modo duas zonas de interface de reac o A invers o de fluxo foi utilizada com o objectivo de incrementar a mistura amostra reagente nas zonas de interface porque com a aspira o da 4 1
121. alteradas entre valores pr ximos de zero e valores muito elevados Com fins de compara o e estabelecendo como prioridade um compromisso entre o ritmo de amostragem e sensibilidade os tempos de amostragem utilizados para realizar as determina es anal ticas foram de 6 e 12 s Os resultados confirmaram que para uma aplica o corrente uma escolha teria que ser feita um tempo de amostragem de 6 s aumenta o ritmo de amostragem 22 amostras h mas reduz o sinal anal tico entre 30 a 40 enquanto que com um tempo de amostragem de 12 s o sinal anal tico maximizado e deste modo a sensibilidade da determina o mas afecta acentuadamente o ritmo de amostragem em cerca de 18 o que equivale a aproximadamente 18 amostras h Deste modo e devido versatilidade de manipula o da etapa de amostragem nos sistemas autom ticos de fluxo por multicomuta o optou se por efectuar as determina es em amostras com os dois tempos de amostragem de 6 e 12 segundos Determina o espectrofotom trica de clomipramina 3 3 3 An lise de formula es farmac uticas A aplica o da metodologia em fluxo para a determina o de clomipramina em formula es farmac uticas obviamente inclui tamb m o estudo da influ ncia de alguns compostos utilizados normalmente como excipientes Solu es de amostra contendo uma quantidade fixa de clomipramina 20 ou 30 mg L e diferentes concentra es dos excipientes em an lise foram anal
122. am preparadas atrav s da selec o de uma toma rigorosamente pesada ap s a tritura o de 5 comprimidos correspondente a aproximadamente 100 mg de f rmaco A toma rigorosamente pesada foi dissolvida em 50 mL de cido ac tico anidro seguido de titula o potenciom trica em meio n o aquoso com solu o 0 1 M de cido percl rico A detec o do ponto final foi realizada por interm dio da observa o da varia o da diferen a de potencial entre dois el ctrodos em fun o da quantidade de solu o titulante adicionada 6 3 Resultados e discuss o No caso particular de um sistema de fluxo acoplado a um sistema de detec o por quimioluminesc ncia a optimiza o que envolve o ajuste de todos os par metros experimentais realizada para que o detector de luz capte o m ximo poss vel de radia o enquanto a zona de reac o atravessa a c lula de fluxo Por isso todos os par metros que influenciem a cin tica de fluxo e a cin tica da reac o qu mica devem ser ajustados de modo a gerar o m ximo de intensidade de emiss o de luz dentro da c lula Como j referido as reac es de quimioluminesc ncia requerem n veis baixos de dispers o de modo a possibilitar elevadas sensibilidades de detec o Deste modo e porque a caracter stica predominante o intervalo de tempo decorrente desde a mistura dos reagentes e amostra at produ o do m ximo de intensidade de luz a optimiza o deve ser central
123. amostragem A observa o dos resultados obtidos e representados na Figura 6 13 B indica que para todos os volumes de amostra cobre inseridos se verificou uma diminui o do sinal anal tico quando se diminu a o caudal Isto significa que utilizando a estrat gia de inser o por conflu ncia de zonas do fluxo de amostra cobre no fluxo de solu o de luminol per xido de hidrog nio ocorria um desenvolvimento muito r pido da reac o de quimioluminesc ncia imediatamente ap s a inser o de cobre amostra no ponto de conflu ncia X e portanto qualquer diminui o no caudal determinava que a reac o ocorresse nas imedia es da c lula de fluxo Adicionalmente deve ser considerado os efeitos de dilui o gerados pela introdu o simult nea de v rias solu es atrav s da conflu ncia de zonas Da que o sinal anal tico registado seja tamb m inferior quando comparado com os resultados obtidos pela inser o de volumes nicos O ensaio relativo ao estudo da influ ncia no sinal anal tico da estrat gia de inser o por amostragem bin ria do fluxo amostra cobre no fluxo de luminol per xido de hidrog nio foi realizado atrav s da activa o alternada das micro bombas pulsos de amostra cobre foram alternados com pulsos de luminol per xido de hidrog nio Os resultados obtidos est o representados na Figura 6 13 C 6 35 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida A utiliza o da estrat
124. amostragem ICP ICP AES a b entradas alternativas x y z pontos de conflu ncia C solu o de transportador S solu o de amostra Std solu es de padr es w dreno Adaptado de 49 Introdu o Geral Hara et al em 1993 50 desenvolveram um sistema de fluxo com detec o potenciom trica Figura 1 10 que denominaram de Analisador Potenciom trico de Alta Velocidade High Speed Potenciometric Analyser HSPA Esta montagem exibia tempos entre 1 2 e 1 3 segundos para a an lise individual de amostras de cloreto tendo como detector um el ctrodo selectivo ao i o cloreto Tais elevados rendimentos deveram se em grande parte aplica o de v lvulas solen ides de 3 vias e tamb m de 2 vias que possibilitaram a r pida comuta o do percurso anal tico e da solu o padr o e amostra sem paragem de funcionamento do sistema O Micro a computador Bomba Perist ltica Conversor sy AD Amostras Solu o alcalina C lula de fluxo Bomba Perist ltica Figura 1 10 Montagem do analisador potenciom trico de alto rendimento SV2 v lvulas solendides de 2 vias SV3 v lvulas solendides de 3 vias OFS solu o de enchimento exterior D dreno PIO placa de interface I O program vel IMB placa de interface e de mem ria Adaptado de 50 1 43 Introdu o Geral Em 1994 consolidou se a
125. amostragem com base no tempo o que permite a inser o reprodut vel de al quotas de amostra com diferentes volumes Deste modo permite a manipula o da dispers o em fun o dos volumes de solu es inseridos obtendo se diferentes valores de dilui o os quais podem ser adaptados concentra o da amostra excluindo a necessidade de efectuar modifica es na configura o da montagem de fluxo Assim estes sistemas permitem ampliar a gama de concentra es determin vel o que se revela vantajoso sempre que a an lise envolva amostras com grande variabilidade nas concentra es O recurso estrat gia amostragem bin ria para a inser o de solu es baseada na intercala o de pequenas al quotas de amostra e reagente possibilita uma mistura mais eficiente das solu es introduzidas no sistema de fluxo em virtude de uma mais r pida homogeneiza o da zona de reac o o que favorece o desenvolvimento da reac o Deste modo pode utilizar se reactores de menores dimens es na montagem anal tica o que adicionalmente resulta na redu o do efeito de dispers o A metodologia desenvolvida para a determina o de clomipramina em formula es farmac uticas demonstrou ser de facto uma metodologia simples r pida e facilmente automatizada que pode ser aplicada vantajosamente em an lises de rotina Ao contr rio da metodologia de refer ncia em que obrigatoriamente se dilui e filtra manualmente o recurso amostrage
126. aneamente como unidades propulsoras de l quidos de inser o de amostra e elementos comutadores simplificando muito a configura o e controlo dos sistemas de fluxo atrav s da redu o do n mero de elementos constituintes de um sistema e minimizando a complexidade do seu controlo ou tamb m a probabilidade de ocorr ncia de falhas de funcionamento As micro bombas podem debitar com reprodutibilidade distintos volumes de solu o com diferentes frequ ncias de actua o assegurando a obten o de fluxos com caudais m dios est veis No entanto nos sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o em vez de um fluxo laminar produzido um fluxo pulsado que pode ser visto como uma cadeia cont nua de segmentos muito pequenos sendo que cada um desses segmentos corresponde a um determinado volume de solu o resultante de cada activa o das micro bombas conferindo a estes sistemas caracter sticas hidrodin micas diferentes dos outros sistemas de fluxo Ao contr rio do t pico fluxo laminar associado com os sistemas de fluxo cont nuo cada pulso das micro bombas origina um movimento ca tico das solu es em todas as direc es dando origem a uma mistura amostra reagente muito r pida e melhorada com baixa dispers o axial o que consequentemente contribui para o desenvolvimento da reac o e um aumento da resposta anal tica O fluxo pulsado a caracter stica dominante dos sistemas baseados no conceito de multi impu
127. aos outros dispositivos de injec o em termos de procedimento de inser o de amostra e 1 31 Introdu o Geral reagentes o que pode ser facilmente alterado e ajustado com base num controlo temporizado Figura 1 3 Montagem multicomutada convencional V v lvula solen ide A amostra C solu o transportadora R reagente L reactor D detector B sistema de propuls o W dreno A amostragem bin ria Figura 1 4 consiste na intercala o de pequenas al quotas de amostra da ordem dos uL com pequenas al quotas de reagente definidas em fun o de um controlo temporizado de abertura e fecho da v lvula em combina o com um caudal de aspira o das solu es o que proporciona uma mais r pida homogeneiza o da zona de amostra e por isso um mais r pido desenvolvimento da reac o quando em compara o com sistemas que se baseiam unicamente na dispers o de grandes volumes de amostras e reagentes Contudo em multicomuta o continua a haver uma componente de difus o na mistura de solu es 1 32 Introdu o Geral Figura 1 4 Amostragem bin ria a amostra r reagente A v lvula solen ide e amostragem bin ria B intercala o de pequenos segmentos de amostra alternados com segmentos de reagente C mistura das duas solu es durante a fase de transporte D homogeneiza o da zona de amostr
128. ar A inser o de mais v lvulas solen ides no sistema de fluxo n o constitui Determina o espectrofotom trica de clomipramina qualquer aumento na dificuldade de controlo do sistema visto que como o controlo de activa o e de desactiva o das mesmas efectuado por computador atrav s de programas apenas necess rio efectuar a introdu o adicional dos dados para controlo das v lvulas adicionadas O sistema de detec o acoplado tamb m pode ser facilmente substitu do desde que o equipamento seja adaptado para determina es anal ticas em fluxo Determina o espectrofotom trica de clomipramina 3 5 Refer ncias bibliogr ficas 1 The Merck Index 13 Ed 2 The Pharmacological Basis of Therapeutics Goodman s amp Gilman s 10 Ed McGraw Hill 2001 3 http www mentalhealth com 4 J Godbillon S Gauron J Chromatogr 204 303 1981 5 P P Rop A Viala A Durand T Conquy J Chromatogr 338 171 1985 6 M P Segatti G Nisi F Grossi M Mangiarotti C Lucarelli J Chromatogr 536 319 1991 7 A M V Rodriguez M I Arranzpena J J L Ibor M G Aguilera R Vinas I Moreno A M V Morales J Pharm Biomed Anal 9 949 1991 8 K K Nielsen K Brosen Ther Drug Monit 15 122 1993 9 P Marescaux E Belan N Houdret N Goudemand M Lhermitte J Liq Chromatogr 17 2171 1994 10 S Joron H Robert Biomed Chromatogr 8 158 19
129. as sendo a selec o da via aberta determinada pela posi o de um mecanismo capaz de rodar 180 O controlo desta v lvula assim as v lvulas solen ides tamb m podia ser efectuado atrav s do programa inform tico de controlo desenvolvido Nas primeiras experi ncias a montagem de fluxo envolvia dois reactores Li e L2 mas ap s a optimiza o como ser discutido adiante o reactor L foi removido Um esquema da montagem anal tica contendo a representa o do reactor Lz encontra se na Figura 4 3 pagina 4 15 A bureta autom tica B estava sempre cheia com solu o 4 0 mol L de cido sulf rico utilizada como transportador e tamb m para definir a linha de base do registo anal tico O constante enchimento da bureta autom tica com solu o 4 0 mol L de cido sulf rico era assegurado pela execu o de uma etapa de aspira o para a bureta de solu o do cido referido entre cada determina o As solu es de amostra A ou de reagente R quando aspiradas para inser o no sistema nunca contactavam com a bureta autom tica atrav s da utiliza o de um reactor L suficientemente comprido para suportar volumes vari veis de amostra Considerando que o reactor tinha de comprimento 2 0 metros obt m se como volume interno do reactor o valor aproximado de 1 mL o que significa que se poderia aspirar at 1 mL de amostra e reagente no total Determina o espectrofotom trica de trimipramina
130. as micro bombas assim como o transporte da zona de reac o para detec o ou para outra fase anal tica tamb m facilmente control vel atrav s de instru es inseridas no computador No trabalho citado anteriormente 93 em que os elementos activos do sistema de fluxo desenvolvido foram micro bombas capazes de debitar volumes de pulso entre 3 e 25 uL os resultados obtidos demonstraram que o volume do pulso e a frequ ncia dos pulsos desempenham um papel decisivo no desenvolvimento da reac o afectando de igual modo o perfil do sinal anal tico O fluxo pulsado caracter stico dos sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o e o facto das micro bombas possu rem um controlo individualizado e serem respons veis pela distinta introdu o de amostra e reagentes no fluxo proporciona algumas vantagens nas determina es anal ticas nomeadamente quando se utiliza um sistema de detec o de quimioluminesc ncia por exemplo 1 84 Introdu o Geral A quimioluminesc ncia usualmente gerada por reac es muito r pidas e consequentemente este fen meno conv m que seja registado quando a reac o qu mica respons vel pela emiss o de luz iniciada em frente ao detector de luz mais concretamente na c lula de medi o implicando alguns requisitos quando se pretende implementar este sistema de detec o numa an lise em fluxo como por exemplo um controlo preciso sobre o processo de mis
131. asso um par metro anal tico muito importante porque afecta directamente o tempo do percurso e contacto no interior da montagem e consequentemente a amplitude do sinal anal tico e ritmo de amostragem A frequ ncia de passo foi controlada atrav s da altera o do tempo de repouso entre duas actua es consecutivas do motor de passo da bureta autom tica Para um determinado volume de passo o caudal aumentava conforme esse tempo de repouso diminu a No entanto devido s limita es operacionais das buretas o caudal mais elevado foi limitado a uma frequ ncia de passo de cerca de 10 passos por segundo ou tempo de repouso entre passos de 0 1 segundos sendo que acima deste valor o funcionamento da bureta autom tica se revelou irregular Considerando uma bureta equipada com seringas de capacidade de 10 5 ou 2 5 mL uma frequ ncia de passo da ordem de 10 s originou caudais de aproximadamente 2 4 1 2 e 0 6 mL min respectivamente Por outro lado e por 5 32 Determina o espectrofotom trica de isoniazida exemplo para a situa o de uma seringa de 2 5 mL tempos de repouso definidos para 0 25 0 5 0 75 e 1 segundos frequ ncias de passo de cerca de 4 2 1 3 e 1 por segundo traduziram se em caudais de 0 24 0 12 0 09 e 0 06 mL min respectivamente E importante referir que o par metro frequ ncia de passo foi avaliado apenas em termos de actua o de um nico passo por cada ordem de activa
132. at gia de inser o de volumes nicos processava se de 0 5 em 0 5 segundos enquanto que para a mostragem bin ria esses tempos sofriam incrementos de 1 segundo Na Figura 4 6 est o representados em esquema os tempos de inser o de amostra e reagente para cada estrat gia de inser o Volumes Unicos Amostragem Bin ria Figura 4 6 Representa o do esquema de inser o de amostra e reagente por volumes nicos e amostragem bin ria Os n meros correspondem ao tempo de inser o em segundos e os quadrados sombreados inser o da solu o de amostra 4 21 Determina o espectrofotom trica de trimipramina Cada linha representa os tempos de inser o de amostra e reagente e tamb m o esquema de inser o no sistema entre as duas estrat gias Assim cada linha simboliza os tempos totais de amostra e reagente inseridos Curiosamente e em oposi o an lise te rica descrita anteriormente os primeiros resultados demonstraram que a resposta anal tica obtida com amostragem bin ria era inferior obtida recorrendo estrat gia de inser o de volumes nicos embora a diferen a n o fosse significativa Figura 4 7 10 00 8 00 6 00 4 00 Amplitude de sinal cm 2 00 0 0 5 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 Tempo de amostragem s Figura 4 7 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes estrat gias de inser o da amostra no sistema anal tico Caudal 1 5 mL min React
133. atingiu a estabiliza o Estes resultados foram concordantes com os resultados obtidos nos ensaios preliminares Deste modo para os restantes ensaios utilizou se como oxidante uma solu o 6 0x 10 mol L de vanadato de am nio 8 00 E 6 00 8 E Oe 8 4 00 QU TG 2 a 200 0 00 0 2 4 6 8 10 Concentra o de oxidante 10 M Figura 3 8 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de vanadato de am nio Volume de amostra 100 pL Tempo de amostragem 6 segundos Caudal 1 0 mL min Reactor 1 0 metros Visando um estudo da varia o do sinal anal tico em fun o da concentra o de cido sulf rico entre 3 0 e 6 0 mol L revelou se um comportamento da resposta anal tica semelhante aos resultados obtidos nos ensaios preliminares em estado Determina o espectrofotom trica de clomipramina estacion rio representado na Figura 3 9 Neste ensaio efectuou se a an lise da solu o de clomipramina com dois tempos de amostragem diferentes 6 e 12 segundos embora a optimiza o dos tempos de amostragem volumes de amostragem tivesse sido efectuada posteriormente 12 00 8 00 q E D o TU o v 2 a 4 00 E lt 0 00 2 3 4 5 6 7 Concentra o do cido M Figura 3 9 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de cido sulf rico Volume de amostra 100 uL Tempo de amostragem 6 segundos Caudal 1 0 mL min Reactor L
134. ativo entre duas estrat gias de amostragem isto um estudo comparativo entre a amostragem bin ria e a inser o de volumes nicos de amostra Com a amostragem bin ria em vez de inserir a amostra como um volume nico volume esse posicionado entre segmentos de reagente o volume de amostra foi dividido em m ltiplas frac es de reduzido volume cada e eram intercaladas com m ltiplas frac es de reagente de igual volume Deste modo esta estrat gia criava n o duas mas m ltiplas interfaces de reac o que Determina o espectrofotom trica de trimipramina ee e aa e pe e ma afectavam positivamente a homogeneiza o e o desenvolvimento da reac o em diferentes perspectivas como ser explicado seguidamente pois essa estrat gia estava associada invers o do sentido de fluxo tamb m utilizada neste sistema de an lise 16 00 E 12 00 O T c B 8 00 3 2 lt 4 00 0 00 0 1 2 3 4 5 Concentra o de vanadato x 10 M Figura 4 5 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de monovanadato de am nio Volume de amostra 100 uL Tempo de amostragem 4 segundos Caudal 1 5 mL min Reactor L 2 0 metros L 1 0 metros Em primeiro lugar ao contr rio do que sucede em SIA a reac o teria in cio imediatamente ap s a inser o da primeira al quota de amostra introduzida por Determina o espectrofotom trica de trimipramina aspira
135. atureza e concentra o do cido utilizado As experi ncias preliminares descritas no Cap tulo 3 em rela o ao f rmaco clomipramina foram reproduzidas para o f rmaco maleato de trimipramina e demonstraram que o oxidante monovanadato de am nio era o mais apropriado agente de oxida o porque originava complexos est veis com elevada velocidade de reac o constituindo ainda um reagente de f cil obten o Ao mesmo tempo venficou se tamb m que a reac o era optimizada em meio cido e mais notoriamente com a utiliza o de cido sulf rico e que com a utiliza o de cido n trico ou cido clor drico para acidificar o meio a resposta anal tica obtida era 4 13 Determina o espectrofotom trica de trimipramina inferior Adicionalmente ainda se concluiu que esse efeito na resposta anal tica era dependente da concentra o de cido utilizada Para a implementa o desta reac o num sistema de fluxo multicomutado foi idealizado uma montagem anal tica envolvendo inicialmente dois reactores distintos Figura 4 3 Um dos reactores L colocado antes do ponto de conflu ncia X tinha como principal fun o a reten o da zona de amostra e reagente aspirados para o sistema e tinha um comprimento de 2 0 metros suficiente para prevenir que a zona de reac o alcan asse a seringa da bureta autom tica Adicionalmente e como ser demonstrado mais tarde esse reactor desempenhava adicion
136. ava a amostra para um fluxo transportador Concluiram os autores a partir dos resultados de ensaios de determina o do fosfato pelo m todo do azul de molibd nio que a v lvula solen ide apresentava um desempenho semelhante ao de uma v lvula rotativa convencional mas com um ritmo de amostragem superior embora com inferior reprodutibilidade A reprodutibilidade da etapa de amostragem nestas situa es depende da sincroniza o dos pulsos das bombas perist lticas com as comuta es das v lvulas solen ides 1 37 Introdu o Geral Transportador rizador gt 30 cm 0 5 mm d i w Figura 1 5 Injector de v lvula solen ide Solen ide desactivado O fechado solen ide activado O fechado Adaptado de 44 Em 1987 Malcolme Lawes et al 45 com o intuito de aumentar a versatilidade dos sistemas FIA propuseram a aplica o de v lvulas solen ides de 3 vias Figura 1 6 com uma constru o diferente da utilizada por Rothwell et al para o controlo da solu o transportadora e para promover a mistura de reagentes A propuls o das solu es foi efectuada por interm dio de um g s sobre press o e o accionamento das v lvulas dependia de um controlo temporizado Introdu o Geral Rv DC Figura 1 6 Estrutura das v lvulas solen ides Quando aplicada corrente o pist o reresentado a sombreado move se para a direita Adaptado de 45 No ano seguinte
137. ava um perfil de gradientes de concentra o id ntico da zona de amostra e deste modo as solu es em fluxo apresentavam ndices de refrac o equivalentes Com esta metodologia foi poss vel realizar a determina o espectrofotom trica de pindolol por complexa o com Ferro III com um ritmo de amostragem de 30 amostras por hora 1 64 Introdu o Geral Figura 1 31 Montagem de fluxo para a determina o de pindolol V a Vs v lvulas solen ides de 3 vias D detector P bureta autom tica R reactor S amostra C conflu ncia z canal de fluxo obstru do Adaptado de 72 A elevada versatilidade e dapacid de de controlo do fluxo conferida pela multicomuta o suscitou o interesse por alguns investigadores no sentido de acoplar a metodologia a outras t cnicas de detec o dado que as metodologias apresentadas anteriormente exploram essencialmente a detec o por espectrofotometria em UV VIS Sendo que concentra es em linha constituem factores limitadores do ritmo de amostragem o recurso multicomuta o permite ultrapassar tal facto O trabalho de Miranda et al 73 envolve fen menos de adsor o e elui o em linha atrav s de tr s colunas de troca i nica geridas por uma v lvula solen ide de quatro vias o que possibilitou um ritmo de 90 amostras por hora na determina o de c dmio n quel e chumbo por ICP AES Figura 1 32 1 65
138. azida com diferentes aldeidos como por exemplo o p dimetilaminobenzaldeido 13 e o benzalde do 14 Foram tamb m propostos como reagentes cromog nios a 1 2 naftoquinona 4 sulfonato que reage com o grupo hidrazida em meio alcalino formando um composto de cor laranja com um m ximo de absorv ncia a 480 nm 15 16 a 2 3 dicloro 1 4 naftoquinona que forma com a isoniazida um composto azul em meio alcalino 17 6 7 dicloroquinolina 5 8 diona que forma produtos de condensa o verdes em meio etan lico alcalino 18 e tamb m a 2 6 dimetoxi 1 4 benzoquinona 19 o 7 cloro 4 nitrobenzo 2 oxo 1 3 diazol 20 a 9 cloroacridina 21 Recentemente surgiu um trabalho publicado em que se explora a reactividade da isoniazida com 4 4 sulfonildianilina em meio com hidr xido de s dio 22 Alguns trabalhos exploram a forte absorv ncia da isoniazida na regi o do ultravioleta para a sua determina o 23 A absorv ncia entre 230 e 290 nm de misturas de isoniazida e rifampicina foi utilizada para determina o espectrofotom trica simult nea destes compostos 24 5 5 Determina o espectrofotom trica de isoniazida eme a eee eee ras Embora a isoniazida n o apresente originalmente fluoresc ncia foram tamb m propostas para a sua determina o metodologias fluorim tricas Em 1971 Bartos 25 prop s a abertura do anel pirid nico do cido nicot nico com brometo de cianog nio com forma o de um derivado do
139. azinamida 6 5 Refer ncias bibliogr ficas aon OA Q 10 11 12 13 14 15 16 17 The Pharmacological Basis of Therapeutics Goodman s amp Gilman s 10 Ed 2001 McGraw Hill The Index Merck Thirteenth Edition 5204 2001 V Chorine Comp Rend Acad Sci 220 150 1945 D McKenzie I Malone S Kushner J J Oleson Y Subbarow J Lab Clin Med 33 1249 1948 H Fox Science 116 129 1952 N Rist F Grumbach D Libermann Am Rev Tuberc 79 1 1959 W McDermott R Tompsett Am Rev Tuberc 70 748 1954 K Konno M Feldman W McDermott Am Rev Respir Dis 95 461 1967 Y Zhang A Scorpio H Nikaido H Sun J Bacteriol 181 2044 1999 Y Zhang S Permar H Sun J Med Microbiol 51 42 2002 A Scorpio Y Zhang Nature Med 2 662 1996 Y Zhang D Mitchison Int J Tuberc Lung Dis 7 6 2003 A Brouard H Barreteau H Merdjan M Paillet G Fredj M Micoud J Chromatr 345 453 1985 K Chan C L Wong S Lok J Chromatr 380 367 1986 T Yamamoto Y Moriwaki S Takahashi T Hada K Higashino J Chromatr Biomed 413 342 1987 S Husain P N Sarma S M Sajjad R Narsimha M Subrahmanyam J Chromatr 513 83 1990 C Altomare A Carotti S Cellamare G Leogrande D Devito Farmaco 45 1229 1990 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida m D DD o 18 19 20 21 22 23 24 2
140. azinamida era um an logo sint tico da nicotinamida que se mostrou mais activo num estudo da tuberculose efectuada em roedores importante referir que os estudos dos an logos da nicotinamida conduziram descoberta de outros potentes f rmacos para o tratamento da tuberculose nomeadamente a isoniazida 5 e a etionamida 6 Posteriormente a descoberta da efic cia da pirazinamida no tratamento da tuberculose originou estudos mais espec ficos das suas propriedades nos laborat rios Walsh McDermott na Universidade de Cornell Na procura das condi es de actua o eficaz da pirazinamida descobriu se que o f rmaco activo contra a bact ria Mycobacterium tuberculosis apenas em meio com pH cido aproximadamente 5 5 7 situa o que pode ocorrer durante a inflama o activa devido produ o de cido l ctico pelas c lulas inflamat rias O mesmo grupo de investiga o tamb m demonstrou pela primeira vez que a pirazinamida um pr f rmaco cuja actividade depende da sua convers o a cido pirazin ico por uma enzima da bact ria infecciosa 8 Estudos recentes 9 11 apontam para que o mecanismo de actua o da pirazinamida por entrada do f rmaco na bact ria causadora da tuberculose atrav s de um processo de difus o passiva onde convertida a cido pirazin ico pela enzima pirazinamidase e o produto excretado por difus o passiva Se o pH extracelular cido pH 5 5 o cido pirazin ico na
141. ba perist ltica para fornecimento desses dois canais e a utiliza o de dois dispositivos de impuls o por pulsos com d bitos entre 0 01 e 5 0 mL Similarmente esses dispositivos solen ides de impuls o foram usados para a determina o de alguns par metros de interesse ambiental num sistema de injec o em fluxo em 1996 por Weeks et al 99 A influ ncia do fluxo pulsado em sistemas de micro fluxo foi avaliada em 1999 por Linden et al 100 atrav s de um comparativo com fluxo cont nuo e fluxo com paragem Verificou se que a partir de uma frequ ncia de Hz para um fluxo pulsado n o havia diferen as na dispers o da amostra em rela o ao fluxo cont nuo O trabalho de revis o de Karlberg et al 101 em 2002 sobre o uso do fluxo pulsado na an lise em fluxo tamb m referenciou os trabalhos que envolveram o uso de micro bombas para impuls o de solu es em micro canais gravados num bloco de pl stico ou em tubos capilares onde ocorressem processos extractivos 102 106 O aproveitamento do fluxo pulsado para a detec o quimioluminom trica tamb m foi salientado 107 109 Em 2002 Santos et al 93 propuseram uma nova estrat gia para a an lise em fluxo que envolveu a utiliza o de m ltiplas micro bombas Figura 1 47 O trabalho explorou a selec o de diferentes volumes de amostra estrat gias de amostragem caudais e manuseamento da zona de reac o atrav s do controlo preciso de cada pulso de cada bomba
142. bombas R e R reagentes S amostra C transportador B e B reactores D detector W dreno x y conflu ncias Adaptado de 115 Santos et al 116 em 2005 exploraram o fluxo pulsado para a determina o quimioluminom trica de metformina em formula es farmac uticas Figura 1 53 O fluxo pulsado assegurou uma eficiente mistura amostra reagente e uma mais r pida e eficiente homogeneiza o da zona de reac o e consequentemente possibilitou a obten o de um sinal anal tico melhor Este trabalho possibilitou efectuar 95 determina es por hora Ainda em 2005 Santos et al 117 realizaram um trabalho de an lise em fluxo por multi impuls o para a determina o de ambroxol em formula es farmac uticas atrav s de um m todo espectrofotom trico por reac o com p dimetilaminobenzaldeido Figura 1 54 O ritmo de amostragem obtido foi de 60 determina es por hora 1 91 Introdu o Geral Figura 1 53 Montagem de fluxo de multi impuls o para a determina o de metformina P a P4 micro bombas R a R4 reagentes L reactor D detector W dreno x y conflu ncias Adaptado de 116 Figura 1 54 Montagem de fluxo de multi impuis o para a determina o de ambroxol P a P micro bombas R reagente S amostra C transportador L reactor D detector W dreno x conflu ncia Adaptado de 117
143. c es de desenvolvimento de cor 35 36 Metodologias envolvendo an lises multivariadas com detec o na regi o do ultravioleta foram igualmente utilizadas para a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas 37 39 Contudo a determina o da pirazinamida em formula es farmac uticas atrav s de uma metodologia em fluxo nunca foi efectuada A an lise em fluxo revelou se como uma t cnica de an lise qu mica que se adapta constantemente aos avan os tecnol gicos fornecendo diferentes alternativas automatizadas mais simples r pidas e miniaturizadas para efectuar determina es qu micas De igual modo a automatiza o dos processos anal ticos para o controlo das prepara es farmac uticas cada vez mais uma prioridade cujos objectivos envolvem por exemplo o aumento dos ritmos de amostragem uma elevada versatilidade nas determina es que um sistema efectua e a maximiza o do desempenho do equipamento anal tico tanto em qualidade dos resultados como em custos de opera o Neste contexto a an lise em fluxo com multi impuls o uma alternativa para a automatiza o dos processos de controlo farmac utico em medicamentos A multi impuls o uma metodologia de an lise em fluxo proposta recentemente que combina a versatilidade e facilidade de controlo conferidas pela automatiza o com o elevado controlo na manipula o das solu es no interior das montagens anal ticas e tamb m com as
144. caracter sticas de fluxo pulsado que assegura uma r pida homogeneiza o da zona de reac o De facto o fluxo pulsado torna a metodologia de multi impuls o numa ferramenta muito atractiva para a implementa o de medi es por quimioluminesc ncia porque este m todo de detec o normalmente gerado por reac es muito r pidas e em que os fen menos de emiss o de luz podem ser detectados unicamente quando a reac o qu mica iniciada numa zona muito pr xima do detector de luz implicando deste 6 5 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida modo a necessidade de uma mistura amostra e reagente muito r pida e eficiente e que ocorra preferencialmente dentro da c lula de medida A emiss o de luz com origem numa reac o de quimioluminesc ncia normalmente iniciada logo que os reagentes se misturem Portanto a intensidade de emiss o de luz dependente do tempo de desenvolvimento de reac o conforme ocorre a forma o dos intermedi rios excitados ou produtos da reac o Numa an lise em fluxo devido elevada velocidade com que pode ocorrer a emiss o de luz derivada de uma reac o de quimioluminesc ncia quando registado o m ximo de intensidade de emiss o de luz correspondente altura m xima do sinal anal tico a reac o de quimioluminesc ncia pode n o estar completa nem muito provavelmente se completou a mistura das solu es envolvidas Neste sentido importan
145. cin ticas de reac o Figura 1 15 A montagem de fluxo envolveu cinco v lvulas solen ides e as solu es de amostra e reagente eram impulsionadas e n o aspiradas atrav s de uma bomba perist ltica Introdu o Geral A fase de amostragem era temporizada e ficou demonstrado no trabalho a simplicidade e precis o do controlo temporizado das v lvulas solen ides Figura 1 15 Montagem de fluxo para a determina o de cobre e zinco V a Vs v lvulas solen ides de 3 vias B a B reactores R a R reagentes S amostra C transportador D detector W dreno W recolha de res duos para tratamento a b x y z t conflu ncias linhas a tracejado caminhos de fluxo alternativos das v lvulas Adaptado de 53 Tamb m em 1996 produzido um trabalho de multicomuta o por Kronka et al 54 que consistiu essencialmente numa aplica o pr tica de conceitos inerentes a multicomuta o amostragem bin ria e versatilidade no controlo independente das solu es intervenientes A montagem de fluxo Figura 1 16 aplicada na determina o sequencial de am nio e fosfato em digestos de plantas era constitu da por seis v lvulas solen ides de 3 vias com uma distribui o em estrela e com dois pontos de conflu ncia 1 49 Introdu o Geral Figura 1 16 Montagem de fluxo para a determina o de am nia e fosfatos V a V
146. cipientes Um composto foi considerado como n o interferente se a varia o de sinal anal tico era 3 quando comparado com o sinal anal tico obtido com a aus ncia do composto referido Os resultados demonstraram que os excipientes glucose sucrose galactose lactose benzoato de s dio e estearato de magn sio n o interferiram at concentra es correspondentes a 100 vezes a raz o molar em rela o trimipramina Ap s a optimiza o do sistema utilizando um caudal de 1 5 mL min e 11 ciclos de 1 segundo amostra 0 25 segundos de solu o 8 9 x 10 mol L de Determina o espectrofotom trica de trimipramina monovanadato de am nio foram obtidos intervalos de concentra es de resposta linear para concentra es de trimipramina entre 1 0 e 18 0 mg L F igura 4 13 A curva anal tica era representada por A 0 7888C 0 6976 com um coeficiente de correla o R correspondente a 0 998 Na equa o da resposta linear A era a altura de sinal anal tico expressa em cm e C era a concentra o de trimipramina expressa em mg L 16 00 12 00 8 00 Amplitude de sinal cm 4 00 0 00 0 3 6 9 12 15 18 21 Concentra o dos padr es mg L Figura 4 13 Curvas de calibra o obtida com solu es padr o de trimipramina com concentra es de 1 at 18 mg L Determina o espectrofotom trica de trimipramina A metodologia anal tica desenvolvida foi aplica
147. colocada Junto ao sensor de luz Figura 6 3 A c lula de fluxo esquematizada colocada junto superf cie de detec o do fotomultiplicador possibilita maximizar a intensidade de luz captada O volume interno da c lula de medi o influencia os tempos de passagem e de resid ncia das solu es no seu interior al m da influ ncia que exerce na mistura das solu es e por isso este par metro deve ser alvo de algumas considera es A aplica o de um sistema de an lise em fluxo baseado no conceito de multi impuls o pode permitir compatibilizar vantagens com a utiliza o de uma c lula de fluxo de baixo volume porque possibilita uma melhor optimiza o do sinal anal tico registado 45 com baixa dispers o devido ao mais eficiente processo de mistura das solu es no interior dos tubos de fluxo em virtude do caracter stico fluxo pulsado que origina um movimento ca tico das solu es durante o transporte para o sistema de detec o como j foi referido anteriormente Deste facto resulta uma menor necessidade da presen a de reactores ou a sua exist ncia com pequenas dimens es na montagem anal tica o 6 9 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida que possibilita a introdu o quase directa das solu es na c lula de fluxo e a sua mistura quase instant nea tamb m na c lula de fluxo Figura 6 3 Esquema da c lula de fluxo Sendo assim com a utiliza o do conc
148. cos autom ticos ou automatizados cujo desenvolvimento contribui para minimizar a interven o humana Na actualidade em campos t o diversos como processos qu micos industriais meio ambiente ou biotecnologia existe uma procura crescente de dados qu micos que idealmente devem ser obtidos em tempo real Tal exig ncia provocou uma acelera o na investiga o e desenvolvimento de m todos autom ticos de an lise de onde resultou o aparecimento de diferentes metodologias e estrat gias para a 1 16 Introdu o Geral execu o de processos anal ticos Consequentemente surgiram diferentes classifica es das metodologias autom ticas sendo pouco consensuais Neste trabalho adoptou se a classifica o proposta por Valc rcel e Luque de Castro 25 Nesta classifica o os m todos autom ticos dividem se fundamentalmente em 3 grupos em fun o do tipo de processamento de amostra m todos descont nuos rob ticos e cont nuos De seguida apresenta se de uma forma resumida o que caracteriza cada uma destas categorias i Os m todos descont nuos dizem respeito a sistemas manuais que foram mecanizados isto sistemas em que existe um mecanismo respons vel pelo transporte dos recipientes com a amostra e introdu o dos reagentes e portanto todas as etapas que constituem o processo anal tico De salientar que cada amostra mantida em recipientes separados onde se realizam os diversos processos a
149. ctid o Em todos os casos 3XS recorreu se seguinte express o de c lculo LD 5 Nesta equa o a express o Syx representa o desvio padr o dos valores de y numa regress o linear calculado por eae b representa o declive da recta de regress o linear n obtida numa calibra o Parte Experimental 2 8 Refer ncias bibliogr ficas l Farmacopeia Portuguesa VII Ed Oficial Lisboa 1342 2002 2 S Alegret J Alonso J Bartrol A A S C Machado J L F C Lima J M Paulis Qu m Anal 6 278 1987 3 Lapa R A S Lima J L F C Reis B F Santos J L M Zagatto E A G Anal Chim Acta 351 223 1997 4 European Pharmacopoeia Council of Europe Strasbourg Fourth Ed 2078 2002 5 Miller J N Miller J C Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry 4 ed Prentice Hall Great Britain 2000 2 19 CAP TULO 3 DETERMINA O ESPECTROFOTOM TRICA DE CLOMIPRAMINA NUM SISTEMA DE FLUXO MULTICOMUTADO A clomipramina um f rmaco utilizado no tratamento dos estados de perturba o obssessivo compulsivos e em depress es Neste cap tulo refere se um procedimento anal tico para a determina o de clomipramina em formula es farmac uticas baseado num sistema de fluxo multicomutado Para a determina o utilizou se um m todo baseado na oxida o da clomipramina por monovanadato de am nio em meio cido cujo produto da reac
150. ctor para maior desenvolvimento da reac o enquanto que outra zona de amostra era processada para a determina o de nitritos e nitratos Deste modo foi conseguido um ritmo de amostragem de 60 h com um tempo de resid ncia de 120 segundos para a am nia o que era suficiente para atingir 95 de convers o 1 73 Introdu o Geral Figura 1 41 Montagem de fluxo para a determina o de nitritos e nitratos V a Vg v lvulas solendides de 3 vias S amostra R a R reagentes C transportador B a B reactores Cp coluna DET detector W dreno h diferen a de altura Adaptado de 82 Outro trabalho equivalente realizado em 2001 83 em que inserido sequencialmente diversos reagentes cromog neos no fluxo de amostra que se comportava como transportador Este sistema Figura 1 42 possibilitava ainda uma etapa de pr concentra o em linha em simult neo com determina es directas atrav s da coloca o de mini colunas com resina de troca ani nica num canal alternativo 1 74 Introdu o Geral Figura 1 42 Montagem de fluxo para a determina o de ani es S amostra Bs solu o tamp o E eluente Ri reagentes Cp e Cp colunas V a Vg v lvulas solen ides de 3 vias B e B reactores D detector W dreno Adaptado de 83 1 3 1 4 Multiseringa Recentemente surgiu uma metodologi
151. da determina o de trimipramina em formula es farmac uticas Os resultados obtidos foram utilizados para avaliar o sistema atrav s da sua compara o com os resultados da determina o da trimipramina pelo m todo de refer ncia Foram obtidos desvios relativos em percentagem entre 0 26 e 2 37 O desvio padr o relativo foi inferior a 1 69 n 10 A Tabela 4 1 resume os resultados obtidos O ritmo de amostragem foi de aproximadamente 48 amostras por hora O sistema anal tico demonstrou um funcionamento est vel sem desvios na linha de base ao longo do tempo Tabela 4 1 Resultados obtidos para a determina o de clomipramina em prepara es farmac uticas Concentra o encontrada Concentra o Lote mg formula o DR Amostra declarada ee analisado Yo E Metodologia M todo de mg formula o desenvolvida Refer ncia z rer A 24 55 0 17 24 61 0 26 urmonti comprimidos 25 B 24 65 0 21 24 56 0 35 C 25 19 0 27 25 15 0 14 Surmontil 100 100 A 99 52 1 68 98 27 1 27 comprimidos B 101 92 1 04 99 56 2 37 Desvio relativo para a metodologia desenvolvida em rela o ao procedimento de refer ncia P M dia desvio padr o Determina o espectrofotom trica de trimipramina 4 4 Conclus es Os resultados obtidos demonstraram que a reac o da trimipramina com monovanadato de am nio constitui um procedimento alternativo para a determina o da trimipramina em
152. da pela optimiza o do sistema em fun o da amplitude do sinal 4 2 4 M todo de refer ncia O m todo de refer ncia foi realizado conforme o recomendado na Farmacopeia Europeia 30 e envolvia a dissolu o de 0 3500 g de maleato de trimipramina subst ncia pura em 50 mL de cido ac tico anidro seguido de titula o Determina o espectrofotom trica de trimipramina potenciom trica em meio n o aquoso com solu o 0 1 M de cido percl rico e sendo a detec o do ponto final realizada atrav s do registo da varia o da diferen a de potencial entre dois el ctrodos em fun o da quantidade de solu o titulante adicionada Para a determina o do f rmaco em formula es farmac uticas s lidas seguiu se o mesmo procedimento atrav s da pesagem de uma toma de pulverizado das formula es s lidas que contivesse aproximadamente a quantidade de 0 3500 g de maleato de trimipramina sendo feita a estimativa com base na dosagem declarada nas formula es farmac uticas comerciais 4 3 Resultados e discuss o Resultados referidos na literatura 37 revelam que o f rmaco maleato de trimipramina dado ser um antidepressivo tric clico reage com fortes oxidantes em meio cido dando origem a produtos de cor azul com m ximo de absorv ncia a 620 nm Os produtos de oxida o apresentam diferentes estabilidades e velocidades de forma o consoante o agente de oxida o utilizado e a n
153. das estas caracter sticas s o reunidas obtido com a utiliza o de buretas autom ticas um sistema anal tico de fluxo totalmente automatizado e em que cada al quota inserida de cada solu o envolvida controlada em termos de n mero volume e frequ ncia de pulso O facto de as seringas colocadas nas buretas serem suscept veis de f cil substitui o possibilita a utiliza o de distintos volumes de passo providenciando os meios para um excelente controlo do processo de mistura entre as solu es de amostra e reagente A explora o dos volumes na ordem dos microlitros tamb m uma perspectiva muito interessante que pode ser facilmente implementada atrav s da utiliza o de seringas de inferior capacidade conjuntamente com tubos de reduzido di metro interno e c lulas de fluxo de baixo volume interno levando deste modo a uma redu o do consumo de amostra e reagentes O sistema de fluxo apresentado que explora o conceito de fluxo pulsado pode constituir uma alternativa para a miniaturiza o dos sistemas de fluxo cont nuo Esta suposi o suportada por duas evid ncias importantes o uso de um inferior n mero de componentes para realizar o mesmo n mero de tarefas com semelhante desempenho anal tico e a redu o no consumo de solu es A metodologia desenvolvida quando comparada com o actual m todo de refer ncia da Farmacopeia Portuguesa demonstra claramente as vantagens em 5 4 Determina
154. das mat rias primas e continuando ao longo da produ o opera es de embalagem testes do produto acabado documenta o e distribui o e controlo qu mico at ao uso cl nico A Introdu o Geral informa o obtida com as t cnicas anal ticas o suporte de importantes decis es tomadas durante todas as fases que um medicamento tem de passar at ser comercializado Neste sentido estabelecem se genericamente especifica es e padr es para as v rias formula es farmac uticas As especifica es s o concebidas com o objectivo primordial de assegurar o uso de materiais e de processos de manufactura adequados enquanto que os padr es surgem como resultado da variabilidade de um determinado processo de fabrico da estabilidade de um produto e das limita es dos m todos usados nos testes de verifica o Os procedimentos envolvidos na concretiza o destes objectivos dependem n o apenas da forma farmac utica em quest o mas tamb m de uma mistura complexa de factores que incluem a natureza e propriedades da subst ncia activa a dosagem e via de administra o os excipientes usados na manufactura do produto e a estabilidade em condi es normais de armazenamento 15 Antes de qualquer demonstra o directa das especifica es de efic cia terap utica e de seguran a dos doentes atrav s de ensaios cl nicos importa garantir que os medicamentos cumpriram todas as especifica es de qualida
155. dato de am nio prevenindo deste modo a ocorr ncia de efeitos de Schlieren 38 Os efeitos de Schlieren manifestam se quando existem gradientes de ndice de refrac o na zona de reac o devido a diferen as nos ndices de refrac o entre a solu o de amostra e de reagente e ou transportador Essas diferen as afectam a propaga o do feixe de radia o incidente provocando o aparecimento de perturba es no sinal anal tico e podendo assim comprometer seriamente a precis o exactid o e limite de detec o da metodologia Neste trabalho a diferen a de densidade e viscosidade entre a gua e cido sulf rico afectaria a dispers o da amostra caso esta fosse solubilizada em gua no reagente e transportador originando a forma o de gradientes de concentra o e portanto o aparecimento de efeitos decorrentes de diferen as de ndices de refrac o Os resultados obtidos para a avalia o da influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de cido sulf rico est o representados na Figura 4 4 Os valores apresentados na Figura 4 4 demonstram que utilizando concentra es entre 1 0 e 3 0 mol L de solu es de cido sulf rico n o se registava sinal anal tico isto para as condi es definidas de configura o do sistema de fluxo e concentra es das solu es envolvidas n o ocorria detec o do maleato de trimipramina No entanto entre as concentra es de 3 0 e 5 0 mol L de solu o de
156. de Assim a garantia de qualidade viabilizada por essas especifica es poder encurtar o tempo de aprova o de novos f rmacos evitar que problemas de qualidade deturpem resultados cl nicos e ainda diminuir os custos globais do processo de produ o Significa que para al m dos testes farmacol gicos e toxicol gicos indispens veis para a avalia o da efic cia e seguran a dos medicamentos a ind stria farmac utica recorre a testes laboratoriais de car cter qu mico f sico e f sico qu mico para avaliar o cumprimento das especifica es de qualidade Portanto m todos anal ticos altamente espec ficos sens veis e confi veis desempenham um papel preponderante em todos os aspectos do controlo de qualidade quer seja na avalia o das especifica es das mat rias primas e Introdu o Geral excipientes do controlo em processo ou das especifica es do produto acabado 11 A avalia o da seguran a e da efic cia das formula es farmac uticas encontra se por isso dependente da exist ncia de m todos adequados para o controlo da qualidade do produto Os estudos de formula o t m como objectivo elaborar uma formula o ideal para que se possa iniciar a produ o das formas farmac uticas em grande escala Para garantir que os produtos finais possuem a identidade pureza pot ncia qualidade e uniformidade pretendidas os procedimentos de produ o devem ser rigorosamente seguidos A p
157. de um artigo cient fico em 2002 38 e que posteriormente sua publica o surgiu uma outra publica o referente determina o de clomipramina em formula es farmac uticas recorrendo tamb m multicomuta o mas neste caso acoplado a detec o por quimioluminesc ncia Nesse trabalho Marques et al 39 explorou um efeito potenciador da clomipramina na reac o de quimioluminesc ncia de oxida o do sulfito por c rio IV em meio acidulado com cido sulf rico 3 2 Parte Experimental 3 2 1 Reagentes Diariamente preparou se uma solu o de clomipramina 500 mg L por dissolu o de 25 mg em 50 mL de cido sulf rico 5 0 mol L Esta solu o foi conservada no frigor fico excepto nas situa es da sua utiliza o para a prepara o de solu es padr o Os padr es para an lise foram preparados atrav s de dilui es da solu o mais concentrada preparada igualmente com solu o de cido sulf rico 5 mol L A solu o de monovanadato de am nio com concentra o 0 1 mol L foi preparada atrav s da dissolu o de 0 585 g do s lido em solu o 5 0 mol L de cido sulf rico e completando o volume para 50 ml com o mesmo cido As solu es das formula es farmac uticas comercialmente dispon veis comprimidos de Anafranil 10 e 25 mg comprimidos de liberta o prolongada de Anafranil 75 mg e inject veis de Anafranil 25 mg 2 mL para an lise pela metodologia desenvolvida foram pr
158. de 3 vias R reactor L al a de amostragem x e y conflu ncias C C2 La reagentes S amostra W dreno Adaptado de 68 Transportador Figura 1 28 Montagem de fluxo C transportador CSV v lvula solen ide do transportador S amostra SSV v lvula solen ide da amostra PP bomba perist ltica D detector W dreno Adaptado de 69 1 62 Introdu o Geral Ainda no mesmo ano Rocha et al 70 utilizam o conceito de multicomuta o para desenvolverem um sistema de fluxo autom tico com o intuito de incrementarem a zona de resposta linear com aplica o na determina o de c lcio por espectrofotometria A montagem anal tica Figura 1 29 englobava seis v lvulas solen ides para permitirem a implementa o de diferentes condi es de processamento de amostras o que resultava em diferentes graus de dispers o sem qualquer modifica o f sica na estrutura da montagem Neste trabalho obtiveram se coeficientes de dispers o entre 2 15 e 754 atrav s de uma redu o do volume de amostra em combina o com a altera o do comprimento do percurso anal tico ou em alternativa pela aplica o de uma divis o de zonas As v lvulas solen ides permitiam a selec o de dois percursos anal ticos para realizar a amostragem temporizada de zonas ou a divis o de fluxo realizando se deste modo a dilui o da amostra previamente adi o dos reagentes
159. de amostra em combina o com a estrat gia de amostragem bin ria para inser o das solu es de amostra Com a configura o da montagem anal tica descrita anteriormente obteve se resposta linear para o intervalo de concentra es de isoniazida de 2 0 ug mL a 18 0 ug mL A curva anal tica Figura 5 18 foi representada por A 0 2933C 0 1014 em que A era a altura de pico em cm e C era a concentra o de isoniazida expressa em ug mL com um coeficiente de correla o de 0 9980 Para 10 determina es consecutivas o desvio padr o relativo foi inferior a 1 48 A qualidade dos resultados fornecidos pelo sistema de fluxo foi avaliada na determina o de isoniazida em formula es farmac uticas dispon veis para distribui o hospitalar Isoniazida 300 Para uma quantidade declarada de 300 mg de isoniazida por comprimido o resultado obtido ap s an lise foi de 295 4 4 mg revelando um desvio relativo em percentagem de 0 68 relativamente ao procedimento de refer ncia A determina o de isoniazida em outras formula es mas contendo a subst ncia rifampicina n o foi poss vel porque a dissolu o deste f rmaco produziu uma solu o de colora o alaranjada interferindo deste modo na detec o no comprimento de onda 475 nm No entanto com os excipientes normalmente utilizados para produzir as formula es farmac uticas comprimidos n o se observou interfer ncia para a determina o de isoniazida
160. de amostra sendo que para valores superiores o aumento da resposta anal tica aumentava ligeiramente Deste modo seleccionou se 1 segundo como tempo de segmento de amostra para inser o atrav s da amostragem bin ria Adicionalmente a reprodutibilidade alcan ada com um tempo de intercala o de 1 segundo era superior obtida com tempos inferiores devido provavelmente s caracter sticas l gicas do programa de controlo A menor reprodutibilidade na execu o dos tempos pelo computador podia dever se a dificuldades de processamento na contagem de tempo realizada pelo microprocessador sendo que uma poss vel solu o implicaria altera es a n vel do programa de controlo desenvolvido de modo a realizar ciclos de contagem com base nos ciclos de rel gio executados pelo microprocessador Com a configura o da montagem de fluxo assim definida foi reavaliada a influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de solu o de cido sulf rico 4 0 e 5 0 mol L Paralelamente e para cada concentra o de cido utilizou se duas diferentes estrat gias de inser o de amostra recorrendo amostragem bin ria e inser o de volumes cont nuos de amostra Para realizar o ensaio recorrendo estrat gia de amostragem bin ria aumentava se gradualmente o n mero de ciclos de intercala o de 1 segundo de solu o 20 mg L de trimipramina seguido de 0 25 segundos de solu o 8 9 x 10 mol L de monovanadato de am n
161. de maior simplicidade na programa o para controlo do sistema embora actualmente se recorra com mais frequ ncia situa o em que se utiliza uma v lvula solen ide para comuta o entre duas solu es Verificou se ent o que a comuta o das v lvulas numa frequ ncia elevada isto com tempos de comuta o muito curtos possibilitava a obten o de uma mistura homog nea de duas solu es constitu da por muito pequenas al quotas sendo o volume destas no entanto dependentes do caudal utilizado Esta zona de amostra pode deste modo ser vista como um grupo de por es adjacentes de solu es que sofrem um processo r pido de mistura enquanto s o deslocadas pelo canal anal tico Para um volume total e constante de amostra e reagente o grau de mistura ampliado pelo decr scimo dos volumes das al quotas e pelo aumento do n mero dessas por es A inser o de n pares de al quotas de amostra e reagente significa que existem 2n 1 interfaces nas quais a mistura ocorre por dispers o axial Por contraste a muitos sistemas de fluxo os processos de interac o entre amostra e reagente nas interfaces tem in cio j na fase de amostragem provocando um aumento do tempo de resid ncia m dio sem que seja afectado o ritmo de amostragem Este trabalho deu in cio a uma s rie de publica es com o intuito de explorar desenvolver e projectar o conceito de multicomuta o na rea da an lise em fluxo Martelli et al 51
162. de solu es para diminuir o intervalo de tempo gasto nesta fase e portanto de modo a aumentar o ritmo de amostragem Visto que as solu es de amostra foram obtidas por dissolu o das formula es farmac uticas sem outro tratamento e tendo em considera o que muitos dos excipientes eram muito pouco sol veis em gua bidesionizada realizava se um processo de filtra o em linha isto submetia se as solu es de amostra a um processo de filtra o antes da sua inser o no sistema atrav s da coloca o de um filtro Figura 3 2 F antes de Vi adaptado para filtra es em fluxo Este filtro da marca Schleicher amp Schuell era constitu do pelos componentes a seguir esquematizados na Figura 3 3 Considerando a estrutura e dimens es interiores do filtro era de considerar a exist ncia de um volume interno que poderia influenciar a fase de amostragem e o ritmo de amostragem Em rela o fase de amostragem o facto de o sistema possuir um equipamento de propuls o robusto como a bureta autom tica capaz de proporcionar um caudal constante e tamb m devido ao controlo autom tico das 3 10 Determina o espectrofotom trica de clomipramina v lvulas solen ides que permitiam ou impossibilitavam eficazmente o acesso ao canal de amostragem o volume interno do filtro n o afectava esta fase Figura 3 3 Figura e esquema do filtro Schleicher amp Schuell FM 013 0 Adaptado de Filtrat
163. diversos trabalhos para a determina o de antidepressivos envolvendo nomeadamente m todos voltam tricos 21 23 Em 1999 foi publicado um trabalho para a determina o de diversos antidepressivos tric clicos de entre os quais a trimipramina com detec o por quimioluminesc ncia electrogerada atrav s da reac o dos grupos amina terci rios com tris 2 2 bipiridil rut nio II 24 A utiliza o da espectrofluorimetria para determina o de trimipramina e tamb m seus metabolitos desmetilados em plasma humano foi proposta em 1978 por McKim et al 25 Determina o espectrofotom trica de trimipramina Em 1986 proposto um trabalho que envolve medidas condutim tricas por Nikolic et al 26 para a determina o de maleato de tramipramina em formula es farmac uticas por titula o com cido silicotungstico e fosfotungstico Os m todos colorim tricos com detec o na regi o do vis vel tamb m foram utilizados para a determina o de antidepressivos Destaca se em 1998 27 a determina o da trimipramina por reac o com sulfato de c rio IV e iodato de pot ssio e determina o da absorv ncia dos produtos de reac o a 620 e a 670 nm respectivamente Em 2000 foi proposto um m todo para a determina o de trimipramina 28 baseado na interac o de dihidrocloreto de p fenilenediamina diazotizada com antidepressivos em meio cido com detec o no comprimento de o
164. dministra o de pirazinamida foram artralgias anorexia n useas e v mitos dis ria desconforto indisposi o e febre A utiliza o cada vez mais frequente da pirazinamida como droga de tratamento da tuberculose a n vel mundial assim como o aumento do n mero de trabalhos de investiga o cient fica das suas propriedades terap uticas impulsionou o desenvolvimento de diversas metodologias anal ticas para a sua determina o Diversas t cnicas foram desenvolvidas e aplicadas na determina o da pirazinamida em formula es farmac uticas e tamb m em amostras biol gicas Encontra se referido na literatura diversas metodologias cromatogr ficas das quais se destacam cromatografia l quida de elevado desempenho HPLC com detec o por espectrofotometria na regi o do ultravioleta 13 24 HPLC acoplada a um detector de massa 25 cromatografia l quida com detec o por espectrofotometria na regi o do ultravioleta 26 30 cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa 31 e cromatografia capilar acoplada a detec o por espectrofotometria na regi o do ultravioleta 32 Na rea dos m todos electroqu micos tamb m foram realizados trabalhos nomeadamente usando a voltametria 33 34 Foram tamb m usadas metodologias com detec o colorim trica na regi o do 6 4 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida vis vel para a determina o de pirazinamida recorrendo a diversas rea
165. do a comprometer a sensibilidade das determina es e que as solu es de cido sulf rico t m elevada viscosidade o que poderia constituir um inconveniente quando as solu es s o aspiradas ver coment rios apresentados no Cap tulo 2 seleccionou se para realizar as experi ncias seguintes a solu o 5 0 mol L de cido sulf rico para acidular os meios de reac o O m todo utilizado para aferir a influ ncia da natureza e concentra o do cido usado para acidular a solu o de vanadato de am nio para a oxida o da clomipramina foi tamb m aplicado para realizar um estudo do sinal anal tico resultante da oxida o do f rmaco em fun o da concentra o de oxidante usada 3 18 Determina o espectrofotom trica de clomipramina Estes ensaios foram realizados com uma solu o de clomipramina 10 mg L e com o meio reaccional acidulado com cido sulf rico 5 0 mol L As diversas concentra es do reagente vanadato de am nio foram preparadas no meio cido referido A avalia o do sinal anal tico foi efectuada como descrita no ltimo ensaio e os resultados obtidos encontram se representados em gr fico na Figura 3 7 0 600 0 500 0 400 Absorv ncia 0 300 0 200 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 Concentra o de Oxidante 10 M Figura 3 7 Avalia o da influ ncia da concentra o do oxidante vanadato de am nio na reac o de oxida o da clomipramina Clomipra
166. do da reac o Determina o espectrofotom trica de trimipramina 4 1 Introdu o Os medicamentos antidepressivos t m demonstrado efic cia no controlo sintom tico das perturba es depressivas do humor Na verdade o seu desenvolvimento a partir da d cada de 50 do s culo passado marcou uma das revolu es terap uticas na rea da sa de mental Os antidepressivos de um modo geral interferem com a recapta o sin ptica de um ou mais neurotransmissores A noradrenalina e a serotonina s o os neurotransmissores mais relevantes no processo O f rmaco maleato de trimipramina maleato de 5 3 dimetilamino 2 metilpropil 10 11 dihidro SH dibenzof b fjazepina Figura 4 1 um agente antidepressivo tric clico com actividade sedativa e redutora da ansiedade e que eficazmente actua no tratamento de estados de ins nia prim rios CHO N D CH2CH CH3 CH2N CH3 2 Figura 4 1 Estrutura qu mica de Maleato de Trimipramina Determina o espectrofotom trica de trimipramina Quando a depress o surge pode ocorrer uma diminui o da quantidade dos transmissores noradrenalina e serotonina libertados das c lulas nervosas no c rebro Quando estes neurotransmissores s o libertados das c lulas nervosas causam efeitos de aumento do humor Quando s o reabsorvidos n o exercem esse efeito A trimipramina actua atrav s do bloqueio da recapta o de noradrenalina e serotonina nas c lulas
167. do programa de controlo das micro bombas foram fixados em 3 pulsos de amostra inseridos no sistema o tempo de pulso das micro bombas em 300 ms e a estrat gia adoptada inicialmente para a inser o de pulsos de amostra cobre foi a inser o de volumes nicos A influ ncia da concentra o de luminol no sinal anal tico foi estudada no intervalo de concentra es de 10 mol L a 10 mol L Figura 6 5 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida w So 2 00 Amplitude de sinal cm o 0 2 4 6 8 10 12 Concentra o do luminol mM Figura 6 5 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de luminol de 10 mol L a 10 mol L Pela an lise dos resultados obtidos verifica se um aumento acentuado do sinal anal tico em fun o da concentra o de luminol at cerca de 4 x 10 mol L A partir da concentra o em luminol de 4 x 10 mol L observa se que o sinal anal tico estabilizou at sensivelmente uma concentra o de 6 x 10 mol L e ap s este valor diminuiu a intensidade de sinal Este comportamento deve se a reac es paralelas nomeadamente de auto absor o de luz em que o excesso de luminol existente no fluxo absorve a radia o de luz emitida pela reac o de quimioluminesc ncia A emiss o de luz pela oxida o do luminol ocorre num comprimento de onda de aproximadamente 445 nm Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Como
168. dutos de reac o num instrumento de medida iii Facilitar a implementa o de t cnicas de separa o continua n o cromatogr ficas por exemplo di lise extrac es l quido l quido ou s lido l quido troca i nica precipita o como forma de incrementar a sensibilidade ou a selectividade iv Possibilitar o desenvolvimento de processos de separa o cont nua baseados em reac es de derivatiza o com o prop sito de facilitar ou incrementar a transfer ncia de massa e ou a detec o Embora a injec o de um volume fixo e reprodut vel de amostra num fluxo transportador n o segmentado tivesse sido vital para a FIA outros conceitos se mostraram igualmente como alicerces da FIA nomeadamente a dispers o controlada e a capacidade da sua manipula o para servir melhor os objectivos anal ticos e os tempos de reac o constantes e reprodut veis que possibilitaram o abandono das medi es em estado estacion rio e consequentemente trouxeram an lises mais r pidas que as tradicionais em sistemas de fluxo cont nuo segmentado e tamb m resultaram na redu o do consumo de reagentes e amostra Durante o transporte da zona de reac o at ao detector ocorrem fen menos de dilui o geralmente em ambas as suas interfaces anterior e posterior denominados de dispers o Em paralelo com estes fen menos de dilui o podem ocorrer reac es qu micas entre a amostra e reagentes A dispers o que depend
169. e 3 vias D detector B bureta autom tica L e L reactores S amostra R e R reagentes C conflu ncia Adaptado de 67 Com o prop sito de compilar os trabalhos efectuados com base no conceito de multicomuta o e para deste modo informar o leitor sobre as aplica es desse conceito os trabalhos apresentados em seguida dizem respeito ao 1 60 Introdu o Geral desenvolvimento de sistemas de fluxo multicomutado para a execu o de dilui es em linha isto idealizados com o objectivo de incrementar a amplitude do intervalo de concentra es determin veis Um sistema de fluxo proposto em 1996 por Gin et al 68 para realizar dilui es autom ticas em linha com o recurso a v lvulas solen ides respons veis pela introdu o precisa de volumes de amostra e solvente no sistema Figura 1 27 Neste trabalho prop e se um procedimento alternativo aos utilizados anteriormente nomeadamente a explora o de gradientes de concentra o em amostragem de zonas divis o de zonas e dispers o de volumes da ordem de microlitros de amostra inseridos Estes procedimentos exigiam a sua aplica o na amostra e nos padr es o que implicava uma estimativa pr via da concentra o do analito nas amostras para preparar os padr es adequados A metodologia explorada por Gin et al baseava se numa dilui o das amostras cuja concentra o do analito ultrapassava a zona de resposta li
170. e real ar a facilidade com que se podem integrar dispositivos que realizem um pr tratamento como por exemplo separativo ou de concentra o da amostra injectada 21 Com esta ac o pretende se geralmente aumentar a selectividade e sensibilidade da an lise As estrat gias s o diversas e incluem m dulos de di lise de difus o de gases extrac o com solventes extrac o em fase s lida reactores tubulares etc Em virtude da facilidade de manipula o da zona de amostra e da zona de reac o num sistema FIA ocorreu tamb m um desenvolvimento paralelo de t cnicas associadas como a paragem de fluxo a t cnica sandwich e t cnicas de gradiente 35 A vantagem mais imediata resultante da aplica o de uma paragem de fluxo 36 o aumento dos tempos de reac o sem necessidade de alterar as dimens es dos reactores ou alterar os caudais e portanto sem aumentar os fen menos de dispers o Deste modo recorrendo a esta t cnica consegue eliminar se o ru do de fundo porque permite eliminar problemas associados com a fraca mistura dos reagentes com o consequente aumento do sinal anal tico ou realizar an lises baseadas em metodologias cin ticas ou aumentar a sensibilidade de uma t cnica Adicionalmente pelo facto de esta t cnica possibilitar a optimiza o da mistura 1 26 Introdu o Geral das solu es ocorre uma diminui o do consumo de reagente em rela o ao m todo cont
171. ebitando 3 uL de volume de solu o por pulso originava um acentuado fluxo pulsado mesmo considerando que o volume por pulso era inferior com uma diferen a de apenas pL para c lulas de fluxo de igual volume ptico O movimento muito mais r pido do diafragma da micro bomba e que permite um d bito quase instant neo do volume do pulso podia explicar este comportamento diferente Numa experi ncia ulterior a dispers o das solu es foi alterada drasticamente atrav s da utiliza o de uma seringa com 2 5 mL de capacidade 1 uL de volume por passo tubos de fluxo com di metro interno de 0 38 mm e tamb m utilizando uma c lula de fluxo com capacidade de 8 uL Nestas condi es limitadas de dispers o as mesmas solu es de isoniazida e NQS produziam um sinal anal tico com um perfil em escada Figura 5 5 o que sem d vida caracter stico de um fluxo pulsado Demonstrou se que em condi es limitadas de dispers o o fluxo pulsado se revela mais acentuadamente enquanto que noutras situa es a dispers o no acto da medida esconde as caracter sticas hidrodin micas do fluxo Determina o espectrofotom trica de isoniazida Figura 5 5 Registo gr fico do sinal anal tico obtido com a inser o de 2 pulsos 8 uL de amostra e reagente por amostragem bin ria Velocidade do registo 5 mm s 5 3 1 Volume de passo da bureta comprimento do reactor volume de amostra e estrat gia de amostragem E
172. ectava o sinal anal tico era o pH da solu o tamp o utilizada Verificou se que a cin tica de reac o era favorecida em meio alcalino e que a solu o tamp o carbonato hidrogenocarbonato a pH 10 2 originava os sinais anal ticos mais elevados Figura 5 17 Por esta raz o foi seleccionado este valor de pH da solu o tamp o para a realiza o das determina es seguintes 5 37 Determina o ea ER ss de isoniazida 12 00 9 00 6 00 Amplitude de sinal cm 3 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 Concentra o de NQS x10 M Figura 5 16 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de solu o de NQS 10 40 10 00 E 5 E 9 60 Q gei 5 3 9 20 E E lt 8 80 8 40 9 4 9 6 9 80 10 00 10 20 10 40 10 60 10 80 pH da solu o tamp o Figura 5 17 Avalia o da influ ncia no sinal analitico de diferentes pH da solu o tamp o utilizada Determina o espectrofotom trica de isoniazida 5 3 5 An lise de formula es farmac uticas Ap s os ensaios de optimiza o do sistema anal tico concluiu se que a obten o do maior valor de resposta anal tica foi poss vel utilizando um caudal de 0 12 mL min atrav s de um tempo de repouso entre passos de 0 5 s para uma bureta equipada com uma seringa de 2 5 mL 1 uL de volume de passo e um volume de amostra de 16 uL 16 passos executados pela bureta autom tica respons vel pela inser o
173. eito de multi impuls o numa an lise em fluxo com detec o por quimioluminesc ncia o que garante um incremento na mistura das solu es a c lula de fluxo pode ter um volume interno pequeno como 40 uL reduzindo assim a influ ncia do volume da c lula de fluxo na amplitude de sinal anal tico permitindo evitar a utiliza o de c lulas com volumes internos grandes que originavam mais dispers o das solu es Ainda no contexto da influ ncia do volume da c lula de fluxo importante referir que a metodologia de multi impuls o permite o controlo autom tico por computador dos caudais gerados por cada micro bomba o que por sua vez possibilita o controlo do tempo de resid ncia da zona de reac o na c lula de fluxo Tal controlo simplificado providencia uma certa adaptabilidade dos tempos de desenvolvimento da reac o qu mica utilizada s dimens es internas da c lula Determina o quimioluminom trica de pirazinamida de fluxo dispon vel e deste modo redu o da influ ncia do volume da c lula de fluxo na amplitude de sinal anal tico obtido uma vez mais A montagem de fluxo envolveu a utiliza o de 4 micro bombas da marca Biochem Valve Inc USA modelo 090SP com capacidade para debitar por pulso volumes de cerca de 8 uL O controlo das micro bombas foi realizado atrav s de um microcomputador com um microprocessador Pentium pelo envio de sinais TTL por interm dio de uma placa de interfaceame
174. em anal tica Experi ncias preliminares visando a avalia o da reactividade dos tomos de azoto quimicamente activos da trimipramina revelaram que este composto reage com o oxidante monovanadato de am nio em meio cido originando produtos de cor azul com o m ximo de absorv ncia a 620 nm Esta reac o foi deste modo utilizada para a implementa o de um m todo autom tico para a determina o espectrofotom trica na regi o do vis vel da trimipramina em formula es farmac uticas atrav s do desenvolvimento de um sistema de fluxo baseado em multicomuta o com capacidades anal ticas optimizadas em virtude do procedimento de amostragem bin ria estar associado com o processo de invers o de direc o do fluxo 4 6 Determina o espectrofotom trica de trimipramina eS 4 2 Parte Experimental 4 2 1 Reagentes Foi preparada diariamente uma solu o 400 mg L de trimipramina atrav s da dissolu o de 55 78 mg de maleato de trimipramina em 100 mL de uma solu o 4 0 mol L de cido sulf rico Esta solu o foi conservada no frigor fico excepto nas situa es da sua utiliza o para a prepara o de solu es padr o As solu es padr o foram preparadas por apropriadas dilui es da solu o mais concentrada de trimipramina em solu o 4 0 mol L de cido sulf rico A solu o 8 9x10 mol L de monovanadato de am nio foi preparada por dissolu o de 104 4 mg do composto num
175. em condi es mais convencionais ou t picas de fluxo cont nuo Inclusive um estudo da influ ncia do di metro interno dos tubos de fluxo no sinal anal tico demonstrou que utilizando tubos com 0 8 mm d i as tr s estrat gias diferentes de amostragem originaram sinais anal ticos id nticos Figura 5 8 Al m disso esta semelhan a ocorria para todos os volumes de amostra inseridos No entanto quando se utilizava tubos com d i de 0 5 mm e mais acentuadamente para tubos com 0 38 mm de d i os sinais anal ticos produzidos pela amostragem bin ria foram ligeiramente superiores aos obtidos com a estrat gia de conflu ncia de zonas mas manifestamente maiores que os obtidos com a estrat gia de inser o de volumes nicos de amostra Figura 5 8 confirmando que devido ao reduzido di metro interno dos tubos tanto a dispers o axial como a dispers o radial eram limitadas 48 o que resultou numa mistura amostra reagente ineficiente e por isso no registo anal tico observou se a ocorr ncia de um duplo pico por amostra introduzida situa o essa que foi reprimida recorrendo s estrat gias de amostragem bin ria ou conflu ncia de zonas Os mesmos resultados foram reorganizados de modo a serem representados de acordo com a estrat gia de inser o de amostra utilizada Fi gura 5 9 5 23 Determina o espectrofotom trica de isoniazida Na A B C Figura 5 8 ALtura m dia cm ALtu
176. em 1996 o trabalho de multicomuta o referente determina o de fosfatos em plantas publicaram em 1997 64 um trabalho considerado um aperfei oamento do anterior para a determina o de fosfatos em guas A vantagem deste trabalho era o facto de possibilitar a 1 56 Introdu o Geral determina o de fosfatos num maior intervalo de concentra es devido utiliza o de dois reactores paralelos Tal configura o de montagem anal tica Figura 1 23 permitia que enquanto uma zona de amostra era retida no interior de um reactor durante um determinado tempo uma segunda zona de amostra id ntica primeira era introduzida e prontamente detectada A t cnica de paragem de fluxo permitiu ent o aumentar o tempo de reac o e deste modo contribuiu para um aumento da sensibilidade da determina o conjuntamente com fen menos de dispers o Figura 1 23 Montagem de fluxo para a determina o de fosfatos V a Vs v lvulas solen ides de 3 vias Ca transportador de amostra R e R reagentes B e B reactores DET detector D dreno Adaptado de 64 1 57 Introdu o Geral Tumang et al em 1998 65 publicou um trabalho com nfase na capacidade de controlo de percursos anal ticos proporcionada pela multicomuta o Com o recurso multicomuta o desenvolveu se um sistema de redes anal ticas isto sistemas com possibilidade de diferent
177. em linha e depois as amostras dissolvidas eram sujeitas a processos de dilui o tamb m em linha e por fim ocorria a determina o dos a cares redutores Para tal realizou se a oxida o dos a cares com excesso de periodato e quantifica o do periodato excedente ap s a sua convers o a complexos de triiodeto pela adi o de iodeto A descrimina o na quantifica o dos a cares foi conseguida pela sua diferente cin tica de oxida o O ritmo de amostragem foi de 50 determina es por hora Figura 1 51 Montagem de fluxo de multi impuls o para a determina o de glucose e frutose P a P micro bombas C transportador da amostra S amostra R a R reagentes B e B reactores D detector DC c mara de dissolu o x y z conflu ncias Adaptado de 114 Tamb m em 2005 Morales Rubio et al 115 desenvolveram um m todo para a determina o espectrofotom trica de surfactantes ani nicos em gua baseado na substitui o do laranja de metilo pelos surfactantes ani nicos na forma o do par i nico com o i o cetil piridina a pH 5 0 atrav s de um sistema de fluxo que explorava o conceito de multi impuls o Figura 1 52 Neste trabalho foi obtido um ritmo de 60 determina es por hora aeee E a a Se 1 90 Introdu o Geral Figura 1 52 Montagem de fluxo de multi impuls o para a determina o de surfactantes ani nicos P a P4 micro
178. en ides de 3 vias Vo v lvula solen ide de 4 vias L al a de amostragem B a B4 reactores DET detector y a ys conflu ncias x canal de fluxo obstru do Cs transportador R reagentes S amostra D dreno Adaptado de 65 Figura 1 25 Montagem de fluxo para a determina o de am nia e fosfatos V a V v lvulas solen ides de 3 vias L e L al as de amostragem x e y conflu ncias B a B4 reactores Det detector P bomba perist ltica C e C transportadores S amostra R a R4 reagentes Rec recircula o de reagentes linhas a tracejado percurso anal tico quando as v lvulas est o activadas Adaptado de 66 1 59 Introdu o Geral Com o mesmo prop sito Lapa et al 67 implementaram um sistema multicomutado com dupla paragem de fluxo atrav s da utiliza o de cinco v lvulas solen ides Figura 1 26 As zonas de amostra obtidas pelo recurso a amostragem bin ria eram retidas por dois minutos com o intuito de aumentar o tempo de reac o ou seja incrementar a sensibilidade sem afectar negativamente o ritmo de amostragem Com este sistema foi poss vel realizar 30 determina es por hora de amiloride em formula es farmac uticas Figura 1 26 Montagem de fluxo para a determina o de amiloride V a V v lvulas solen ides de 2 vias normalmente fechadas V e Vs v lvulas solen ides d
179. endo esse decr scimo mais acentuado quando se introduziu volumes nicos de amostra Determina o espectrofotometrica de isoniazida A E 8 00 2 v E 6 00 N U TU 3 3 4 00 E lt 2 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL B E 8 00 2 E 6 00 o o S 3 4 00 E lt 2 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL C Amplitude de sinal cm N gt o 3 S S S 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL Figura 5 6 Avalia o da influ ncia no sinal analitico da estrat gia de inser o de amostra utilizada em fun o do volume de amostra A seringa de 2 5 mL B seringa de 5 0 mL C seringa de 10 0 mL e amostragem bin ria m volumes nicos A conflu ncia de zonas Determina o espectrofotom trica de isoniazida ss Se sda Este facto concordante com o aparecimento de um segundo pico no registo anal tico localizado na zona do registo correspondente cauda da zona de amostra era devido a uma deficiente mistura entre amostra e reagente que n o atingia porventura a zona mais central da zona de amostra para o caso da estrat gia de volumes cont nuos ou por falta de reagente na zona central para o caso das outras estrat gias Por outro lado e tendo em conta os factos apresentados a mistura entre amostra e reagente providenciada pelas estrat gias de amostragem bin ria e conflu ncia de
180. entada para 8 9 x 10 mol L para compensar a diminui o do volume de reagente introduzido Nestas circunst ncias a estrat gia de amostragem bin ria originou sinais anal ticos superiores aos obtidos com a estrat gia de volumes nicos de amostra Figura 4 9 confirmando que a efici ncia da mistura amostra reagente conferida pela combina o de amostragem bin ria e invers o de fluxo e o tempo de resid ncia dentro de L eram suficientes para promover o desenvolvimento da reac o Determina o espectrofotom trica de trimipramina 12 00 10 00 8 00 p E 0 6 00 9 a 4 00 E lt 2 00 0 00 0 5 10 15 20 25 30 Tempo de amostragem s Figura 4 9 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes estrat gias de inser o da amostra no sistema anal tico Caudal 1 5 mL min Reactor L 2 0 metros m Volumes nicos Amostragem Bin ria Ainda para mais o ritmo de amostragem aumentou consequentemente devido redu o dos tempos de amostragem diminui o do tempo de inser o do reagente e encurtamento do caminho anal tico no sistema de fluxo e o consumo de reagente diminuiu Mais concretamente e como exemplo para um tempo de inser o de amostra de 11 segundos o sinal anal tico medido utilizando a montagem com o reactor L e utilizando monovanadato de am nio com concentra o 3 0 x 10 mol L foi de 5 9 cm a um ritmo de amostragem de 34 amostras hor
181. entatous doadsdnesdvehs Edi 1 75 1 3 1 5 Lab on valve aire ci aid ese let dada 1 78 1 3 1 6 Multi impuls o 2 2 0 0 inicie 1 81 1 3 1 6 1 Conceitos gerais ccc cece ee eens 1 81 1 3 1 6 2 Evolu o da multi impuls o 1 85 1 4 Metodologias anal ticas autom ticas para a an lise de produtos farmac ticos occ Oc nd uh os cad A a aa ES ira ia aA S 1 93 ndice CAP TULO 2 Parte Experimental 2A Introd o cee sir SET a asa E cana dada GR Saio Sia quad 2 1 2 2 Reagentes e solu es de nianidlnc as CnsMAs ATA asas da psd 2 1 2 3 Equipamento e instrumenta o 0 cc ceceeee iii 2 2 2 3 1 Montagens de fluxo baseadas no conceito de multicomuta o suscscaeseniraca nestas SEEN escadas 2 3 2 3 1 1 Sistemas de propuls o e transporte 2 3 2 3 1 2 Unidades de comuta o v lvulas solen ides 2 6 2 3 1 3 Sistema de detec o cece cece cece eee es 2 8 2 3 1 4 Sistema de controlo 0 cccceeee eee e eee 2 9 2 3 1 4 1 Aparelhagem cece cece eee 2 9 2 3 1 4 2 Programas inform ticos 2 10 2 3 2 Montagens de fluxo baseadas no conceito de multi TIP USA 2 sairia a een E AE ston donna sien 2 11 2 3 2 1 Sistemas de propuls o inser o e transporte 2 11 2 3 2 2 Sistema de detec o 2 sutussa ses pinsass do a 2 13 2 3 2 3 Sistema de controlo cc cece cece eee
182. ente da geometria e hidrodin mica do sistema origina um gradiente de concentra es vari veis ao longo do sistema anal tico Sendo a dispers o constante e reprodut vel assim como os restantes par metros f sicos do sistema 1 24 Introdu o Geral como por exemplo tempo de resid ncia e temperatura n o existe necessidade de aguardar pelo equil brio f sico homogeneiza o entre amostra e reagentes e equil brio qu mico reac o qu mica completa para realizar a detec o e medi o Os componentes b sicos de um sistema de an lise FIA s o 1 Sistema de propuls o respons vel pelo transporte por aspira o ou propuls o da zona de reac o e reagentes no sistema FIA pode ser uma bomba perist ltica ou bomba de pist o 11 Sistema de inser o de amostra equipamento que introduz a amostra no fluxo transportador sem o interromper e que pode ser por exemplo uma v lvula rotativa ou um injector comutador 111 Sistema de transporte o sistema de tubos atrav s dos quais circulam os l quidos e que podem ser de teflon PTFE ou polipropileno e com di metros internos diversos Englobam os reactores que podem estar empacotados com reagentes enzimas imobilizadas ou reagentes em fase s lida por exemplo ou incluir c maras de mistura ou m dulos separativos iv Sistema de detec o respons vel pela transdu o de um sinal anal tico durante a passagem da zona de reac o e que pode ser
183. entemente desenvolvidos nomeadamente cin ticos enzim ticos ou com o uso de reagentes inst veis foram f cil e rapidamente implementados em sistemas de an lise em fluxo 21 A metodologia FIA baseia se na injec o de uma al quota de amostra l quida definida em fun o das dimens es da al a loop de amostragem do dispositivo de injec o normalmente uma v lvula rotativa ou um injector comutador 31 33 numa solu o transportadora ou reactiva que flu continuamente A zona de amostra formada pela inser o de uma al quota de amostra no fluxo transportador transportada at ao detector que continuamente regista um sinal Durante o percurso para a detec o a amostra pode ser sujeita a um conjunto de reac es que podem ser com a solu o transportadora ou pela adi o atrav s de conflu ncias de distintas solu es com reagentes espec ficos que originam determinadas reac es qu micas De uma forma resumida e com base na descri o da metodologia FIA as suas fun es s o 34 i Actuar como um processo de transporte de amostras e padr es at ao instrumento de medida por exemplo um espectrofot metro de absor o at mica 1 23 Introdu o Geral ou um detector electroquimico quando os analitos possuem caracter sticas fisico qu micas que possibilitem a sua detec o ii Possibilitar a implementa o e execu o de reac es qu micas e a introdu o dos seus pro
184. eparadas atrav s da dissolu o da quantidade Determina o espectrofotom trica de clomipramina n tati een ear a a me necess ria de comprimidos pulverizados ou por dilui o do volume necess rio de injectavel em cido sulf rico 5 0 mol L e completando o volume para 100 mL As solu es de amostra para an lise pela metodologia desenvolvida n o foram sujeitas a qualquer tratamento pr vio em virtude de o processo de filtra o ser em linha no sistema de fluxo 3 2 2 Equipamento As medi es espectrofotom tricas foram realizadas com um espectrofot metro da marca Jenway UK modelo 6100 configurado para um comprimento de onda de 620 nm e equipado com uma c lula de fluxo da marca Hellma com volume interno de 18 uL A montagem envolveu o uso de duas v lvulas solen ides NResearch de 3 vias 161 T031 Os tubos de transporte das solu es foram de PTFE da marca Omnifit com um di metro interno de 0 8 mm e todos os ligadores e as conflu ncias foram de constru o laboratorial 40 Para as filtra es em linha das solu es de amostra utilizou se um filtro Schleicher amp Schuell FM 013 0 A aspira o das solu es foi realizada atrav s de uma bureta autom tica Crison Micro BU 2030 equipada com uma seringa de 5 mL e controlada por um microcomputador atrav s do protocolo s rie RS 232C Determina o espectrofotom trica de clomipramina _ __OO rir er aaae aL 3 2 3
185. epresentada por A 0 2055 C 20 611 em que A representa a amplitude de sinal anal tico em cm e C representa a concentra o de pirazinamida em mg L O correspondente coeficiente de correla o foi 0 9965 Esse intervalo de resposta linear foi utilizado para efectuar a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas Determina o quimioluminom trica de pirazinamida 5 15 00 a o D D 2 a 10 00 E lt 5 00 0 20 40 60 80 100 Concentra o de pirazinamida mg L 1 Figura 6 15 Curva de calibra o obtida com solu es padr o de pirazinamida com concentra es de 10 at 70 mg L 0 4 pontos experimentais 4 pontos experimentais da curva de calibra o Para uma quantidade declarada de 500 mg de pirazinamida por comprimido Pramide o resultado obtido ap s an lise foi 499 5 0 20 mg e com um erro de exactid o de 0 3 em rela o ao resultado obtido pelo m todo de refer ncia Para 21 determina es consecutivas numa amostra real o desvio padr o relativo em percentagem foi 0 99 e o ritmo de amostragem foi cerca de 150 determina es por hora Determina o quimioluminom trica de pirazinamida nmr 6 3 4 Explora o do sistema de fluxo Visando a possibilidade de executar determina es anal ticas em amostras biol gicas como por exemplo a urina realizaram se ensaios para obter uma curva de calibra o para valores inferio
186. es e determina a estrat gia de introdu o de amostra e reagente no sistema Estando os canais do sistema de fluxo preenchidos com a solu o transportadora cada ciclo anal tico come ava com a introdu o de solu o de amostra A solu o de amostra era inserida por aspira o atrav s de uma sequ ncia alternada de actua o das v lvulas V e V2 com tempos de actua o predefinidos para estabelecer a intercala o de muito reduzidas al quotas de amostra e reagente que desta forma preenchiam parcialmente o reactor L Deste modo a solu o de amostra n o era introduzida como um volume nico mas como uma cadeia de pequenos segmentos de amostra e de reagente O n mero e tempos de cada ciclo de inser o definiam o tempo final de amostragem que dependendo do caudal determinava o volume total de amostra inserido no sistema anal tico Durante o ciclo de inser o de amostra as v lvulas V3 e V4 encontravam se sempre na posi o 1 para garantir que a press o negativa no interior dos tubos gerada pela aspira o da bureta autom tica influenciava unicamente os tubos para introdu o de solu o de amostra e solu o de reagente Figura 4 2 A Ap s a inser o da amostra e reagente as v lvulas V e V2 eram comutadas para a posi o 1 a v lvula V3 era comutada para a posi o 2 e o sentido do fluxo era invertido atrav s da mudan a do modo de aspira o da bureta autom tica para o Determina
187. es altera o via computador dos par metros de controlo do sistema desenvolvido 7 4 Lista de publica es cientificas ANEXO LISTA DE PUBLICA ES CIENT FICAS 4 Prior J A V Santos J L M Lima J L F C Chemiluminometric determination of pyrazinamide in an automated multi pumping flow system Analytical and Bioanalytical Chemistry submetido 3 Prior J A V Santos J L M Lima J L F C Trimipramine determination in pharmaceutical preparations with an automated multicommutated reversed flow system Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 33 903 2003 2 Prior J A V Santos J L M Lima J L F C Sampling strategies exploiting multi pumping flow systems Analytical and Bioanalytical Chemistry 375 1234 2003 1 Lima J L F C Prior J A V Reis B F Santos J L M Zagatto E A G Automated spectrophotometric determination of clomipramine on a multicommutated flow system Analytical Chimica Acta 467 75 2002
188. es percursos anal ticos Este sistema Figura 1 24 constitu do por cinco v lvulas solen ides de tr s vias e uma de quatro vias possibilitou criar tr s percursos anal ticos alternativos com dimens es id nticas nos quais eram inseridas e retidas tr s zonas de amostra durante o tempo necess rio para que a reac o se completasse procedendo por ltimo sua detec o Neste sistema as solu es eram impulsionadas atrav s de uma bomba perist ltica e o volume de amostra era definido pelo comprimento do canal de amostragem e n o por um controlo temporizado Um sistema assim idealizado permitia a realiza o de reac es lentas por aumento dos tempos de reac o sem que no entanto fosse afectado negativamente o ritmo de amostragem tal como comprova o ritmo de 35 amostras por hora com um tempo de an lise de 3 minutos por amostra na determina o espectrofotom trica de boro em plantas Reis et al 66 em 2002 desenvolvem um sistema de an lise Figura 1 25 baseado num comutador operado electronicamente e associado a v lvulas solen ides de tr s vias para a determina o de am nia e fosfato em guas Diversas zonas de amostra eram processadas em simult neo conseguindo se deste modo um ritmo de amostragem de 56 amostras por hora embora com um tempo de resid ncia de 160 segundos 1 58 Introdu o Geral Figura 1 24 Montagem anal tica para a determina o de boro V a Vs v lvulas sol
189. es s o aspectos importantes quando o objectivo a monitoriza o dos processos em linha O LOV com canais de di metro consider vel e com percursos de fluxo curtos tamb m perfeito para a manipula o de fluidos com me aeee rea re 1 80 Introdu o Geral mat ria suspensa podendo ser um ve culo ptimo para a Bead Injection BI 86 As configura es em modo LOV servem se dos mesmos materiais e hardware desenvolvidos para as t cnicas de fluxo sendo por isso facilmente implementadas Estas caracter sticas t m sido demonstradas nos ltimos anos atrav s de aplica es em estudos de interac es de bioligandos 88 em associa o com o conceito BI 89 na monitoriza o de processos de fermenta o em linha 90 91 e na separa o de ani es em associa o com a electroforese capilar 92 As vantagens que os sistemas LOV trazem An lise Qu mica em fluxo s o a inerente compacta o dos equipamentos utilizados o controlo inform tico de todas as etapas do procedimento experimental e ainda a integra o de todos os componentes da montagem numa estrutura r gida o que melhora a reprodutibilidade das opera es de processamento das amostras 1 3 1 6 Multi impuls o 1 3 1 6 1 Conceitos gerais Os sistemas de fluxo que exploram o conceito de multi impuls o foram recentemente propostos como uma nova estrat gia para a manipula o de solu es de amostra e de reagentes e
190. eta vis vel sintonizado usualmente a um comprimento de onda da regi o ultravioleta embora actualmente sejam utilizados cada vez com maior frequ ncia sistemas de detec o com diode array Embora os procedimentos estabelecidos com os sistemas cromatogr ficos forne am resultados de boa precis o e exactid o podendo ser implementados quer com um objectivo quantitativo quer com um objectivo qualitativo eles envolvem algumas manipula es das amostras particularmente desarejamento e filtra o e longos per odos de condicionamento de uma coluna de separa o apropriada A sua implementa o em controlo anal tico de rotina poder n o ser a mais adequada pela impossibilidade de realiza o de an lises expeditas Adicionalmente o equipamento aqui envolvido dispendioso e requer pessoal especializado para o seu funcionamento o que sugere a procura de t cnicas alternativas 1 1 Introdu o Geral Os ensaios de dissolu o de formula es farmac uticas s o igualmente importantes para o controlo de qualidade dos medicamentos para a avalia o da similitude das caracter sticas de diferentes lotes Quando estes testes fornecem uma informa o detalhada das caracter sticas din micas do processo dissolu o s o tamb m teis para acompanhar os estudos de desenvolvimento de novas formas de dosagem A maioria dos ensaios oficiais descritos nas Farmacopeias com excep o dos que recorrem a aparelhos de
191. eu interior para o sistema de fluxo Portanto entre cada pulso situa o de entrada de al quotas de solu o no sistema decorria um intervalo de tempo correspondente ao somat rio do tempo de activa o com o tempo de pulso Outro par metro avaliado foi o volume de amostra Por raz es de simplicidade na explica o dos resultados apenas se utilizar o termo volume de amostra mas no entanto importante referir que juntamente com cada pulso de solu o de amostra inserido no sistema foi tamb m inserido um pulso de solu o de cati o cobre II pois era deste modo formado o fluxo de amostra cobre atrav s da estrat gia de conflu ncia de zonas Na Figura 6 13 encontram se os resultados obtidos para este estudo As estrat gias de amostragem utilizadas para o ensaio foram a inser o de volumes nicos a amostragem bin ria e a conflu ncia de zonas O gr fico 6 13 A representa a influ ncia no sinal da estrat gia de inser o de volumes nicos em fun o do volume de amostra e tamb m em fun o do caudal No gr fico 6 13 B representa se a influ ncia da estrat gia de inser o por Determina o quimioluminom trica de pirazinamida conflu ncia de zonas em fun o dos mesmos par metros referidos anteriormente e no gr fico 6 13 C a representa o diz respeito estrat gia de inser o por amostragem bin ria tamb m em fun o dos par metros referidos acima Para avaliar a
192. formula es farmac uticas e que adicionalmente n o implica aquecimento ou longos tempos para desenvolvimento de reac o e n o suscept vel de interfer ncias provocadas por subst ncias excipientes normalmente usadas nas formula es farmac uticas Quando implementado num sistema de fluxo baseado no conceito de multicomuta o resulta numa metodologia simples de baixo custo r pida sens vel e exacta que pode ser vantajosamente aplicada a an lises de rotina Em SIA por comuta o da v lvula multiposi o e por invers o do sentido de escoamento cria se uma zona composta de sobreposi o das zonas de amostra e reagente para a qual tamb m contribuem os processos de dispers o radial e axial Quando esta zona de sobreposi o encaminhada para o detector obtido um sinal transiente de magnitude proporcional concentra o da esp cie monitorizada numa zona de concentra es O novo procedimento de homogeneiza o explorado neste trabalho consistindo na combina o da estrat gia de amostragem bin ria com invers o de fluxo exibiu uma efici ncia de mistura muito elevada o que permitiu reduzir marcadamente a dispers o da amostra durante o transporte para o sistema de detec o enquanto se assegurava um desenvolvimento conveniente da reac o As vantajosas caracter sticas operacionais da multicomuta o nomeadamente o elevado grau de automa o e a versatilidade que proporciona asseguram um controlo efecti
193. gativos de irreprodutibilidade no fluxo como por exemplo o fluxo latejado originado pelo movimento dos rolamentos No entanto quando se considera como factor decisivo da escolha o posicionamento do sistema propulsor na montagem a bomba perist ltica apresenta se com mais vantagens quando se opta por impuls o uma vez que permite transportar simultaneamente mais do que uma solu o ao passo que com a utiliza o de buretas autom ticas seriam necess rias para o mesmo efeito uma bureta por cada solu o impulsionada Em modo de aspira o uma bureta autom tica torna se a melhor op o principalmente quando utilizada num sistema de fluxo baseado no conceito de multicomuta o visto que suficiente um nico canal de propuls o das solu es Por estes motivos optou se pela utiliza o de uma bureta autom tica nos sistemas multicomutados em modo de aspira o Nesta disserta o utilizaram se buretas autom ticas da marca Crison modelos micro BU 2030 ou 2031 operadas por um motor de passo capacidade de execu o de 2500 passos e que possu am incorporadas v lvulas autom ticas para esvaziamento das seringas O sistema Crison possu a ainda um controlador interno com comandos pr prios e em que atrav s de um microcomputador interligado pela porta s rie se efectuava o controlo de desloca o do embolo assim como da selec o do canal aberto da v lvula incorporada na bureta autom tica A transmiss o da informa o de c
194. icando que com o reactor de 25 cm se obtinha um grau aceit vel de mistura de solu es para os par metros de funcionamento do sistema fixados para os ensaios 4 50 4 00 3 50 3 00 Amplitude de sinal cm 2 50 2 00 0 10 20 30 40 50 60 Comprimento do reactor L2 cm Figura 6 11 Influ ncia do comprimento do reactor L no sinal anal tico entre 2 5 cm e 50 cm Determina o quimioluminom trica de pirazinamida _ OOOO C O O reactor L tinha como fun o facilitar o processo de mistura causado pelo fluxo pulsado entre a solu o de luminol e a solu o de per xido de hidrog nio de modo a que quando se inseria a solu o resultante da mistura de amostra e cati o cobre II no fluxo de luminol per xido de hidrog nio se obtinha uma mistura optimizada e r pida Ap s avalia o da influ ncia no sinal anal tico das dimens es do reactor L Figura 6 12 verificou se que o m ximo de resposta anal tica foi obtido com a utiliza o de um reactor L com 25 cm de comprimento 6 00 E 5 00 8 6 S 4 00 Q 3 3 E lt 3 00 2 00 0 10 20 30 40 50 60 Comprimento do reactor L3 Figura 6 12 Influ ncia do comprimento do reactor L no sinal anal tico entre 2 5 cm e 50 cm Nos sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o os caudais e os volumes de amostra e reagentes inseridos no sistema s o definidos pelo volume nn EEE 6 28 Determina o quim
195. idade de automatizar m todos de an lise de rotina que exigiam uma frequ ncia de amostragem elevada 30 Figura 1 1 Montagem FIA convencional A amostra C solu o transportadora R reagente B bomba perist ltica V v lvula L reactor D detector W dreno De entre as metodologias automatizadas tem maior destaque a FIA pois constituiu o ponto de partida para a utiliza o da automa o em an lises qu micas por fluxo cont nuo dado que o que mais a distingue o recurso a instrumentos e material de laborat rio de muito f cil acesso baixo custo e tamb m 1 22 Introdu o Geral reprodutibilidade cada vez mais elevadas e exactid o e precis o igualmente distintas Inclusivamente apesar das potencialidades de todas as outras metodologias de an lise em fluxo que lhe sucederam a FIA continua a ser a mais usada muito possivelmente por n o requerer o recurso a equipamentos inform ticos e electr nicos assim como conhecimentos de programa o inform tica A FIA permitiu melhorar significativamente numerosas metodologias anal ticas especialmente em termos de manipula o e processamento das amostras dado que revelou uma elevada capacidade de controlo reprodut vel do volume de amostra introduzido no sistema da mistura da amostra com os reagentes e dos tempos de desenvolvimento da reac o Consequentemente m todos anal ticos cl ssicos assim como m todos rec
196. ido num fluxo constante Este facto muito importante porque um fluxo pulsado implica um movimento ca tico das solu es em todas as direc es dentro dos tubos o que contribui para a optimiza o da mistura e consequentemente uma eficiente mistura entre amostra e reagente quando comparado com o t pico fluxo laminar geralmente associado com o fluxo cont nuo Com o intuito de observar a ocorr ncia de fluxo pulsado originado pelo funcionamento programado das buretas autom ticas e utilizando o sistema descrito anteriormente na Figura 5 3 configurou se o registador para uma velocidade elevada de deslizamento de papel 5 mm por segundo Deste modo foi poss vel visualizar em papel os r pidos incrementos de absorv ncia os picos surgem com um aspecto semelhante a escada fornecidos pelo espectrofot metro ii e e O ee 5 15 Determina o espectrofotom trica de isoniazida para a reac o entre isoniazida e o reagente NQS Para tal inseriu se uma solu o 50 ug mL de isoniazida e uma solu o 5x10 mol L de NQS A capacidade das seringas acopladas s buretas era de 10 mL originando por isso um volume de 4 uL por cada passo da bureta No entanto verificou se que utilizando tubo de PTFE com um di metro interno de 0 8 mm e uma c lula de fluxo de 18 pL acoplada no espectrofot metro os pulsos n o se revelavam Estes resultados s o diferentes dos obtidos em outro trabalho 41 em que uma micro bomba d
197. ilidade e economia de reagentes da multicomuta o 85 1 76 Introdu o Geral As v lvulas solen ides substituem as v lvulas normalmente incorporadas nas buretas de pist o autom ticas e permitem mudan as de estado ON OFF com frequ ncias elevadas na ordem de 35 ms As frequ ncias elevadas de comuta o possibilitam que sejam realizadas sem paragem do movimento dos mbolos Comparando a an lise por fluxo com multiseringa com a an lise por injec o em fluxo conclui se que poss vel obter consumos de reagentes mais baixos porque em multiseringa os reagentes podem retornar ao reservat rio quando n o s o necess rios enquanto que em FIA verifica se um movimento cont nuo de reagentes para o sistema e efluente Al m disso a utiliza o das buretas de pist o autom ticas permitiu ultrapassar um dos principais problemas de FIA que se prende com o uso de tubos polim ricos de impuls o nas bombas perist lticas que s o incompat veis com cidos e bases concentrados ou solventes org nicos Os tubos usados na montagem anal tica e as extremidades dos pist es s o constitu das por PTFE Tamb m o facto de se usar bombas de pist o como equipamento propulsor em vez de bombas perist lticas confere a estes sistemas alguma robustez no transporte das solu es tornando o mais homog neo e resistente a altera es inerentes s bombas perist lticas como seja o seu movimento pulsado e o facto dos tubos de
198. imo aspecto importante tendo em conta factores ambientais 1 Na rea de an lise qu mica tem se vindo a observar gradualmente um maior uso da automatiza o em procedimentos envolvendo determina es qu micas em consequ ncia do aumento do conhecimento tecnol gico disponibilizado tornando a automa o uma ferramenta de an lise As novas estrat gias anal ticas automatizadas possibilitaram um aumento do n mero de amostras analisadas por unidade de tempo a redu o da exposi o do operador a amostras perigosas a elimina o de erros associados ao factor humano um incremento da efici ncia anal tica a redu o do consumo de reagentes e produ o de res duos e a maximiza o da capacidade anal tica do equipamento dispon vel Deste modo a op o pelas metodologias autom ticas por parte dos laborat rios de controlo justifica se com base em aspectos econ micos derivados de um menor envolvimento do operador e o aumento do n mero de an lises efectuadas com menor consumo de reagentes Atrav s da diminui o do consumo de reagentes ocorre um decr scimo dos custos anal ticos e resulta simultaneamente num aumento da seguran a ambiental devido diminui o da forma o de res duos perigosos 3 A express o qu mica anal tica verde engloba uma s rie de pr ticas e estrat gias realizadas com vista a reduzir ou evitar os efeitos laterais poluentes dos m todos anal ticos Para manter as principais caracter stica
199. ina forma o de hidrazona e N metila o originam reduzidas quantidades de metabolitos mas tamb m detectados na urina De todos os metabolitos formados a acetilhidrazina formada no figado por N acetila o apresenta elevada toxicidade hep tica A taxa de acetila o altera significantemente as concentra es da droga no plasma e o seu tempo de semi vida na circula o O tempo de semi vida do f rmaco pode ser prolongado em casos de insufici ncia hep tica aconselh vel uma redu o da dose administrada de isoniazida nos doentes que s o acetiladores lentos e que sofrem de insufici ncia renal A excre o de isoniazida dependente em pequena percentagem do estado da fun o renal mas os pacientes que s o inactivadores lentos da droga podem acumular concentra es t xicas caso sofram de insufici ncia renal A isoniazida usada em associa o com outros f rmacos como a rifampicina e a pirazinamida no tratamento da tuberculose pulmonar e extrapulmonar e isoladamente na profilaxia da tuberculose em grupos de elevado risco A dose di ria total de isoniazida administrada normalmente 5 mg kg num m ximo de 300 mg durante 6 meses 5 3 Determina o espectrofotom trica de isoniazida A reac o adversa mais comum resultante da administra o cr nica a nevrite perif rica cujos sintomas s o entorpecimento zumbidos e uma sensa o de irrita o da pele A hepatite tamb m outro efe
200. ina trimipramina e isoniazida em formula es farmac uticas foi usado um espectrofot metro Jenway modelo 2 8 Parte Experimental eens 6100 equipado com uma c lula de fluxo da marca Hellma com um volume interno de 18 uL e um percurso ptico de 1 cm Tamb m foi utilizada uma c lula de fluxo com um volume interno de 8 uL e um percurso ptico de 1 cm da mesma marca 2 3 1 4 Sistema de controlo 2 3 1 4 1 Aparelhagem Como unidade central de aquisi o e processamento de dados e de controlo do equipamento constituinte dos sistemas de fluxo de multicomuta o desenvolvidos foram utilizados microcomputadores Para a determina o de clomipramina utilizou se um microcomputador com um microprocessador Intel 486DX a 66 MHz e para a determina o de trimipramina de isoniazida e de pirazinamida recorreu se a um Pentium I a 200 MHz embora a frequ ncia de funcionamento dos microprocessadores utilizados n o tenha qualquer efeito limitativo na execu o dos programas de controlo desenvolvidos O controlo dos diversos componentes dos sistemas de fluxo desenvolvidos foi efectuado atrav s de uma placa de interfaceamento da marca Advantech modelo PC LabCard PCL 818L que possibilitava a comunica o entre o microcomputador e os sistemas de inser o propuls o e detec o Esta placa de controlo e aquisi o possu a um conversor anal gico digital com uma resolu o de 12 bits 16 entradas e 16 sa das dig
201. inal seria atenuada pela optimiza o da mistura da amostra e reagente antes da detec o O estudo da influ ncia do oxidante monovanadato de am nio no sinal anal tico para a determina o de trimipramina foi efectuado utilizando a mesma configura o da montagem anal tica num intervalo de concentra es entre 1 0 x 10 mol L e 40 x 10 mol L de solu o de monovanadato de am nio preparada em solu o 4 0 mol L de cido sulf rico Atrav s da inser o de uma solu o 50 0 mg L de trimipramina com um tempo de amostragem de 4 segundos correspondendo a cerca de 100 uL de volume de amostra introduzido e de uma solu o de cido sulf rico 4 0 mol L usada como transportador observa se que a resposta anal tica aumenta acentuadamente com o aumento da concentra o da solu o de monovanadato de am nio de 1 0 x 10 mol L a 2 0 x 10 mol L e depois apresenta tend ncia para estabilizar Figura 4 5 Deste modo para os ensaios seguintes utilizou se uma solu o de monovanadato de am nio com concentra o 3 0 x 10 mol L de modo a garantir algum excesso de reagente Definindo como objectivo a obten o de uma mistura r pida da zona de amostra com o reagente que era em alguma extens o dificultada pela elevada viscosidade da solu o de cido sulf rico com concentra o 4 0 mol L porque limitava a interdispers o entre os segmentos de amostra e os segmentos de reagente realizou se um estudo compar
202. inda de acordo com a IUPAC um sistema anal tico automatizado uma colec o de m dulos anal ticos de automatiza o e de instrumentos anal ticos modulares configurados para automatizar uma an lise completa desde a entrada da amostra sa da de informa o 24 O sistema anal tico cont m uma interface para o usu rio para permitir a interac o humana e pode tamb m ter um m dulo de arquivo para fornecer pesquisas posteriores Esta no o de automa o conduz a uma distin o bem evidente entre sistemas autom ticos e automatizados 1 Sistemas Autom ticos sistemas sem capacidade de decis o portanto sem sistema de retroalimenta o em que determinadas ac es inclu das num conjunto mais ou menos alargado de opera es s o realizadas sequencialmente e de forma repetitiva sem interven o humana ii Sistemas Automatizados sistemas que s o controlados ou regulados por sistemas de retroalimenta o sem interven o de um operador Estes sistemas s o automonotorizados e autocontrolados possuindo uma independ ncia de actua o superior dos sistemas autom ticos Com o objectivo de evitar situa es eventualmente amb guas derivadas do facto de por vezes ser dif cil estabelecer com precis o os limites ou a fronteira entre sistemas autom ticos e sistemas automatizados utilizar se indiscriminadamente a express o sistemas autom ticos corrente na l ngua Portuguesa para designar os sistemas anal ti
203. io Para o correspondente ensaio mas recorrendo estrat gia de inser o de volumes cont nuos o volume de amostra inserido correspondia ao volume originado pelo somat rio dos volumes de inser o de segmentos de amostra na amostragem bin ria definidos pelos tempos de inser o para um caudal de 1 5 mL min utilizado no ensaio Deste modo e para fins comparativos entre os v rios ensaios manteve se equipar vel o volume de amostra inserido no sistema Os resultados est o representados na Figura 4 11 Determina o espectrofotom trica de trimipramina 18 00 15 00 E 12 00 D ad a S 9 00 3 kej 3 Z 6 00 E lt q 3 00 q 0 00 0 5 10 15 20 25 30 Tempo de amostragem s Figura 4 11 Influ ncia na resposta anal tica de diferentes concentra es de cido sulf rico e com diferentes estrat gias de amostragem E Volumes nicos e H SO 4 mol L O Volumes nicos e H SO 5 mol L A Amostragem bin ria e H SO 4 mol L A Amostragem bin ria e H2SO 5 mol L Observou se que os resultados obtidos com a estrat gia de amostragem bin ria eram apreciavelmente melhores dos obtidos com a inser o de volumes nicos de amostra A maior resposta anal tica foi obtida utilizando uma solu o de cido sulf rico 4 0 mol L e com a estrat gia de inser o de amostra por amostragem bin ria embora a diferen a de sinal para a concent
204. iol gicas Uma pesquisa bibliogr fica no ISI WEB Of Knowledge base de dados cient fica disponibilizada on line 5 revela aproximadamente 210 artigos cient ficos publicados e relativos determina o de isoniazida em formula es farmac uticas e ou amostras biol gicas Em virtude da lista de publica es cient ficas ser extensa apenas se ir referir a t tulo de exemplo alguns desses trabalhos mais significativos e relacion veis com o conte do deste cap tulo 5 4 Determina o espectrofotom trica de isoniazida Os m todos cromatogr ficos s o provavelmente os mais frequentemente usados na determina o de isoniazida em prepara es farmac uticas e muito especialmente em amostras biol gicas Estes m todos recorrem a diferentes tipos de detectores sendo no entanto a detec o na regi o do ultravioleta a mais utilizada 6 8 A detec o fluorim trica quer por derivatiza o usando como agente oxidante o per xido de hidrog nio 9 quer por tratamento fotoqu mico 10 tem sido tamb m utilizada assim como a cromatografia gasosa 11 e a cromatografia em camada fina 12 No entanto h a destacar um n mero significativo de m todos colorim tricos que tiram proveito da estrutura qu mica da isoniazida nomeadamente da reactividade do grupo hidrazida Deste modo foram propostas v rias metodologias colorim tricas baseadas na forma o de hidrazonas coradas por reac o da isoni
205. ioluminesc ncia resultou em algumas caracter sticas atractivas para realizar determina es anal ticas em formula es farmac uticas i baixo tempo de an lise o ritmo de amostragem de 150 amostras por hora obtido neste trabalho por exemplo demonstra a utilidade destes sistemas quando est envolvido um elevado n mero de an lises ii precis o devido ao modo reprodut vel da introdu o das solu es iii versatilidade demonstrada pela elevada capacidade de manipula o da zona de amostra e zona de reac o devido ao controlo individualizado e independente de cada micro bomba respons vel pela inser o de cada solu o de reagente envolvido iv automatiza o o elevado grau de automatiza o associado aos sistema de fluxo por multi impuls o possibilita que as medi es de quimioluminesc ncia possam ser realizadas muito rapidamente e com um m nimo de participa o do operador A automatiza o associada com a versatilidade e tamb m a estrutura modular destes sistemas permitem que diversas solu es de Determina o quimioluminom trica de pirazinamida reagentes possam ser adicionadas solu o de amostra atrav s do recurso a diferentes e individuais linhas de fluxo cujas condi es de funcionamento devidamente optimizadas possibilitam as melhores condi es para a obten o do m ximo de intensidade de luz emitida 6 45 Determina o quimioluminom trica de pir
206. ioluminom trica de pirazinamida caaaeaee interno das micro bombas utilizadas e pelo n mero de pulsos e tempos de pulsos configurados tal como j se referiu anteriormente O caudal um par metro importante a considerar no desenvolvimento de um sistema de an lise em fluxo acoplado a um sistema de detec o por quimioluminesc ncia As limita es associadas por vezes com o volume da c lula de medi o podem ser ultrapassadas atrav s do controlo preciso dos caudais de cada fluxo de solu o introduzido no sistema como j referido em 6 2 2 O caudal originado por cada micro bomba que pode ser facilmente optimizado pelo operador define o tempo de desenvolvimento da reac o e tamb m o tempo de resid ncia da zona de reac o dentro da c lula de medi o Os caudais a programar num sistema de fluxo dependem da velocidade das reac es de quimioluminesc ncia exploradas Conforme a velocidade da reac o aumenta e com os restantes par metros fixos o caudal deve ser aumentado igualmente de modo a registar o m ximo de intensidade de emiss o de luz quando a zona de reac o passa pela c lula de medida mas ao mesmo tempo aumenta o consumo de reagentes por determina o O caudal tamb m influencia o perfil e altura dos picos de sinal anal tico assim como o ritmo de amostragem A maior parte dos trabalhos publicados que envolvem sistemas FIA acoplados a detectores de quimioluminesc ncia s o baseados em iguais valore
207. ion Catalog Schleicher amp Schuell 2002 2003 a parte superior b rede met lica c o nng em silicone d filtro em papel e rede met lica f parte inferior Adicionalmente a realiza o de uma etapa de lavagem ap s a substitui o de uma solu o garantia que n o ocorria contamina o entre solu es Podia constituir um problema na fase de substitui o de solu es porque a exist ncia de um volume interno no filtro implicava que a fase de lavagem ap s troca de solu es fosse obrigatoriamente realizada mais exaustivamente para evitar contamina o de solu es o que poderia limitar o ritmo de amostragem No entanto o facto da fase de substitui o das solu es e lavagem se realizar atrav s do funcionamento e La 3 11 Determina o espectrofotom trica de clomipramina msme Ne a da bureta na sua velocidade m xima possibilitava que a exist ncia do volume morto do filtro n o afectasse de modo significativo as determina es por diminui o do ritmo de amostragem As condi es descritas de funcionamento da bureta na fase de lavagem possibilitavam a realiza o desta fase de um modo eficaz de modo a prevenir contamina o de solu es sem grande comprometimento do ritmo de amostragem O mesmo procedimento anal tico foi utilizado para obter uma curva de calibra o anal tica o que envolveu a an lise de um conjunto de solu es padr o de cloridrat
208. isadas pelo m todo desenvolvido Um composto foi considerado como n o interferente quando a varia o de sinal anal tico era 3 quando comparado com o sinal anal tico obtido na aus ncia do composto referido Os resultados demonstraram que os excipientes glucose sucrose galactose lactose benzoato de s dio e estearato de magn sio n o interferiram a partir de uma raz o molar superior a 100 vezes relativamente clomipramina Ap s a optimiza o do sistema com um caudal de 1 ml min e um reactor de 1 0 metros e utilizando sequ ncias de amostragem bin ria com intercala o de 6 ou 12 ciclos de 1 s de amostra l s de monovanadato de am nio foram obtidos intervalos de resposta linear para concentra es de clomipramina at 50 e 40 mg L respectivamente Para um tempo de amostragem de 6 s a curva anal tica foi representada por A 0 1904 C 0 0665 em que A era a altura de pico expressa em cm e C era a concentra o de clomipramina expressa em mg L com um coeficiente de correla o de 0 9996 Figura 3 11 e o limite de detec o associado era de 2 23 Para 10 determina es consecutivas o desvio padr o relativo foi inferior a 2 0 Para um tempo de amostragem de 12 s a equa o que relaciona o sinal anal tico com a concentra o foi A 0 2903 C 0 1496 com um coeficiente de correla o de 0 9994 Figura 3 11 e um limite de detec o de 2 29 Para 10 determina es consecutivas o desvio padr o relativo em
209. itais compat veis com TTL Transistor transistor logic 16 entradas absolutas anal gicas ou oito diferenciais e uma sa da anal gica sinais de rel gio e triggers program veis 2 9 Parte Experimental As v lvulas solen ides requerem uma diferen a de potencial de 12 V e uma intensidade de corrente de aproximadamente 100 mA para serem activadas o que n o pode ser providenciado atrav s da placa de interface PCL 818L Para ultrapassar este obst culo foi desenvolvido um circuito de pot ncia com base num circuito integrado ULN 2003 3 2 3 1 4 2 Programas inform ticos Os programas para controlo do sistema anal tico ou seja para a activa o e desactiva o das v lvulas solen ides e ainda controlo do equipamento propulsor foi desenvolvido em BASIC uma linguagem simples de alto n vel implementada em ambiente DOS Esses programas desenvolvidos especificamente para aplica o nos trabalhos produzidos entravam em considera o com diversos aspectos como por exemplo o objectivo do trabalho a sua funcionalidade e versatilidade desejada A linguagem de programa o BASIC permitiu que facilmente se realizassem altera es nas linhas de programa o durante o tempo de desenvolvimento e testes dos sistemas de fluxo Para a aquisi o de dados recorreu se inclus o de uma rotina de aquisi o pr elaborada sendo apenas necess rio proceder a altera es menores com o intuito de adapta o a
210. ito lateral associado com o tratamento e igualmente de grande perigosidade Consistindo numa inflama o do f gado os sintomas podem ser pele e olhos amarelados n useas v mitos anorexia urina escura sensa o anormal de cansa o ou fraqueza generalizada Outras reac es adversas que podem ocorrer s o problemas na vis o nevrite ptica diarreias febre dores de est mago hiperpirexia hipotens o taquicardia reten o urin ria hemorragias cianose e agranulocitose Em casos raros a isoniazida pode provocar depress o ou desordens man aco depressivas possivelmente resultantes do facto da droga interactuar com a vitamina B6 provocando ent o uma deple o dos seus n veis biol gicos A isoniazida liga se a piridoxal 5 fosfato que a forma activa da piridoxina vitamina B6 para formar hidrazonas isoniazida piridoxal O piridoxal 5 fosfato um cofactor para a descarboxilase do cido glut mico e para a transaminase do GABA no caminho de s ntese do GABA Um excesso dos n veis de isoniazida resulta na diminui o de piridoxal 5 fosfato e portanto diminui o da s ntese de GABA Consequentemente ocorre excitabilidade cerebral e ataques apopl ticos A enorme popularidade e import ncia alcan ada pela isoniazida como agente prim rio no tratamento da tuberculose impulsionaram o desenvolvimento de diversas metodologias anal ticas para a sua determina o tanto em prepara es farmac uticas como em amostras b
211. izada neste intervalo de tempo Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Num sistema de fluxo este intervalo de tempo depende dos caudais utilizados para cada fluxo de solu o envolvida na determina o e das dimens es dos tubos de transporte entre o ponto de mistura dos reagentes e a c lula de fluxo Consequentemente a sensibilidade de detec o pode ser maximizada atrav s do controlo destes par metros Al m da influ ncia dos caudais e das dimens es dos reactores na amplitude do sinal anal tico a altera o dos volumes inseridos das solu es de reagentes e da estrat gia de amostragem utilizada influencia tamb m o tempo em que a passagem da zona de reac o pela c lula de fluxo coincide com o m ximo de intensidade de luz emitida Adicionalmente um estudo do efeito no sinal anal tico das concentra es de cada reagente envolvido na reac o qu mica forneceu dados para optimizar ainda mais a sensibilidade da detec o A influ ncia dos par metros referidos foi investigada atrav s da inser o no sistema representado na Figura 6 4 em triplicado de solu es padr o de pirazinamida e atrav s da modifica o dos par metros da Tabela 6 1 Tabela 6 1 Esquema representativo dos par metros de configura o do programa de controlo do sistema A defini o dos par metros na tabela apenas exemplificativa str eee N mero de Tempo de Etapa Estado de Impuls o pulsos pu
212. izadas eram da marca NResearch Nas montagens anal ticas desenvolvidas aplicaram se dois modelos diferentes quanto ao n mero de portas modelo 161 T031 de 3 vias uma entrada duas sa das ou uma saida duas entradas e o modelo 161 T011 de duas vias uma entrada uma sa da originalmente fechada Estes dispositivos Figura 2 1 possu am reduzidas dimens es com cerca de 1 9 cm de di metro e 2 92 cm de altura com uma forma cil ndrica As v lvulas apresentavam um baixo consumo de energia alimenta o a 12 V 0 8 A eram compactas tinham reduzidos volumes mortos e reduzido volume interno o 2 6 Parte Experimental volume interno de porta a porta de cerca de 27 uL de acordo com informa o do fabricante press o m xima de funcionamento de 30 psi curto tempo de resposta 5 a 20 ms para activa o elevada resist ncia qu mica constitui o em PTFE baixo custo e eram suscept veis de automatiza o nm pa ee rs Sol gt aja e EL gt E2 Figura 2 1 Diagrama representativo do corte de uma v lvula solen ide Sol solen ide El entrada 1 E2 entrada 2 S sa da M mola MT1 MT2 membranas de teflon Parte Experimental A selec o do percurso das solu es nas v lvulas solen ides era condicionada pelo sentido de press o exercida sobre duas membranas de teflon no caso das v lvulas de 3 vias colocadas opostamente como a imagem
213. lidado um processo de fabrico existe ent o a necessidade de um controlo constante para cada lote produzido no sentido de garantir a qualidade seguran a e efic cia do produto comercial devendo cada lote encontrar se devidamente documentado no que se refere aos v rios est gios da produ o A implementa o do controlo de qualidade numa ind stria farmac utica deve se necessidade dos medicamentos para uso humano corresponderem exactamente a padr es relacionados com a sua qualidade seguran a e efic cia 15 De uma forma ampla o controlo da qualidade definido como o controlo di rio da qualidade dos produtos preparados por uma determinada empresa Na ind stria farmac utica o controlo da qualidade envolve uma equipa de cientistas e t cnicos respons veis por aceitar ou rejeitar as mat rias primas e os materiais de embalagem pelo n mero indefinido de inspec es e testes ao longo do processo de fabrico por assegurar o controlo e monitoriza o dos v rios sistemas estabelecidos e ainda por aprovar ou rejeitar as formula es farmac uticas preparadas 16 O controlo da qualidade inclui por isso testes anal ticos que acompanham todas as fases de processamento de um medicamento desde a descoberta de uma nova mol cula com actividade terap utica ao desenvolvimento de uma formula o sua produ o englobando testes anal ticos do produto acabado e a avalia o de todas as opera es come ando com a recep o
214. lin N Gregory J Simmons J Pharm Biomed Anal 17 885 1998 A P Argekar S S Kunjir K S Purandare J Pharm Biomed Anal 14 1645 1996 V Spinkova Pharm Acta Helv 46 643 1971 L H Welsh J Assoc Offic Agr Chem 40 807 1957 E L Pratt Anal Chem 25 814 1953 P Nagaraja K C Srinivasa Murthy H S Yathirajan Talanta 43 1075 1996 Determina o espectrofotom trica de isoniazida 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 A A Abou Ouf A M Taha M B Saidhom J Pharm Sci 62 1700 1973 M E El Kommos A S Yanni Analyst 113 1091 1988 N M A Mahfouz K M Emara Talanta 40 1023 1993 H S I Tan J Pharm Sci 62 993 1973 J T Stewart D A Settle J Pharm Sci 64 1403 1975 P Nagaraja K Sunitha R Vasantha H Yathirajan Turk J Chem 26 743 2002 D S Goldman Science 120 315 1954 K K Mahalanabis D Basu B Roy Analyst 114 1311 1989 J Bartos Ann Pharm Fr 29 71 1971 P C Ioannou Talanta 34 857 1987 M Sarwar A Malik U A Khan Anal Lett 22 853 1989 E Kahane O Sackur Ann Pharm Fr 11 175 1953 M B Devani C J Shishoo J Pharm Sci 59 90 1970 J J Vallon C Bichon Anal Chim Acta 78 93 1975 S T Sulaiman Y O Hameed Anal Chim Acta 206 379 1988 V J Jennings A Dodson A Harrison Analyst 99
215. logical Basis of Therapeutics 10 Ed 2001 C B Eap L Koeb E Holsboertrachsler P Baumann Ther Drug Monit 14 380 1992 J E Kountourallis C K Markopoulou J A Stratis Anal Lett 26 2171 1993 S Hartter B Hermes C Hiemke J Liq Chromatogr 18 3495 1995 E Ameyibor J T Stewart J Liq Chromatogr R T 20 3107 1997 C Frahnert M L Rao K Grasmader J Chromatogr B 794 35 2003 A A Gulaid G A Jahn C Maslen M J Dennis J Chromatogr Biomed 566 228 1991 S Bouquet S Guyon G Chapelle M C Perault D Barthes J Liq Chromatogr 15 1993 1992 H W Zhang K Heinig J Henion J Mass Spectrom 35 423 2000 S McClean E J O Kane W F Smith J Chromatogr B 740 141 2000 U Gutteck K M Rentsch Clin Chem Lab Med 41 1571 2003 R F Suckow T B Cooper J Pharm Sci 73 1745 1984 N Jourdil B Pinteur F Vincent C Marka G Bessard J Chromatogr Biomed 613 59 1993 A A Syed M F Silwadi S R Kirumakki N Narasimiah Acta Chromatogr 12 80 2002 A M Bougerolle J L Chabard M Jbilou H Bargnoux J Petit J A Berger G Dordain J Chromatogr Biomed 434 232 1988 C B Eap L Koeb P Baumann J Chromatogr B 652 97 1994 Determina o espectrofotom trica de trimipramina 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
216. ls Taylor amp Francis London UK 1996 H M Kingston M L Kingston Pure amp Appl Chem 66 609 1994 J Ruzicka E H Hansen Flow Injection Analysis 2 ed John Wiley and Sons New York 1988 W E Linden Pure Appl Chem 66 2493 1994 L T Skeggs Am J Clin Pathol 28 311 1957 J P Kutter ED Special issue miniaturization in analytical chemistry Talanta 56 221 2002 http www flowinjection com J Ruzicka H Hansen Anal Chim Acta 78 145 1975 H Bergamim F E A G Zagatto F J Krug B F Reis Anal Chim Acta 101 17 1978 F J Krug H Bergamim F E A G Zagatto Anal Chim Acta 179 103 1986 B F Reis H Bergamim F Quim Nova 16 570 1993 W J Hurst Automation in the laboratory VHC Publishers Inc New York 1995 1 96 Introdu o Geral 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 E H Hansen Anal Chim Acta 308 3 1995 G D Christian J Ruzicka Anal Chim Acta 261 11 1992 J Alonso J Bartroli M Del Valle M Escalada R Barber Anal Chim Acta 199 191 1990 J Ruzicka G D Marshall Anal Chim Acta 237 329 1990 P J Baxter G D Christian Acc Chem Res 29 515 1996 J Ruzicka E H Hansen Anal Chem 72 212A 2000 G D Christian Analyst 119 2309 1994 J L M Santos Sistemas de fluxo multicomutado aplicados an lise de prod
217. ls o originando uma r pida e intima mistura de reagentes Neste sentido o volume do pulso que determinado pelas caracter sticas estruturais das micro bombas que podem ser como j referido de 3 8 25 e 50 uL um par metro de grande import ncia em rela o efic cia de homogeneiza o da zona de reac o porque o fluxo originado pelo funcionamento das micro bombas constitu do por segmentos de volumes correspondentes aos volumes internos das micro bombas Quanto menor for o 1 83 Introdu o Geral volume interno das micro bombas tamb m menor o volume de cada segmento de solu o introduzida no sistema As micro bombas conferem elevada versatilidade aos sistemas de fluxo desenvolvidos o que possibilita a utiliza o de diferentes procedimentos para a manipula o das amostras incluindo desde varia es no volume introduzido que dependente do n mero de pulsos at a diferentes estrat gias de amostragem como por exemplo amostragem bin ria e conflu ncia de zonas sem necessidade de reconfigura o da montagem anal tica Sendo as micro bombas respons veis pela introdu o individual de amostra e reagentes um sistema de fluxo baseado no conceito de multi impuls o possibilita um efectivo e preciso controlo do volume introduzido de amostra e dos volumes das restantes solu es sejam estes definidos com base numa inser o temporizada ou com base numa contagem de pulsos d
218. lso ms Pl P2 P3 P4 1 ON ON OFF OFF 10 300 2 OFF OFF ON ON 4 300 3 ON ON OFF OFF 50 300 Etc a Determina o quimioluminom trica de pirazinamida _ oC eee teto rr te 6 3 1 Optimiza o dos par metros qu micos A optimiza o dos par metros qu micos que influenciavam o sinal de quimioluminesc ncia foi realizada atrav s de um m todo univariado isto eram fixados todos os par metros envolvidos na determina o qu mica com excep o do par metro a optimizar Assim as condi es qu micas iniciais de trabalho foram definidas tendo em considera o trabalhos realizados por outros autores que envolviam a reac o de quimioluminesc ncia do luminol catalisada pelo cati o cobre II 48 49 Deste modo preparou se uma solu o 2 5 x 10 mol L de per xido de hidrog nio uma solu o 2 mg L de cati o cobre II em solu o de cido sulf rico com concentra o 2 x 10 mol L uma solu o de luminol com concentra o 4 x 10 mol L em solu o 2 x 10 mol L de hidr xido de s dio e uma solu o 20 mg L de pirazinamida Em rela o estrutura da montagem anal tica para os primeiros ensaios de optimiza o os reactores L e L Figura 6 4 representavam as liga es entre os componentes reduzidas ao m nimo que as condi es f sicas entre os componentes permitiam enquanto o reactor Lz tinha 30 cm de comprimento Os par metros de configura o
219. lume de amostra de 16 uL inserido pela estrat gia de amostragem bin ria Estes resultados obtidos foram muito semelhantes aos obtidos com a estrat gia conflu ncia de 5 33 Determina o espectrofotom trica de isoniazida zonas mas superiores aos obtidos com a estrat gia de inser o de volumes nicos de amostra Ali s por observa o da Figura 5 14 verificou se que os resultados obtidos para a amostragem bin ria se sobrepuseram com frequ ncia aos obtidos com a estrat gia de conflu ncia de zonas para todos os caudais avaliados Ocorreu obviamente para a utiliza o da estrat gia de volumes nicos uma diferen a significativa na amplitude dos sinais anal ticos que foram inferiores aos obtidos com as outras estrat gias sendo esse facto mais acentuado para valores elevados de volumes de amostra mais concretamente para volumes de amostra entre 16 e 40 L de notar que para um volume de amostra de 8 uL o sinal anal tico diminuiu conforme aumentava o caudal o que pode ser explicado pelo aumento da dispers o mas insuficiente tempo de reac o Para este volume em todos os ensaios n o se verificou a ocorr ncia de duplos picos Este comportamento foi partilhado pelas tr s estrat gias de amostragem que produziram sinais anal ticos equipar veis Significa portanto que em todas as situa es se conseguiu misturas eficientes de amostra com reagente Elevados volumes de amostra 32 a 40 uL n o foram
220. m bin ria e a inclus o de um processo de filtra o em linha na montagem de fluxo melhora notoriamente o tempo requerido para an lise Esta metodologia de fluxo 7 2 Conclus es Finais combinou a capacidade de mistura homog nea r pida conferida pela amostragem bin ria com um controlo efectivo da dispers o devido vers til inser o de amostra com base no tempo que possibilita a inser o alternada de al quotas de reduzido volume de amostra e reagente contribuindo significativamente para o aumento da extens o da mistura das solu es dispensando deste modo a obrigatoriedade de utiliza o de reactores de maiores dimens es para promover a mistura das solu es o que originava inevitavelmente um aumento da dispers o A estrat gia desenvolvida para a determina o de trimipramina em prepara es farmac uticas atrav s de um sistema de fluxo multicomutado resultou numa metodologia que para al m de envolver todas as vantagens citadas para o trabalho anterior explora um novo procedimento de homogeneiza o consistindo na combina o da estrat gia de amostragem bin ria com a invers o de fluxo sendo este ltimo procedimento t pico do conceito de SIA Este novo procedimento de homogeneiza o das solu es num sistema de fluxo resultou numa elevada efici ncia de mistura n o sendo necess rio recorrer a reactores de maiores dimens es para promover a mistura das solu es o que permiti
221. m compromisso entre o ritmo de amostragem e a sensibilidade o que como resultado de uma r pida homogeneiza o da zona de amostra podia ser aumentado atrav s da limita o da dispers o de amostra para as experi ncias seguintes seleccionou se uma sequ ncia de intercala o consistindo Determina o espectrofotom trica de trimipramina em 11 ciclos de 1 segundo de amostra 0 25 segundos de monovanadato de am nio e um caudal de 1 5 mL min Resumindo os tempos totais de inser o eram de 11 segundos para a solu o de trimipramina e 3 segundos para a solu o de monovanadato de am nio cada ciclo de inser o come ava e terminava com um segmento de volume de monovanadato de am nio Uma importante vantagem inerente metodologia desenvolvida que os produtos da reac o s o transportados em direc o ao sistema de detec o sobre uma press o positiva enquanto que geralmente em multicomuta o 40 o sistema de propuls o colocado ap s o detector sendo a zona de reac o transportada por aspira o A utiliza o de press es positivas reduz a ocorr ncia de bolhas de ar como sucede com press es negativas o que pode comprometer seriamente a detec o 4 3 1 An lise de formula es farmac uticas Para avaliar a metodologia desenvolvida na determina o da trimipramina em formula es farmac uticas foi investigada a influ ncia de alguns compostos utilizados normalmente como ex
222. m virtude dos resultados anteriores embora aparentemente uma bureta autom tica n o origine pelo menos em condi es normais de dispers o uma corrente de fluxo que possa ser considerada sem d vida um fluxo pulsado o volume debitado por cada passo executado pela bureta e a estrat gia de amostragem desempenham um efeito importante na amplitude da resposta 5 17 Determina o espectrofotom trica de isoniazida anal tica Esta influ ncia deve se ao facto de tanto o volume de passo como a estrat gia de amostragem utilizada afectarem n o apenas o transporte das solu es mas igualmente a homogeneiza o da zona de reac o Assim para estudar experimentalmente este facto foi desenhado um ensaio envolvendo uma solu o 50 ug ml de isoniazida e uma solu o 5x10 mol L de NQS e que serviu para avaliar a influ ncia na resposta anal tica de tr s distintas estrat gias de inser o de amostra amostragem bin ria conflu ncia de zonas e volumes nicos de amostra 47 O ensaio realizou se atrav s do registo do sinal anal tico em fun o dos volumes de amostra inserida no sistema para cada uma das diferentes estrat gias de amostragem e tamb m para distintos volumes de passo das buretas 1 2 e 4 uL Estes diferentes volumes de passo foram conseguidos recorrendo a seringas de diferentes capacidades 2 5 5 e 10 mL a que correspondem volumes de passo 1 2 e 4 uL respectivamente estes valores
223. ma J M Paulis Quim Anal 6 278 1987 B F Reis M F Gin E A G Zagatto J L F C Lima R A Lapa Anal Chim Acta 293 129 1994 British Pharmacopoeia 1998 Vol II The Stationery Office London 1998 H A Mohamed H Y Hassan A I Mohamed S A Hussein Anal Lett 25 63 1992 B Renfroe C Harrington G R Proctor Azepines Part I Wiley New York 1984 Wieslawa Misiuk J Pharm Biomed Anal 22 189 2000 Determina o espectrofotom trica de clomipramina 46 A Mohamed Horria Y Hassan Hoda I Mohamed Abdel Maboud A Hussein Samiha Anal Lett 25 63 1992 47 J Karpinska B Starczewska Pharmazie 54 41 1999 48 M Valcarcel M D L Castro Flow Injection Analysis Principles and Applications Ellis Horwood Chichester 1987 CAP TULO 4 DETERMINA O DE TRIMIPRAMINA COM UM SISTEMA AUTOM TICO MULTICOMUTADO COM INVERS O DE FLUXO Neste cap tulo proposta uma metodologia anal tica baseada no conceito de multicomuta o a qual combina a amostragem bin ria com a utiliza o de uma invers o do sentido do fluxo para a determina o de trimipramina em prepara es farmac uticas A intercala o de pequenos segmentos de amostra e reagente favorecendo a mistura das solu es e a combina o com a estrat gia de invers o de sentido do fluxo de modo a aumentar a interpenetra o de zonas resultou num desenvolvimento r pi
224. ma para nova determina o Atrav s da activa o dos solen ides das v lvulas V e V2 para a posi o 2 o transporte das solu es inseridas em V era direccionado pelo canal alternativo L da montagem evitando deste modo a passagem do l quido pelo reactor L e pelo detector Como o canal Lz era de reduzidas dimens es o tempo para an lise entre amostras era reduzido Determina o espectrofotom trica de clomipramina ea eree visto que a etapa para troca de solu o de amostra se realizava mais rapidamente at porque a velocidade de aspira o da bureta autom tica era programada para valores superiores em rela o aos valores de caudal estabelecidos para as an lises Ao contr rio das outras etapas em que a actua o da bureta era efectuada atrav s da programa o do intervalo de tempo de execu o entre cada passo na etapa de troca de solu es as instru es programadas eram as correspondentes desloca o directa do embolo da seringa entre as posi es extremas de acordo com as instru es do fabricante de modo a rentabilizar a velocidade m xima de aspira o da bureta Nesta situa o n o ocorria programa o de caudal dado que a velocidade de desloca o do embolo era a m xima permitida pela bureta N o se realizaram ensaios de medi o dos caudais originados por este modo de actua o da bureta porque esse procedimento de aspira o era apenas utilizado na etapa de troca
225. ma v lvula multiposi o controlada por computador cuja porta central est ligada atrav s de uma al a de armazenamento a uma seringa autom tica de elevada precis o que utilizada para o transporte de solu es para a al a de armazenamento para a sua mistura e para o transporte da zona de reac o para o detector Nos sistemas LOV a miniaturiza o conseguida atrav s da utiliza o de um componente monobloco Figura 1 44 que montado sobre a v lvula multiposi o de uma montagem SIA Figura 1 45 Introdu o Geral Figura 1 44 Fotografia de uma Unidade Central de Processamento da Amostra Adaptado de 87 Figura 1 45 Montagem de fluxo LOV P unidade de propuls o Pa unidade de propuls o auxiliar L al a de armazenamento V v lvula multiposi o CSPU unidade central de processamento da amostra A amostra Fe feixe de entrada Fs feixe de sa da W dreno 1 79 Introdu o Geral mmaLU Este componente designado por Unidade Central de Processamento da Amostra CSPU do ingl s Central Sample Processing Unit foi engenhosamente idealizado e desenvolvido de modo a integrar uma porta de injec o de amostra canais de acesso para reagentes e uma c lula de fluxo que possibilita o acoplamento de diversos sistemas de detec o espectrosc picos como por exemplo absorv ncia reflect ncia e fluoresc ncia De
226. maneira diversos problemas derivados de dispers o da luz excita o n o selectiva ou instabilidade na intensidade da fonte de luz 1 3 M todos de Fluxo Tal como se referiu anteriormente os m todos de an lise em fluxo s o tradicionalmente definidos como baseados na introdu o de uma al quota de amostra num fluxo transportador seja ele l quido ou gasoso e que pode ser simultaneamente um reagente ou n o formando uma zona de amostra que transportada at uma unidade de detec o onde ocorre a medi o de uma propriedade f sica ou qu mica relacionadas normalmente com a concentra o ap s reac o com um ou mais reagentes No entanto os m todos em fluxo podem 1 19 Introdu o Geral funcionar apenas como m todo de transporte da amostra at ao detector sem que ocorra qualquer reac o como ocorre em algumas metodologias de fluxo com sistemas de detec o por espectrofotometria de absor o at mica com atomiza o por chama Com a constante e crescente evolu o tecnol gica a acompanhar os desenvolvimentos na investiga o em fluxo surgiram novas t cnicas que impuseram uma reclassifica o dos m todos em fluxo com inevit veis ramifica es 26 Em continua o com a divis o dos m todos autom ticos exposta anteriormente os m todos cont nuos de an lise autom tica podem ser divididos em dois tipos gerais m todos cont nuos segmentados e m todos cont nuos n o segmentad
227. me de pL por passo das buretas combinado com a estrat gia de amostragem bin ria para inser o das solu es de amostra no sistema constituiu um procedimento mais vers til e que assegurou um controlo rigoroso e minucioso da introdu o de amostra no sistema anal tico providenciando os meios para a implementa o de sistemas de fluxo compactos dada a efici ncia nos processos de homogeneiza o sem implicar a presen a de reactores maiores ou outros dispositivos promotores de mistura Adicionalmente a estrat gia referida possibilitou a minimiza o dos volumes de reagente consumido 5 26 Figura 5 10 A B C Amplitude de sinal cm Amplitude de sinal cm E Amplitude de sinal cm Determina o espectrofotom trica de isoniazida 5 00 4 00 3 00 2 00 1 00 E 0 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL 5 00 4 00 3 00 2 00 1 00 0 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra uL 5 00 4 00 3 00 2 00 1 00 0 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pL Avalia o da influ ncia no sinal anal tico da estrat gia de inser o de amostra utilizada em fun o do volume de amostra A seringa de 2 5 mL B seringa de 5 0 mL C seringa de 10 0 mL o amostragem bin ria volumes nicos A conflu ncia de zonas 5 27 Determina o espectrofotom trica de isoniazida A 5 00 4 00 3 00 2 0
228. mida um p branco ligeiramente sol vel na gua pouco sol vel no lcool e no cloreto de metileno e muito pouco sol vel no ter 2 Actualmente a sa de mundial depara se com o problema do aumento gradual da resist ncia da tuberculose ao tratamento com os antibi ticos utilizados Este facto tem adquirido tais dimens es que a Organiza o Mundial de Sa de recomenda um tratamento de dura o de seis meses envolvendo uma terapia de associa o isto a aplica o de diversos antibi ticos como por exemplo rifampicina isoniazida pirazinamida e etambutol administrados em associa o nos dois primeiros meses seguido nos restantes quatro meses de uma terapia com rifampicina e pirazinamida A pirazinamida uma droga muito importante no 6 1 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida tratamento da tuberculose porque contribui para diminuir o tempo de dura o do tratamento quimioter pico aplicado actualmente 1 A descoberta dos efeitos de actividade da pirazinamida no tratamento da tuberculose teve in cio em 1945 quando Chorine descobriu que a nicotinamida vitamina B3 tinha actividade inibit ria sobre a bact ria Mycobacterium tuberculosis 3 Este facto tamb m foi verificado em 1948 por McKenzie et al nos Laborat rios Lederle de American Cyanamid 4 Nestes laborat rios prosseguiram estudos conjuntamente com os laborat rios Merck onde descobriram que a pir
229. mina 10 mg mL H2S04 5 0 mol L 3 19 Determina o espectrofotom trica de clomipramina Pelos resultados representados na Figura 3 7 observa se um aumento acentuado do sinal anal tico resultante da oxida o da clomipramina com vanadato de am nio com concentra es do reagente at aproximadamente 5 0x10 mol L ocorrendo ap s este valor uma estabiliza o da resposta anal tica Este facto indica uma satura o do reagente oxidante vanadato de am nio consumido na reac o a partir do valor de 5 0x10 mol L para as condi es qu micas estabelecidas no in cio do ensaio 3 3 2 Desenvolvimento e optimiza o do sistema de fluxo Um aspecto de grande import ncia para a implementa o em fluxo do m todo espectrofotom trico seleccionado para a determina o de clomipramina em formula es farmac uticas foi a estrat gia adoptada para a inser o das amostras no fluxo Atrav s da introdu o de volumes crescentes de uma solu o de clomipramina com uma concentra o de 10 mg L verificou se que a utiliza o da t cnica de amostragem bin ria que como j referido consiste na intercala o de pequenas al quotas de solu o de clomipramina com pequenas al quotas de solu o de vanadato originando uma cadeia cont nua de interfaces amostra reagente aumentou de um modo significativo a intensidade de sinal relativamente ao sinal obtido aquando da inser o de volumes nicos de amostra
230. mina o dos res duos Quando se procura obter o m ximo de informa o poss vel durante essas etapas encontra se diversos problemas como por exemplo perda ou contamina o dos analitos extrac es ou dissolu es muito morosas selectividade e sensibilidade A automatiza o de todas as etapas de uma an lise qu mica pode ser concretizada por interm dio do conceito de an lise em fluxo 1 A an lise qu mica em fluxo surge como uma das mais relevantes estrat gias para a integra o de todas as etapas referidas acima e para o desenvolvimento de metodologias para a resolu o de problemas que possam ser limitativos da execu o rotineira de an lises qu micas como por exemplo no controlo qu mico numa ind stria farmac utica Considerando a etapa anal tica de amostragem e a necessidade de conserva o das amostras sabido que a qualidade dos resultados depende n o s da selec o apropriada e da representatividade das amostras como tamb m das altera es nas condi es das amostras do seu pr prio ambiente desde a colheita at ao transporte para o laborat rio constituindo este facto provavelmente o calcanhar de Aquiles de qualquer m todo anal tico independentemente do uso da mais sofisticada instrumenta o 1 Deste modo os conceitos de an lise em fluxo 9 que no in cio foram aplicados automa o das t cnicas de medi o 10 oferecem hoje excelentes possibilidades para a melhoria da etapa de amo
231. minado volume de solu o e quando a micro bomba desactivada essa al quota de solu o impelida para o sistema O volume de solu o envolvido na aspira o e impuls o depende do volume interno da micro bomba determinado por fabrico na origem como j referido no Cap tulo 2 Em concord ncia com recomenda es providenciadas pelo fabricante o tempo durante o qual o solen ide das micro bombas deve ser activado foi definido por um valor constante de 150 ms no programa de controlo do sistema Esse tempo assim definido como sendo o suficiente para que as micro bombas aspirem os volumes de solu o para os quais foram desenhadas Por outro lado o tempo decorrente entre activa es dos solen ides e portanto correspondente ao per odo de tempo em que o solen ide estava desactivado correspondente a um tempo de pulso Este tempo de pulso tamb m denominado de tempo de pulso por corresponder ao intervalo de tempo entre a execu o de pulsos pelas micro bombas define o par metro frequ ncia de pulso termo esse referido na literatura relativa aos sistemas de fluxo baseados no conceito de multi impuls o 45 Por motivos de simplifica o os tempos definidos no programa de controlo e referidos ao longo deste cap tulo s o os correspondentes ao tempo de pulso frequ ncia de pulso Deste modo o caudal no sistema de fluxo foi definido pela programa o do tempo decorrente entre activa es dos solen ides tempo de pul
232. miniaturiza o 28 As metodologias em fluxo cont nuo s o as mais divulgadas na comunidade cient fica porque representam um vasto leque de ferramentas que possibilitam eficazmente a automatiza o de processos de an lise Deste modo estes m todos ser o alvo de uma abordagem mais detalhada no mbito do trabalho desenvolvido 1 3 1 M todos de Fluxo Cont nuo r E evidente que a constante evolu o tecnol gica provocou a ramifica o da An lise em Fluxo Ap s a realiza o de milhares de estudos e aplica es de An lise por Injec o em Fluxo surgiu a metodologia An lise por Injec o Sequencial depois a Multicomuta o a Multiseringa seguido de Lab On Valve e muito recentemente a Multi Impuls o Em seguida apresenta se uma breve refer ncia das metodologias de fluxo referidas acima sendo a multicomuta o e multi impuls o apresentadas com maior desenvolvimento por serem as estrat gias de fluxo utilizadas na disserta o 1 2 Introdu o Geral 1 3 1 1 An lise por Injec o em Fluxo Nas ltimas d cadas as potencialidades dos m todos de Fluxo Cont nuo foram evidenciadas pelos milhares de trabalhos cient ficos publicados incidindo estes na An lise por Injec o em Fluxo 29 muito embora na ltima d cada outras metodologias de fluxo tenham sido alvo de investiga o e desenvolvimento A An lise por Injec o em Fluxo FIA Figura 1 1 surgiu face necess
233. multicomuta o est o fundamentalmente associadas com as caracter sticas operacionais das v lvulas solen ides Destacam se a inferior robustez e press es de trabalho inferiores as v lvulas solen ides utilizadas nesta disserta o apresentam uma press o m xima de trabalho de 30 psi embora o mesmo fabricante disponibilize v lvulas que permitem trabalhar a press es de 60 psi A inferior robustez das v lvulas solen ides origina a longo prazo custos superiores de manuten o embora no caso de um sistema de multicomuta o seja poss vel a substitui o de uma v lvula sem afectar a restante montagem sendo que em SIA a substitui o da v lvula selectora multiposi o acarreta imediatamente um custo bastante superior al m de afectar toda a montagem anal tica Em conclus o atrav s da combina o de um conjunto de caracter sticas operacionais muito vantajosas como por exemplo a simplicidade das montagens anal ticas e seu funcionamento e o conceito de inser o de amostra por amostragem bin ria a multicomuta o possibilita os meios para atingir um desenvolvimento r pido da reac o baixo consumo de reagentes e uma variedade alargada de interven es sobre a zona de amostra sem implicar modifica es na configura o da montagem Estas capacidades podem ser aperfei oadas atrav s da utiliza o em simult neo de uma metodologia de amostragem baseada em tempo que permite a selec o do volume de amostra mais apropri
234. na estudadas Adicionalmente observou se que para concentra es de cido inferiores a 3 3 mol L o sinal anal tico obtido quando a solu o de clomipramina era acidulada com cido n trico era superior ao obtido para a mesma concentra o de clomipramina quando acidulada com cido sulf rico ou clor drico mas esta situa o alterou se para concentra es mais elevadas de cido onde os outros cidos originavam valores de absorv ncia superiores indicando uma maior extens o de reac o com cido sulf rico e clor drico Verificou se tamb m um r pido desenvolvimento da reac o em cido n trico acompanhado de uma menor estabilidade dos produtos de oxida o em concentra es de cido superiores a 3 3 mol L porque verificou se visualmente que para concentra es de cido n trico 5 0 ou 6 0 mol L a colora o azul desaparecia t o rapidamente quanto o seu aparecimento Deste modo com o aumento da concentra o de cido o correspondente aumento na extens o da reac o em meios acidulados com cido sulf rico ou clor drico garantia que o desenvolvimento de cor fosse maximizado Quando se realizou a oxida o da clomipramina com o reagente vanadato de am nio acidulado com solu o de cido sulf rico 6 0 mol L obteve se o sinal anal tico mais elevado Tendo em considera o que a diferen a de sinal anal tico obtido com as solu es de cido sulf rico 5 0 e 6 0 mol L n o foi significativo de mo
235. nal ticos tais como dilui es adi es de reagentes misturas e aquecimentos Cada amostra encaminhada mecanicamente para um detector como por exemplo um espectrofot metro ou um volt metro onde se realiza a medida da grandeza que vai ser relacionada com a concentra o da esp cie na amostra Como resultado deste procedimento obtido um conjunto de sinais discretos correspondendo cada um a uma das amostras introduzidas no instrumento autom tico ii Os m todos robotizados s o essencialmente caracterizados por um bra o mec nico que mimetiza as tarefas realizadas por um operador humano mas com a vantagem de serem realizadas com maior rapidez e eliminando erros do operador O bra o mec nico controlado por computador sendo este tamb m respons vel pela aquisi o e tratamento dos dados anal ticos O dispositivo mec nico pode exercer diversas fun es de acordo com as rotinas de programa o que podem ser adicionalmente de aprendizagem e ou auto programa o Alguns exemplos de automa o laboratorial s o bem conhecidos e incluem tituladores autom ticos colectores de amostras 1 17 Introdu o Geral iii Os m todos cont nuos em que a amostra ou amostras s o sucessivamente introduzidas num fluxo l quido ou gasoso que pode ser reagente ou n o e que desde o ponto de introdu o at unidade de detec o sofrem processos reactivos qu micos ou f sicos que origi
236. nal ticos r pidos mecanizados ou automatizados Esse controlo pode incidir na determina o de um princ pio activo ou princ pios activos das formula es farmac uticas ou em estudos cin ticos da sua liberta o dessas formula es A possibilidade de adapta o em alguns casos dos m todos discretos caracterizados por serem dispendiosos e demorosos por m todos de an lise em fluxo autom ticos para a determina o de 1 18 Introdu o Geral uma determinada subst ncia de interesse sempre vantajoso Consequentemente o n mero de tais procedimentos desenvolvidos para aplica o farmac utica est constantemente a aumentar Em virtude da maioria dos f rmacos serem compostos org nicos os m todos espectrofotom tricos e de luminesc ncia s o os mais explorados como m todo de detec o acoplado a estes sistemas 23 A espectrometria de absor o molecular sem d vida o m todo de detec o mais utilizado nos laborat rios anal ticos devido larga disponibilidade e acessibilidade dos instrumentos requeridos O grande n mero de trabalhos realizados recorrendo a esta t cnica de detec o consequ ncia da sua excelente flexibilidade na adapta o a uma grande variedade de problemas anal ticos O interesse anal tico nos m todos de quimioluminesc ncia deriva do facto de ocorrer a forma o de mol culas fluorescentes sem implicar a aplica o de irradia o pr via evitando desta
237. nald T A Nieman Anal Chem 57 936 1985 http www rxlist com CAP TULO 7 CONCLUSOES FINAIS Neste capitulo s o apresentadas as conclus es finais e realizada uma avalia o geral do trabalho desenvolvido sendo salientado os seus aspectos mais relevantes Conclus es Finais Com este trabalho pretendeu se desenvolver metodologias anal ticas autom ticas baseadas em sistemas de fluxo que contribu ssem para vincar as enormes potencialidades das t cnicas de fluxo quando utilizadas como ferramentas para o desenvolvimento e implementa o de sistemas autom ticos de an lise na execu o de determina es anal ticas Visto que ocorreu a n vel mundial um aumento da procura da produ o de formula es farmac uticas e consequentemente do controlo de qualidade da sua produ o outro dos objectivos deste trabalho foi estender a aplica o dos sistemas autom ticos de fluxo an lise de v rios produtos farmac uticos O desenvolvimento de sistemas de fluxo para a avalia o de alguns par metros envolvidos no controlo da qualidade de formula es farmac uticas constitui uma alternativa com vantagens aos procedimentos reconhecidos internacionalmente nas mais diversas farmacopeias nos quais se referem etapas fastidiosas e longas de pr tratamento de amostras e ou a necessidade de recorrer a equipamento sofisticado e de operadores especializados para a sua utiliza o
238. nam transi es no sinal anal tico O fluxo rejeitado sa da do sistema e o sinal fornecido pelo instrumento de medida registado num instrumento conveniente O sinal fornecido pelo instrumento de medida do tipo cont nuo isto medido ininterruptamente em fun o do tempo originando cada amostra um sinal transit rio em forma de curva cujas caracter sticas geralmente a altura m xima se relaciona com o par metro que se quer medir em cada amostra Os requisitos exig veis a analisadores para uma monitoriza o desejavelmente devem englobar um reduzido consumo de amostra e reagentes um elevado ritmo de amostragem rapidez de an lise especificidade e selectividade mesmo quando as amostras s o de matriz complexa estrutura o simples f cil manuten o e possibilidade de automatiza o em todas as etapas da an lise desde a amostragem s medi es e tamb m calibra es peri dicas Ainda se inclui baixos custos de instala o opera o e manuten o por influ ncia da sua estrutura modular que lhe confere flexibilidade em situa es de necess ria reconfigura o para adapta o a novas aplica es anal ticas As metodologias de automatiza o que t m maior potencialidade para responder aos requisitos apresentados s o os m todos em fluxo especialmente os de fluxo cont nuo O controlo de qualidade de formula es farmac uticas cada vez mais desafiante para os analistas qu micos e requer procedimentos a
239. nar do ve culo ou base da formula o ou ainda de eventuais subst ncias activas presentes Apesar disso a prepara o da amostra pode conduzir na maioria das situa es a modifica es qu micas do composto em an lise dando origem a compostos quimicamente aparentados que podem interferir na determina o Adiconalmente o elevado n mero de manipula es tamb m envolvido aumenta a probabilidade da ocorr ncia de erros aleat rios Neste 1 10 Introdu o Geral sentido as determina es daqui decorrentes tornam se menos exactas e ou precisas al m de n o se adequarem s an lises de rotina requeridas no controlo da qualidade de um produto em fabrico N o ser pois surpreendente que estes m todos cl ssicos de separa o tenham dado lugar em numerosas monografias apresentadas nas mais recentes edi es das farmacopeias aos m todos instrumentais correspondentes No entanto as t cnicas instrumentais separativas s o tamb m aquelas que predominam na escolha dos v rios investigadores em trabalhos dedicados an lise de formula es farmac uticas Por entre as v rias t cnicas instrumentais separativas destaca se claramente a cromatografia A t cnica cromatogr fica mais utilizada baseada em sistemas de Cromatografia L quida de Alto Desempenho HPLC associados a um detector mais ou menos universal O sistema de detec o mais frequentemente utilizado um espectrofot metro de ultraviol
240. nda de 565 nm No mesmo ano outro trabalho 29 envolveu uma reac o com ferro III e subsequente reac o com cianeto de ferro em cido ac tico originando produtos de reac o com m ximo de absorv ncia no intervalo de comprimentos de onda de 720 a 730 nm No entanto muitos dos m todos referidos requerem longos tempos de an lise ou equipamento relativamente muito dispendioso Por exemplo o m todo de refer ncia da Farmacopeia Europeia 30 envolve uma titula o potenciom trica em meio n o aquoso da trimipramina com uma solu o 0 1 M de cido percl rico em cido ac tico glacial Na determina o de trimipramina as vantagens associadas s metodologias anal ticas autom ticas foram muito pouco exploradas sendo somente poss vel encontrar uma refer ncia na literatura relativa determina o da trimipramina atrav s de uma metodologia de An lise por Injec o em Fluxo FIA Neste cap tulo estudou se a possibilidade de desenvolvimento de um sistema multicomutado para a determina o de trimipramina em formula es farmac uticas Determina o espectrofotom trica de trimipramina Co iii iii O iii i ees Uma das muitas caracter sticas que pode ser usada para caracterizar ou estabelecer semelhan as ou diferen as entre t cnicas de fluxo cont nuo a estrat gia empregue para efectuar a mistura entre amostra e reagente De acordo com o que j foi referido no Cap tulo 1 enquan
241. near A montagem anal tica por explora o da amostragem bin ria permitia a inser o de frac es volum tricas vari veis de amostra possibilitando dilui es atrav s da intercala o temporizada de uma solu o diluente de modo a que mantendo constante o volume amostrado a frac o volum trica da amostra fosse reduzida A raz o entre a frac o volum trica inicial e a ajustada comparada numa base de tempo definia o n vel de dilui o produzido Com a mesma finalidade Gouveia et al dois anos mais tarde 69 desenvolve um sistema anal tico Figura 1 28 que possibilitava a dilui o da amostra em linha sempre que o sinal anal tico gerado pelo analito fosse superior zona de resposta linear atrav s de dois procedimentos alternativos para a redu o do volume de amostragem diminui o do tempo de amostragem aquando da inser o de uma nica al quota fazendo o variar entre 0 05 e 2 segundos correspondendo um inferior tempo a um volume inferior de amostra inserido e 1 61 Introdu o Geral por redu o da frac o volum trica da amostra no caso do recurso amostragem bin ria resultando num aumento da raz o volume de reagente volume de amostra Este sistema permitia realizar ensaios de dissolu o de comprimidos Figura 1 27 Montagem de fluxo para a determina o de c lcio com dilui o autom tica PP bomba perist ltica V a Vs v lvulas solen ides
242. ntes Assim um volume de zona de amostra de 160 uL 94 uL de amostra correspondente a cinco ciclos de intercala o de amostra cloreto de b rio sulfato com volumes de 18 8 9 9 3 3 uL respectivamente foi usada para uma gama de concentra es entre 0 150 mg L enquanto que uma zona de amostra de 132 uL 54 uL de amostra obtida com quatro ciclos a 13 2 9 9 3 3 uL das mesmas solu es foi usada para an lise no intervalo 100 500 mg L J em 1995 Kom et al 56 exploraram a estrat gia de amostragem bin ria num sistema de fluxo multicomutado para encontrar o ponto de equival ncia em titula es com detec o espectrofotom trica do ponto final Este sistema Figura 1 18 rentabilizava vantagens da amostragem bin ria num fluxo com caudal constante e possibilitou determina es num intervalo amplo de concentra es sem necessidade de reconfigura es f sicas da montagem A titula o por procura bin ria proposta neste trabalho consistia na procura da menor varia o da frac o volum trica de titulante titulado que produzia uma varia o na cor do indicador Este processo foi implementado atrav s da fixa o de um volume total de titulante titulado e variando as frac es volum tricas de ambas as solu es fazendo variar as al quotas de amostra e titulante inseridas por amostragem bin ria Como vantagens salienta se o curto tempo necess rio para uma titula o fornecendo ao mesmo tempo resultados precisos e um c
243. nto L e depois um segmento da zona de amostra era impulsionada para o ponto de conflu ncia para mistura com o reagente A seringa da bureta autom tica B estava sempre preenchida com gua bidesionizada que era utilizada como transportador da solu o de amostra Durante a etapa de substitui o da solu o de amostra tal como acontecia com a configura o anterior Figura 5 3 a bureta autom tica era operada numa frequ ncia de passo elevada Como em ambas as configura es o caminho anal tico era o mesmo os resultados obtidos eram id nticos No entanto quando era usada a v lvula solen ide o consumo das solu es reduzia acentuadamente porque n o era necess rio o enchimento da 5 12 Determina o espectrofotom trica de isoniazida ms m Ns seringa da bureta autom tica e sua lavagem com a solu o de amostra a determinar Adicionalmente a versatilidade de funcionamento do sistema tamb m aumentou pois a etapa de substitui o da solu o de amostra realizava se de modo a prevenir a mistura de diferentes solu es Figura 5 4 Diagrama da montagem de fluxo para a determina o de isoniazida B e Bz Buretas autom ticas equipadas com seringas de 2 5 mL para a introdu o de amostra e reagente respectivamente V V lvula solen ide de comuta o 3 vias A Solu o de amostra C Solu o de reagente transportador H Agua L e Lz Reactores X ponto
244. nto e de aquisi o e controlo de sinais da marca Advantech modelo PCL 818L para uma outra placa da marca NResearch Inc USA modelo CoolDrive sendo esta ltima um circuito de alimenta o das micro bombas Todo o sistema foi controlado atrav s do microcomputador por interm dio de um programa desenvolvido em linguagem BASIC Microsoft Os tubos de fluxo e os reactores eram em PTFE da marca Omnifit e com di metro interno de 0 8 mm Tamb m foram utilizados adaptadores constru dos no laborat rio conectores e conflu ncias 46 6 2 3 Montagem de fluxo A configura o f sica da montagem anal tica desenvolvida neste trabalho foi concebida com o objectivo de possibilitar uma f cil manipula o de cada solu o envolvida na reac o tendo em especial aten o a import ncia da reac o da amostra com o cati o cobre ID Na Figura 6 4 encontra se representada a montagem anal tica utilizada para a determina o de pirazinamida 6 11 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Figura 6 4 Diagrama do sistema de fluxo para a determina o de pirazinamida P a P4 micro bombas de 8 nL Li Lz L reactores de 15 cm 25 cm e 25 cm respectivamente X ponto de conflu ncia F c lula de fluxo PMT fotomultiplicador R solu o de luminol R solu o de per xido de hidrog nio R solu o de cati o cobre II S solu o de amostra pirazinamida W
245. o ou seja multicomuta o e multi impuls o 2 3 1 Montagens de fluxo baseadas no conceito de multicomuta o 2 3 1 1 Sistemas de propuls o e transporte O conceito de multicomuta o permite tal como foi referido anteriormente que um sistema de an lise em fluxo seja operado com base em redes de fluxo atrav s duma selec o de percursos anal ticos Esta caracter stica possibilita a inser o selec o e transporte quer de reagentes quer de amostras num mesmo canal de fluxo por interm dio da coloca o do sistema propulsor ap s o detector Nesta perspectiva a escolha do sistema propulsor da montagem de fluxo e a op o entre efectuar aspira o ou impuls o das solu es ficou dependente dos seguintes factores necessidade da obten o de um caudal constante sendo este um aspecto decisivo no sentido de assegurar uma adequada reprodutibilidade em termos de amostragem temporizada da amostra e transporte da zona de reac o simplifica o da montagem anal tica e ainda a facilidade de opera o e controlo Tendo em aten o os aspectos referidos conclui se que uma bureta autom tica 2 3 Parte Experimental rn baseada no deslocamento continuo e robusto de um mbolo re ne uma s rie de caracter sticas que confere vantagens na sua utiliza o em detrimento do uso muito generalizado das bombas perist lticas que implicavam a aplica o de diversas estrat gias para compensar efeitos ne
246. o 1 fluoro 2 4 dinitrobenzeno em meio micelar 34 5 6 Determina o espectrofotom trica de isoniazida A detec o fluorim trica tamb m foi utilizada num sistema de fluxo por Calatayud et al em que propuseram uma metodologia de fluxo com base na oxida o da isoniazida pelo per xido de hidrog nio 35 Uma metodologia automatizada de fluxo baseada na quimioluminesc ncia produzida durante a reac o entre a isoniazida e a N bromosuccinimida em meio alcalino foi proposta por Calokerinos et al 36 Este reagente tamb m foi usado numa metodologia por An lise por Injec o em Fluxo por Safani et al em 2003 37 O objectivo deste trabalho foi desenvolver uma nova metodologia de fluxo automatizada para a determina o de isoniazida em formula es farmac uticas ap s reac o com 1 2 naftoquinona 4 sulfonato de s dio NQS em meio alcalino e com detec o espectrofotom trica dos produtos da reac o no comprimento de onda 475 nm A reac o qu mica envolvida est representada na Figura 5 2 Ne NHNH SO Na NNH o l GL N Figura 5 2 Mecanismo de reac o entre a isoniazida e NQS Adaptado de 16 5 7 Determina o espectrofotom trica de isoniazida Simultaneamente foi implementado um sistema de fluxo baseado na utiliza o de m ltiplas buretas autom ticas de modo a que originassem volumes de passo entre le 4 pL As buretas autom ticas frequentemente
247. o comparado com o sinal anal tico obtido na aus ncia do composto referido Os resultados demonstraram que os excipientes celulose lactose amido de milho e estearato de c lcio n o interferiram at 100 vezes a raz o molar em rela o trimipramina O mecanismo para a determina o indirecta de um ligando org nico atrav s da complexa o com um i o met lico foi estudado anteriormente 50 e desse trabalho concluiu se que o perfil da varia o da intensidade de luz em fun o do logaritmo da concentra o do analito apresentava uma forma sigmoidal Os resultados obtidos neste trabalho de determina o da pirazinamida em formula es farmac uticas est o de acordo com o trabalho de MacDonald et al e deste modo a representa o gr fica da amplitude de sinal anal tico em fun o do logaritmo da concentra o do analito apresentava um perfil sigmoidal Figura 6 14 6 37 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida nd ia O O a ES ES 20 00 16 00 I cm ina _ N o S Amplitude de s oo o 4 00 0 00 0 0 5 1 1 5 2 2 5 3 Log Pirazinamida mg L Figura 6 14 Perfil da varia o do sinal anal tico em fun o do logaritmo da concentra o de pirazinamida O sistema de fluxo desenvolvido possibilitou obter se uma zona de resposta linear para o intervalo de concentra es de pirazinamida entre 10 mg L e 70 mg L A curva anal tica Figura 6 15 foi r
248. o da clomipramina com vanadato de am nio Um primeiro ensaio consistiu no estudo do meio cido necess rio para ocorrer a reac o de oxida o A partir dos primeiros resultados foi evidente que a velocidade de reac o era afectada pelo tipo e concentra o do cido utilizado Figura 3 5 2 0 1 5 rv ncia Abso 0 5 0 0 300 400 500 600 700 800 Comprimento de onda nm Figura 3 5 Espectros de absor o dos produtos de oxida o da clomipramina obtidos em solu es aciduladas com 5 0 mol L de a H SO b HCI c HNO3 3 15 Determina o espectrofotom trica de clomipramina A influ ncia da concentra o de cido na reac o de oxida o da clomipramina foi avaliada atrav s da an lise de uma solu o de clomipramina 10 mg L em meios acidulados com cido n trico sulf rico e clor drico num intervalo de concentra es de 2 0 a 6 0 mol L Os diversos ensaios foram realizados em cuvetes de 1 cm de percurso ptico atrav s da mistura de volumes apropriados de solu o de vanadato de am nio e solu o de clomipramina de modo a obter as concentra es a ensaiar para cada subst ncia isto 1 25x 10 M de vanadato de am nio e 10 mg L de clomipramina A solu o de oxidante para cada ensaio foi preparada na solu o de cido a testar e as solu es de clomipramina foram preparadas em gua bidesionizada Para cada ensaio foi acompanhado o desenvolvimento d
249. o de clomipramina entre outros f rmacos actuadores no Sistema Nervoso Central com um sistema de detec o na regi o do ultravioleta As dibenzoazepinas possuem estruturas reaccionais t picas conferidas pela presen a de tomos de azoto quimicamente activos que prontamente se envolvem em reac es qu micas que podem ser usadas para avalia o anal tica Em experi ncias relatadas na literatura cient fica foi demonstrado que a clomipramina reagia com oxidantes fortes em meio cido originando produtos de oxida o corados sendo a estabilidade dos produtos e a cin tica da reac o afectadas pela natureza e concentra o do cido Esta reac o qu mica sendo implementada num sistema de an lise de multicomuta o possibilita uma metodologia r pida e simples para a determina o de clomipramina em prepara es farmac uticas podendo inclusivamente a metodologia ser explorada para an lises de rotina quando combinada com todas as potencialidades anal ticas conferidas pelos sistemas de an lise multicomutados 37 Neste trabalho foi desenvolvido um sistema de an lise em fluxo que permite uma mistura em linha de solu es mais eficiente e deste modo uma homogeneiza o mais r pida da zona de reac o para a determina o espectrofotom trica da clomipramina Determina o espectrofotom trica de clomipramina e aaaea de vincar que o trabalho descrito no presente cap tulo originou a publica o
250. o de clomipramina preparadas por dissolu o e dilui es da mesma subst ncia 3 2 4 M todo de refer ncia A precis o e exactid o da metodologia descrita neste cap tulo foram avaliadas atrav s da determina o de clomipramina em formula es farmac uticas de acordo com a Farmacopeia Brit nica 42 por espectrofotometria na regi o do ultravioleta a 252 nm As formula es farmac uticas analisadas foram Anafranil 10 mg Anafranil 25 mg Anafranil 75 mg e Anafranil 25 mg 2 mL inject vel Este procedimento envolvia duas dilui es consecutivas da amostra e uma filtra o As solu es de amostra das formula es s lidas foram preparadas atrav s da selec o de uma toma rigorosamente pesada ap s a tritura o de um determinado n mero de unidades 20 a 30 comprimidos e por sua vez correspondente a aproximadamente 50 mg de f rmaco A toma rigorosamente pesada foi sujeita a agita o por uma hora em 200 mL de cido clor drico 0 1 mol L Em seguida diluiu se a solu o anterior para 250 mL e filtrou se Uma segunda dilui o foi e e aeee reter 3 12 Determina o espectrofotom trica de clomipramina realizada atrav s da dilui o de 15 mL de filtrado para 100 mL com cido clor drico 0 1 mol L A absorv ncia a 252 nm para a solu o resultante foi registada O branco utilizado foi a solu o de cido clor drico 0 1 mol L O conte do em clomipramina f
251. o espectrofotom trica de trimipramina modo de impuls o originando o redireccionamento da zona de reac o localizada dentro do reactor L para o sistema de detec o Figura 4 2 B As etapas de troca de solu es de amostra e condicionamento da montagem para a medi o seguinte eram realizadas atrav s do canal CL pela comuta o de V3 para a posi o 1 e da v lvula V para a posi o 2 Para a prepara o do sistema para an lise de outra solu o de amostra a nova solu o era aspirada para o sistema at alcan ar o reactor L e em seguida por invers o da direc o do fluxo o volume de amostra contido no reactor era direccionado pelo canal CL para esgoto evitando deste modo a passagem pelo sistema de detec o Figura 4 2 B D Com o objectivo de aumentar o ritmo de amostragem influenciado pelo tempo necess rio para a substitui o de solu es e lavagem do sistema foi realizada uma programa o para o funcionamento da bureta que recorria a diferentes caudais isto o n mero de passos a realizar pela bureta no espa o de 1 segundo variava consoante a etapa anal tica Durante a etapa de enchimento da seringa e durante a troca de amostra e prepara o do sistema o movimento do pist o era programado para a velocidade m xima o mais elevado caudal poss vel dependente das limita es da bureta mas durante a aspira o de amostra transporte da zona de reac o e detec o a velocidade era a determina
252. o publicado e dedicado multicomuta o foi realizado em 1998 por Vieira et al 55 O sistema desenvolvido neste trabalho Figura 1 17 foi aplicado determina o de sulfato em plantas por turbidimetria tendo como mais valia o facto de proporcionar determina es numa gama alargada de concentra es A montagem anal tica era constitu da por seis v lvulas solen ides dispostas em estrela em redor de um ponto de conflu ncia respons veis pela inser o por amostragem bin ria da amostra e reagentes O transporte das solu es era efectuado por um canal nico e consequentemente por aspira o pis w A Figura 1 17 Montagem de fluxo para a determina o de fosfatos V a V v lvulas solen ides de 3 vias R reactor D detector P bomba perist ltica S amostra Cs transportador R a R reagentes y conflu ncia x canal de fluxo obstruido W dreno Adaptado de 55 1 51 Introdu o Geral 8 is Sn E Neste sistema a versatilidade da multicomuta o foi demonstrada uma vez mais dado que permitia que qualquer sequ ncia ou volume de amostragem pudesse ser facilmente seleccionado sem necessidade de efectuar qualquer altera o na configura o f sica do mesmo Com base nestes estudos a utiliza o de dois volumes de amostragem possibilitou a determina o de sulfato em dois intervalos de concentra o distintos com um baixo consumo de reage
253. o tempo de amostragem at aproximadamente 12 segundos o que corresponde a 200 uL de volume de amostra Para valores superiores a 200 uL de amostra o sinal anal tico continua a aumentar mas notoriamente esses aumentos s o muito menos significativos revelando tend ncia para a estabiliza o de sinal anal tico Para um tempo de Determina o espectrofotom trica de clomipramina amostragem de 12 segundos o valor de altura de sinal era quase o dobro do valor obtido com um tempo de amostragem de 6 segundos 100 uL de volume de amostra Estes resultados Figura 3 10 B confirmam que sem a reconfigura o do sistema anal tico era poss vel realizar a an lise com diferentes sensibilidades o que resultava em zonas de resposta linear distintas De facto um tempo de amostragem de 6 segundos possibilitava a an lise de amostras num intervalo de concentra es at 50 mg L com rela o linear entre o sinal anal tico e a concentra o enquanto que para um tempo de 12 segundos a zona de resposta linear alterava para um intervalo de concentra es at 40 mg L A possibilidade de realizar determina es em amostras com concentra es muito diversas sem efectuar altera es f sicas na configura o do sistema anal tico uma caracter stica vantajosa e que pode ser particularmente til quando aplicada em estudos de dissolu o de formula es farmac uticas onde as concentra es das solu es podem ser
254. o trabalho em curso As rotinas de controlo e aquisi o foram desenvolvidas atrav s de instru es de acesso mem ria Deste modo as linhas de programa o para comuta o das v lvulas solen ides foram do tipo Parte Experimental O Si ii ia C PORT amp H300 OUT PORT 11 3 Nestas instru es procede se ao envio de um valor bin rio 3 no exemplo acima correspondente s sa das digitais a activar sa das digitais O e 1 para o valor bin rio 3 para o endere o de mem ria PORT 11 Este endere o corresponde ao endere o base amp H300 da placa definido em conformidade com as configura es da placa de aquisi o e controlo e corresponde s sa das digitais 0 7 2 3 2 Montagens de fluxo baseadas no conceito de multi impuls o 2 3 2 1 Sistemas de propuls o inser o e transporte Uma montagem anal tica de um sistema de fluxo baseado no conceito de multi impuls o envolve um determinado n mero de micro bombas correspondente ao n mero de solu es de que depende a determina o anal tica O desenvolvimento destes sistemas de fluxo n o requer a utiliza o de outros componentes activos a n o ser unicamente as micro bombas Para a montagem dos sistemas anal ticos utilizou se micro bombas da marca Bio Chem Valve Inc que debitavam 8 uL embora tamb m existam no mercado estes dispositivos com d bitos de 25 e 50 pL Por d bito de 8 pL indica
255. ogias de refer ncia Ser o feitas refer ncias especiais s v lvulas de inser o utilizadas dado o papel preponderante que desempenham nas montagens desenvolvidas determinando e caracterizando o desempenho dos sistemas de fluxo implementados 2 2 Reagentes e solu es A gua utilizada na prepara o das solu es foi gua bidesionizada com uma condutividade inferior a 0 1 uS cm Os reagentes utilizados para a prepara o das solu es foram de qualidade p a ou semelhante sem qualquer processo de tratamento ou purifica o adicional De igual modo os f rmacos na sua forma pura usados na prepara o das solu es Parte Experimental padr o foram sempre que poss vel seleccionados de acordo com as caracter sticas exigidas pela Farmacopeia Portuguesa VI 1 2 3 Equipamento e instrumenta o A gua bidesionizada utilizada na prepara o das solu es foi obtida por passagem sequencial atrav s de duas colunas com resinas da marca Millipore adaptadas num sistema de ultra purifica o da gua da marca Milli Q modelo RG Para a medi o autom tica de volumes rigorosos recorreu se a pipetas da marca Gilson de volume regul vel modelos P100 P200 P1000 e P5000 verificando periodicamente as suas condi es de funcionamento de acordo com o procedimento especificado pelo fabricante Nos m todos de refer ncia que envolviam determina es espectrofotom tricas com o objectivo de a
256. oi calculado atrav s de uma rela o indicada na farmacopeia em que se considera o valor 226 para a absorv ncia espec fica de uma solu o a 1 por cento massa volume na espessura de 1 cent metro 1 1 cm no comprimento de onda 252 nm 3 3 Resultados e discuss o 3 3 1 Ensaios preliminares por procedimentos discretos Uma an lise da literatura revelou que as dibenzoazepinas grupo de subst ncias farmac uticas ao qual pertence a clomipramina reagiam com haletos ou complexos met licos com tiocianato por exemplo Fe III Ti IV Nb V Cr III Zn IN e com subst ncias org nicas por exemplo cido p crico violeta de pirocatecol cromazurol S para formar compostos corados 43 Adicionalmente foram encontradas referencias a ensaios de avalia o do efeito exercido por oxidantes fortes em solu es de dibenzoazepinas Esse efeito traduzia se na forma o de compostos de cor azul quando se utilizava oxidantes como sulfato de c rio dicromato de pot ssio iodato de pot ssio persulfato de am nio ou vanadato de am nio De acordo com Renfroe et al 44 o mecanismo de oxida o das dibenzoazepinas envolvia a forma o de compostos dim ricos com colora o azul intensa O mecanismo de reac o encontra se esquematizado na Figura 3 4 3 13 Determina o espectrofotom trica de clomipramina e F R R gt it Figura 3 4 Mecanismo de oxida o das dibenzoazepinas adaptado de 45
257. ola o gr fica da intensidade de sinal obtida na recta de calibra o estabelecida para cada metodologia 2 5 Prepara o de padr es e amostras Os trabalhos referidos nesta disserta o envolveram a an lise de formula es farmac uticas dispon veis em Portugal Parte Experimental As solu es padr o de f rmaco puro foram obtidas atrav s da solubiliza o em solvente adequado de quantidades rigorosamente medidas de subst ncia Para as determina es anal ticas dos f rmacos nas formula es farmac uticas comerciais pelos m todos de refer ncia respeitou se os procedimentos descritos nas farmacopeias 1 4 para a sua prepara o quando dispon veis isto nas situa es em que n o era referido em farmacopeia o procedimento a executar na prepara o de amostras de formas farmac uticas para analisar recorreu se ao procedimento descrito no respectivo ensaio de doseamento da subst ncia pura mas adaptado para doseamento da subst ncia em formula es farmac uticas Genericamente a conduta seguida para efectuar determina es anal ticas na forma farmac utica comprimidos foi pesagem de um determinado n mero de comprimidos seguido da sua pulveriza o em almofariz de porcelana ap s a pulveriza o recolhia se uma toma de p rigorosamente pesada por ltimo procedia se sua solubiliza o A prepara o das solu es do f rmaco a determinar dependia se as solu es se de
258. olocado entre duas v lvulas e que funcionava como canal de amostragem Transportador Figura 1 8 Diagrama do dispositivo de introdu o da amostra D detector T conflu ncia VE v lvulas electromec nicas de 3 vias S entrada de amostra L al a de amostragem A aspira o de amostra A modo de amostragem v lvulas activadas B modo de injec o v lvulas desactivadas Adaptado de 48 1 4 Introdu o Geral Em 1992 Reis et al 49 propuseram um sistema de an lise direccionado para o manuseamento em fluxo das amostras e reagentes O sistema de fluxo Figura 1 9 podia assumir diferentes configura es essencialmente devido combina o de um injector comutador e v lvulas solen ides controladas por um microcomputador A disposi o das v lvulas solen ides e o seu accionamento selectivo no sistema de fluxo proporcionava m ltiplas op es de manuseamento da zona de amostra como por exemplo conflu ncia de zonas amostragem de zonas fluxo intermitente injec es sequenciais reten o de zonas e paragem de fluxo Com base em procedimentos de dilui es em linha e no m todo das adi es realizaram determina es simult neas em amostras vegetais digeridas com detec o por espectrofotometria de emiss o at mica em plasma Figura 1 9 Montagem de fluxo modular I Injector comutador V v lvulas solen ides de 3 vias R reactores L al a de
259. ons de la configuration physique du montage En rentabilisant la versatilit op rationnelle lev e proportionn e par la multicommutation une m thodologie analytique pour la d termination de la trimipramine dans des formulations pharmaceutiques qui combinait la strat gie de chantillonnage binaire avec utilisation d un changement de sens du flux r sultant en un avancement rapide de la r action a t d velopp e Un syst me d analyse en flux continu bas sur l utilisation de burettes automatiques qui agissent simultan ment comme unit s d insertion et de propulsion des solutions a t con u Ce syst me appliqu la d termination d isoniazide dans des formulations pharmaceutiques a rendu possible la combinaison de la strat gie d chantillonnage binaire avec insertion de segments vii R sum de solutions de volume d environ 1 uL r sultant en une am lioration du m lange chantillon r actif m me dans des conditions de dispersion limit e Une m thodologie analytique bas e sur l impl mentation d un syst me de flux multi impulsion a t d velopp e pour la d termination de pirazinamide dans des formulations pharmaceutiques L extension lev e du m lange des solutions conf r e par le flux puls caract ristique de ce syst me a rendu possible Putilisation d un syst me de d tection par chimiluminescence Deux intervalles de r ponse lin aire pour de
260. onsumo reduzido de solu es 1 52 Introdu o Geral Wo Figura 1 18 Montagem de fluxo para implementar o procedimento de procura bin ria Vl a V3 v lvulas solen ides de 3 vias DET detector Rc reactor P liga o bomba perist ltica Cs transportador S amostra T titulante y conflu ncia x canal de fluxo obstru do Adaptado de 56 Com algumas altera es surgiu em 1999 por Martelli et al 57 uma nova proposta de sistema de an lise multicomutado para titula es Este sistema agora com detec o potenciom trica do ponto de equival ncia assentava na utiliza o de um fluxo monosegmentado que por isso implicava pelo menos o uso de uma v lvula solen ide adicional para introdu o de ar Figura 1 19 No entanto utilizou se mais uma v lvula para possibilitar a introdu o de uma solu o diluente devido a usar se um m todo diferente para a procura bin ria do ponto de equival ncia como explicado de seguida Esse m todo por aproxima es sucessivas consistia em manter constante a frac o volum trica relativa amostra e fazer variar a frac o de titulante atrav s da adi o de diferentes volumes de titulante e de solu o diluente sendo esta ltima para evitar efeitos de varia es na matriz da amostra A topologia da montagem de fluxo era igualmente em estrela 1 53 Introdu o Geral Figura 1 19 Mon
261. ontrolo foi efectuada atrav s do protocolo s rie padr o RS 232C As seringas utilizadas nas buretas autom ticas eram da marca Hamilton modelos 1010 1005 e 1002 correspondendo a capacidades de 10 5 e 2 5 mL respectivamente 2 4 Parte Experimental O volume de solu o debitado por passo dependia da capacidade da seringa acoplada Como o curso completo do embolo de aspira o era de 2500 passos cada passo correspondia a volumes de cerca de 4 uL no caso da capacidade da seringa ser de 10 mL 2 uL no caso da capacidade ser 5 mL e 1 uL para seringas com capacidade de 2 5 mL A liga o porta s rie do microcomputador foi efectuada por interm dio de uma ficha DB25 e a liga o bureta autom tica atrav s duma ficha DIN3 As defini es de protocolo utilizadas para a transmiss o da informa o foram i velocidade de transmiss o 2400 bit por segundo baud ii controlo de paridade na recep o par iti sincroniza o 1 bit inicial start bit e 2 bit no final stop bit iv caracter 7 bit As instru es de controlo da bureta autom tica eram enviadas sob a forma de sequ ncias lineares de caracteres strings com o seguinte formato 1 identifica o do dispositivo n mero do dispositivo de 0 a 9 no conjunto de dispositivos ii posicionamento da v lvula integrada respons vel pela entrada sa da das solu es O formato utilizado era I Input para entrada e O Output para sa da
262. or L 2 0 metros L 1 0 metros W Volumes nicos Amostragem Binaria Determina o espectrofotom trica de trimipramina Estes resultados podiam ter justifica o quer na utiliza o do segundo reactor L2 que originava um tempo de resid ncia excessivo em que os efeitos de dispers o prevaleciam quer na possibilidade de estar dispon vel quantidades insuficientes de reagente baixas concentra es que conduziam a efeitos de dilui o pela solu o transportadora Deste modo realizou se um ensaio formalmente semelhante ao anterior mas utilizando uma solu o de reagente monovanadato de am nio com concentra o aproximadamente 10 vezes superior 1x10 mol L Para este ensaio apenas se comparou o efeito das diferentes concentra es de reagente em rela o estrat gia de inser o de volumes nicos de amostra Os resultados obtidos encontram se representados na Figura 4 8 12 00 10 00 5 8 00 7 6 00 o TU 2 4 00 E lt 2 00 0 00 0 0 5 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 35 0 Tempo de amostragem s Figura 4 8 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de monovanadato de am nio introduzindo volumes nicos de amostra como estrat gia de inser o Caudal 1 5 mL min Reactor L 2 0 metros L 1 0 metros m vanadato de am nio 1 0x10 mol L A vanadato de am nio 3 0x10 mol L Determina o espectrofotom
263. os Os m todos cont nuos segmentados que foram propostos pela primeira vez por Skeggs em 1957 27 associam se normalmente ao modo de funcionamento dos Autoanalizadores da firma Technicon que deteve durante muitos anos em exclusivo a comercializa o destes instrumentos Neste m todo as amostras s o aspiradas sequencialmente e entre elas intercalam se bolhas de ar que as separam ou segmentam o fluxo Este processo inclui na maioria dos casos um ciclo de lavagem As bolhas de ar intercaladas no sistema s o retiradas antes de atingirem o detector Os m todos cont nuos n o segmentados distinguem se essencialmente do anterior nos seguintes aspectos 1 o fluxo n o se encontra segmentado por bolhas de ar 11 a amostra injectada no sistema iii no momento da detec o n o alcan ado nem o equil brio f sico homogeneiza o da amostra com os reagentes nem existe n o tem necessidade de existir o equil brio qu mico As metodologias de fluxo possibilitam automatizar facilmente e com baixo custo numerosas determina es anal ticas Ainda para mais estas t cnicas s o r pidas precisas e t m um custo de manuten o reduzido apresentam baixos consumos de 1 20 Introdu o Geral amostras e reagentes factor importante na perspectiva de Qu mica Verde minimizam os erros de opera o e permitem realizar determina es m ltiplas 2 Outra caracteristica a ressaltar a sua possibilidade de
264. ositivas Por isso foi realizada a sua avalia o em determina es farmac uticas A multi impuls o como metodologia de fluxo mais recente e por isso com um inferior n mero de aplica es publicadas possibilita um manuseamento diferente das solu es e esta caracter stica deve ser explorada de modo a fornecer indica es da sua utiliza o frequente em determina es farmac uticas l 93 Introdu o Geral Neste trabalho pretendeu avaliar se o potencial das metodologias de fluxo baseadas em multicomuta o e multi impuls o na an lise de produtos farmac uticos de maneira a que pudessem constituir alternativas aos procedimentos j utilizados Com as metodologias desenvolvidas procurou se tamb m que possibilitassem diferentes tipos de manuseamento da amostra que funcionassem como estrat gias anal ticas inovadoras e que pudessem ser aplicadas a distintas situa es anal ticas envolvendo diminutas altera es ao n vel de configura o f sica das montagens e de programa o de controlo dos sistemas 1 94 Introdu o Geral 1 5 Refer ncias bibliogr ficas AA tw N 10 11 12 13 14 15 M de la Guardia J Braz Chem Soc 10 429 1999 K Grudpan Talanta 64 1084 2004 M de la Guardia J Ruzicka Analyst 120 17N 1995 W Wardencki J Curylo J Namiesnik Pol J Environ Stud 14 389 2005 F R P Rocha J A N brega O Fatibello F
265. ostra e reagentes Deste modo em SIA o escoamento das solu es n o se processa sempre na mesma direc o Embora a SIA possibilite interven es na zona de amostra em muito id nticas metodologia FIA possuindo por isso fun es id nticas s de FIA a sua principal diferen a funcional nomeadamente a configura o estrutural das montagens anal ticas e a inser o temporizada das amostras e reagentes conferem lhe potencialidades anal ticas 41 vantajosas em rela o FIA em FIA na grande maioria dos casos a amostragem feita na base de volume fixo Destaca se a implementa o de reac es mais complexas contudo envolvendo montagens anal ticas mais simples apesar da utiliza o de um n mero elevado de solu es qu micas produ o de um menor volume de res duos indesej veis devido ao ma a SS GE ee eT eS Ie 1 29 Introdu o Geral consumo inferior de reagentes e amostra porque tradicionalmente nestes sistemas deixa de ser necess rio um fluxo permanente de solu o transportadora e tamb m porque os reagentes e amostras s o utilizados de uma forma mais eficiente j que s os volumes estritamente necess rios s o processados e uma maior flexibilidade operacional com o controlo temporizado contudo mais vers til do volume de solu es A facilidade com que os par metros experimentais podem ser alterados e controlados pelo computador o conhecimento dos perfis dos caudais e
266. ostragem como por exemplo a amostragem bin ria ou a conflu ncia de zonas em combina o com o fluxo pulsado de modo a optimizar o processo de mistura quando est o envolvidos volumes elevados de solu es introduzidos no sistema de fluxo O programa inform tico que definia o funcionamento do sistema possibilitava o controlo individual e independente de cada micro bomba e porque cada uma das micro bombas era respons vel pela inser o no sistema de uma determinada solu o de reagente envolvido na reac o ent o foi poss vel aplicar diferentes configura es para o controlo do sistema unicamente atrav s de altera es no programa de controlo Portanto o controlo autom tico e individualizado das micro bombas possibilitava diferentes combina es de activa o e deste modo a execu o de diferentes estrat gias de amostragem As diferentes estrat gias de amostragem originam diferentes graus de dispers o o que por sua vez permite alterar os gradientes de concentra o dos reagentes e amostra dentro dos tubos de fluxo sem implicar modifica es na estrutura f sica da montagem A f cil manipula o e controlo autom tico do sistema anal tico por computador possibilitou efectuar um ensaio descrito de seguida e em que al m de se efectuar Determina o quimioluminom trica de pirazinamida estudos da influ ncia no sinal anal tico das diferentes estrat gias de amostragem tamb m se efectuou sim
267. percentagem foi inferior a 1 3 Determina o espectrofotom trica de clomipramina aa aa ee erre e 14 00 12 00 E 10 00 E o 8 00 o 6 00 B a E 4 00 lt 2 00 0 00 0 10 20 30 40 50 60 Concentra o dos padr es mg L Figura 3 11 Curvas de calibra o obtida com solu es padr o de clomipramina com concentra es at 50 ou 40 mg L para os tempos de amostragem 6 s O e 12 s IB respectivamente A metodologia desenvolvida foi avaliada na determina o da clomipramina em formula es farmac uticas Os resultados obtidos quando comparados com os obtidos pelo m todo de refer ncia demonstram um desvio relativo entre 1 2 e 2 6 Os resultados apresentam se sumariados na Tabela 3 1 Durante a realiza o das determina es anal ticas n o se verificou qualquer desvio da linha de base Determina o espectrofotom trica de clomipramina O EE E E A E E Tabela 3 1 Resultados obtidos para a determina o de clomipramina em prepara es farmac uticas Concentra o encontrada x Tempo de encena o P mg formula o DR Amostra declarada Amostragem o mg formula o s Metodologia M todo de desenvolvida Refer ncia Anafranil 10 10 6 10 0 0 1 10 1 1 0 comprimidos 12 10 2 0 1 10 1 1 0 Anafranil 25 25 6 25 4 0 3 25 4 0 comprimidos 12 25 1 0 3 25 4 1 2 Anafranil 75 6 742 0 3 73 6 0 8 comprimidos 75 de liberta o 12 75 5 0
268. possam ser facilmente e rapidamente adapt veis a este tipo de medi es em linha que possibilitem a obten o de r pidas respostas e que sejam precisos sens veis robustos e reprodut veis As condi es de opera o devem permitir a inser o directa de amostras para an lise ou a sua manipula o directa como quando se pretende medi es de par metros f sicos como a temperatura press o ou caudal Este facto torna se mais dif cil de realizar quando est o envolvidas vari veis qu micas devido s dificuldades impostas pela selectividade do sensor ou do seu uso ou pela necessidade de calibra es e recalibra es como por exemplo quando se utiliza el ctrodos selectivos 23 As metodologias de an lise em fluxo podem ser adaptadas para a monitoriza o qu mica em diferentes fases de um processo de produ o A crescente ades o automatiza o dos procedimentos anal ticos conduziu aplica o de novos conceitos e termos cujo significado ainda pouco consolidado pode gerar alguma ambiguidade e confus o 1 14 o Introdu o Geral Com o objectivo de normalizar a nomenclatura relacionada com os m todos autom ticos de an lise a Comiss o para a Nomenclatura Anal tica da International Union of Pure and Applied Chemistry IUPAC estabeleceu a defini o de alguns dos termos mais usados Deste modo hoje poss vel evitar equ vocos decorrentes da utiliza o das mesmas palavras com sentidos
269. providenciou um extenso desenvolvimento de cor De facto reactores de reduzido comprimento resultaram em inferiores tempos de resid ncia ou seja quando a zona de amostra chegou ao detector a reac o n o apresentava suficiente desenvolvimento Considerando que para um reactor de 1 0 metros a varia o na altura de sinal tanto para um caudal de 0 5 como de 1 0 ml min n o era significativo e considerando como objectivo um compromisso entre sensibilidade e ritmo de amostragem foi seleccionado um caudal de 1 0 ml min para as experi ncias seguintes O estudo relativo influ ncia que o volume de amostra exerce no sinal anal tico foi efectuado com base no tempo de amostragem isto para um determinado caudal o tempo de amostragem estabelecia o volume de amostra inserido no sistema de fluxo De acordo com Ruzicka 48 a dispers o de uma zona de amostra num sistema de fluxo inversamente proporcional ao volume de amostra introduzido e inclusivamente para segmentos de amostra muito grandes a por o Determina o espectrofotom trica de clomipramina central dessa zona pode eventualmente n o sofrer fen menos de dispers o Sendo assim no caso do sinal anal tico depender da dispers o se esta alterada atrav s de altera es no volume de amostra introduzido ocorrem varia es na amplitude do sinal anal tico Verificou se que controlando o tempo de amostragem era poss vel manipular a dispers
270. r um excesso adequado de reagente para garantir um consider vel desenvolvimento da reac o Finalmente durante a invers o do fluxo n o ocorria apenas a invers o de duas interfaces de reac o mas sim de m ltiplas interfaces que se interpenetravam e sobrepunham cada uma numa extens o para garantir elevados e reprodut veis sinais anal ticos e deste modo aumentar a sensibilidade sem implicar a necessidade de efeitos de dispers o adicionais obtidos com o segundo reactor L2 Neste estudo o n mero e tempos que definiam cada ciclo de inser o determinavam o tempo de amostragem final e que por sua vez em depend ncia do caudal estabelecia o volume de amostra inserido Dado que estes par metros eram 4 20 Determina o espectrofotom trica de trimipramina controlados rigorosamente por computador obtinha se um controlo completo e efectivo da dispers o da amostra no sistema anal tico Para o estudo comparativo das estrat gias de amostragem uma solu o de trimipramina 10 mg L foi injectada no sistema e uma solu o 3 0 x 10 mol L de monovanadato de am nio foi utilizada como reagente A solu o transportadora foi cido sulf rico 4 0 mol L O tempo de amostragem foi programado de modo a obter iguais volumes totais de amostra e reagente para os dois procedimentos de amostragem amostragem bin ria e inser o de volumes nicos Para tal o incremento de tempo em rela o ao reagente na estr
271. ra o 5 0 mol L de cido sulf rico n o seja significativa Estes resultados s o justificados pelos diferentes graus de mistura obtidos com a utiliza o de diferentes concentra es de solu es de cido sulf rico devido aos diferentes valores de viscosidade das solu es de Determina o espectrofotom trica de trimipramina cido Utilizando volumes nicos de amostra e estabelecendo id nticos tempos de amostragem globais verificou se um comportamento semelhante excepto que o sinal anal tico mais elevado foi obtido com a utiliza o de uma solu o 5 0 mol L de cido sulf rico Estes resultados podem ser explicados como foi anteriormente referido pela efici ncia da homogeneiza o da zona de amostra providenciada pela estrat gia de amostragem bin ria em associa o invers o do sentido de fluxo Em confirma o a esta hip tese verificou se que para o mesmo tempo de amostragem e para uma solu o 4 0 mol L de cido sulf rico o sinal anal tico obtido com amostragem bin ria era acentuadamente superior ao obtido com volumes nicos de amostra Figura 4 11 Al m de que registou se uma superior reprodutibilidade muito provavelmente devido menor dificuldade na mistura amostra e reagente com a utiliza o de uma solu o 4 0 mol L de cido sulf rico A influ ncia do caudal no sinal anal tico foi estudada em combina o com o volume total inserido de amostra atrav s da u
272. ra 3 10 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico de diversos comprimentos de reactor e caudais em fun o da varia o do tempo de amostragem A reactor 0 5 m A reactor 1 0 m reactor 1 5 m reactor 2 0 m A Caudal 0 5 mL min B 1 0 mL min C 1 5 mL min Determina o espectrofotom trica de clomipramina Estes resultados confirmam que elevados valores de dispers o de amostra com 2 0 metros de reactor e baixos tempos de reac o ou mistura ineficiente entre amostra e reagente com 0 5 metros de reactor resulta em sinais anal ticos acentuadamente inferiores Para o ensaio referente a um caudal de 1 0 ml min Figura 3 10 B observa se que para volumes de amostra inferiores a 166 uL e com um reactor de 1 0 metros de comprimento o sinal anal tico obtido foi semelhante ao obtido com o uso de um reactor de 1 5 metros Mas comparando com o sinal obtido aquando da utiliza o de um reactor com 2 0 metros de comprimento verifica se que com 1 0 metros de reactor o sinal superior No entanto para volumes de amostra superiores verifica se que a altura de sinal anal tico aumenta com o aumento do comprimento do reactor Este ltimo comportamento tamb m se observa quando se utiliza um caudal de 1 5 ml min Figura 3 10 C Neste caso a dispers o foi suficiente para garantir uma adequada mistura amostra reagente ao mesmo tempo que o crescente tempo de reac o
273. ra m dia cm ALtura m dia cm 7 00 6 00 5 00 4 00 3 00 7 00 6 00 5 00 4 00 3 00 7 00 6 00 5 00 4 00 3 00 L 0 6 12 18 24 30 36 42 Volumes amostra ul um 0 6 12 18 24 30 36 42 Volumes amostra ul 5 0 6 12 18 24 30 36 42 Volumes amostra pl Avalia o da influ ncia no sinal anal tico de diferentes di metros internos dos tubos em fun o do volume de amostra introduzido no sistema A di metro interno 0 8 mm B di metro interno 0 5 mm C di metro interno 0 38 mm e amostragem bin ria m volumes nicos A conflu ncia de zonas Determina o espectrofotom trica de isoniazida 7 00 6 00 5 00 4 00 E 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra ul A Amplitude de sinal cm E 7 00 e w 6 00 Cc 0 5 00 o 3 4 00 A E lt 3 00 0 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra pl C 7 00 6 00 5 00 4 00 ii 6 12 18 24 30 36 42 Volume de amostra ul Amplitude de sinal cm Figura 5 9 Avalia o da influ ncia no sinal anal tico de diferentes di metros internos dos tubos em fun o do volume de amostra A amostragem bin ria B conflu ncia de zonas C volumes nicos di metro interno 0 8 mm O di metro interno 0 5 mm A di metro interno 0 38 mm 5 25 Determina o espectrofotom trica de isoniazida A partir da observa o dos resultado
274. res de concentra o de pirazinamida Atrav s da altera o do esquema de actua o das micro bombas foi poss vel obter outra curva de calibra o para um intervalo de concentra es entre 1 e 15 mg L de pirazinamida Figura 6 16 A curva anal tica foi representada por A 0 5807 C 12 476 a representa o das vari veis equivalente representa o em 6 3 3 e o correspondente coeficiente de correla o foi 0 9982 15 00 10 00 5 00 Amplitude de sinal cm 0 00 0 5 10 15 20 25 Concentra o de pirazinamida mg L 1 Figura 6 16 Curva de calibra o obtida com solu es padr o de pirazinamida com concentra es de 1 at 15 mg L 0 pontos experimentais pontos experimentais da curva de calibra o Determina o quimioluminom trica de pirazinamida A raz o entre os volumes de solu o de cati o cobre II e solu o de pirazinamida que foi inserida no fluxo de solu o de luminol per xido de hidrog nio foi modificada atrav s do programa de controlo do sistema de fluxo substituindo deste modo a necessidade de preparar novas solu es de reagentes com concentra es diferentes O intervalo de concentra es de pirazinamida mais baixo para o qual se verificou linearidade entre a amplitude do sinal anal tico e a concentra o foi obtido atrav s da inser o de 2 pulsos de solu o de cati o cobre ID 16 pL e 8 pulsos de solu o de pirazinamida 64 p
275. resultados relacionam se como no ensaio anterior com a influ ncia positiva no sinal anal tico pela presen a de i es hidr xido para desencadear a oxida o do luminol e com a influ ncia negativa pelo excesso de i es hidr xido que provocam um efeito de diminui o da concentra o de cati o cobre II livre em solu o Deste modo a concentra o da Determina o quimioluminom trica de pirazinamida solu o de cido sulf rico seleccionada para as determina es seguintes foi 4 x 10 mol L Tamb m se realizaram ensaios para estudar a influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es da solu o de per xido de hidrog nio utilizada para a oxida o de luminol Figura 6 8 As concentra es de per xido de hidrog nio ensaiadas variavam entre 0 5 x 10 mol L e 6 x 10 mol L 7 00 6 00 5 00 4 4 00 3 00 2 00 Amplitude de sinal cm 1004 0 00 0 1 2 3 4 5 6 7 Concentra o de H20 mM Figura 6 8 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de per xido de hidrog nio entre 0 5 x 10 mol L e 6 x 10 mol L Da observa o dos resultados verifica se que nesse intervalo de concentra es a intensidade de sinal anal tico aumenta sempre mas no entanto a varia o de sinal Determina o quimioluminom trica de pirazinamida C O err obtido para concentra es de per xido de hidrog nio superiores a aproximadamente 2 5
276. ria foi realizada estabelecendo um tempo de amostragem total de 12 segundos o que para um caudal de 1 0 ml min corresponde a 200 uL de volume de amostra e usando distintas sequ ncias de intercala o de maneira a manter constante o valor correspondente a n mero de ciclos x tempo de intercala o 12 ciclos x 1 s para amostra e reagente 6 ciclos x 2 s 4 ciclos x 3 s 6 ciclos x 2 s e 1 ciclo x 12 s Os resultados confirmaram que a utiliza o de um tempo de intercala o de 1 s possibilitava a obten o do mais elevado sinal anal tico como consequ ncia de uma mistura melhorada Deste modo todos os ensaios realizados posteriormente foram efectuados recorrendo amostragem bin ria com tempos de intercala o amostra reagente de 1 segundo 1 segundo A influ ncia no sinal anal tico da concentra o de vanadato de am nio na an lise da clomipramina em fluxo foi avaliada por compara o dos sinais anal ticos obtidos com uma solu o 20 mg L de clomipramina e um intervalo de concentra es de oxidante de 1 0x10 mol L a 8 0x10 mol L tendo sido escolhido este intervalo de concentra es de acordo com os resultados obtidos nos ensaios preliminares Da an lise dos resultados representados na Figura 3 8 Determina o espectrofotom trica de clomipramina conclui se que de 1 0x10 mol L a 6 0x107 mol L o sinal anal tico obtido traduzido em altura de sinal registado teve um aumento acentuado e depois
277. rica de trimipramina 35 S Alegret J Alonso J Bartroli A A S C Machado J L F C Lima J M Paulis Quim Anal 6 278 1987 36 R A S Lapa J L F C Lima B F Reis J L M Santos Anal Chim Acta 377 103 1998 37 Wieslawa Misiuk J Pharm Biomed Anal 22 189 2000 38 D Betteridge E L Dagless B Fields N F Graves Analyst 103 897 1978 39 G D Marshall J F van Staden Process Contr Qual 3 251 1992 40 R A S Lapa J L F C Lima J L M Santos Anal Chim Acta 419 17 2000 CAP TULO o DETERMINA O DE ISONIAZIDA POR UM SISTEMA EM FLUXO CONT NUO A isoniazida considerada um f rmaco de primeira escolha no tratamento da tuberculose Neste cap tulo descrito o desenvolvimento de um sistema de fluxo baseado na utiliza o de buretas autom ticas que actuam simultaneamente como unidades de inser o de amostra introdu o de reagente e propuls o de solu es O sistema de fluxo desenvolvido foi avaliado atrav s da utiliza o de diferentes estrat gias de inser o como a amostragem bin ria a conflu ncia de zonas e a inser o de volumes nicos na determina o espectrofotom trica de isoniazida em formula es farmac uticas ap s reac o com 1 2 naftoquinona 4 sulfonato em meio alcalino A combina o de amostragem bin ria com a inser o de segmentos de solu es com 1 microlitro resultou num favorecimento da mistura
278. rigina m ltiplas interfaces de reac o para cada solu o de amostra que se juntam total ou parcialmente durante o transporte para o sistema de detec o acoplado ao sistema No entanto embora se consiga uma ptima mistura amostra reagente a presen a de um reactor essencial para promover Determina o espectrofotom trica de trimipramina dispers o adicional da amostra mesmo sendo um reactor de pequeno comprimento No trabalho descrito neste cap tulo atrav s da combina o do potencial de mistura da amostragem bin ria e da penetra o de zonas obtida com invers o do fluxo 34 obteve se um sistema multicomutado com uma melhor homogeneiza o de solu es em fluxo possibilitando inclusive a utiliza o de solu es muito viscosas A combina o de amostragem bin ria com invers o do sentido do fluxo permitiu tamb m a redu o significativa do comprimento do reactor ou at a sua supress o aparente enquanto se assegurava elevada reprodutibilidade sensibilidade e ritmo de amostragem e ainda baixo consumo de reagentes A utiliza o da express o supress o aparente est relacionada com o facto de existir sempre entre um determinado ponto de conflu ncia e o detector um segmento de tubo para o transporte das solu es entre os referidos pontos Deste modo a situa o de supress o total do reactor corresponderia converg ncia das solu es exactamente no local de detec o da montag
279. rodu o realizada seguindo exactamente os procedimentos operacionais estabelecidos e necess rio antes mesmo de iniciar a produ o verificar que todas as mat rias primas utilizadas durante a produ o cumpriram as especifica es de qualidade previamente definidas Para assegurar que a produ o decorreu como era esperado necess rio identificar os passos cr ticos do processo verificar se estes foram convenientemente executados e ainda avaliar se os padr es de qualidade do produto est o dentro dos limites previamente definidos Esta estrat gia conhecida pelo controlo em processo controlo in line que n o mais que uma s rie de testes concebidos para controlar os problemas que podem surgir durante a produ o de uma forma farmac utica de modo a que uma ac o correctiva e imediata possa ser considerada O objectivo do controlo de qualidade em processo monitorizar todas as propriedades do produto que podem afectar a sua qualidade podendo assim detectar varia es em rela o aos limites de toler ncia de um produto As determina es anal ticas efectuadas na monitoriza o de reac es qu micas e bioqu micas envolvidas nos processos de produ o devem fornecer sistematicamente medidas quantitativas dos v rios par metros que controlam Introdu o Geral essas reac es 17 18 Estas determina es possibilitam assim obter rapidamente um relat rio do est
280. rrendo a uma estrat gia diferente foi realizado titula es cido base 60 argentometrias 61 e iodometrias 62 Nestes trabalhos a medi o e registo do sinal anal tico em 1 55 Introdu o Geral fun o de adi es de diferentes volumes de titulante e ou titulado permitiu obter curvas de titula o Wang et al 63 em 1998 desenvolvem um sistema de an lise Figura 1 22 recorrendo a v lvulas solen ides mas sem associarem a metodologia ao conceito de multicomuta o N o obstante realizaram a titula o potenciom trica de c lcio e tamb m a determina o espectrofotom trica de ortofosfato pelo azul de molibd nio atrav s da inser o de volumes vari veis de amostra e reagentes com base num controlo temporizado como j tinha sido realizado por Reis et al em 1994 A base do m todo volum trico aqui utilizada era novamente a varia o das frac es de tempo de actua o alternada das v lvulas solen ides para um pr determinado intervalo de tempo total que correspondia a um determinado volume de zona de amostra vi Solu o X Fluxo Bomba perist ltica Solu o 2 43 ae 7N amp ca CML Detector pu aH Res duos Solu o 3 3 sea Smo t Solu o x cand a mn es Coma mo ram memmen ema m nemh Figura 1 22 Montagem de fluxo V1 a V4 v lvulas solen ides M c mara de mistura Adaptado de 63 Os mesmos autores que publicaram
281. s v lvulas solen ides de 3 vias B e B reactores DET detector P bomba perist ltica R a R4 reagentes S amostra Cs transportador da amostra C transportador D detector W dreno x y conflu ncias t canal de fluxo obstru do linhas a tracejado caminhos de fluxo alternativos das v lvulas setas direc o do fluxo Adaptado de 54 Tal como em montagens anteriores cada uma das v lvulas era respons vel pela inser o de uma solu o atrav s da obstru o de uma das suas vias de forma a funcionar como um monocomutador aberto fechado O sistema de transporte era uma bomba perist ltica respons vel pela aspira o das amostras e reagentes introduzidas no sistema por amostragem bin ria isto eram inseridas por controlo temporizado das v lvulas solen ides com tempos de intercala o de 0 2 s Primeiro era efectuada a determina o de am nio por reac o com salicilato em meio alcalino e depois a determina o de fosfato com molibdato em meio cido Embora o sistema fosse constitu do por seis v lvulas respons veis pela inser o de quatro reagentes uma solu o transportadora e uma solu o de amostra o seu funcionamento e controlo era de uma simplicidade muito superior 1 50 Introdu o Geral de um sistema FIA convencional montado com o mesmo objectivo possibilitando ainda um menor consumo de reagentes Outro trabalh
282. s D detector P bureta autom tica L a L4 reactores S amostra I reagente C conflu ncias Adaptado de 79 Figura 1 39 Montagem de fluxo para a determina o de ferro cobre zinco e n quel I injector comutador V a Vs v lvulas solendides de 3 vias B a By reactores D detector L al a de amostragem C transportador S amostra W dreno Adaptado de 80 1 72 Introdu o Geral Tamb m em 2001 Rocha et al 81 publica um trabalho que envolve a adi o intermitente de diferentes reagentes cromog neos selectivos para a determina o de ferro cobre zinco c lcio e magn sio em formula es multi vitam nicas Figura 1 40 As determina es sequenciais s o tamb m facilmente implementadas pela multicomuta o atrav s da possibilidade conferida pela metodologia de realizar diferentes tarefas V K V Vy Ye EXIST ar y Fi h A lt 4 Figura 1 40 Montagem de fluxo para a determina o de ferro cobre zinco c lcio e magn sio C transportador S amostra Ri reagentes V a Vg v lvulas solen ides de 3 vias B e B reactores D detector h diferen a de altura Adaptado de 81 Em 2000 Rocha et al 82 desenvolvem um sistema de fluxo para a determina o de azoto em guas Figura 1 41 Neste trabalho a determina o de am nia era efectuada por paragem da zona de amostra num rea
283. s concentrations de pirazinamide ont t obtenus uniquement par des alt rations des valeurs des param tres de contr le du syst me via ordinateur La validation des syst mes analytiques d velopp s a t r alis e par valuation comparative des r sultats obtenus relativement ceux fournis par des m thodes indiqu es par les pharmacop es viii CAP TULO 1 INTRODU O GERAL As metodologias anal ticas em fluxo cont nuo caracterizadas por uma grande versatilidade flexibilidade e facilidade de automatiza o assumem um papel cada vez mais importante no desenvolvimento de sistemas autom ticos de an lise de produtos farmac uticos As metodologias de fluxo possibilitam o desenvolvimento e implementa o de sistemas de an lise em fluxo os quais fornecem um conjunto de caracter sticas operacionais que permitem um leque alargado de interven es e manipula es da amostra em condi es de elevada reprodutibilidade Introdu o Geral 1 Introdu o Nas ltimas d cadas tem vindo a assistir se a uma readapta o e ramifica o da Qu mica Anal tica Esta rea da Qu mica vasta pelas suas aplica es sofreu transforma es nos seus objectivos que passaram a englobar por exemplo o desenvolvimento de m todos anal ticos mais r pidos mais f ceis de executar com menos custos e com menor gera o de res duos por consequ ncia das evolu es tecnol gicas e
284. s da Qu mica Anal tica sem sacrificar outros par metros importantes como o custo e a velocidade da an lise bvio que a melhoria dos m todos anal ticos deve incidir na redu o dos res duos na miniaturiza o do equipamento anal tico e na descontamina o in line ou reciclagem dos res duos anal ticos 4 5 importante garantir que os novos desenvolvimentos nas metodologias anal ticas integrem todos estes objectivos e que sejam incorporados na an lise qu mica de amostras e aquisi o de dados Introdu o Geral O maior recurso a instrumentos para realizar an lises qu micas possibilita o processamento de amostras com volume reduzido ou inclusive v rias determina es em simult neo Outra vantagem que n o pode deixar de ser mencionada o facto de a automatiza o das metodologias anal ticas ter originado novas perspectivas e actua es face a an lises de dif cil execu o manual consequ ncia de uma necessidade de obten o de resultados mais exactos e precisos de forma mais r pida e segura Tal situa o ocorre quando se pretende por exemplo recorrer a m todos de an lise baseados em reac es incompletas melhorar o desempenho em situa es em que a esp cie a determinar inst vel ou em situa es em que a recupera o da esp cie incompleta como no caso de extrac es ou di lises e por ltimo na implementa o de m todos cin ticos Em parte todas as vantagens
285. s de caudal para cada fluxo de solu o de reagente envolvido na determina o mas no entanto no caso de se utilizar diferentes caudais ocorreria possivelmente a deteriora o da reprodutibilidade devido a processos de mistura incompletos e a caracter sticas hidrodin micas an malas 40 A utiliza o de uma metodologia de fluxo baseada em multi impuls o possibilita ultrapassar estes inconvenientes e dificuldades devido ao controlo vers til individual e independente dos caudais originados por cada micro bomba e sua eficiente homogeneiza o das solu es devido ao fluxo pulsado Determina o quimioluminom trica de pirazinamida a ee Os volumes de reagentes e amostra introduzidos tamb m afectam a amplitude de sinal anal tico Se os volumes de solu es inseridos no sistema aumentam muito os processos de dispers o tornam se limitados na zona central dos volumes inseridos originando gradientes de concentra o muito acentuados O resultado final valores elevados de dispers o nos extremos de uma zona de amostra e baixos valores na zona central Numa situa o extrema podem surgir duplos picos no registo do sinal anal tico Uma vez mais a utiliza o da multi impuls o como metodologia de an lise em fluxo possibilita ultrapassar as situa es referidas devido ao controlo individualizado e independente de cada micro bomba Esse vers til controlo permite explorar diferentes estrat gias de am
286. s microlitros Ainda para mais provou ser exacta e vers til porque possibilitou m ltiplas manipula es da amostra sem implicar altera es na configura o estrutural do sistema Estes factos referidos como vantagens dos sistemas de fluxo multicomutados demonstram a capacidade de adapta o destes sistemas para a an lise de amostras de diferentes concentra es como acontece com os ensaios de dissolu o de f rmacos em formas farmac uticas orais s lidas os quais s o actualmente procedimentos correntes fundamentais e que deste modo poder o ser desejavelmente executados de forma autom tica Por outro lado devido sua estrutura modular o sistema pode ser facilmente modificado para aplica o na determina o de outros compostos Caso a reac o qu mica envolvida seja diferente da utilizada neste trabalho e consequentemente tamb m as vari veis qu micas e f sicas como por exemplo concentra es de reagentes pH do meio e temperatura este sistema possibilita al m da versatilidade na manipula o da zona de amostra a introdu o de outros componentes como um banho termostatizado ou a substitui o do reactor por outro de comprimento diferente Tamb m a introdu o de mais v lvulas solen ides para inser o de diferentes reagentes facilmente efectuada resultando numa montagem com maior diversidade de percursos anal ticos e consequentemente uma maior diversidade de reac es qu micas que se podem realiz
287. s representados na Figura 5 9 verifica se claramente que com tubos de di metro interno de 0 8 mm a utiliza o de diferentes estrat gias n o influenciou a amplitude sinal anal tico No entanto a situa o j foi bem diferente quando se utilizou tubos com di metro interno de 0 5 ou 0 38 mm Neste caso j se verificou uma evidente separa o das amplitudes de sinal obtidas para a situa o de inser o de volumes nicos em fun o da utiliza o de diferentes di metros internos nos tubos A estrat gia de inser o de volumes nicos de amostra mais influenciada pelas condi es de dispers o do sistema anal tico pois a mistura amostra reagente durante o transporte para detec o est dependente unicamente dos efeitos de dispers o Numa perspectiva mais geral tamb m se verificou que os sinais anal ticos obtidos com a utiliza o de uma c lula de fluxo de 18 uL foram comparativamente inferiores aos obtidos aquando da utiliza o de uma c lula de fluxo de 8 uL o que j seria de esperar devido ao incremento da dispers o da zona de reac o no interior da c lula de fluxo Tamb m o perfil das escadas do registo anal tico foi diferente devido ao efeito aumentado da dispers o numa c lula de fluxo de 18 uL Os resultados obtidos para este ensaio est o representados na Figura 5 10 e Figura 5 11 Adicionalmente e referindo como considera es gerais importante assinalar que a estrat gia de utiliza o de um volu
288. so e tamb m pelo n mero de micro bombas activadas simultaneamente e que debitavam volumes Determina o quimioluminom trica de pirazinamida para um mesmo ponto de conflu ncia Adicionalmente e porque cada micro bomba independente das restantes podia ser definido um caudal diferente para cada unidade de inser o e propuls o originando deste modo diferentes raz es entre as quantidades de reagentes no interior do sistema A versatilidade e facilidade de automatiza o e controlo das micro bombas que s o respons veis pela inser o de solu es no sistema possibilitaram o total controlo da manipula o dos volumes de amostra e reagente introduzidos no sistema do caudal do tempo de amostragem e da estrat gia de amostragem A montagem anal tica desenvolvida consistiu em duas sub estruturas uma respons vel pela inser o e mistura da solu o de luminol e solu o de per xido de hidrog nio e outra respons vel pela inser o e mistura da solu o de amostra e solu o de cati o cobre II As micro bombas P e P gt foram respons veis pela inser o de luminol e per xido de hidrog nio respectivamente e o reactor L3 possibilitava a mistura adicional destas solu es j promovida essencialmente pelo fluxo pulsado caracter stico destes sistemas Estas solu es constitu am a linha de base Como n o era adicionada a solu o de cati o cobre II que funciona como catalisador d
289. solu es incluindo a inser o de volumes nicos a conflu ncia de zonas e a amostragem bin ria que podem ser exploradas visando a manipula o da adi o de reagentes e a homogeneiza o da amostra com os reagentes e portanto o desenvolvimento da reac o 6 43 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida A utiliza o de micro bombas para originar um fluxo pulsado possibilita uma melhor mistura amostra reagentes o que contribui para um desenvolvimento da reac o mais r pido Este facto torna se muito importante por exemplo nas situa es em que se pretende efectuar medi es de intensidade de luz emitida por uma reac o de quimioluminesc ncia que resulta da mistura de amostra e reagentes e desenvolvimento da reac o na c lula de fluxo Face aos aspectos descritos anteriormente resultantes de acoplar um detector de quimioluminesc ncia a um sistema de fluxo por multi impuls o a metodologia desenvolvida demonstrou elevada versatilidade possibilitando a obten o de dois intervalos de calibra o diferentes para a determina o de pirazinamida sem implicar modifica es na configura o f sica da montagem anal tica mas sim por interm dio de diferentes valores de par metros de controlo o que possibilitou diferentes propor es de amostra e reagentes no sistema Portanto a combina o de an lise em fluxo baseado no conceito de multi impuls o com o sistema de detec o por quim
290. sos Da que seja obtido um sinal anal tico equivalente na introdu o de maiores volumes de amostra cobre para caudais inferiores Determina o quimioluminom trica de pirazinamida A N o 8 00 4 00 Amplitude de sinal cm 0 00 N mero de pulsos B 12 00 8 00 4 00 0 00 Amplitude de sinal cm 0 2 4 6 N mero de puisos C 12 00 8 00 4 00 Amplitude de sinal cm 0 00 0 2 4 6 N mero de pulsos Figura 6 13 Influ ncia no sinal anal tico do caudal e da estrat gia de amostragem 300 ms 500 ms A 700 ms A Estrat gia de inser o de volumes nicos B Estrat gia de conflu ncia de zonas C Estrat gia de amostragem bin ria Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Para a avalia o da influ ncia no sinal anal tico da estrat gia de conflu ncia de zonas o fluxo de cobre e pirazinamida foi convergido no fluxo de luminol e per xido de hidrog nio enquanto este tamb m era direccionada para o detector Deste modo na altura da inser o de amostra as 4 micro bombas eram utilizadas simultaneamente Para compensar o aumento do caudal durante a etapa de amostragem em X devido activa o simult nea das 4 micro bombas o tempo de pulso das micro bombas foi reduzido para metade durante a etapa de amostragem de modo a manter o ensaio compar vel com os restantes estudos da estrat gia de
291. ste modo o percurso anal tico da amostra desde a injec o at c lula de fluxo integrada possibilita a dilui o da amostra a adi o de reagentes a mistura incuba o separa o e detec o por qualquer sequ ncia num regime de fluxo em modo de aspira o paragem e propuls o embora a CSPU seja caracteristicamente de dimens es reduzidas A miniaturiza o conseguida atrav s de uma CSPU que engloba canais de processamento de amostra e uma c lula de fluxo polivalente As caracter sticas mais evidentes deste equipamento s o 1 grande proximidade entre a porta de injec o e a c lula de fluxo ii c lula de fluxo polivalente iii flexibilidade do processamento de amostra devido revers o de fluxo na al a de armazenamento e pelo acesso aleat rio providenciado pela v lvula multiposi o Com os sistemas LOV os microensaios tornam se poss veis porque os elementos chave tais como as portas de reagentes e amostras reactores de mistura colunas de reac o e detectores de fluxo est o centralizados e os percursos do fluxo s o minimizados Qualquer m todo de injec o sequencial pr existente pode ser rapidamente adaptado a uma configura o LOV com redu o dr stica do consumo de reagentes e da gera o de res duos Esta uma caracter stica importante quando est o dispon veis pequenas quantidades de amostra e reagente como por exemplo nos bioensaios A instrumenta o compacta e as montagens simpl
292. stinavam a ensaios pelo m todo de refer ncia ou se pela metodologia desenvolvida Uma descri o mais detalhada ser abordada em cada cap tulo experimental respectivo determina o do f rmaco em an lise 2 6 M todos de refer ncia Com a finalidade de avaliar a exactid o dos resultados obtidos com os sistemas anal ticos desenvolvidos estabeleceu se uma estrat gia de compara o com os resultados obtidos pela execu o dos m todos de refer ncia descritos em Farmacopeias para o f rmaco em estudo anal tico e em respeito forma farmac utica que o veiculava As Farmacopeias abordadas foram a Portuguesa 1 2 16 Parte Experimental e Europeia 4 As metodologias de refer ncia ser o analisadas especificamente em cada um dos cap tulos respectivos 2 7 Procedimentos de avalia o das metodologias anal ticas desenvolvidas O desenvolvimento de novas metodologias anal ticas tem como objectivos b sicos principais permitir a determina o de uma nova esp cie analito melhorar a exactid o a precis o ou o limite de quantifica o de m todos preexistentes permitir ou aumentar o grau de automatiza o e reduzir os custos laboratoriais nomeadamente em termos de consumo de reagentes e envolvimento de pessoal O processo de desenvolvimento de novas metodologias inclui obrigatoriamente a verifica o experimental do seu desempenho no qual se inclui particularmente a avalia o da precis o
293. stragem e para reduzir os riscos do armazenamento das amostras Um sistema de an lise em fluxo pode facilmente ser transportado para o local de recolha de amostras como por exemplo a recolha de gua do mar no alto mar ou produ o de amostras como por exemplo numa ind stria farmac utica e permitir a determina o directa em Introdu o Geral fluxo dos elementos ou compostos em causa sem necessidade de armazenamento e conserva o das amostras 1 1 Controlo de qualidade de formula es farmac uticas O fabrico de medicamentos pode ser inserido no mbito mais geral da ind stria qu mica e assim compreende se que os m todos anal ticos desempenhem um papel importante em todas as fases de investiga o desenvolvimento produ o e uso cl nico de medicamentos 11 Actualmente o desenvolvimento de uma nova formula o farmac utica pressup e uma s rie de etapas que contudo podem diferir em alguns aspectos de ind stria para ind stria 12 nomeadamente i s ntese em pequena escala de uma s rie de compostos org nicos para os quais se espera teoricamente o desenvolvimento de actividade biol gica ii testes farmacol gicos dos compostos iii selec o de um ou mais dos compostos para estudos posteriores iv s ntese do composto em pequena escala v estudos toxicol gicos desenvolvimento anal tico e de pr formula o vi investiga o da nova formula o forma farmac
294. t and the time dependent control of the sample volume inserted into the system allowed the manipulation of the dispersion of the sample inside the system without the need for any physical reconfiguration of the manifold The high operational versatility provided by multicommutation was exploited in an analytical methodology for the determination of trimipramine in pharmaceutical formulations through the combination of the binary sampling approach with flow reversion yielding a very fast reaction development It was also conceived a continuous flow analytical system based in the use of multiple syringe pumps that act simultaneously as sample insertion reagent introduction and solution propelling units This system applied for the determination of isoniazid in pharmaceutical formulations allowed the combinations of the binary sampling approach with the insertion of small solution volumes of approximately uL resulting in an enhancement of the sample and reagent mixing even in limited dispersion conditions Abstract It was developed an analytical methodology based on the concept of multi pumping for the determination of pyrazinamide in pharmaceutical formulations The high extension of the solutions mixture due to the pulsed flow characteristic of these systems allowed the use of a chemiluminescence detection system It were obtained two ranges of linear response for pyrazinamide concentrations only by performing modifica
295. tagem de fluxo para a titula o autom tica V a Vs v lvulas solen ides de 3 vias B reactor C transportador S amostra T titulante D diluente x conflu ncia ISE el ctrodo selectivo REF el ctrodo de refer ncia W dreno mV potenci metro P bomba perist ltica Adaptado de 57 Com detec o espectrofotom trica e com base no mesmo algoritmo descrito Reis et al 58 determinam cido asc rbico em sumos e outras bebidas por titula o Figura 1 20 Recorrendo monosegmenta o e amostragem bin ria tamb m se realizaram titula es cido base atrav s do m todo de Fibonacci Figura 1 21 59 1 54 Introdu o Geral Figura 1 20 Montagem de fluxo V a V v lvulas solen ides de 3 vias B e B reactores Det detector P bomba peristaltica S amostra Cs gua R reagente x canal de fluxo obstru do y conflu ncia W dreno Linhas a tracejado indicam percurso anal tico quando as v lvulas est o activadas Adaptado de 58 MPV S A r E RC po P Gx es g ANNA Do pp W amen x y C al E Figura 1 21 Montagem de fluxo S T W A amostra titulante gua ar respectivamente MPV v lvula multi porta com v lvulas solen ides de 2 vias acopladas RC reactor D detector P bomba perist ltica Adaptado de 59 Apenas com uma v lvula solen ide de tr s vias e reco
296. te atrav s da dissolu o de 6 5 mg do reagente s lido pesado rigorosamente em 500 mL de gua bidesionizada Esta solu o era conservada num frasco de cor mbar para limitar os poss veis efeitos de degrada o provocados por exposi o luz facto resultante de observa es realizadas durante o trabalho A solu o tamp o de carbonato hidrogenocarbonato a pH 10 2 foi preparada atrav s da mistura de 11 76 mL de solu o 0 02 mol L de hidrogenocarbonato de s dio e 25 79 mL de uma solu o 0 01 mol L de carbonato de s dio e perfazendo o volume at 100 mL com gua bidesionizada 38 5 2 2 Equipamento A montagem de fluxo era constitu da por buretas autom ticas da marca Crison modelos Micro BU 2030 e 2031 e estavam equipadas com seringas da marca Hamilton de capacidades 2 5 5 ou 10 mL O seu controlo foi realizado atrav s de um microcomputador Pentium I atrav s da porta de s rie RS 232C e por interm dio de um programa de computador desenvolvido em linguagem BASIC Microsoft Como interface entre microcomputador e sistema anal tico utilizou se uma placa PCL 818L da marca Advantech que tamb m possibilitava realizar a aquisi o de dados As medi es espectrofotom tricas foram realizadas com um espectrofot metro Jenway modelo 6100 equipado com uma c lula de fluxo Hellma de 8 ou 18 pL de volume interno e com percurso ptico de 10 mm 5 9 Determina o espectrofotom trica de
297. te que o sistema de fluxo forne a ptimas condi es de mistura das solu es e que essa mistura se realize o mais poss vel no interior da c lula de fluxo de modo a maximizar a emiss o de luz e a sua detec o Por isso quando se realiza uma an lise em fluxo com detec o por quimioluminesc ncia as solu es de amostra e de reagentes devem entrar na c lula de medi o assim que a emiss o de luz atinja valores pr ximos dos correspondentes intensidade m xima permanecendo entretanto dentro da c lula sair apenas quando o sinal esta a diminuir 40 Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia para determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas por interm dio de um sistema de an lise em fluxo baseado no conceito de multi impuls o e acoplado a um sistema de detec o de quimioluminesc ncia A origem da emiss o de luz foi uma reac o de quimioluminesc ncia muito utilizada que consiste na oxida o de luminol por per xido de hidrog nio catalisada por cati o cobre II A quimioluminesc ncia do luminol foi relatada pela primeira vez em 1928 por Albrecht 41 Como j referido a reac o de quimioluminesc ncia utilizada neste 6 6 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida trabalho envolve a oxida o de luminol normalmente por ac o do per xido de hidrog nio e ocorre na presen a de um catalizador como por exemplo o cati o cobre II Figura 6 2
298. tema de fluxo com multi impuls o para a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas A elevada extens o de mistura das solu es conferida pelo fluxo pulsado caracter stico destes sistemas possibilitou a utiliza o de um sistema de detec o por quimioluminesc ncia Foram obtidos dois intervalos de resposta linear para concentra es de pirazinamida unicamente atrav s de altera es nos valores dos par metros de controlo do sistema via computador A valida o dos sistemas anal ticos desenvolvidos foi realizada por avalia o comparativa dos resultados obtidos relativamente aos fornecidos pelos m todos indicados pelas Farmacopeias iv Abstract ABSTRACT The aim of this work was the development of automated analytical systems for the chemical control of pharmaceutical formulations The implemented flow systems allowed several ways of manipulation of the zone sample namely the exploitation of different sampling strategies including the binary sampling the insertion of unique volumes and the merging zones and also allowed a precise control of the reaction zone transportation towards detection system It was developed an analytical procedure for the determination of clomipramina in pharmaceutical formulations based on a multicommutated flow system The use of the binary sampling approach for the sample and reagents insertion into the analytical system enhanced the reaction developmen
299. tempo requerido para a 1 30 Introdu o Geral an lise de uma determinada amostra resultado n o s do tempo de reac o e de medida mas tamb m do tempo consumido na aspira o das diferentes solu es 1 3 1 3 Multicomuta o 1 3 1 3 1 Conceitos gerais A multicomuta o surgiu na ltima d cada como estrat gia para determina es anal ticas como consequ ncia de uma evolu o do conceito de comuta o em an lises em fluxo A comuta o pressup e a exist ncia de dois estados e sua altern ncia Em multicomuta o o uso de um dispositivo injector embora se possa recorrer a v rios dispositivos consistindo numa v lvula electromec nica activada por um solen ide pass vel de automatiza o e controlo computorizado para a inser o de amostra e reagente tornou poss vel o desenvolvimento de sistemas de fluxo equiparados a redes de an lise Figura 1 3 42 Os sistemas de multicomuta o possuem como principal caracter stica uma grande rapidez de comuta o em determinados pontos num sistema de an lise A versatilidade de op es de comuta o em diversos locais num sistema anal tico assim como a sua velocidade de varia o de estados permitiram o desenvolvimento de uma nova estrat gia de inser o de amostra e reagente denominada amostragem bin ria 43 As elevadas frequ ncias de comuta o das v lvulas solen ides confere de imediato uma vantagem relativamente
300. tiliza o de diferentes tempos de inser o de amostra e de reagente que determinavam o volume de solu o introduzido no sistema dependendo do caudal Essa varia o nos volumes introduzidos foi realizada por modifica o do n mero de repeti o de ciclos da sequ ncia de amostragem bin ria Figura 4 12 Uma grande limita o existente neste ensaio era as caracter sticas operacionais da bureta autom tica que limitavam o caudal m ximo dispon vel Considerando a bureta autom tica equipada com uma seringa de volume 5 0 mL e movida com um motor de passo com um total de 2500 passos 2 uL por cada passo um caudal de 1 5 mL min iria corresponder aproximadamente a 750 passos por minuto ou execu o de um passo por cada 0 08 segundos o que se aproximava da frequ ncia operacional m xima da bureta autom tica podendo assim afectar a estabilidade do fluxo Tal Determina o espectrofotom trica de trimipramina facto foi verificado e observou se que para tempos inferiores a bureta n o efectuava alguns passos fen meno que ocorria de um modo aleat rio 20 00 16 00 E 2 E 12 00 o o E 3 8 00 E lt 4 00 0 00 0 5 10 15 20 25 N meros de ciclos de inser o 1 Tri 0 25 Van Figura 4 12 Influ ncia na resposta anal tica de diferentes caudais e diferentes volumes de amostra introduzidos A caudal 1 0 mL min m caudal 1 5 mL min Com o objectivo de estabelecer u
301. tions of the parameter values controlling the system through computer The validation of the developed flow systems was accomplished by a comparative evaluation of the obtained results in relation to the ones supplied by the execution of the reference procedures in the Pharmacopoeias vi R sum RESUME L objectif de ce travail tait le d veloppement de syst mes analytiques automatiques pour le contr le chimique de formulations pharmaceutiques Les syst mes de flux impl ment s ont rendu possible plusieurs formes d intervention sur la zone d chantillonnage comme exploration de diff rentes strat gies d chantillonnage ainsi que chantillonnage binaire l insertion de volumes uniques et l insertion par confluence de zones et ils ont permis galement un contr le pr cis de la zone de r action jusqu au syst me de d tection Une proc dure analytique a t impl ment e pour la d termination de la clomipramine dans des formulations pharmaceutiques bas e sur un syst me automatique de flux multicommut La strat gie d insertion de l chantillon et des r actifs par chantillonnage binaire a favoris le d veloppement de la r action et le contr le du volume de l chantillon ins r bas sur Vutilisation d un chantillonnage temporis a permis de manipuler la dispersion de l chantillon l int rieur du syst me excluant la n cessit d effectuer des modificati
302. to que em FIA 31 a zona de amostra intercalada normalmente numa corrente de transportador na qual convergem posteriormente outras correntes como por exemplo de reagentes seguindo se o transporte da zona de reac o para a detec o em An lise por Injec o Sequencial SIA 32 uma zona de amostra e uma zona de reagente s o sequencialmente inseridas e retidas num canal de reten o originando uma zona de reac o que posteriormente transportada atrav s da invers o do sentido do fluxo em direc o ao sistema de detec o atravessando ainda um reactor para promover adicionalmente o desenvolvimento da reac o importante referir que em SIA o processo de homogeneiza o das solu es assenta em grande parte na invers o do sentido do fluxo Em ambas as metodologias de fluxo a efici ncia dos procedimentos de mistura de primordial import ncia para um conveniente desenvolvimento da reac o e usualmente envolve a dispers o m tua entre amostra e reagente dentro de um reactor de adequadas dimens es n o apenas para melhorar a resposta anal tica mas igualmente a reprodutibilidade dos sinais anal ticos Os sistemas de fluxo baseados na metodologia de multicomuta o 33 fundamentados na utiliza o de m ltiplos dispositivos monocomutadores autom ticos v lvulas solen ides possibilitam a explora o de um procedimento distinto para a inser o de amostra e reagente amostragem bin ria Este procedimento o
303. tom ticas que est o usualmente associadas gera o de um fluxo constante e n o pulsado e que por essa raz o Justificaram a sua aplica o em distintas Determina o espectrofotom trica de isoniazida ds O o DD SS SE t cnicas de fluxo como por exemplo an lise por injec o sequencial 45 e multicomuta o 46 Contudo a suposi o geralmente reconhecida de que o fluxo originado pelo funcionamento das buretas autom ticas n o pulsado pode ser questionada porque a maioria das buretas autom ticas comerciais constitu da por motores de passo com capacidade de execu o de 2500 ou 5000 passos no m ximo pelo menos pela altura da realiza o do trabalho descrito no presente cap tulo Actualmente por exemplo s o comercializadas buretas autom ticas da marca Crison com capacidade m xima de resolu o de 40000 passos por seringa Considerando por exemplo uma bureta autom tica com um motor de 2500 passos Crison BU 2030 e 2031 equipada com uma seringa com capacidade de 10 mL facilmente verificado que cada passo executado pela bureta corresponde a um volume debitado de 4 uL da seringa Deste modo esperado que atrav s do controlo da frequ ncia de actua o da bureta frequ ncia de passo e em condi es restritas de dispers o seja obtido um fluxo pulsado porque quando a bureta executa diversos passos consecutivos cada volume de passo debitado independentemente n o estando envolv
304. trica de trimipramina 8S SS SS Considerando uma diferen a de aproximadamente 10 vezes entre as concentra es de reagente e observando que a diferen a no sinal anal tico n o significativa relativamente diferen a de concentra es ent o conclui se que os resultados representados na Figura 4 7 n o se devem ao facto do reagente ser um factor limitante no desenvolvimento da reac o e portanto na resposta anal tica Por consequ ncia a configura o da montagem foi alterada e o segundo reactor L2 colocado imediatamente antes do sistema de detec o foi removido restando apenas na montagem anal tica o reactor L Figura 4 2 Com esta modifica o a homogeneiza o entre a amostra e reagente ocorria unicamente no reactor L durante a etapa de inser o de amostra e era optimizada com a invers o do sentido do fluxo Estabelecendo como objectivo a diminui o do comprimento total da zona de amostra reagente inserida no sistema e portanto o volume total da zona de reac o a sequ ncia de intercala o na amostragem bin ria foi modificada atrav s da reprograma o do ciclo de inser o isto realizou se uma redu o do tempo de inser o do reagente durante a amostragem bin ria em vez da sequ ncia bin ria 1 segundo de amostra 1 segundo de reagente utilizou se uma sequ ncia de 1 segundo de amostra 0 25 segundos de reagente Simultaneamente a concentra o da solu o de monovanadato de am nio foi aum
305. tura da amostra e reagentes e tamb m sobre o caudal A combina o do fluxo pulsado com a simplicidade das montagens anal ticas e o controlo autom tico individualizado das micro bombas confere multi impuls o os meios necess rios para desenvolver um sistema de fluxo caracterizado por um desenvolvimento r pido da reac o baixo consumo de reagentes e uma variedade de interven es sobre a zona de amostra sem implicar altera es f sicas na montagem Estas vantagens podem ser aproveitadas para o desenvolvimento de sistemas de an lise em fluxo com detec o por quimioluminesc ncia providenciando os meios para colmatar algumas dificuldades quando se realizam an lises com aquele sistema de detec o 1 3 1 6 2 Evolu o da Multi Impuls o Em 1980 Taylor et al 94 desenvolveram um sistema anal tico que denominaram fluxo acelerado por pulsos do ingl s pulsed accelerated flow que envolvia a inser o de volumes pequenos de solu es pulsos com uma frequ ncia constante atrav s do uso de uma seringa acoplada a um computador Este sistema serviu unicamente para avaliar a cin tica de reac es qu micas r pidas 95 97 1 85 Introdu o Geral No Jap o em 1994 Korenaga et al 98 realizaram um estudo detalhado das caracter sticas f sicas de uma mistura de duas solu es provenientes de dois canais separados por interm dio de uma compara o entre a utiliza o de uma bom
306. u micas mais complexas que envolviam o uso de um n mero elevado de reagentes procurando contudo a simplifica o das montagens 1 27 Introdu o Geral anal ticas A An lise por Injec o Sequencial SIA 38 surgiu para colmatar as defici ncias de autonomia robustez simplicidade e versatilidade apresentadas pela metodologia FIA e caracteriza se por um elevado grau de flexibilidade nas an lises que envolviam um n mero relativamente elevado de reagentes sem ser necess rio a reconfigura o da montagem de fluxo 39 Salienta se que o seu aparecimento e desenvolvimento foram facilitados pela prolifera o de computadores e pela possibilidade do seu interfaceamento com unidades de propuls o e com as v lvulas autom ticas que s o os componentes cruciais para a sua implementa o 40 Um sistema de fluxo baseado na metodologia SIA quando comparado com um sistema FIA partilha de quase os mesmos componentes Um sistema SIA b sico Figura 1 2 constitu do por um dispositivo propulsor bidireccional um reactor de armazenagem uma v lvula selectora multiposi o um detector tubagem adequada para unir os diferentes componentes do sistema e um microcomputador Este componente possibilita o controlo sincronizado do dispositivo de propuls o e da v lvula selectora multiposi o de modo a definir o volume e direc o de escoamento das diferentes solu es Deste modo a mais relevante diferen a entre FI
307. u ligeiramente amarelado 1 E facilmente sol vel em gua metanol e no cloreto de metileno sol vel no lcool e praticamente insol vel no ter et lico e hexano 1 Adicionalmente este f rmaco foi o primeiro aprovado pela FDA Food and Drug Determina o espectrofotom trica de clomipramina Administration para uso veterin rio no tratamento de ansiedade de separa o ou outras formas mic o inapropriada e agress o dominante A clomipramina pertencendo classe farmacol gica dos tric clicos inibe a recapta o de noradrenalina e serotonina nas termina es nervosas centrais aumentando deste modo a concentra o das monoaminas transmissoras nos locais de recep o A inibi o da recapta o ocorre pelo bloqueio das bombas de transporte de membrana nos neur nios e o seu efeito incide essencialmente sobre a recapta o da serotonina 2 O f rmaco clomipramina possui propriedades anti colin rgicas que s o respons veis por alguns dos seus efeitos adversos Tamb m baixa o limite de disparo das convuls es potencia o efeito da noradrenalina e outras drogas actuadoras no Sistema Nervoso Central e possui um efeito interferente na condu o card aca Alguns dos efeitos adversos observados com mais ocorr ncia e associados s propriedades anti colin rgicas da clomipramina foram perturba es gastro intestinais incluindo boca seca obstipa o intestinal n useas e anorexia perturba es a n
308. u reduzir a dispers o da amostra durante o transporte para o sistema de detec o enquanto se assegurou um desenvolvimento conveniente da reac o qu mica No sistema de fluxo para a determina o de isoniazida em formula es farmac uticas a utiliza o de buretas autom ticas para efectuar simultaneamente diferentes tarefas incluindo a inser o individual de solu es de amostra e reagentes a comuta o de fluxo e a propuls o das diferentes solu es envolvidas demonstrou uma excelente precis o exactid o e versatilidade na execu o dessas fun es Com este sistema o controlo computorizado das buretas autom ticas assegura uma elevada versatilidade na manipula o de solu es em que cada al quota inserida de cada solu o envolvida na determina o anal tica controlada em termos de n mero volume e frequ ncia de inser o O sistema de fluxo desenvolvido pode constituir uma alternativa para a miniaturiza o dos sistemas 7 3 Conclus es Finais de fluxo cont nuo porque envolve a utiliza o de um reduzido n mero de componentes para realizar simultaneamente as tarefas de inser o comuta o e transporte de solu es como j referido Adicionalmente a estrat gia adoptada para a inser o das solu es neste sistema permitiu uma redu o no consumo de solu es porque as determina es eram realizadas com al quotas de solu o com baixo volume 1 a 4 uL Com a aplica
309. uanto que a bureta autom tica B foi utilizada para a inser o e propuls o da solu o de amostra Alguns par metros inerentes ao funcionamento do sistema como por exemplo a frequ ncia de passo das buretas volume por cada passo volumes de solu o inseridos no sistema e estrat gia de amostragem foram definidos para cada uma das unidades autom ticas de seringa possibilitando deste modo uma elevada versatilidade na manipula o da inser o de amostra e transporte das solu es em direc o ao sistema de detec o Inicialmente a bureta Bz era operada com uma frequ ncia de passo constante e definida de modo a estabelecer a linha de base Em seguida para possibilitar a inser o de solu o de amostra e solu o de reagente no ponto de conflu ncia X as buretas autom ticas B e B3 eram operadas simultaneamente e ou alternadamente dependendo da estrat gia de amostragem utilizada A resultante zona de reac o era de seguida transportada em direc o ao sistema de detec o D atrav s da actua o da bureta autom tica Bp O caudal foi definido pela frequ ncia de passo e o volume correspondente a cada passo Relativamente ao volume de amostra inserido no sistema este foi estabelecido pelo n mero de passos executados pela bureta multiplicado pelo volume de cada passo Nas situa es de an lise que implicassem a substitui o da solu o de amostra inserida por interm dio da bureta autom tica B era necess rio
310. ultaneamente estudos que envolviam a influ ncia do caudal e dos volumes de amostra introduzidos no sistema A possibilidade de executar um procedimento de optimiza o conjunta dos par metros referidos revela se como uma das vantagens intr nsecas da automatiza o dos sistemas de fluxo por multi impuls o Nestes estudos a estrat gia de amostragem avaliada incidiu no ponto de conflu ncia X da montagem anal tica Figura 6 4 a partir do qual ocorria a reac o de quimioluminesc ncia inibida pela pirazinamida sendo deste modo mais relevante o estudo da inser o das solu es neste ponto da montagem Portanto um dos par metros avaliado em termos de influ ncia no sinal anal tico foi a estrat gia de inser o do fluxo de amostra cobre no fluxo de luminol per xido de hidrog nio assistida pela natureza pulsada do fluxo A necessidade de fixar uma estrat gia para a forma o do fluxo de luminol per xido de hidrog nio e do fluxo de amostra cobre levou utiliza o da inser o de solu es por conflu ncia de zonas porque esta estrat gia providenciava um grau de mistura priori aceit vel al m de que a exist ncia dos reactores Lz e L tamb m promovia a mistura adicional das diferentes solu es Para esta finalidade o fluxo resultante da mistura de solu o de cati o cobre II com solu o de amostra foi originado atrav s da activa o simult nea das micro bombas P e P4 e igual procedimento foi adoptado par
311. uma primeira droga de escolha no tratamento da tuberculose um f rmaco altamente activo contra microorganismos do g nero Mycobacterium especialmente M tuberculosis O seu derivado isopropilo iproniazida 1 isonicotinil 2 isopropilhidrazida tamb m inibe a multiplica o dos bacilos Mycobacterium No entanto este composto que tamb m um potente inibidor da monoamina oxidase muito t xico para poder ser administrado em seres humanos Contudo o seu estudo levou ao uso de inibidores da monoamina oxidase para o tratamento de depress es A isoniazida bacteriost tica para bacilos em estado latente mas bactericida para microorganismos em estado de multiplica o A sua concentra o tuberculost tica m nima 0 025 a 0 05 ug mL 3 A droga marcadamente selectiva para micobact rias pois s o necess rias concentra es em excesso da ordem de 500 ug mL para inibir o crescimento de outros microorganismos Em 1975 Takayama e colaboradores sugeriram que uma ac o principal da isoniazida a inibi o da biosintese de cidos mic licos que s o constituintes muito importantes da parede celular das micobact rias E porque os cidos mic licos s o constituintes nicos das micobact rias esta ac o explica o elevado grau de selectividade da actividade antimicrobiana da isoniazida Verificou se que a exposi o a isoniazida leva perda r pida de cidos gordos verific vel experimentalmente por uma diminui
312. utica e excipientes vii s ntese de um lote ligeiramente maior do composto viii testes cl nicos de fase I Farmacologia Cl nica ix testes cl nicos de fase II avalia o da dose efeitos laterais e biodisponibilidade x testes cl nicos de fase III xi primeira produ o de lote completa ou parcial xii aplica o da nova formula o xiii produ o de lotes estudos de estabilidade xiv produ o de rotina exclus o do lote de estabilidade xv poss vel altera o da f rmula estudos de estabilidade Introdu o Geral Neste sentido e de um ponto de vista anal tico o desenvolvimento de uma nova formula o farmac utica requer entre outros testes biol gicos nomeadamente avalia es de mutagenecidade carcinogenecidade toxicidade farmacodin mica farmacocin tica etc Estas an lises que decorrem apenas durante as primeiras etapas de desenvolvimento de uma formula o 13 despertam a procura de novas t cnicas anal ticas de elevada sensibilidade selectividade precis o e exactid o que permitem a determina o tanto da subst ncia activa como dos seus metabolitos em fluidos biol gicos e tecidos Al m dos testes biol gicos incluem se tamb m estudos qu micos detalhados das mat rias primas de intermedi rios sint ticos do pr prio f rmaco e do produto na formula o final Estes estudos devem identificar tipos e n veis de impurezas produtos e velocidade de degrada
313. utilizadas como unidades de propuls o alternativas s bombas perist lticas s o muito vers teis e facilmente controladas e operadas o que faz delas dispositivos muito atractivos para a implementa o de metodologias anal ticas autom ticas O funcionamento programado das buretas possibilitou a obten o de um fluxo pulsado A sua avalia o foi realizada com distintas estrat gias de amostragem incluindo volumes nicos de amostra amostragem bin ria e conflu ncia de zonas que representam diferentes procedimentos para a mistura entre amostra e reagente Este estudo foi estendido a outros par metros de fluxo pulsado que afectavam o perfil do sinal anal tico como por exemplo o reactor e o volume interno da c lula de fluxo 5 2 Parte experimental 5 2 1 Reagentes Uma solu o 500 ug mL de isoniazida foi preparada diariamente atrav s da pesagem rigorosa de 50 0 mg do s lido isoniazida seguido de dissolu o em 100 mL de solu o tamp o de carbonato hidrogenocarbonato pH 10 2 Esta solu o era conservada no frigor fico e a partir dela eram preparadas as solu es padr o utilizadas para determina o na montagem anal tica e para elabora o das curvas de calibra o por dilui o com a mesma solu o tamp o de carbonato hidrogenocarbonato Determina o espectrofotom trica de isoniazida rr A solu o de NQS com uma concentra o de 5 0x10 mol L foi preparada tamb m diariamen
314. utos farmac uticos Tese de Doutoramento Faculdade de Farmacia da Universidade do Porto Porto 2000 B F Reis M F Gin E A G Zagatto J L F C Lima R A S Lapa Anal Chim Acta 293 129 1994 S D Rothwell A A Woolf Talanta 32 431 1985 D J Malcolme Lawes G A Milligan R Newton J Autom Chem 9 179 1987 D J Malcolme Lawes C Pasquini J Autom Chem 10 25 1988 C Riley L H Aslett B F Rocks R A Sherwood J D Watson J Morgon Clin Chem 29 332 1983 C Pasquini L C de Faria J Autom Chem 13 143 1991 B F Reis M F Gin F J Krug H Bergamin F J Anal At Spectrom 7 865 1992 H Hara N Ishio K Takahashi Anal Chim Acta 281 45 1993 P B Martelli B F Reis E A M Kronka H Bergamin F M Korn E A G Zagatto J L F C Lima A N Ara jo Anal Chim Acta 308 397 1995 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Introdu o Geral A N Ara jo J L F C Lima B F Reis E A G Zagatto Anal Chim Acta 310 447 1995 C C Oliveira R P Sartini B F Reis E A G Zagatto Anal Chim Acta 332 173 1996 E A M Kronka B F Reis M Korn H Bergamin F Anal Chim Acta 334 287 1996 J A Vieira B F Reis E A M Kronka A P S Paim M F Gin Anal Chim Acta 366 251 1998 M Korn L F B P Gouveia E Oliveira B F Reis Anal
315. valiar comparativamente os resultados obtidos pelas metodologias desenvolvidas foi utilizado um espectrofot metro UV VIS de feixe duplo da marca Perkin Helmer Instruments modelo Lambda 45 Nos m todos de refer ncia quando foi necess rio efectuar titula es potenciom tricas utilizou se um titulador autom tico desenvolvido no laborat rio de Qu mica F sica o qual era constitu do por uma bureta autom tica Crison modelo Micro BU 2031 um decimilivoltimetro de alta imped ncia com uma sensibilidade de 0 1 mV da marca Crison modelo 2002 um agitador Crison modelo Micro ST 2039 um el ctrodo de pH Ingold refer ncia 10 402 e um el ctrodo de dupla jun o Orion refer ncia 900200 A unidade de controlo do titulador autom tico foi um microcomputador Hyundai Super 16 equipado com uma placa de aquisi o e controlo anal gico digital Advantech modelo PCL 720 2 2 Parte Experimental As titula es efectuadas com detec o visual do ponto de equival ncia por interm dio de um indicador foram realizadas pelo m todo tradicional com o recurso a buretas de vidro Os sistemas de fluxo desenvolvidos no mbito desta disserta o foram montados com base em equipamentos e componentes comuns entre todas as montagens anal ticas de fluxo A descri o dos equipamentos e componentes das montagens anal ticas desenvolvidas encontra se referida em seguida agrupada de acordo com o conceito de fluxo explorad
316. vo dos par metros anal ticos e deste modo da reac o qu mica e possibilita uma vasta gama de manipula es da zona de amostra sem requerer qualquer reconfigura o f sica da montagem de fluxo 4 34 Determina o espectrofotom trica de trimipramina Consequentemente a metodologia desenvolvida pode ser estendida a outras reac es qu micas ou para a determina o de outras esp cies atrav s de nenhumas ou poucas modifica es na estrutura modular caracter stica do sistema de fluxo por multicomuta o Mais concretamente para efectuar a inser o de mais um reagente unicamente necess rio a adi o ao sistema de mais uma v lvula solen ide Evidencia se deste modo a elevada versatilidade dos sistemas de fluxo por multicomuta o no sentido de facilmente possibilitar diversos percursos anal ticos devido presen a de pontos de comuta o numa montagem anal tica Existindo a possibilidade de alterar o n mero desses pontos de comuta o atrav s da adi o de v lvulas solen ides ent o um sistema de fluxo por multicomuta o possibilita facilmente o acrescento de canais de inser o de solu es que deste modo permitem executar determina es qu micas que envolvem mais reagentes Determina o espectrofotom trica de trimipramina 4 5 Refer ncias bibliogr ficas NY Dn Bs 10 11 12 13 14 15 16 Goodman amp Gilman s The Pharmaco
317. vulas solen ides de 3 vias U l mpada de UV D detector B bureta autom tica L reactor S amostra C transportador Adaptado de 78 Entretanto em 1998 Lapa et al 79 desenvolve um sistema de fluxo multicomutado com recircula o cont nua de amostra numa configura o circular aberta Figura 1 38 onde se salientaram as vantajosas caracter sticas da multicomuta o elevada capacidade de direccionalidade de fluxo e eficaz capacidade de manipula o da zona de amostra Deste modo um programado accionamento das v lvulas permitiu que a zona de amostra fosse recirculada possibilitando a sua multidetec o ou a sua dilui o at enquadramento na zona de resposta linear A dilui o al m de ocorrer por fen menos de dispers o tamb m era induzida por remo o das frac es terminais da zona de amostra Paralelamente conseguia se uma renova o do reagente cromog neo e das interfaces de reac o o que resultava num aumento da velocidade de reac o Em 2001 as potencialidades da multicomuta o em determina es sequenciais s o expandidas por associa o com detectores multi canal como evidencia o trabalho de Rocha et al 80 em que se realiza a termina o sequencial de ferro cobre zinco e n quel por espectrofotometria Figura 1 39 1 71 Introdu o Geral Figura 1 38 Montagem de fluxo com configura o circular V a Vs v lvulas solen ides de 3 via
318. x 10 mol L n o era t o acentuada como para as concentra es inferiores Consequentemente uma solu o 2 5 x 10 mol L de per xido de hidrog nio foi utilizada para realizar as experi ncias seguintes Por ltimo foi verificada a influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de cati o cobre II atrav s do ensaio com solu es de cati o cobre II com concentra es entre 1 mg L e 19 mg L F igura 6 9 20 00 16 00 12 00 8 00 Amplitude de sinal cm 4 00 0 00 0 5 10 15 20 Concentra o de cobre II mg L Figura 6 9 Influ ncia no sinal anal tico de diferentes concentra es de cati o cobre II entre 1 mg L e19 mg L Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Dos resultados obtidos verificou se que at concentra es de 5 mg L o sinal anal tico aumentava e que para concentra es superiores de cati o cobre II a intensidade de sinal anal tico obtida apresentava sinais de estabiliza o pelo que para as posteriores determina es utilizou se uma solu o de cati o cobre II com concentra o 4 mg L 6 3 2 Optimiza o dos par metros do sistema de fluxo Com vista a optimizar a intensidade de emiss o de luz pela reac o de oxida o do luminol realizaram se estudos da influ ncia das dimens es dos reactores Li L2 e L na amplitude de sinal anal tico Teoricamente o reactor L tinha como fun o auxiliar a mistura
319. zado para a obten o da linha de base Como j foi referido esta era constitu da unicamente por solu o de luminol e solu o de per xido de hidrog nio e por isso n o sucedia a detec o de luz durante o registo da linha de base O procedimento adoptado possibilitou realizar a mistura da solu o de amostra com a solu o de cati o cobre II com mais extens o previamente ao desenvolvimento da reac o de detec o A alternativa seria promover constantemente a emiss o de luz atrav s da introdu o no sistema das solu es de luminol per xido de hidrog nio e cati o cobre II constituindo este procedimento a linha de base e ap s a introdu o de solu es de pirazinamida com diferentes concentra es observar no registo as varia es de sinal que consistiriam em diminui es da emiss o de luz O registo anal tico corresponderia portanto a picos invertidos 6 2 4 M todo de refer ncia Para avaliar a exactid o e a precis o da metodologia apresentada neste cap tulo foi realizada a determina o de pirazinamida em formula es farmac uticas de 6 15 Determina o quimioluminom trica de pirazinamida dispensa hospitalar Pramide 500 mg de pirazinamida por comprimido de acordo com o m todo de refer ncia referido na Farmacopeia Portuguesa 47 por interm dio de uma titula o potenciom trica em meio n o aquoso As solu es de amostra das formula es s lidas for
320. zado para os restantes ensaios 5 00 4 00 3 00 2 00 Amplitude de sinal cm 1 00 0 00 0 10 20 30 40 50 60 Comprimento do reactor L1 cm Figura 6 10 Influ ncia no sinal anal tico do comprimento do reactor L entre O cm e 50 cm O reactor Lz era unicamente respons vel pela mistura adicional da solu o de pirazinamida com a solu o de cati o cobre II sendo o fluxo resultante desta mistura inserido posteriormente no fluxo constitu do pela mistura da solu o de luminol com solu o de per xido de hidrog nio para desenvolvimento da reac o de quimioluminesc ncia Determina o quimioluminom trica de pirazinamida Deste modo para o reactor Lz assumiu se que as melhores condi es de resposta anal tica seriam as que originavam a mais baixa intensidade de luz emitida pela reac o de quimioluminesc ncia porque assim confirmava se uma eficiente mistura de solu o de pirazinamida com solu o de cati o cobre II pelo reactor L2 o que resultava numa menor disponibilidade do cati o cobre II para a reac o de oxida o do luminol pelo per xido de hidrog nio ap s a mistura dos fluxos de solu es no ponto de conflu ncia X da Figura 6 4 De acordo com os resultados obtidos Figura 6 11 seleccionou se um reactor L2 com 25 cm de comprimento tendo em conta que para maiores dimens es o sinal anal tico de quimioluminesc ncia apresentava sinais de estabiliza o ind

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